一種軟骨組織工程支架及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種軟骨組織工程支架及其制備方法，屬于軟骨修復(fù)領(lǐng)域。該支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)，通過(guò)將天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)相結(jié)合，該支架不僅具備了水凝膠的可塑性、粘附性和可注射性，使其具備了天然生物支架材料本身所帶來(lái)的各種優(yōu)勢(shì)；而且，脫鈣骨基質(zhì)能夠提供膠原纖維網(wǎng)架，賦予所制備的支架更高的力學(xué)強(qiáng)度和誘導(dǎo)能力，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增殖和分化。本發(fā)明還公開(kāi)該軟骨組織工程支架的制備方法，通過(guò)將配制的天然高分子水凝膠溶液注射至脫鈣骨基質(zhì)中，使其完全滲入脫鈣骨基質(zhì)的空隙中，并在預(yù)設(shè)溫度下凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力較高的軟骨組織工程支架。該方法簡(jiǎn)單，易操作，實(shí)用性高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種軟骨組織工程支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及一種軟骨組織工程支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨組織工程是一種采用組織工程學(xué)方法構(gòu)建軟骨復(fù)合組織的技術(shù)。軟骨組織工程中三大基本要素是:種子細(xì)胞，可降解的軟骨組織工程支架以及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其中，軟骨組織工程支架在軟骨修復(fù)過(guò)程中所起的作用至關(guān)重要。軟骨組織工程支架主要用來(lái)為構(gòu)建軟骨細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的黏附、增殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境。
[0003]目前，常用的軟骨組織工程支架主要采用天然生物支架材料制備而成，例如，絲素蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白等蛋白質(zhì)類(lèi)，瓊脂糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和殼聚糖等糖類(lèi)，采用上述天然生物支架材料制備的軟骨組織工程支架不僅能夠促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成軟骨分化(即軟骨誘導(dǎo)能力)方面具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題:
[0005]現(xiàn)有技術(shù)采用上述蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)等材料制備軟骨組織工程支架，由于蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)等材料的力學(xué)強(qiáng)度較差，導(dǎo)致所制備的軟骨組織工程支架的力學(xué)強(qiáng)度較差，從而使現(xiàn)有技術(shù)軟骨組織工程支架在臨床應(yīng)用中的持久性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)軟骨組織工程支 架的力學(xué)強(qiáng)度較差的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架及其制備方法。所述技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架，所述軟骨組織工程支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)。
[0008]作為優(yōu)選，所述天然高分子水凝膠為殼聚糖水凝膠。
[0009]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程支架的制備方法，所述方法包括:
[0010]制備脫鈣骨基質(zhì)，配制天然高分子水凝膠溶液，將所述天然高分子水凝膠溶液注射至所述脫鈣骨基質(zhì)中，使所述天然高分子水凝膠溶液完全滲入所述脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到所述軟骨組織工程支架。
[0011]作為優(yōu)選，所述天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度為100~400cP。
[0012]具體地，所述預(yù)設(shè)溫度為34_38°C。
[0013]具體地，所述制備脫鈣骨基質(zhì)具體為:
[0014]將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨；
[0015]取所述修整的股骨的骨骺并清洗；
[0016]將所述骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，對(duì)所述骨塊進(jìn)行脫脂處理；
[0017]利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待所述骨塊完全脫鈣后，對(duì)所述骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到所述脫鈣骨基質(zhì)，并于4°C保存。
[0018]具體地，所述配制天然高分子水凝膠溶液具體為:
[0019]配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存；
[0020]配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存；
[0021]在冰浴環(huán)境中，將所述甘油磷酸鈉溶液滴加到所述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到所述天然高分子水凝膠溶液，室溫保存；
[0022]所述甘油磷酸鈉溶液與所述殼聚糖的乙酸溶液的質(zhì)量比為1:9。
[0023]作為優(yōu)選，所述殼聚糖的脫乙酰度大于等于95%。
[0024]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是:
[0025]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種由天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)制備得到的軟骨組織工程支架，通過(guò)將天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)相結(jié)合，一方面，該軟骨組織工程支架具備了水凝膠的可塑性、粘附性和可注射性，使其具備了天然生物支架材料本身所帶來(lái)的各種優(yōu)勢(shì)；另一方面，脫鈣骨基質(zhì)能夠提供膠原纖維網(wǎng)架，賦予所制備的軟骨組織工程支架更高的力學(xué)強(qiáng)度和誘導(dǎo)能力，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增殖和分化。
[0026]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程支架的制備方法，通過(guò)將配制的天然高分子水凝膠溶液注射至脫 鈣骨基質(zhì)中，使水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)中的空隙中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力較高的軟骨組織工程支架。該方法簡(jiǎn)單，易操作，實(shí)用性高。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0028]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的制備方法流程圖；
[0029]圖2是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的制備方法流程圖；
[0030]圖3是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的掃描電鏡圖；
[0031]圖4是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的應(yīng)力應(yīng)變特性示意圖；
[0032]圖5是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的彈性模量示意圖；
[0033]圖6是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的平衡膨脹率對(duì)比示意圖；
[0034]圖7是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的生物降解率對(duì)比示意圖；
[0035]圖8a和圖Sb是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的生物相容性對(duì)比示意圖；
[0036]圖9a、圖％、圖9c、圖9d和圖10是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的軟骨誘導(dǎo)能力對(duì)比示意圖。
[0037]其中，I天然高分子水凝膠，
[0038]2脫鈣骨基質(zhì)，
[0039]3軟骨組織工程支架?！揪唧w實(shí)施方式】
[0040]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0041]實(shí)施例1
[0042]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架3，該軟骨組織工程支架3的成分包括:天然高分子水凝膠I和脫鈣骨基質(zhì)2。
[0043]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種由天然高分子水凝膠I和脫鈣骨基質(zhì)2制備得到軟骨組織工程支架3，通過(guò)將天然高分子水凝膠I與脫鈣骨基質(zhì)2相結(jié)合，一方面，該軟骨組織工程支架3具備了水凝膠的可塑性、粘附性和可注射性，使其具備了天然生物支架材料本身所帶來(lái)的各種優(yōu)勢(shì)；另一方面，脫鈣骨基質(zhì)2能夠提供膠原纖維網(wǎng)架，賦予所制備的軟骨組織工程支架3更高的力學(xué)強(qiáng)度和誘導(dǎo)能力，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增殖和分化。
[0044]實(shí)施例2
[0045]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架3，該軟骨組織工程支架3的成分包括:天然高分子水凝膠I和脫鈣骨基質(zhì)2。
[0046]天然高分子水凝膠I具有高含水性、可塑性及可注射性，是組織工程研究的常用材料。天然高分子水凝膠I最大的優(yōu)勢(shì)是能使包裹的細(xì)胞維持圓球形的軟骨細(xì)胞表型及不發(fā)生去分化。其能設(shè)計(jì)成液體形態(tài)使其具備可注射性，能與軟骨修復(fù)細(xì)胞較好的混合，避免細(xì)胞丟失?？梢?jiàn)，天然高分子水凝膠I具備的可注射性、高粘附性，使其能夠廣泛應(yīng)用在微創(chuàng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。此外，由于水凝膠可在水中溶脹并保持大量水分而又不溶解，使得其與充盈有大量水性液體的機(jī)體組織 及其相似，而且水凝膠柔軟，潤(rùn)濕的表面能夠與組織親和，極大減少了其對(duì)周?chē)鷻C(jī)體組織的刺激性，從而使其具有了良好的生物相容性。
[0047]脫鈣骨基質(zhì)2是一種天然固態(tài)生物材料，不僅具備一定的力學(xué)強(qiáng)度，而且生物相容性高。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)脫鈣骨內(nèi)含有的生物因子，能在不同的環(huán)境下誘導(dǎo)出相應(yīng)的再生組織，這些特性使其在骨骼運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)修復(fù)上有一定優(yōu)勢(shì)。通過(guò)嚴(yán)格的脫鈣及脫細(xì)胞制備過(guò)程，脫鈣骨基質(zhì)2的主要成分僅由一種膠原纖維網(wǎng)架構(gòu)成，不具有生物毒性及免疫源性，同時(shí)能夠促使各種組織細(xì)胞的粘附、增殖、分化等。雖然脫鈣骨基質(zhì)2擁有較大的孔隙，約300~600um之間，容易造成細(xì)胞的逸漏，不利于與體內(nèi)組織的粘附整合，但本發(fā)明實(shí)施例通過(guò)將一定粘度的天然高分子水凝膠I溶液注入該脫鈣骨基質(zhì)2中的孔隙內(nèi)，使脫鈣骨基質(zhì)2的孔隙內(nèi)完全充滿(mǎn)水凝膠成分，有效避免細(xì)胞的遺漏，而且通過(guò)兩者結(jié)合所制備的軟骨組織工程支架3能夠與周邊組織緊密粘附，從而促使軟骨組織與周邊組織形成整體化修復(fù)。
[0048]作為優(yōu)選，該天然高分子水凝膠I為殼聚糖水凝膠。
[0049]殼聚糖是一種來(lái)源廣泛，廉價(jià)易得，且具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性的用于制備水凝膠的理想材料。殼聚糖具有溫敏性，其在室溫或低于室溫時(shí)可保持液態(tài)較長(zhǎng)時(shí)間，而溫度升高到生理體溫(37°C )后則發(fā)生凝膠化，生成水凝膠。基于此，本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選殼聚糖水凝膠。本發(fā)明實(shí)施例通過(guò)將天然的殼聚糖水凝膠與天然固態(tài)支架結(jié)合，利用殼聚糖的溫敏性，使殼聚糖溶液發(fā)生凝膠化生成殼聚糖水凝膠，制備成一種軟骨組織工程固膠雙相支架。這種固膠雙相支架不僅能保留水凝膠的可注射性、高含水性、粘附性、可塑性，還能利用脫鈣骨提供的膠原纖維網(wǎng)架，賦予支架更高的力學(xué)強(qiáng)度，避免了單純?cè)黾铀z交聯(lián)密度而出現(xiàn)的骨分化或軟骨肥大，最終能夠誘導(dǎo)出適宜的成軟骨分化。
[0050]可以理解的是，該天然高分子水凝膠I還可選自明膠、膠原、纖維蛋白、透明質(zhì)酸鹽、海藻酸鹽和瓊脂糖中的任意一種。
[0051]實(shí)施例3
[0052]如附圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架3的制備方法，該方法包括:
[0053]步驟101:制備脫鈣骨基質(zhì)2。
[0054]步驟102:配制天然高分子水凝膠溶液。
[0055]步驟103將天然高分子水凝膠溶液注射至脫鈣骨基質(zhì)2中，使該天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)2中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到軟骨組織工程支架3。
[0056]其中，上述使該天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)2中指的是天然高分子水凝膠溶液完全充滿(mǎn)脫鈣骨基質(zhì)2中任何空隙的一種理想狀態(tài)。
[0057]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程支架3的制備方法，通過(guò)將配制的天然高分子水凝膠溶液注射至脫鈣骨基質(zhì)2中，使天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)2中的空隙中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力較高的軟骨組織工程支架3。該方法簡(jiǎn)單，易操作，實(shí)用性高。
[0058]實(shí)施例4
[0059]如附圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架3的制備方法，該方法包括:
[0060]步驟201:制備脫鈣骨基質(zhì)2:
[0061]將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨；
[0062]取修整的股骨的骨骺并清洗；
[0063]將骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，并對(duì)骨塊進(jìn)行脫脂處理；
[0064]利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待骨塊完全脫鈣后，對(duì)骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到脫鈣骨基質(zhì)2，并于4°C保存。
[0065]步驟202:配制天然高分子水凝膠溶液:
[0066]配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存；
[0067]配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存；
[0068]在冰浴環(huán)境中，將質(zhì)量份分別為I等份的甘油磷酸鈉溶液滴加到9等份的殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，室溫保存。
[0069]其中，還可選用其他弱酸溶液來(lái)溶解殼聚糖，例如，草酸、碳酸等。
[0070]作為優(yōu)選，該天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度為100~400cP。
[0071]為了保證天然高分子水凝膠溶液兼具較好的可注射性和粘附性，本發(fā)明實(shí)施例將該天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度控制為100~400cP。
[0072]作為優(yōu)選，該殼聚糖的脫乙酰度大于等于95%。
[0073]為了保證殼聚糖能夠容易地在乙酸溶液中溶解，且保持其高分子量、高粘度的特性，從而保證所制備的軟骨組織工程支架3具有結(jié)構(gòu)形態(tài)完好均一，本發(fā)明實(shí)施例將殼聚糖的脫乙酰度控制在大于等于95%，例如96%、98%等。[0074]步驟203:將該天然高分子水凝膠溶液注射至脫鈣骨基質(zhì)2中，使天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)2中，并在34-38°C下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到軟骨組織工程支架3。
[0075]其中，上述使天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)2中指的是天然高分子水凝膠溶液完全充滿(mǎn)脫鈣骨基質(zhì)2中任何空隙的一種理想狀態(tài)。
[0076]實(shí)施例5
[0077]制備脫鈣骨基質(zhì)2:
[0078]I)將股骨上附著的肌肉、筋膜、脂肪等軟組織剔去，僅保留骨性成分。
[0079]2)將修整的股骨進(jìn)行切割，選取骨骺端，利用生理鹽水沖洗殘留的骨髓3次。[0080]3)將沖洗后的骨骺切割成4X4X2cm3大小的骨塊，懸浸于脫脂液(甲醇:氯仿=1:1)內(nèi)，進(jìn)行脫脂處理48小時(shí)。
[0081]4)脫鈣液配制:用去離子水配制0.5M乙二胺四乙酸脫鈣液，控制其PH=8.3，脫鈣液保存及脫鈣過(guò)程均在4°C下用塑料容器盛載(避免玻璃容器)。
[0082]5)生理鹽水沖洗脫脂后骨塊，浸泡于乙二胺四乙酸脫鈣液中，脫鈣液每日更換。
[0083]6)脫鈣完全度檢測(cè):每日換下的脫鈣液用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)鈣離子濃度以監(jiān)測(cè)脫鈣進(jìn)程，當(dāng)脫鈣液中的鈣(Ca)螯合物濃度〈0.5g/L，即為完全脫鈣，脫鈣后的標(biāo)本進(jìn)行X線(xiàn)和CT檢測(cè)，證明完全脫鈣。
[0084]制備天然高分子水凝膠溶液:
[0085]I)殼聚糖的乙酸溶液配制:用去離子水配制0.1M乙酸溶液，將2.5g殼聚糖顆粒加到100mL乙酸溶液內(nèi)，磁力攪拌48小時(shí)至完全溶解，高壓滅菌后分裝4°C保存。
[0086]2)甘油磷酸鈉溶液配制:去離子水配制60%甘油磷酸鈉溶液，0.22um過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0087]3)冰浴攪拌下，將質(zhì)量份分別為I等份的甘油磷酸鈉溶液緩慢滴加進(jìn)9等份的殼聚糖的乙酸溶液內(nèi)，攪拌至澄清，得到天然高分子水凝膠溶液，室溫保存。
[0088]制備軟骨組織工程支架:
[0089]使用20ml注射器抽取上述配制好的天然高分子水凝膠溶液，并將其注射至上述制備好的脫鈣骨基質(zhì)2上，使該天然高分子水凝膠溶液完全滲透進(jìn)脫鈣骨基質(zhì)2的孔隙內(nèi)，然后在37°C或體溫下使該天然高分子水凝膠溶液在脫鈣骨基質(zhì)2中發(fā)生凝膠化反應(yīng)，使溶液轉(zhuǎn)變成天然高分子水凝膠，制備得到軟骨組織工程支架3。
[0090]通過(guò)掃描電鏡分別對(duì)比觀察天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和所制備的軟骨組織工程支架3的結(jié)構(gòu)，如附圖3所示，軟骨組織工程支架3有效并充分地將上述兩者進(jìn)行了結(jié)合，形成一體結(jié)構(gòu)。該軟骨組織工程支架3不僅保留了天然高分子水凝膠I的有利的微觀結(jié)構(gòu)，即30~70um的微孔，且利用了脫鈣骨基質(zhì)2的300~600um的膠原蛋白網(wǎng)架，使該軟骨組織工程支架3有效保留大量細(xì)胞。
[0091]分別對(duì)天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3的應(yīng)力承受能力進(jìn)行測(cè)試，如附圖4所示，本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3表現(xiàn)出最佳的應(yīng)力承受能力?？梢?jiàn)，本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3有效解決了現(xiàn)有技術(shù)組織工程支架力學(xué)強(qiáng)度低的缺陷，不僅具備了較高的力學(xué)強(qiáng)度，且具備天然高分子材料在生物組織工程應(yīng)用中的各種優(yōu)勢(shì)，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)用性。[0092]分別對(duì)天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3的彈性模量進(jìn)行測(cè)試，如附圖5所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架3表現(xiàn)出最高的彈性模量，具有更高的抵抗形變的能力，進(jìn)一步增加了本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3在軟骨組織工程修復(fù)領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)。
[0093]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程支架3的理化特性進(jìn)行檢測(cè):
[0094]平衡膨脹率(ESR, Equilibrium swelling ratio)的測(cè)定:將上述天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3分別進(jìn)行24小時(shí)冷凍干燥處理，并測(cè)其重量(Wd)，然后放進(jìn)磷酸鹽緩沖液內(nèi)，在37°C下進(jìn)行孵育。在不同時(shí)間點(diǎn)，取出上述天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3，用濾紙清除上述各材料的表面水分后，立即用微量天平進(jìn)行稱(chēng)重(Ws)。根據(jù)公式ESR=(Ws-Wd)/Wd計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平衡膨脹率。如附圖6所示，相比天然高分子水凝膠1，軟骨組織工程支架3在磷酸鹽緩沖液內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)明顯膨脹，該軟骨組織工程支架3的形狀及力學(xué)性質(zhì)能夠得到有效保護(hù)。
[0095]生物降解測(cè)定:將天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3分別在37°C下進(jìn)行24小時(shí)的磷酸鹽緩沖液孵育，使天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3在磷酸鹽緩沖液內(nèi)達(dá)到平衡后，分別測(cè)其重量(W0)。然后再放回37°C的磷酸鹽緩沖液內(nèi)進(jìn)行降解，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3，測(cè)量上述各材料的剩余質(zhì)量(Wt)，利用公式:降解率=100%X (WO-Wt)/WO來(lái)計(jì)算上述各材料的生物降解率。如附圖7所示，相對(duì)于脫鈣骨基質(zhì)2，軟骨組織工程支架3具有與天然高分子水凝膠I相當(dāng)?shù)纳锝到庑?，利于?nèi)部細(xì)胞增殖與分化。
[0096]實(shí)施例6
[0097]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)上述制備的天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和期望的軟骨組織工程支架3的細(xì)胞相容性進(jìn)行了檢測(cè)，具體過(guò)程如下:
[0098]1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的原代培養(yǎng)及傳代:商品化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Pl代(RASMX-01001，廣州賽業(yè))，復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的MEM-α培養(yǎng)基(minimum essential medium), 2~3天換一次液，并傳一代，傳至P4代進(jìn)行支架細(xì)胞相容性檢測(cè)。
[0099]2)P4代大鼠BMSC，胰酶消化，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，離心，用預(yù)先配制的殼聚糖溶液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度控制在3 X 106/ml。
[0100]3)分別將天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和期望的軟骨組織工程支架3轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，37°C孵育15分鐘。
[0101]4)在6孔板內(nèi)添加含10%胎牛血清的MEM- α培養(yǎng)基于37 °C孵箱培養(yǎng)。
[0102]5)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集上述天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3，進(jìn)行細(xì)胞相容性檢測(cè):live/dead染色檢測(cè)細(xì)胞保留量及存活度；免疫熒光觀察細(xì)胞骨架形態(tài)。
[0103] 如附圖8a所示，通過(guò)live/dead檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上述天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3均能支持BMSC存活，但軟骨組織工程支架3能保留更多的BMSC，且BMSC的空間分布更均勻。(其中，電鏡圖上的白點(diǎn)均表示存活的BMSC)。如附圖8b所示，通過(guò)免疫熒光觀察細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)現(xiàn)，軟骨組織工程支架3內(nèi)的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，且具有聚集現(xiàn)象，有利于成軟骨分化的發(fā)生及表型維系(其中，電鏡圖上的白色區(qū)域均表示細(xì)胞骨架的形態(tài))。
[0104]實(shí)施例7
[0105]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)上述制備的天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和期望的軟骨組織工程支架3的軟骨誘導(dǎo)能力進(jìn)行了檢測(cè)，具體過(guò)程如下:
[0106]DBMSC原代培養(yǎng)及傳代:商品化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Pl代(RASMX-01001，廣州賽業(yè))，復(fù)蘇后加入含10%FBS的MEM- α培養(yǎng)基，2~3天換一次液，并傳一代，傳至Ρ4代進(jìn)行軟骨分化能力檢測(cè)。
[0107]2)Ρ4代大鼠BMSC，胰酶消化，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，離心，用預(yù)先配制的殼聚糖溶液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度控制在I X 107/ml。
[0108]3)分別將天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和期望的軟骨組織工程支架3轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，37°C孵育15分鐘。
[0109]4)將商品化軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RASMX-90041，廣州賽業(yè))添加到上述各6孔板內(nèi)，37°C孵箱培養(yǎng)，2~3天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液。
[0110]5)在不同培養(yǎng)時(shí)間，收集天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2和軟骨組織工程支架3，進(jìn)行細(xì)胞增 殖及軟骨分化檢測(cè)，包括CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)測(cè)定，RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction,實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng))測(cè)定，GAG(Glycosaminoycan,軟骨糖胺多糖)測(cè)定，以及免疫突光檢測(cè)一型膠原(collagenl,C0L1)及二型膠原(collagen2，C0L2)。
[0111]如附圖9a和9b所示，體外培養(yǎng)BMSC—段時(shí)間后，本發(fā)明期望的軟骨組織工程支架3內(nèi)的細(xì)胞增殖更明顯；如附圖9c所示，本發(fā)明期望的軟骨組織工程支架3產(chǎn)生了更多的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì):軟骨糖胺多糖；如附圖9d所示，在基因水平上，本發(fā)明期望的軟骨組織工程支架3也表現(xiàn)出顯著的軟骨分化。
[0112]如附圖10所示(電鏡圖上的灰白色區(qū)域均表示二型膠原蛋白)，相比天然高分子水凝膠1、脫鈣骨基質(zhì)2，本發(fā)明期望的軟骨組織工程支架3更能促進(jìn)二型膠原蛋白的分泌，可見(jiàn)，本發(fā)明期望的軟骨組織工程支架3能更有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)軟骨分化的發(fā)生，有利于軟骨基質(zhì)的生成，最終促進(jìn)BMSC的成軟骨分化，對(duì)于軟骨組織的修復(fù)具有重要的意義。
[0113]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種軟骨組織工程支架，其特征在于，所述軟骨組織工程支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟骨組織工程支架，其特征在于，所述天然高分子水凝膠為殼聚糖水凝膠。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述方法包括: 制備脫鈣骨基質(zhì)，配制天然高分子水凝膠溶液，將所述天然高分子水凝膠溶液注射至所述脫鈣骨基質(zhì)中，使所述天然高分子水凝膠溶液完全滲入所述脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到所述軟骨組織工程支架。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度為100~400cP。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)溫度為 34-38 °C。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述制備脫鈣骨基質(zhì)具體為: 將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨； 取所述修整的股骨的骨骺并清洗； 將所述骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，對(duì)所述骨塊進(jìn)行脫脂處理； 利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待所述骨塊完全脫鈣后，對(duì)所述骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到所述脫鈣骨基質(zhì)，并于4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述配制天然高分子水凝膠溶液具體為: 配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存； 配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存； 在冰浴環(huán)境中，將所述甘油磷酸鈉溶液滴加到所述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到所述天然高分子水凝膠溶液，室溫保存； 所述甘油磷酸鈉溶液與所述殼聚糖的乙酸溶液的質(zhì)量比為1:9。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的軟骨組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖的脫乙酰度大于等于95%。
【文檔編號(hào)】A61L27/56GK103877615SQ201410101227
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】敖英芳, 黃洪杰, 張辛, 胡曉青, 滿(mǎn)振濤, 周春燕 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院