專利名稱：多肽在制備ace抑制劑及降血壓藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽VYNEGLPAP在制備抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 及降血壓中的應(yīng)用。
技術(shù)背景高血壓是一種常見的心血管疾病，發(fā)病率高、是引發(fā)心、腦、腎和血管 等各種并發(fā)癥和導(dǎo)致中風(fēng)、促進動脈粥樣硬化、冠心病的一個重要危險因 子。我國高血壓患者己超過1.6億人口，治療和預(yù)防高血壓是當(dāng)前社會十 分重要的課題。肽是一類重要的降血壓藥物，肽降血壓的作用靶點是抑制 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin - converting enzyme, ACE)的活性(文獻1: Vanessa Vermeirssen， John Van Camp， Willy Verstraete， British Journal of Nutrition 2004， 92: 357-366)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶可將不具活性的 十肽血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強烈收縮血管作用的八肽血管緊張素n，從 而使血壓升高，因此抑制ACE活性可有效控制高血壓。多肽是一類重要的 ACE抑制劑，天然蛋白質(zhì)的酶解肽是ACE抑制劑肽的主要來源(文獻2: Lieselot Vercruysse, John Van Camp， Guy Smagghe， J. Agric. Food Chem 2005， 53: 8106-8115)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶對于機體血壓和心血管功能起 著重要的調(diào)節(jié)作用，因此抑制ACE活性的藥物在心血管、心力衰竭等疾病 的治療中發(fā)揮重要作用。多肽類的ACE抑制劑在降血壓的同時不會引起常 見降壓藥物的干咳等副作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供多肽VYNEGLPAP在抑制ACE活性和降血壓中的 應(yīng)用；多肽VYNEGLPAP具有ACE抑制活性及降血壓活性，作為高血壓、 心臟病和心血管病的保健品和藥物先導(dǎo)化合物具有良好的應(yīng)用前景。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以所述多肽VYNEGLPAP為抑制ACE活性和 降血壓的有效成份。其具有序列表SEQ ID NO: 1中氨基酸序列；多肽VYNEGLPAP為 ACE抑制劑及降血壓藥物的活性成份，其中可添加藥物學(xué)上可接受的載體 或輔料。具有抑制ACE活性和降血壓活性的多肽化合物VYNEGLPAP的氨基 酸序列為Val-Tyr-Asn-Glu-Gly-Leu-Pro-Ala-Pro。單鏈線性結(jié)構(gòu)，分子量為 959.7Da，白色粉末狀，易溶于水，對ACE活性具有很強的抑制作用，1C50 為3.1亂。多肽VYNEGLPAP具備ACE抑制劑所要求的特征1. ACE傾向于C末端三肽的每個位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制劑，C末端為Try， Phe， Tyr和Pro而N端為支鏈氨基酸的肽段具有較 強的ACE抑制活性。多肽VYNEGLPAP的C末端三肽均為疏水性氨基酸分 別為Pro、 Ala和Pro, C末端為Pro， N端的Val具有支鏈，因此完全滿足 要求。2.肽的疏水性是影響其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有 較多的疏水氨基酸。多肽VYNEGLPAP的疏水氨基酸有Val， Tyr， Leu， Pro， Ala，和Pro含有較多的疏水氨基酸。經(jīng)ACE抑制活性檢測，多肽VYNEGLPAP的IC50為0.00298mg/ml， 即3.1 yM。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果本發(fā)明首次從清原馬鹿血中獲得并確定了活性化合物的結(jié)構(gòu)，化合物具有較好的抑制ACE的活性，因此作為治療高血壓等心血管疾病藥物的先導(dǎo) 化合物具有良好的潛力和應(yīng)用前景。
具體實施方式
實施例1 多肽VYNEGLPAP的制備 采用凝膠色譜和LC-MS/MS相結(jié)合的方法，以中國撫順清原馬鹿鹿血 (Cen/t/se/ap/7t/s)為原料，經(jīng)離心，丙酮沉淀，酶解蛋白及柱分離獲得 乳白色粉末，溶于水。其具體的提取分離方法如下采用柱分離技術(shù)，用溶劑淋洗，凝膠層 析柱與LC-MS/MS相結(jié)合，可按如下步驟分離提取操作以清原馬鹿鹿血 (Cen/us e/ap/ us)為原料，取10_100毫升血漿蛋白，用60—200毫升 的丙酮沉淀蛋白，棄上清，將沉淀離心，棄上清；將沉淀于40—100。C水浴， 揮發(fā)丙酮并使蛋白變性；加入等體積5 — 1000毫摩爾，PH8.0, NH4HC03 緩沖液，按1: 10—500 (質(zhì)量比)加入蛋白酶，于30—10(TC水浴，攪拌 進行酶解1一12小時；50—100。C滅酶IO—IOO分鐘；上述酶解產(chǎn)物經(jīng) SephadexG-25凝膠柱層析分離，將得到的不同組分冷凍干燥，為乳白色粉 末狀產(chǎn)品。肽序列搜庫將經(jīng)SephadexG-25凝膠柱層析后得到的組分分別用LTQ (線性離子阱四級桿)進行質(zhì)譜分析，離子源為ESI，得到的數(shù)據(jù)在 red.deer.fasta庫中進行搜庫檢索，獲得序列為 Val-Tyr-Asn-Glu-Gly-Leu-Pro-Ala-Pro的多月太。實施例2 多肽VYNEGLPAP的ACE抑制活性檢測 ACE在37° C、 PH8.3的條件下催化分解血管緊張素I的模擬底物 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)產(chǎn)生馬尿酸，該物質(zhì)在228nm處有特征 紫外吸收峰。當(dāng)加入ACE抑制物時，ACE對HHL的催化作用受到抑制， 馬尿酸的生成量會減少。通過測定加入抑制劑前后的馬尿酸紫外吸收值可 以計算出抑制活性的大小。反應(yīng)體系
緩沖液為 0.05M ， PH8.3 硼酸鹽緩沖液；底物為 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)， MW 429.47,用上述緩沖液配成 5mM; ACE (angiotensin畫converting enzyme)用上述緩沖液配成0.1U/ml。
ODA (對照組，為不存在抑制劑但存在酶時的吸光值)50 Ul緩沖液 +50ulHHL+50lU緩沖液于37° C水浴5min，然后加入50tUACE， 37° C 水浴30min，加入200 y 1， 1M的HC1終止反應(yīng)，再加入1ml乙酸乙酯萃取 產(chǎn)物馬尿酸，振蕩15S， 3500r/min離心5min，取0.8ml上清，卯° C水浴 干燥15min,重溶于0.8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為ODA。
ODB (樣品組，為存在抑制劑和酶時的吸光值)50lU樣品+50tUHHL+50 lU緩沖液于37。 C水浴5min，然后加入50ulACE， 37° C水浴30min， 加入200 u 1， 1M的HC1終止反應(yīng)，再加入lml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物馬尿酸， 振蕩15S， 3500r/min離心5min，取0.8ml上清，90。 C水浴干燥15min,重 溶于0.8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為ODB。
ODc (空白纟l，為不存在抑制劑和酶時的吸光值)50 lU緩沖液+50u lHHL+50ul緩沖液于37。 C水浴5min，然后加入50 " 1緩沖液，37° C水 浴30min，加入200ul， 1M的HC1終止反應(yīng)，再加入lml乙酸乙酯萃取產(chǎn) 物馬尿酸，振蕩15S, 3500r/mhi離心5min，取0.8ml上清，90° C水浴干 燥15min,重溶于0.8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為ODc。
ACE抑制率(％) =(ODA—ODB)/(ODA—ODc) X100%
分別用0.5mg/ml, 0.1mg/ml , O.Olmg/ml ， O.OOlmg/ml , 0.0001mg/ml的濃
度，按上述方法進行ACE抑制活性檢測。結(jié)果如下表
濃度湖制率⑧
0.593.99
0.171.92
0.0149.88
O細(xì)34.92
O細(xì)l28.59
經(jīng)IC5()計算器計算該序列的ICso為0.00298mg/ml，即3.1 u M。ACE抑制劑
SEQUENCE LISTING <110>中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 <120〉多肽在制備ACE抑制劑及降血壓藥物中的應(yīng)用 <130〉 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 9
<212〉 PRT
〈213> Cervus el即hus <220〉
<221> CONFLICT
<222〉 (1)..(9) <223〉
<400> 1
Vsl Tyr Asn Glu Gly Leu Pro Als Pro 1 權(quán)利要求
1.多肽在制備ACE抑制劑及降血壓藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述多肽為VYNEGLPAP，具有序列表SEQ ID NO1中氨基酸序列；該多肽的氨基酸序列具體為，Val-Tyr-Asn-Glu-Gly-Leu-Pro-Ala-Pro。
2. 按照權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述ACE抑制劑及降 血壓藥物是以多肽VYNEGLPAP為活性成份，其中可添加藥物學(xué)上可接受 的載體或輔料。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)活性及降血壓的一種多肽化合物VYNEGLPAP，其氨基酸序列分別為Val-Tyr-Asn-Glu-Gly-Leu-Pro-Ala-Pro。多肽VYNEGLPAP具有ACE抑制活性及降血壓活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導(dǎo)化合物具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K38/08GK101618207SQ20091001208
公開日2010年1月6日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者劉曉艷, 鄒漢法, 艷 靳 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所