專利名稱：一種納米仿生創(chuàng)面覆蓋物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種納米仿生創(chuàng)面覆蓋物及其制備方法，屬于生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
在人體的生命活動中，常見因機械創(chuàng)傷、物理、化學及生物損傷等不同原 因造成皮膚的缺損。僅達表皮或淺層真皮或小面積深層真皮的皮膚損傷可以通 過包扎和敷用外科輔料類創(chuàng)面覆蓋物，依靠原有皮膚自身再生能力痊愈。這些 外科輔料類創(chuàng)面覆蓋物產(chǎn)品的作用是暫時性的覆蓋燒傷創(chuàng)面，防止感染及水 分、體液流失，并可能有加速創(chuàng)面愈合的作用。而傷及大面積的深層真皮、或 表皮真皮完全損失的皮膚損傷則無法依靠原有皮膚自身再生能力痊愈，必須進 行皮膚移植。
自臨床開創(chuàng)皮膚移植成功搶救，將皮膚大面積燒傷者的存活率成功由20% 以下提升到了 64%,皮膚移植從此成為臨床救治皮膚損傷的常用手段之一，尤 其是嚴重皮膚損傷的重要手段。目前臨床皮膚移植主要是自體皮膚移植和人工 皮膚移植兩大類型。
目前臨床多采用自體皮膚的移植治療皮膚缺損，然而這種方法有以下缺 陷①常受到供皮來源的限制。由于臨床培養(yǎng)周期通常在10天以上，對嚴重 受損的病人而言，緩不濟急，尤其是大面積皮膚受傷的病人，皮膚來源有限。 因此在臨床上將皮膚一分再分，出現(xiàn)了篩狀、網(wǎng)點，點狀、微粒植皮，直到不 可分的細胞，同此也造成臨床移植效果不好，出現(xiàn)水皰，不貼附等現(xiàn)象；②以 傷治傷，需要二次手術，造成供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷；③費用昂貴，據(jù)估算，做 全身皮膚移植費用需要多次手術，總費用在10-40萬元/人左右。為了克服上 述缺陷，近年來以組織工程技術為基礎開發(fā)的人工創(chuàng)面覆蓋物產(chǎn)品得到了臨床 應用。
現(xiàn)有技術中的創(chuàng)面覆蓋物主要是外科敷料類和人工皮膚類兩種。 外科輔料類產(chǎn)品有甲殼素類、海藻類、硅凝膠、膠原、水凝膠、生物活性玻璃材料、納米銀等。現(xiàn)有的人工皮膚又分為兩大類產(chǎn)品， 一類是由非活性
材料組成，不含活細胞成分；另一類是含細胞的組織工程產(chǎn)品，是真正的組織 工程皮膚。前者一般是天然真皮網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)或者是仿真皮纖維結(jié)構(gòu)，這種網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)作為細胞生長的支架，甚至營養(yǎng)物質(zhì)。后者的主要原理是使用人體皮膚 纖維細胞或角質(zhì)細胞種植在合適的生物支架材料上，以模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)及功 能。
非活性材料人工皮膚一般是天然真皮網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)或者是仿真皮纖維結(jié) 構(gòu)。根據(jù)其材料來源，又可以分為兩大類天然材料和人工合成材料兩類。
天然材料又可以才艮據(jù)材料來源再分為兩類異種來源和異體來源。異種來 源的多半是用豬皮或牛皮，來源于動物，因此無法徹底消除免疫原性，此外還 可能攜帶病毒、傳播疾病。臨床研究中還發(fā)現(xiàn)，異體皮植皮后，與自體植皮相 比，血管化更為困難，新生血管較難長入，而隨后排斥反應卻比傳統(tǒng)器官移植 要強烈得多。異體來源的取自人的尸體皮，其缺點是缺乏活細胞成分，且來源 有限，人工皮中所含的異體表皮細胞可引起免疫排斥反應，非目前通用的免疫 抑制劑可以控制，無法徹底消除免疫原性，有傳播病毒危險。即使用高效免疫 抑制劑，也很難保證皮片不被排斥。人工合成材料的產(chǎn)品的缺點是無皮膚細 胞成分，且與天然皮膚結(jié)構(gòu)差異較大，也缺乏合適孔徑和合理分布的釋控的生 長因子，不能有效誘導皮膚干細胞長入，也不能誘導其合理分化。
含活細胞成分的是真正意義上的組織工程皮膚，如Apligraf (Organogenesis, Inc.)、 Dermagraft (Advanced Tissue Science, Inc.)。纟且織工牙呈方法是通過獲得自 體或異體的極少量皮膚組織，將其在體外(實驗室中)經(jīng)過滅菌、消化、分離、 培養(yǎng)，在獲得足夠的細胞數(shù)量時將其重組制備表皮皮膚組織或全層皮膚組織 (包括表皮層及真皮層)，用于患者皮膚創(chuàng)傷的修復，這種全層皮膚組織在種 植后不易變形，易于愈合，將有著重要的臨床價值和社會經(jīng)濟效益。
但由于為了解決臨床現(xiàn)貨供應的需要，所含的活細胞成分大都需要在預先 在體外培養(yǎng)，導致細胞來源都多是異體的，這樣，就無法完全消除免疫原性， 影響皮膚移植的效果和成功率。同時，由于在目前人體細胞培養(yǎng)過程中，現(xiàn)多 用動物血清培養(yǎng)，由于使用了異種動物的血清，就無法完全避免病毒傳播的危 險。而且目前的體外培養(yǎng)過程周期較長，難以及時滿足臨床需要。皮膚移植臨 床研究中還發(fā)現(xiàn)由于組織工程化人工皮沒有血管系統(tǒng)供給營養(yǎng)，血管化較慢,表面上皮容易壞死脫落。由于移植的表皮膜薄脆，不能牢固地黏附于基底膜， 缺乏正常的機能穩(wěn)定性，因而移植后不可避免地導致許多功能和外觀上的減 弱，如易感染、瘢痕收縮、水泡形成等，這些都說明人工皮膚的韌性及機械性 能同天然皮膚仍有較大的差距。
總結(jié)以上已有技術創(chuàng)面覆蓋物的不足
外科輔料類皮膚產(chǎn)品只是暫時性的覆蓋創(chuàng)面，其共同缺點在于
① 效果一般，無法達到真皮層完全修復的效果，不含活細胞，不能再生皮 膚，只能靠原來的皮膚修復； '
② 不適用于嚴重損傷，通常只對于傷及表皮和淺層真皮或小面積深層真皮 受損有效，對慢性傷口效果非常有限；對于三度燒傷和大面積深二度燒傷及程 度相同的皮膚損傷無效，不能代替人工皮膚。
③ 這類敷料都有其各自的適用范圍和不同的缺點。其中海藻類、硅凝膠、 膠原、水凝膠、生物活性玻璃材料等閉合敷料不適于感染創(chuàng)面。納米銀有低毒， 而膠原耐用性、生物相容性及制備的高成本是問題。水凝膠最大的缺點就是相 對較低的機械強度。海藻類敷料單獨應用時粘附性較差。天然曱殼素/殼聚糖 類則因為在中性、堿性溶液中溶解性不好，應用受到限制。
非活性材料的人工皮膚有以下缺點
① 由于缺乏活細胞成分，不能再生皮膚，只能靠原來的皮膚修復，也就不 能充分發(fā)揮皮膚細胞再生增殖能力和其在皮膚修復中的作用，以至于達到的修 復效果有限。這是這類材料共同缺點，也是其最大的缺點。
② 多數(shù)人工材料結(jié)構(gòu)與天然皮膚結(jié)構(gòu)差異較大，缺乏合適孔徑和合理分布 的釋控的生長因子，不能有效誘導皮膚干細胞長入，也不能誘導其合理分化。 創(chuàng)面修復的效果有限。
③ 皮膚移植臨床研究中還發(fā)現(xiàn)，人工材料的力學性能差，移植后缺乏合適 的孔徑及不利于周圍血管的長入，不如自體移植的皮膚具有彈性和柔軟度。
目前不含活細胞成分的天然材料多來源于動物或異體的真皮，其主要成 分為膠原，因此無法徹底消除免疫原性，異種/異體人工皮中所含的異種/異體 表皮細胞可引起免疫排斥反應，非目前通用的免疫抑制劑可以控制，無法徹底 消除免疫原性，即使用高效免疫抑制劑，也很難保證皮片不被排斥。
⑤異種/異體真皮的使用導致無法完全避免攜帶病毒、傳播疾病的危險。⑥ 臨床研究中還發(fā)現(xiàn)，異體皮植皮后，與自體植皮相比，血管化更為困難， 新生血管較難長入，而隨后排斥反應卻比傳統(tǒng)器官移植要強烈得多。
⑦ 天然材料成本高，改性復雜，來源受限。異體皮膚來源尤其有限。
組織工程皮膚則有以下缺點
① 目前的體外培養(yǎng)過程周期較長，難以及時滿足臨床需要。
② 皮膚移植中也發(fā)現(xiàn)由于組織工程化人工皮沒有血管系統(tǒng)供給營養(yǎng)，血管 化較慢，表面上皮容易壞死脫落。
③ 由于移植的表皮膜薄脆，不能牢固地黏附于基底膜，缺乏正常的機能穩(wěn) 定性，因而移植后不可避免地導致許多功能和外觀上的減弱，如瘢痕收縮、水 泡形成等，這些都說明人工皮膚的韌性及機械性能同天然皮膚仍有較大的差 距。
④ 大多人工皮膚使用異體表皮細胞，可引起免疫排斥反應，非目前通用的 免疫抑制劑可以控制，皮片最終壞死脫落，目前尚不能用于大面積深度燒傷創(chuàng) 面。
⑤ 異體和異種來源的人工皮膚不僅無法徹底消除免疫原性，此外還可能攜
帶病毒、傳播疾病。由于為了解決臨床現(xiàn)貨供應的需要，組織工程皮膚所含的 活細胞成分多需要在預先在體外培養(yǎng)，導致目前市場上商業(yè)化的人工皮膚細胞 來源是異體的，這也導致了免疫原性。由于目前在人體細胞培養(yǎng)過程中，多用 動物血清培養(yǎng)，因此無法避免病毒傳播的危險。
總之，目前的組織工程皮膚生產(chǎn)成本昂貴、生產(chǎn)周期長，保存、運輸困難， 不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及臨床推廣。
生物打印技術是近年來出現(xiàn)的新技術。生物打印能按預定計劃精確定位， 這和打印技術的特點是一致的。生物打印與 一般打印的不同僅在于其墨水和接 受打印的紙張不一樣。生物打印的紙片是在體內(nèi)可降解的生物紙片；生物打印 的"生物墨水"是特制的細胞溶液或有生物活性的細胞因子溶液。生物打印技 術是將這種特制溶液噴射到可生物降解的生物紙片上。打印后再將紙片按一定 順序的堆疊。由于使用了打印技術，可以將細胞或/和細胞因子("生物墨水") 精確的結(jié)合到預定部位；而按特定的堆疊方式的生物紙片則會形成三維結(jié)構(gòu)。 理論上如果所用的生物墨水是細胞溶液，則形成三維的組織結(jié)構(gòu)和器官，最后 生物紙片降解，細胞保留下來，形成立體結(jié)構(gòu)，例如，活的三維組織、血管和器官。但是生物打印技術仍處于基礎研究的階段，還沒有出現(xiàn)直接利用細胞通
過生物打印技術制備的人工器官，也沒有見到相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術的不足，提供一種成本較低、生產(chǎn)周期很 短、保存、運輸容易、不帶病毒、無免疫排斥或免疫排斥作用極低的、應用范 圍廣泛的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物，具體地說，本發(fā)明以細胞因子作為墨水，利用 生物打印技術成功制備得到人工皮膚。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述納米仿生創(chuàng)面覆蓋物的制備方法，所述方 法筒單易行、可適應大規(guī)模生產(chǎn)、成本低，同時拓寬了生物打印技術應用范圍 的。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
一種納米仿生創(chuàng)面覆蓋物，所述創(chuàng)面覆蓋物為膜狀結(jié)構(gòu)，包括納米仿生支 架和附著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細胞因子。
本發(fā)明的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物的厚度、形狀和大小根據(jù)具體的應用場合來 決定，如不同受傷程度的創(chuàng)面，不同的人體部位，應用于動物體的創(chuàng)面等多種 情形。
所述納米仿生支架是采用支架材料通過靜電紡絲技術制備得到，所述支架 材料包括聚乳酸、聚已內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二曱 酸乙二酯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷 酸酯、聚氨基曱酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙 烷、聚對二惡酮、丙交酯、乙交酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、己內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán) 氧丙烷、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、 纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、 海藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸。將上述材料溶于一定的 溶劑，形成電紡液，就可以通過靜電紡絲技術得到納米仿生支架。這些溶劑可 以為曱酸、乙酸、乙醇、丙酮、二曱基曱酰胺、二曱基乙酰胺、四氫呋喃、二 曱基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯曱烷、三氯曱烷、曱醇、乙醇、氯仿、 二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩Ｉ鲜龅母叻肿硬?料和溶劑用于靜電紡絲的相關技術，例如材料與溶劑的重量比例等參照現(xiàn)有技 術。用上面提到的 一種或兩種以上混合材料通過靜電紡絲技術，可以按照具 體需要做出合適孔徑和直徑的納米材料。此項工藝在本發(fā)明制備方法一節(jié)有詳 細敘述，操作簡單，所得到的纖維是納米級的，比傳統(tǒng)的方法得到的無紡布直 徑小幾個數(shù)量級，其直徑分布是幾個納米到幾個微米，并可通過工藝參數(shù)調(diào)整 得到不同直徑，做到和人體真皮網(wǎng)狀結(jié)締組織高度相似，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔
徑大小和其分布也可調(diào)整，以利于不同類型的細胞遷入，如50土20微米的孔徑 有利于血管內(nèi)皮細胞長入，而神經(jīng)纖維則需要30 IOO微米的孔徑。本發(fā)明采 用上述材料的電紡絲(納米仿生支架)根據(jù)創(chuàng)面修復過程自動安全降解，避免 了結(jié)締組織的異常增生，出現(xiàn)瘢痕、水泡等現(xiàn)象；避免了新生上皮壞死脫落現(xiàn) 象的出現(xiàn)，保持了人的正常外貌，達到和人體自身皮膚的韌性及機械性完全相 同的效果。
所述的納米仿生支架在生物打印中同時起到生物"紙片"的作用。 所述水溶膠可以是以下聚合物制成的水溶膠多糖類聚合物，如淀粉、纖 維素、海藻酸、透明質(zhì)酸或殼聚糖；多肽類聚合物，如膠原、聚L-賴氨酸或聚 L-谷胺酸；合成的親水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰 胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物制備的水溶膠通過改變溫度、酸堿度、 經(jīng)紫外線照射或者加入交聯(lián)劑(固化液)等方法，可由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)。
可選自細胞定向遷移因子(SDF-1)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長 因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素結(jié)合因子(ECM)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF-a)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或細胞定向遷移因子、胰島素生 長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子、結(jié)締組織 生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、骨橋蛋白、生長激素類(如促生長素) 等細胞吸引及粘附因子。本發(fā)明也可用于其它對干細胞歸巢/趨化和分化起作 用的其它因子。據(jù)已有的文獻報道和證實，EGF具有在體促進骨髓間充質(zhì)干細 胞向表皮細胞分化的作用，在體內(nèi)還可介導上皮生長，促進血管形成，加快皮 膚創(chuàng)面愈合速度和提高愈合質(zhì)量的作用；FGF對表皮細胞增殖、分化和皮膚 附件發(fā)生有誘導作用；白介素IL-3可刺激皮膚上皮細胞增殖；ECM支持內(nèi)皮 或成纖維細胞的粘附和移動；TGF-a可促進成纖維細胞和上皮的生長，刺激 體內(nèi)的血管生成因子；血小板衍生的生長因子(PDGF)可促進皮膚成纖維細
9胞增殖； 一定劑量的生長激素可促進皮膚膠原蛋白特別是I型膠原蛋白的合 成，使皮膚明顯增厚。SDF-1是目前明確的對干細胞趨化歸巢起最重要作用的 分子，可趨使干細胞定向遷移，應激、損傷、缺氧及G-CSF等均可誘導損傷 局部干細胞定向遷移因子SDF-1大量表達，從而捕獲干細胞定向遷移于損傷局 部，進而增殖分化為各種功能細胞。CXCR4是SDF-1的唯一受體，且在CD34+ 干細胞表面都有廣泛表達。SDF-1因子不僅能通過SDF-1—CXCR4結(jié)合來捕 獲遷移中干細胞，同時能通過CXCR4介導的細胞反應(如上調(diào)黏附分子的表 達)來激活千細胞穿越內(nèi)皮細胞層的遷移運動。目前現(xiàn)有技術已經(jīng)證實CD34+ 干細胞可依據(jù)SDF-1的濃度梯度遷移，并且SDF-1在誘導干細胞趨化和轉(zhuǎn)移 動員的同時，也具有刺激活性，增加干細胞的增殖分化的作用。SDF-1 - CXCR4 是目前明確的對造血干細胞趨化定向遷移起最重要作用的分子。
本發(fā)明同時提供了上述納米仿生創(chuàng)面覆蓋物的制備方法，包括以下步驟 (1)制備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； (2 )用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架;
架上，水溶膠固化后即得。
上述步驟(1)中所述制備含有細胞因子的水溶膠溶液也可以步驟(2)和 步驟(3)之間進行。
在本發(fā)明中，步驟(2)和(3)可重復一次或者更多次，以得到不同厚度 的創(chuàng)面覆蓋物。
所述電紡溶液是將前述支架材料溶于一定的溶劑，形成電紡液；支架材料 包括聚乳酸、聚已內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二曱酸乙二 酯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基曱酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚 對二惡酮、丙交酯、乙交酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、己內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、 聚氨酯類、聚> 友酸酯、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、 改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、海藻酸、 硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸的一種或兩種以上混合溶液；
溶劑為曱酸、乙酸、乙醇、丙酮、二曱基甲酰胺、二曱基乙酰胺、四氫呋 喃、二曱基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯曱烷、三氯曱烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一種或者它們?nèi)我獗壤幕旌?物。上述的高分子材料和溶劑用于靜電紡絲的相關技術，例如材料與溶劑的重 量比例等參照現(xiàn)有技術。
所述電紡溶液優(yōu)選粘均分子量為10000的聚-DL-乳酸和分子量為400的聚 乙二醇的二氯曱烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分別為 80%和20%，溶劑所占質(zhì)量百分比為85%。
步驟(1)所述含有細胞因子的水溶膠溶液是含有千細胞定向遷移因子和 干細胞分化因子的水溶膠緩沖液；所述干細胞定向遷移因子和干細胞分化因子 所占質(zhì)量百分比總數(shù)不高于10%。
步驟(1)所述水溶膠緩沖溶液為藻酸鹽或藻酸鹽與其它物質(zhì)的混合溶液， 交聯(lián)劑溶液為氯化釣溶液；或所述水溶膠緩沖溶液為纖維蛋白原溶液，交聯(lián)劑 溶液為凝血酶溶液；或所述水溶膠緩沖溶液為透明質(zhì)酸碳酸氫鈉溶液，交聯(lián)劑 溶液為酰肼或碳化二亞胺；或所述水溶膠緩沖溶液為膠原-聚陰離子溶液，交 聯(lián)劑為碳化二亞胺。
步驟(2)所述靜電紡絲的優(yōu)選參數(shù)為注射泵推進速度為0.3 0.8ml/h, 紡絲針頭為10、 12、 14、 16、 18或20號針頭，施加電壓為15 25KV， 4妄收 噴絲的細胞培養(yǎng)皿中裝有交if關劑溶液，生物打印的紙片為電紡制得的納米仿生 支架。
所述噴墨打印機優(yōu)選改裝的惠普550C噴墨打印才幾，改裝方法參考美國專 利US 7051654。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明采用干細胞技術及納米仿生技術的結(jié)合，利用特定的千細胞遷移分 化因子、結(jié)合納米仿生支架材料，在創(chuàng)傷原位吸引干細胞遷移及分化為皮膚細 胞，進行修復再生，解決了當前創(chuàng)人工皮膚所面臨的發(fā)展屏障。
理想的人工皮膚替代物應具有以下特性與正常皮膚組織相似的結(jié)構(gòu)，對 傷口有一定的貼附性，可防止細菌入侵及生長，可用于修復皮膚組織缺損，無 毒性、不產(chǎn)生免疫排斥反應，并有良好的生物相容性等。結(jié)合這些特性說明本 發(fā)明的優(yōu)點和有益效果
(1)本發(fā)明采用了原位自體干細胞工程技術，采用干細胞趨化因子吸引 自體干細胞定向遷移進入創(chuàng)面并按設計要求進行分化，即避免了使用活細胞帶來的不便，又能達到使用與其同等或者更佳的修復效果；
(2) 本發(fā)明利用生物打印技術，將生長因子等生物物質(zhì)按設計要求與納 米支架精確結(jié)合，形成誘導干細胞遷移、聚集、分化的微環(huán)境，吸引干細胞進 入創(chuàng)面；
(3) 本發(fā)明的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物本身不含活細胞成分，不使用外源細 胞和蛋白，免除了因此而帶來免疫排斥、病毒傳播、疾病傳染的諸多風險；
(4 )本發(fā)明所使用的材料是目前已經(jīng)證實對人體無毒無害的安全生物材 料，是人工材料，即不會帶來免疫排斥、病毒傳播、疾病傳染的諸多風險，也 不會帶來其它毒害作用。
(5) 本發(fā)明的創(chuàng)面覆蓋物材料根據(jù)創(chuàng)面修復過程自動安全降解，在降解 過程的同時創(chuàng)面得到了完全修復，這使得創(chuàng)面皮膚再生過程與正常的皮膚分化 過程一致，新生的纖維與原來的皮膚纖維排列一致，這就避免結(jié)締組織的異常 增生，出現(xiàn)瘢痕、水泡等現(xiàn)象；皮膚的附屬器官，如血管等，也在同時進行再 生，這就避免了新生上皮壞死脫落現(xiàn)象的出現(xiàn)，使新生皮膚牢固地黏附于基底 膜，達到正常的機能穩(wěn)定性。因此保持了人的正常外貌。達到和天然皮膚的韌 性及機械性完全相同的效果；
(6) 本發(fā)明的創(chuàng)面覆蓋物由于不含活細胞成分，材料來源充分，成本較 低，避免了天然材料來源不足，成本高，改性復雜的缺點，貯存運輸簡單；
(7) 本發(fā)明的創(chuàng)面覆蓋物的制備方法工藝步驟簡化，生產(chǎn)時間短，能有 效避免加工過程中產(chǎn)品受到污染，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，產(chǎn)品標準容易實現(xiàn)，產(chǎn) 品可實現(xiàn)低成本、高效率的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(8) 本發(fā)明的創(chuàng)面覆蓋物具有良好的力學強度的柔韌性，能夠有效保護 皮膚，在皮膚完全修復之前，可以防止細菌入侵和生長，避免感染等現(xiàn)象發(fā)生。
(9) 本發(fā)明的應用范圍較任何一種現(xiàn)有技術的產(chǎn)品都更為廣泛，能用于 修復三度燒傷和大面積深二度燒傷及程度相同的皮膚損傷，達到與自身皮膚移 植相近的修復效果；再生皮膚的韌性和機械強度與自體皮膚接近，能夠維持人 的正常外貌；由于生產(chǎn)成本低，還適用于輕度損傷或燒傷，促進修復效果，有 效降低病人痛苦；也可用于潰瘍等引起的慢性傷口修復。


圖1為本發(fā)明創(chuàng)面覆蓋物的結(jié)構(gòu)示意12圖2為實施例5中創(chuàng)面覆蓋物移植到家兔皮膚創(chuàng)傷部位6小時后的結(jié)果示
意圖3為實施例5中創(chuàng)面覆蓋物移植到家兔皮膚創(chuàng)傷部位7小時后的結(jié)果示
意圖4為實施例5中創(chuàng)面覆蓋物移植到家兔皮膚創(chuàng)傷部位14天的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖和具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。 實施例1
(1)制備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； 電紡溶液采用粘均分子量為10000的聚-DL-乳酸和分子量為400的聚乙蘭
醇的二氯甲烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分別為80%
和20%,溶劑所占質(zhì)量百分比為85%。 交if關劑溶液選用0.1M氯化4丐溶液。
含有細胞因子的水溶膠溶液采用細胞因子藻酸鹽溶液，所述細胞因子藻酸 鹽溶液中細胞因子SDF-1的質(zhì)量百分比濃度為10ppm。
將配置好的0.1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細胞培養(yǎng)i中，置于靜 電紡絲裝置及打印機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機按照現(xiàn)有 專利報道進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654^Hf的方法，固定在電 紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細胞因子定位打印。將配好的細胞因子藻 酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中。本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。 (2 )用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；
將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.6ml/h, 選用 12號針頭，施加電壓為20KV, 用裝有氯化4丐溶液的細胞培養(yǎng)皿接收噴絲。 噴絲30分鐘后，停止靜電紡絲；
(3 )用噴墨打印機將含有細胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支 架上，水溶膠固化后即得。
開啟噴墨打印機，按照設定的位置，將細胞因子藻酸鹽溶液打印在培養(yǎng)皿 的電紡層上，藻酸鹽溶液接觸電紡層上的氯化鉤溶液后迅速固化，形成藻酸鹽 水溶膠，將細胞因子包裹并固定。重復打印20遍后，關閉打印機，重新靜電紡絲30分鐘，然后再關閉靜電 紡絲，打印20遍，形成厚度約0.5mm的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物。
制得的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物是納米纖維水溶膠薄膜，將其從培養(yǎng)皿中取 出，用蒸餾水漂洗5遍，經(jīng)凍干后真空包裝，經(jīng)25kGy鈷-60滅菌后負20攝 氏度低溫保存。 實施例2
實施步驟同實施例1。
電紡溶液采用粘均分子量為10000的聚-DL-乳酸和分子量為400的聚乙二 醇的二氯甲烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分別為80% 和20%,溶劑所占質(zhì)量百分比為85%。
交耳關劑溶液選用100IU/ml凝血酶溶液；
含有細胞因子的水溶膠溶液采用細胞因子纖維蛋白原溶液，纖維蛋白原濃 度為40mg/ml，所述纖維蛋白原溶液中表皮生長因子和SDF-1因子的質(zhì)量百分 比濃度為500ppm。
具體操作是將配置好的凝血酶溶液放入直徑90mm的細胞培養(yǎng)皿中，置于 靜電紡絲裝置及打印機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機按照現(xiàn) 有專利報道進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在 電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細胞因子定位打印。將配好的細胞因子 纖維蛋白原溶液裝入噴墨打印墨盒中，本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。
將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，^i殳定注射泵推進速度為0.3ml/h，選用 16號針頭，施加電壓為15KV，用裝有凝血酶溶液的細胞培養(yǎng)亞接收噴絲。噴 絲25分鐘后，停止靜電紡絲，開啟噴墨打印機，按照設定的位置，將打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，纖維蛋白原溶液接觸電紡層上的凝血酶溶液后迅速固化， 形成水溶膠，將細胞因子包裹并固定。重復打印15遍后，關閉打印機，重新 靜電紡絲30分鐘，然后再關閉靜電紡絲，打印15遍，形成厚度約0.4mm的 納米仿生創(chuàng)面覆蓋物。
保存方法同實施例1。 實施例3
實施步驟同實施例1。
電紡溶液采用粘均分子量為50000的聚己內(nèi)脂和分子量為400的聚乙二醇的六氟異丙醇溶液；所述聚己內(nèi)脂和聚乙二醇所占的重量百分比分別為90%和 10%。所述六氟異丙醇溶液的重量百分比濃度為85%。 交耳關劑溶液選用100mg/ml水溶性石友化二亞胺溶液；
含有細胞因子的水溶膠溶液采用細胞因子的膠原與聚陰離子溶液，其中膠 原濃度為1%，聚陰離子采用聚谷氨酸，濃度50mg/ml,所述細胞因子包括細 胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、白介素IL-3 和堿性成纖維細胞生長因子，質(zhì)量百分比濃度為1%。
具體操作是將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細胞培養(yǎng)皿 中，至于靜電紡絲裝置及打印機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印 機按照現(xiàn)有專利報道進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法； 固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細胞因子定位打印。將配好的細 胞因子溶液裝入噴墨打印墨盒中，本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。
將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.6ml/h,選用 12號針頭，施加電壓為20KV, 用裝有碳化二亞胺溶液的細胞培養(yǎng)皿接收噴 絲。噴絲30分鐘后，停止靜電紡絲，開啟噴墨打印機，按照設定的位置，將 細胞因子的透明質(zhì)酸碳酸氫鈉溶液(細胞因子質(zhì)量百分比濃度0.1%)打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，透明質(zhì)酸溶液接觸電紡層上的碳化二亞胺后迅速固化，形
成透明質(zhì)酸水溶膠，將細胞因子包裹并固定。
重復打印15遍后，關閉打印機，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關閉靜電 紡絲，打印15遍，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關閉靜電紡絲，形成厚度約 0.5mm的納米仿生創(chuàng)面覆蓋物。
保存方法同實施例l。 實施例4
(1)制備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； 電紡溶液采用粘均分子量為50000的聚己內(nèi)脂和分子量為400的聚乙二酉r
的六氟異丙醇溶液；所述聚己內(nèi)脂和聚乙二醇所占的重量百分比分別為90%和
10%。所述六氟異丙醇溶液的重量百分比濃度為85%。 交耳關劑溶液選用1%石灰化二亞胺溶液；
含有細胞因子的水溶膠溶液采用透明質(zhì)酸的碳酸氫鈉溶液，透明質(zhì)酸濃度 為15mg/ml，所述細胞因子為細胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子，濃度
150.1%。
將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細胞培養(yǎng)皿中，置于靜電 紡絲裝置及打印機共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機按照現(xiàn)有專 利報道進行改裝，例如可參照美國專利US 7051654/>開的方法，固定在電紡 絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細胞因子定位打印。將配好的細胞因子溶液 裝入噴墨打印墨盒中。本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。 (2 )用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；
將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設定注射泵推進速度為0.8ml/h， 選用 20號針頭，施加電壓為25KV,用裝有碳化二亞胺溶液的細胞培養(yǎng)皿接收嘴絲: 噴絲30分鐘后，停止靜電紡絲；
(3 )用噴墨打印機將含有細胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支 架上，水溶膠固化后即得。
開啟噴墨打印機，按照設定的位置，將含細胞因子的透明質(zhì)酸溶液打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，含細胞因子的透明質(zhì)酸溶液接觸電紡層上的酰肼二亞胺溶
液后迅速固化，形成水溶膠，將細胞因子包裹并固定，形成厚度約0.01mm的 納米仿生創(chuàng)面覆蓋物。
保存方法同實施例1。 實施例5
本發(fā)明實施例1的納米材料人工皮膚，見圖1所示，圖1中顯示了在納米 仿生支架結(jié)構(gòu)中，分布不同濃度、不同類型的細胞因子，其中l(wèi)為細胞趨化因 子，2為納米纖維，3是細胞分化因子。
本實施例提供所述人工皮膚在修復家兔(菜兔)皮膚創(chuàng)傷中的應用效果 以腹部人為造成全層皮膚缺損(3 x 3 cm2 )的成年家兔作為實驗動物;漠型。 創(chuàng)傷后2小時，將實施例1制備的納米材料人工皮膚(3x3 cm2)移植到創(chuàng) 傷部位。移植進行6小時后，可見干細胞開始定向遷移進入人工皮膚；移植物 與正常皮膚組織融合良好，且與創(chuàng)面貼合緊密，見圖2,受到趨化因子作用， 干細胞遷入、貼附，同時形態(tài)發(fā)生變化，圖2中4表示干細胞遷入分化為皮膚 細胞；5表示干細胞正遷入；6表示干細胞。移植7天后鏡下可見有毛細血管 從周圍正常組織向移植物內(nèi)長入，且長入移植物基質(zhì)內(nèi)的新生毛細管數(shù)量逐漸 增多。移植的人工皮膚與其周圍正常皮膚顏色十分接近，表皮層清晰可見層次分明的基底層、棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層，并可見表層有角質(zhì)化細胞層剝離 脫落，同時可見真皮層細胞數(shù)量及細胞外基質(zhì)顯著增加，并且納米支架已開始
被吸收并被這些增殖的細胞及其所分泌的細胞外基質(zhì)所取代，參見圖3，由圖 3可見干細胞分化為皮膚細胞的同時，人工皮膚的纖維開始分解并吸收，同時 血管和神經(jīng)開始形成，圖中7表示分化為上皮細胞，8表示降解的納米纖維， 9表示尚未完全分化的細胞，10表示誘導的神經(jīng)，11表示誘導的血管。術后 14天，經(jīng)過本發(fā)明創(chuàng)面覆蓋物治療的皮膚，創(chuàng)面覆蓋物完全降解后，所達到的 皮膚修復效果見圖4，由圖4大體可見創(chuàng)面已基本愈合，修復區(qū)皮膚顏色正常, 并且無殘留的癱痕，圖中12表示腺體，13表示血管，14表示神經(jīng)。
權(quán)利要求
1. 一種納米仿生創(chuàng)面覆蓋物，包括納米仿生支架和附著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細胞因子。
2. 如權(quán)利要求1所述的創(chuàng)面覆蓋物，其特征在于所述細胞因子是對細胞 的歸巢、趨化或分化起作用的因子。
3. 如權(quán)利要求2所述的創(chuàng)面覆蓋物，其特征在于所述對細胞的歸巢、趨 化或分化起作用的因子選自細胞定向遷移因子、表皮生長因子、成纖維細胞生 長因子、白介素iL-3、血管生成素結(jié)合因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a、血小板衍生 的生長因子、胰島素生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi) 皮生長因子、結(jié)締組織生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、骨橋蛋白和/或 生長激素類因子。
4. 如權(quán)利要求1所述的創(chuàng)面覆蓋物，其特征在于所述納米仿生支架是采 用支架材料通過靜電紡絲技術制備得到，所述支架材料為聚乳酸、聚已內(nèi)酯、 聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二曱酸乙二酯、聚曱基丙烯酸曱酯、 聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳 酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚對二惡酮、丙交酯、乙 交酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、己內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、聚氨酯類、聚碳酸酯、 膠原蛋白、明膠、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、改性纖維素、明膠、 纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、海藻酸、硫酸軟骨素，肝素， 瓊脂，葡聚糖或褐藻酸的任意一種或兩種以上材料的混合物。
5. 如權(quán)利要求1所述的創(chuàng)面覆蓋物，其特征在于所述水溶膠是選自以下 聚合物制成的水溶膠淀粉、纖維素、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖、膠原、聚 L-賴氨酸、聚L-谷胺酸、聚丙烯酸、聚曱基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代 丙烯酰胺。
6. —種權(quán)利要求1所述納米仿生創(chuàng)面覆蓋物的制備方法，其特征在于包 括以下步驟(1)制備電紡溶液、含有細胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； (2 )用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架； (3 )用噴墨打印機將含有細胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支 架上，水溶膠固化后即得。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟(1 )中所述水溶膠 溶液的制備在步驟(2)和步驟(3)之間進行。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于步驟(2)和(3 )重 復若干次。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(l)中所述電紡溶液 所用的溶劑為曱酸、乙酸、乙醇、丙酮、二曱基甲酞胺、二甲基乙酞胺、四氫 呋喃、二曱基亞颯、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯曱烷、曱醇、乙 醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們的任意混合物；所述含有細胞因子的水溶膠溶液是含有干細胞定向遷移因子和干細胞分 化因子的水溶膠緩沖液；所述干細胞定向遷移因子和干細胞分化因子所占質(zhì)量 百分比總數(shù)不高于10%。
10. 如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述靜電紡 絲的參數(shù)為注射泵推進速度為0.3~0.8ml/h,用10、 12、 14、 16、 18或20號 針頭，施加電壓為15 25KV。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種納米仿生創(chuàng)面覆蓋物及其制備方法，所述納米仿生創(chuàng)面覆蓋物包括納米仿生支架和附著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細胞因子。本發(fā)明提供的所述納米仿生創(chuàng)面覆蓋物的制備方法包括制備電紡溶液和含有細胞因子的水溶膠溶液及交聯(lián)劑溶液；用靜電紡絲制得納米仿生支架；用噴墨打印機將含有細胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上等步驟，電紡和打印可以重復，以得到不同厚度的創(chuàng)面覆蓋物。本發(fā)明采用了原位自體干細胞工程技術，采用干細胞趨化因子吸引自體干細胞定向遷移進入創(chuàng)面并按設計要求進行分化，即避免了使用活細胞帶來的不便，又能達到使用與其同等或者更佳的修復效果，有廣闊的應用前景。
文檔編號A61L27/26GK101507835SQ20091003773
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者弢 徐, 袁玉宇 申請人:廣州邁普再生醫(yī)學科技有限公司