專利名稱：：通過抑制Gpr12治療認(rèn)知障礙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過抑制Gprl2基因或者基因產(chǎn)物治療認(rèn)知障礙的方法。
背景技術(shù)：
：許多生物體包括人具有對過去事件記憶的屬性。對這個(gè)屬性已經(jīng)進(jìn)行幾十年的研究，目前可以利用更多的信息解釋其許多其支派。例如，已經(jīng)鑒別了兩種基本類型的記憶轉(zhuǎn)錄非依賴性記憶，其包括短期記憶；以及轉(zhuǎn)錄依賴性記憶，其包括長期記憶。Gpr12是一種孤兒(orphan)GPCR。通過原位雜交分析Gprl2表達(dá)表明Gprl2在小鼠CNS中廣泛表達(dá)，在海馬和丘腦中具有最高水平的表達(dá)(Ignatovetal.2003,J.Neurosci.23=907-914)。Gprl2的內(nèi)源配體還未知。Gprl2的種系發(fā)生分析表明孤兒受體Gpr3和Gpr6與Gprl2同源性最近。包含三個(gè)孤兒GPCR的亞組與GPCR的Mcr(黑皮質(zhì)素樣肽)和Edg(內(nèi)皮分化)家族最密切相關(guān)。這表明脂質(zhì)或肽可能是Gprl2的配體。鞘氨醇基磷酸膽堿(SPC)在異源表達(dá)系統(tǒng)中激活Gprl2。SPC促進(jìn)培養(yǎng)的胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元分化和成熟(出處同上)。然而，Gpr12的內(nèi)源配體及其在成人CNS的體內(nèi)功能還未知。先前結(jié)果示出Gprl2通過Gai依賴性機(jī)制發(fā)出信號(hào)(出處同上)。在哺乳動(dòng)物腦中cAMP/PKA途徑調(diào)節(jié)CREB活性和長期記憶(Abeletal.，1997，Cell88:615_626)、(Bourtchouladzeetal,1998.LearnMem.5365-374)>(Baradetal.,1998.Proc.Natl.Acad.SciUSA9515020-15025)、(Bourtchouladzeetat.,2003,Proc.NatlAcad.SdUSA10010518-10522)。發(fā)明概述已經(jīng)揭示g_偶聯(lián)蛋白受體Gprl2在介導(dǎo)哺乳動(dòng)物記憶形成的細(xì)胞事件中起重要作用。如本文所述，海馬內(nèi)Gprl2介導(dǎo)的mRNA運(yùn)輸在哺乳動(dòng)物情景長期記憶形成中是重要的。已經(jīng)揭示海馬Gprl2功能的破壞或抑制增強(qiáng)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄依賴性記憶形成(如長期記憶形成)。本申請涉及例如通過抑制Gprl2基因或基因產(chǎn)物治療長期記憶缺陷或者認(rèn)知障礙的方法。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物認(rèn)知功能的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物施用有效量的調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gprl2活性的藥劑。在另一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是成年哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中所述哺乳動(dòng)物是人。在另一實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致長期記憶形成調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施方案中長期記憶形成被增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測長期記憶形成中的調(diào)節(jié)作用。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)作用的檢測是檢測對海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)作用的檢測是檢測對杏仁核依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)作用的檢測是檢測對海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)和杏仁核依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。在特定實(shí)施方案中，對Gprl2活性的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gprl2蛋白表達(dá)。在另外的實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致認(rèn)知功能增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在足以導(dǎo)致執(zhí)行特定認(rèn)知任務(wù)的能力改善的條件下訓(xùn)練所述哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中，相對于在不施用條件下單獨(dú)訓(xùn)練達(dá)到的執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)的能力得到了能力改善。在另一實(shí)施方案中，所述訓(xùn)練包含多個(gè)訓(xùn)練期。在另一實(shí)施方案中，所述訓(xùn)練包含有間隔的訓(xùn)練期。在另一實(shí)施方案中，所述藥劑在每個(gè)訓(xùn)練期之前和/或期間施用。在另一實(shí)施方案中，所述藥劑包含一或多種有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物學(xué)活性Gprl2反義片段和/或有效量的特異于Gprl2蛋白的抗體。本發(fā)明的另一方法包括如下步驟(a)將感興趣的藥劑導(dǎo)入表達(dá)Gprl2蛋白的宿主細(xì)胞中；和(b)確定Gprl2功能，其中在(b)中確定的Gprl2功能與未施用所述藥劑的(a)宿主細(xì)胞中Gprl2功能相比的差異確定所述藥劑能調(diào)節(jié)Gprl2功能。本發(fā)明的另一方法包括如下步驟(a)給哺乳動(dòng)物施用調(diào)節(jié)Gprl2功能的藥劑；(b)在足以在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生長期記憶形成的條件下訓(xùn)練步驟(a)的哺乳動(dòng)物和相同物種的未施用所述藥劑的對照哺乳動(dòng)物；(c)評估在步驟(b)中訓(xùn)練的哺乳動(dòng)物中的長期記憶形成情況；和(d)對比在步驟(c)中評估的哺乳動(dòng)物中長期記憶形成情況，其中在施用所述藥劑的哺乳動(dòng)物中評估的長期記憶形成相對于在對照哺乳動(dòng)物中評估的長期記憶形成的差異確定所述藥劑能調(diào)節(jié)長期記憶形成。在一特定實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是成年哺乳動(dòng)物。在另一特定實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在另一實(shí)施方案中，所述長期記憶形成是海馬依賴性長期記憶形成。在另一實(shí)施方案中，所述長期記憶形成是杏仁核依賴性長期記憶形成。在另一實(shí)施方案中，所述長期記憶形成是海馬依賴性和杏仁核依賴性記憶形成。在另一實(shí)施方案中，對Gpr12活性的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gprl2蛋白表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述訓(xùn)練包含多個(gè)訓(xùn)練期。在另一實(shí)施方案中，所述訓(xùn)練包含有間隔的訓(xùn)練期。在又一實(shí)施方案中，所述藥劑在每個(gè)訓(xùn)練期之前和/或期間施用。在另一實(shí)施方案中，所述藥劑包含一或多種有效量的Gpr12siRNA分子、有效量的生物學(xué)活性Gprl2反義片段和/或有效量的特異于Gprl2蛋白的抗體。參考下文詳細(xì)描述和附圖可以更加明了本發(fā)明的這些及其它方面。應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明基本精神和范圍的前提下可以對本文揭示的特定實(shí)施方案進(jìn)行各種改變、更改和替代。此外，應(yīng)進(jìn)一步理解附圖只是舉例及以圖示表述本發(fā)明舉例的實(shí)施方案，其它未舉例的實(shí)施方案也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。附圖簡述圖Ia是示出實(shí)驗(yàn)數(shù)目對情景記憶形成的作用的柱狀圖。用增多數(shù)目的成對CS-US訓(xùn)練小鼠，4天后評估情景記憶。圖Ib是示出痕跡間隔對于時(shí)間記憶形成的作用的柱狀圖。使用與延遲條件反射(delayconditioning)相比逐漸增加的長痕跡間隔和音調(diào)(tone)記憶在痕跡恐懼條件反射中訓(xùn)練小鼠。圖2a是通過實(shí)時(shí)PCR測量的小鼠CNS中Gprl2mRNA表達(dá)水平表。圖2b是通過實(shí)時(shí)PCR測量的小鼠CNS中Gprl2mRNA表達(dá)水平表。圖3是Neuro2A細(xì)胞中在siRNA處理后24小時(shí)的Gprl2mRNA水平的柱狀圖。圖4a是小鼠海馬中Gprl2siRNA對情景記憶的作用的柱狀圖。圖4b是小鼠杏仁核中Gprl2siRNA對情景記憶的作用的柱狀圖。圖5是小鼠海馬中Gprl2siRNA對痕跡恐懼記憶的作用的柱狀圖。圖6是被灌注海馬中非靶向SiRNA(A)與Gprl2siRNA(B)的Nissl染色圖。圖中示出插管插入部位背側(cè)和腹側(cè)的海馬切片。圖7是在Gprl2siRNA處理后2天和3天的海馬Gprl2mRNA水平的柱狀圖。圖8a示出Gprl2-/-、Gpr12+/"小鼠和WT對照同窩出生小鼠中Gprl2、Crebl和GrinlmRNA水平的qPCR分析。在Gprl2+/_小鼠中Gprl2mRNA降低至對照的51%，在純合KO小鼠中不可檢測到。相反，Crebl和GrinlmRNA不受影響。圖8b示出對Gprl2+/_和WT海馬形態(tài)學(xué)(Cresylviolet染色)的大體分析。在Gpr+小鼠中觀測到無顯著異常。圖9a示出Gpr12+/-小鼠(η=9)和WT對照(η=8)在開放場所的一般運(yùn)動(dòng)和試探性活動(dòng)以及特定水平活動(dòng)(走動(dòng))。圖9b示出Gpr12+/-小鼠(η=9)和WT對照(η=8)在開放場所的一般運(yùn)動(dòng)和試探性活動(dòng)以及特定垂直活動(dòng)(用后腿站起)。圖10示出WT小鼠(η=19)中作為目標(biāo)識(shí)別記憶的長期保持的NOR記憶依賴于訓(xùn)練時(shí)間。圖Ila示出在Gpr12+/"小鼠(η=15)和WT對照(η=165)中NOR記憶的24小時(shí)保持。圖lib示出在Gprl2+/_小鼠和WT對照中檢測期間的檢測時(shí)間。圖12a示出在Gpr12+/-小鼠(η=6)和WT對照(η=8)中NOR記憶的3小時(shí)保持。圖12b示出在檢測期間的檢測時(shí)間。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即抑制Gprl2可促進(jìn)長期記憶形成。轉(zhuǎn)錄非依賴性記憶包括各種“記憶階段(memoryphase)”，如短期記憶、中期記憶和(在飛蠅中)抗麻醉記憶(anesthesia-resistantmemory)。這些形式的共同之處是RNA轉(zhuǎn)錄的藥理學(xué)抑制劑不破壞這些記憶。轉(zhuǎn)錄依賴性記憶通常稱作長期記憶且RNA合成的抑制劑阻斷其顯現(xiàn)。這種特定的實(shí)驗(yàn)性經(jīng)歷的記憶形成可以兩種一般形式存在轉(zhuǎn)錄非依賴性形式和轉(zhuǎn)錄依賴性形式。前者包括各種“記憶階段”，如短期記憶和中期記憶。這些形式的共同之處是RNA轉(zhuǎn)錄的藥理學(xué)抑制劑不破壞這些記憶。后一形式通常被稱作長期記憶且RNA合成的抑制劑阻斷其顯現(xiàn)。本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)g-偶聯(lián)蛋白受體Gprl2在介導(dǎo)哺乳動(dòng)物記憶形成的分子事件中起重要作用。如本文所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)Gprl2-介導(dǎo)的mRNA運(yùn)輸在哺乳動(dòng)物情景長期記憶形成中是重要的。本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海馬Gprl2功能的破壞或抑制增強(qiáng)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄依賴性記憶形成(如長期記憶形成)。本發(fā)明涉及通過抑制Gprl2基因或基因產(chǎn)物治療長期記憶缺陷或者認(rèn)知障礙的方法。除非另外定義，本文所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到有許多方法和材料與本文所述那些方法和材料相似及相當(dāng)，其可用于實(shí)踐本發(fā)明。事實(shí)上，本發(fā)明非限于本文所述方法和材料。針對本發(fā)明，定義了如下術(shù)語。定義如本文所用，術(shù)語“動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物以及其它動(dòng)物，脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物(例如鳥類、魚類、爬行類、昆蟲(例如果蠅)、海螺)。如本文所用，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”是指任何脊椎動(dòng)物，包括單孔類、有袋動(dòng)物和有胎盤動(dòng)物，其為其幼仔哺乳以及分娩出活的幼仔(真哺乳亞綱(eutharian)或者有胎盤哺乳動(dòng)物)或者是卵生動(dòng)物(后獸亞綱(metatharian)或者非胎盤哺乳動(dòng)物)。哺乳動(dòng)物的例子包括人和其它靈長類動(dòng)物(例如猴子、黑猩猩)、嚙齒類動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反芻動(dòng)物(例如牛、豬、馬)。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物是人。如本文所用，“對照動(dòng)物”或者“正常動(dòng)物”是與在一定條件下訓(xùn)練的動(dòng)物相同物種及其它方面相當(dāng)(例如相似年齡、性別)的動(dòng)物，所述條件是足以在所述動(dòng)物中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄依賴性記憶形成的條件。"Gprl2功能”是指Gprl2的生物學(xué)活性。生物學(xué)活性是指生物學(xué)功能或作用。術(shù)語“Gprl2抑制劑或者GRP12抑制劑化合物或制劑”是指這樣的化合物，其能作為Gprl2多肽的拮抗劑且能直接或間接抑制Gprl2多肽的功能。這種化合物包括特異于Gpr12基因的干擾RNA(siRNA)、特異于Gpr12基因的反義核苷酸、特異于Gpr12蛋白的抗體以及小分子，包括肽。小鼠和人的Gprl2基因和蛋白質(zhì)序列在表1中示出。表1“GRP12基因和蛋白質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在各個(gè)物種中，長期記憶(LTM)由兩個(gè)主要生物學(xué)性質(zhì)定義。首先，長期記憶的形成需要新蛋白質(zhì)合成。其次，其包含CAMP一應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄且由CAMP一應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)家族轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。“認(rèn)知障礙、缺陷或病癥”包括年齡相關(guān)記憶缺陷，神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓病(舞蹈病)、其它老年性癡呆)，精神疾病(例如抑郁癥、精神分裂癥、孤獨(dú)癥、注意力不足癥)，創(chuàng)傷依賴性功能喪失(例如腦血管疾病(例如卒中、缺血)、腦腫瘤、頭或腦損傷)，遺傳缺陷(例如魯賓斯坦-泰比綜合征、唐氏綜合征、Angelimn綜合征、神經(jīng)纖維瘤、Coffin-Lowry綜合征、Rett綜合征、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、脆性X染色體綜合癥(例如脆性X-I染色體綜合癥、脆性X-2染色體綜合癥)、William's綜合征)以及學(xué)習(xí)障礙。本領(lǐng)域已知且可易于獲得正規(guī)的認(rèn)知訓(xùn)練方案。見例如Kami，A.mdSagi，D.，“Wherepracticemakesperfectintextdiscrimination:evidenceforprimaryvisualcortexplasticity“,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,884966-4970(1991)；Kami,A.andSagi,D.，“Thetimecourseoflearningavisualskill"，Nature,365250-252(1993)；Kramer，A.F.etat，“Taskcoordinationandaging-explorationsofexecutivecontrolprocessesinthetaskswitchingparadigm“，ActaPsychol.(Amsf)，101:339_378(1999)；Kramer，A.F.etal.，“TrainingforexecutivecontrolTaskcoordinationstrategiesandaging“，InAgingandSkilledPerformanceAdvancesInTheoryandApplications，W.Rogersetal，eds.(Hillsdale，NJ.Erlbaum)(1999)；Rider，R.A.andAbdulahad，D.T.，“Effectsofmassedversusdistributedpracticeongrossandfinemotorproficiencyofeducablementallyhandicappedadolescents“,Percept.Mot.Skills,73219-224(1991)；Willis,S.L.andSchaie,K.W.,“Trainingtheelderlyontheabilityfactorsofspatialorientationandinductivereasoning"，Psychol·Aging，1:239_247(1986)；Willis,S.L.andNesselroade,C.S.，“Long-termeffectsoffluidabilitytraininginold-oldage“,Develop.Psychol,26905-910(1990)；Wek,S.R.andHusak,W.S..“Distributedandmassedpracticeeffectsonmotorperformanceandlearningofautisticchildren”，Percept.Mot.Skills,68107-113(1989)Verhaehen，P.etal.，“Improvingmemoryperformanceintheagedthroughmnemonictraining:ameta-analyticstudy“，Psychol.Aging,7242~251(1992)；Verhaeghen，P.andSalthouse.Τ.A.,“Meta-analysesofage-cognitionreIationsinadulthood-estimatesoflinearandnonlinearageeffectsandstructuralmodels“.PsycholBull，122:231_249(1997);Dean，C.M.etai，“Task-relatedcircuittrainingimprovesperformanceoflocomotortasksinchronicstroke:arandomized,controlledpilottrial"，Arch.Phys.Med,Rehabi1.,81409-417(2000)；Greener,J.etai,“Speechandlanguagetherapyforaphasiafollowingstroke“，CochraneDatabaseSyst.Rev.，CD000425(2000)；Hummelsheim，H.andEickhof，C，“Repetitivesensorimotortrainingforarmandhandinapatientwithlocked-insyndrome“，Scand.J.Rehabil.Med.,31250~256(1999)；Johansson,B.B.，〃Brainplasticityandstrokerehabilitation.TheWillislecture〃，Stroke,31223-230(2000)；KoKo,C,“Effectivenessofrehabilitationformultiplesclerosis”,Clin.Rehabi1.,13(Suppl.1):33_41(1999)；Lange.G.etai，“Organizationalstrategyinfluenceonvisualmemoryperformanceafterstroke:cortical/subcorticalandleft/righthemispherecontrasts“,Arch.Phys.Med.Rehabi1.，8189~94(2000)；Liepert，J.etal，“Treatment-inducedcorticalreorganizationafterstrokeinhumans〃，Stroke,31:1210-1216(2000)；Lotery,A.J.etai,“Correctablevisualimpairmentinstrokerehabilitationpatiems“，AgeAgeing,29221-222(2000)；Majid,Μ.J.etal,“Cognitiverehabilitationformemorydeficitsfollowingstroke“(Cochranereview),CochraneDatabaseSyst.Rev.,CD002293(2000)；Merzenich,M.etal,“Corticalplasticityunderlyingperceptual，motor，andcognitiveskilldevelopment!implicationsforneurorehabilitation”，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol,611-8(1996)；Merzenich,M.M.etal,“Temporalprocessingdeficitsoflanguage-learningimpairedchildrenamelioratedbytraining"，Science，271:77_81(1996)；Murphy,Ε.,“Strokerehabilitation“，J.R.Coll.PhysiciansLond·，33:466_468(1999)；Nagarajan，S.S.etal，“Speechmodificationsalgorithmsusedfortraininglanguagelearning-impairedchildren"，IEEETrans.Rehabil.Eng.,6:257-268.(1998)；Oddone,Ε.etai,“QualityEnhancementResearchInitiativeinstroke-prevention，treatment,andrehabi1itation“，Med.Care38192-1104(2000)；Rice-Oxley,M.andTurner-Stokes,L.,〃Effectivenessofbraininjuryrehabilitation〃，Clin.Rehabil.,13(Suppl1):7_24(1999)；Tallal，P.etal,〃Languagelearningimpairments!integratingbasicscience，technology,andremediation"，Exp.BrainRes·，123:210_219(1998)；Tallal,P.etai,〃Languagecomprehensioninlanguage-learningimpairedchildrenimprovedwithacousticallymodifiedspeech"，Science，271:81-84(1996):Wingfield.A.etai,“Regaininglosttime:adultagingandtheeffectoftimerestorationonrecalloftime-compressedspeech".Psychol.Aging,14:380-389(1999)，所述文獻(xiàn)以其全部內(nèi)容并入本文作參考。訓(xùn)練可以包含一或多個(gè)訓(xùn)練期，且是適于使得執(zhí)行感興趣的認(rèn)知任務(wù)的能力改善的訓(xùn)練。例如，如果希望語言習(xí)得改善，則訓(xùn)練針對語言習(xí)得進(jìn)行。如果希望學(xué)習(xí)樂器的能力改善，則針對學(xué)習(xí)樂器的能力進(jìn)行訓(xùn)練。如果希望特定運(yùn)動(dòng)技能改善，則針對該特定運(yùn)動(dòng)技能習(xí)得進(jìn)行訓(xùn)練。感興趣的特定認(rèn)知任務(wù)與適當(dāng)訓(xùn)練相匹配?！岸鄠€(gè)訓(xùn)練期”是指兩或更多個(gè)訓(xùn)練期。Gprl2抑制劑可以在一或多個(gè)訓(xùn)練期之前、期間或之后施用。在特定的實(shí)施方案中，Gprl2抑制劑在每個(gè)訓(xùn)練期之前和期間施用?！坝?xùn)練”是指認(rèn)知訓(xùn)練?！罢{(diào)節(jié)”是指基因的表達(dá)、或者編碼一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等價(jià)RNA分子的水平或者一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性被上調(diào)或下調(diào)，由此所述表達(dá)、水平或活性高于或低于在無所述調(diào)節(jié)劑的條件下的觀測結(jié)果。例如，術(shù)語“調(diào)節(jié)”可以是指“抑制”，但是術(shù)語“調(diào)節(jié)”的用法非限于該定義?！耙种啤?、“下調(diào)”或者“降低”是指基因的表達(dá)、或者編碼一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等價(jià)RNA分子的水平或者一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性被降低至低于在無本發(fā)明核酸分子(例如siNA)的條件下的觀測結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，SiNA分子的抑制、下調(diào)或者降低低于在存在無活性或弱化siRNA分子條件下的觀測水平。在另一實(shí)施方案中，siNA分子的抑制、下調(diào)或者降低低于在存在例如具有混雜的序列或者具有錯(cuò)配的siNA分子條件下的觀測水平。在另一實(shí)施方案中，siRNA分子的抑制、下調(diào)或者降低是指靶RNA分子或者等價(jià)RNA分子的表達(dá)水平與無所述siRNA分子的條件下的水平相比降低至少20%、30%、40%、50%、60%或者70%?！霸鰪?qiáng)”是指相對于正常的生物化學(xué)或者生理學(xué)作用或效果加強(qiáng)、增加、改善或者更大或更好的能力。例如，增強(qiáng)長期記憶形成是指相對于動(dòng)物的正常長期記憶形成加強(qiáng)或增加動(dòng)物的長期記憶形成的能力。結(jié)果，長期記憶習(xí)得更快速或更好地保留。增強(qiáng)執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)能力是指相對于動(dòng)物正常的認(rèn)知任務(wù)執(zhí)行能力(performance)加強(qiáng)或改善動(dòng)物的特定認(rèn)知任務(wù)執(zhí)行能力的能力。術(shù)語“海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)”是指與腦的海馬區(qū)相關(guān)的認(rèn)知任務(wù)。術(shù)語“杏仁核依賴性認(rèn)知任務(wù)”是指與腦的杏仁核區(qū)相關(guān)的認(rèn)知任務(wù)。術(shù)語“靶基因”或者“基因”是指編碼RNA的核酸，例如包括但不限于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的核酸序列。靶基因可以是衍生自細(xì)胞的基因或內(nèi)源基因?！鞍泻怂帷笔侵钙浔磉_(dá)或活性被調(diào)節(jié)的任何核酸序列。所述靶核酸可以是DNA或RNA?！巴葱蛄小笔侵赣梢换蚨鄠€(gè)多核苷酸序列如基因、基因轉(zhuǎn)錄物和/或非編碼多核苷酸共有的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由編碼相關(guān)但不同的蛋白質(zhì)的兩或多個(gè)基因共有的核苷酸序列，例如基因家族不同成員、不同蛋白質(zhì)表位、不同蛋白質(zhì)同種型或者完全趨異(divergent)的基因，如細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體。同源序列可以是由兩或多個(gè)非編碼多核苷酸共有的核苷酸序列，如非編碼DNA或RNA、調(diào)節(jié)序列、內(nèi)含子以及轉(zhuǎn)錄控制或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。同源序列也可包含由一個(gè)以上多核苷酸序列共有的保守序列區(qū)域。同源非必須是完全同源(例如100%)，本發(fā)明也包含部分同源序列(例如99%、98%、97%、96%、95%、94%,93%,92%,91%,90%,89%,88%,87%,86%,85%,84%,83%,82%,81%,80%寸乂O“保守序列區(qū)域”是指多核苷酸中一或多個(gè)區(qū)域的核苷酸序列在世代之間或者從一個(gè)生物學(xué)系統(tǒng)、對象或生物體至另一個(gè)生物學(xué)系統(tǒng)、對象或生物體無明顯變化。所述多核苷酸可包含編碼和非編碼DNA和RNA二者。“有義區(qū)”是指與siNA分子的反義區(qū)具有互補(bǔ)性的siNA分子的核苷酸序列。此夕卜，siNA分子的有義區(qū)可包含與靶核酸序列具有同源性的核酸序列。“反義區(qū)”是指與靶核酸序列具有互補(bǔ)性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反義區(qū)可任選包含與siNA分子的有義區(qū)具有互補(bǔ)性的核酸序列。“互補(bǔ)性”是指核酸可與另一核酸序列通過傳統(tǒng)的Watson-Crick或者其它非傳統(tǒng)類型形成氫鍵。關(guān)于本發(fā)明的核酸分子，核酸分子與其互補(bǔ)序列的結(jié)合自由能足以使得所述核酸的相關(guān)功能例如RNAi活性進(jìn)行下去。核酸分子的結(jié)合自由能的確定為本領(lǐng)域熟知(見例如Turneretal.，1987，CSHSymp.Quant.Biol.LIIpp.123-133；Frieretal.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA839373-9377；Turneretal.,1987,J.Am.Chem.Soc.109=3783-3785)0互補(bǔ)性百分比表示核酸分子中可以與另一核酸序列形成氫鍵(例如Watson-Crick堿基配對)的連續(xù)殘基的百分比(例如第一個(gè)寡核苷酸中共10個(gè)核苷酸中的5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸與具有10個(gè)核苷酸的第二個(gè)核酸序列堿基配對分別代表50%、60%、70%、80%、90%、和100%互補(bǔ)性)?！巴耆パa(bǔ)”是指核酸序列的所有連續(xù)殘基與另一個(gè)核酸序列中相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵?！癛NA”是指包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子?！昂颂呛塑账帷笔侵冈讦?D-呋喃核糖部分的2'位置具有羥基的核苷酸。該術(shù)語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA如部分純化的RNA、基本純的RNA、合成RNA、重組產(chǎn)生的RNA，以及通過添加、缺失、取代和/或改變一或多個(gè)核苷酸而與天然發(fā)生的RNA不同的改變的RNA。這種改變可包括如在siNA末端或者例如在RNA的一或多個(gè)核苷酸內(nèi)部添加非核苷酸材料。本發(fā)明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，如非天然發(fā)生的核苷酸或者化學(xué)合成的核苷酸或者脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以被稱作類似物或天然發(fā)生的RNA的類似物。如本文所用，術(shù)語“硫代磷酸酯”是指RNA分子中的核苷酸間的鍵，其中兩個(gè)核苷酸之間的至少一個(gè)鍵包含硫原子。因此，術(shù)語硫代磷酸酯是指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸間鍵二者。如本文所用，術(shù)語“膦酰乙酸鍵”是指RNA分子中核苷酸間鍵，其中兩個(gè)核苷酸之間至少一個(gè)鍵包含乙?；蛘弑Ｗo(hù)的乙?；Ｒ娎鏢heehanetal.,2003NucleicAcidsResearch31，4109-4118或者美國專利出版物No.2006/0247194所述。如本文所用，術(shù)語“硫代膦酰乙酸鍵”是指包含至少一個(gè)核苷酸間鍵的RNA分子，所述鍵包含乙?；蛘弑Ｗo(hù)的乙?；土蛟印Ｒ娎鏢heehanetal.,2003NucleicAcidsResearch31，4109-4118或者美國專利出版物No.2006/0247194所述。如本文所用，“治療”是指改善不良長期記憶形成的臨床癥狀。改善臨床癥狀包括例如與預(yù)處理水平或者無長期記憶形成缺陷的個(gè)體相比增加或改善長期記憶，增加的執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)的能力。如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”是指阻止不良長期記憶形成的臨床癥狀出現(xiàn)。如本文所用，術(shù)語“治療效力”是指藥物或候選藥物在治療長期記憶形成缺陷、改善長期記憶形成、改善執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)能力中的治療作用。所述治療效力可以通過監(jiān)測患者執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)的能力而測量。RNA分子合適的SiRNA可以通過例如合成或者通過在細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼siRNA分子的反義鏈的DNA序列可以通過PCR產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，將siRNA編碼DNA克隆進(jìn)載體如質(zhì)?；虿《据d體中以便于轉(zhuǎn)移進(jìn)哺乳動(dòng)物中。在另一實(shí)施方案中，可以使用化學(xué)或者酶學(xué)手段合成siRNA分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明SiNA分子的每個(gè)序列的長度單獨(dú)地為大約18到大約30個(gè)核苷酸，在特定的實(shí)施方案中其長度是大約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述siRNA分子含有大約19-23個(gè)堿基對，優(yōu)選大約21個(gè)堿基對。在另一實(shí)施方案中，所述siRNA分子含有大約24-28個(gè)堿基對，優(yōu)選大約26個(gè)堿基對。各個(gè)siRNA分子可以是單鏈形式以及成對的雙鏈形式(“有義”和“反義”)且可以包含二級結(jié)構(gòu)如發(fā)夾環(huán)。各個(gè)siRNA分子也可以作為前體分子輸送，其隨后被改變產(chǎn)生活性分子。舉例的單鏈形式的siRNA分子包括抗DNA序列非轉(zhuǎn)錄區(qū)(例如啟動(dòng)子區(qū))的單鏈反義siRNA。在再一個(gè)實(shí)施方案中，包含發(fā)夾或者環(huán)形結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的siNA分子的長度為大約35到大約55(例如大約35、40、45、50或55)個(gè)核苷酸，或者長度為大約38到大約44(例如大約38、39、40、41、42、43或44)個(gè)核苷酸，且包含大約16到大約22(例如大約16、17、18、19、20、21或22)個(gè)堿基對。所述SiRNA分子可包含這樣的核苷酸片段，其是編碼天然小鼠或人Gprl2蛋白質(zhì)序列的DNA序列的有義鏈或反義鏈。優(yōu)選所述小鼠或人Gprl2蛋白質(zhì)序列包含表1所示那些序列，選自SEQIDNO=USEQIDNO:4或SEQIDNO:6。本發(fā)明的siRNA分子可以是如表1所示選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO5的天然小鼠或人Gprl2mRNAWmRNA序列的有義鏈的核苷酸片段。本發(fā)明的siRNA分子可以是與如表1所示選自SEQIDNO2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5的天然小鼠或人Gprl2mRNA的mRNA序列反義的序列。下文討論了目前已知由短干擾RNA介導(dǎo)的RNA干擾的機(jī)制，其不意味著是限制性的及承認(rèn)是現(xiàn)有技術(shù)?；瘜W(xué)修飾的短干擾核酸具有與siRNA分子相似或改善的介導(dǎo)RNAi的能力且預(yù)期具有改善的體內(nèi)穩(wěn)定性和活性。因此。這個(gè)討論非僅限于siRNA，也可以用于siNA?！案纳频慕閷?dǎo)RNAi的能力”或者“改善的RNAi活性”是指包括在體外和/或在體內(nèi)測量的RNAi活性，其中RNAi活性是siNA介導(dǎo)RNAi的能力以及本發(fā)明siNA的穩(wěn)定性二者的反映。RNA干擾是指由短干擾RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動(dòng)物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程(Fireetal.，1998，Nature，391，806)。植物中的相應(yīng)過程通常被稱作轉(zhuǎn)錄后基因沉默或者RNA沉默，且在真菌中也被稱作壓抑(quelling)。轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程被認(rèn)為是進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機(jī)制，用于阻止由不同區(qū)系(flora)和門(phyla)共有的外源基因表達(dá)(Fireetal.，1999，TrendsGenet.,15,358)這種阻止外源基因表達(dá)的保護(hù)機(jī)制也許已經(jīng)進(jìn)化應(yīng)答衍生自病毒感染的雙鏈RNA(dsRNA)的產(chǎn)生或者轉(zhuǎn)座子元件通過特異性破壞同源單鏈RNA或者病毒基因組RNA的細(xì)胞應(yīng)答向宿主基因組的隨機(jī)整合。細(xì)胞中dsRNA的存在通過目前未完全鑒定的機(jī)制觸發(fā)RNAi應(yīng)答。這個(gè)機(jī)制看起來與干擾素應(yīng)答不同，所述干擾素應(yīng)答得自蛋白激酶PKR和2’，5’-寡腺苷酸合成酶的dsRNA-介導(dǎo)的活化，導(dǎo)致核糖核酸酶L對mRNA的非特異性裂解。細(xì)胞中長dsRNA的存在刺激稱作Dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer參與dsRNA加工為dsRNA短片段，稱作短干擾RNA(siRNA)(Bersteinetal.，2001，Nature，409，363)。衍生自Dicer活性的短干擾RNA的長度典型為大約21至大約23個(gè)核苷酸，且包含大約19個(gè)堿基對雙鏈體。Dicer也參與21-和22-個(gè)核苷酸的小時(shí)間RNA(stRNA)從參與翻譯控制的保守結(jié)構(gòu)的前體RNA中切除(Hutvagneretal.，2001，Science，293，834)。RNAi應(yīng)答的特征還在于通常稱作RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)的含有siRNA的核酸內(nèi)切酶復(fù)合物，其介導(dǎo)具有與所述siRNA同源的序列的單鏈RNA裂解。靶RNA的裂解在與siRNA雙鏈體的引導(dǎo)序列互補(bǔ)的區(qū)域的中間發(fā)生(Elbashiretal.,2001,GenesDev.，15，188)。此夕卜，RNA干擾也可包含小RNA(例如微小RNA或mRNA)介導(dǎo)的基因沉默，可能是通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞機(jī)制且從而阻止靶基因序列轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)(見例如Allshire，2002，Science,297,1818-1819；Volpeetal.,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218；Halletal.，2002，Science,297，2232-2237)。已經(jīng)在許多系統(tǒng)中研究了RNAi。Fireetal.，1998，Nature，391，806首先在線蟲(C.elegans)中觀測RNAi。WiannyandGoetz,1999,NatureCellBiol.，2，70描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammondetal.，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅細(xì)胞中的RNAi。Elbashiretal.，2001，Nature，411，494描述了通過在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入合成的21個(gè)核苷酸RNA雙鏈體誘導(dǎo)的RNAi，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人胚胎腎細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。近來在果蠅胚胎裂解產(chǎn)物中進(jìn)行的研究揭示了介導(dǎo)有效RNAi活性必需的siRNA長度、結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分以及序列的某些必要條件。這些研究已經(jīng)示出21個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈體當(dāng)含有兩個(gè)2-核苷酸3’-末端核苷酸突出端時(shí)是最具活性的。此夕卜，siRNA的一或兩個(gè)鏈由2'-脫氧核苷酸或者2'-O-甲基核苷酸的取代會(huì)消除RNAi活性，而siRNA的3’-末端核苷酸由脫氧核苷酸取代是容許的。siRNA雙鏈體中心的錯(cuò)配序列也示出消除RNAi活性。此外，這些研究還表明靶RNA中裂解位點(diǎn)的位置由siRNA引導(dǎo)序列的5，-末端而不是3，-末端限定(Elbashiretal.,2001,EMBOJ.,20,6877)其它研究表明在siRNA雙鏈體的靶互補(bǔ)鏈上的5'-磷酸酯是siRNA活性必需的，且ATP用于維持siRNA上的5'-磷酸酯部分(Nykanenetal.，2001，Cell，107，309)；然而，缺少5'-磷酸酯的siRNA分子當(dāng)被外源導(dǎo)入時(shí)是活性的，提示siRNA構(gòu)建體的5'-磷酸化可以在體內(nèi)發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及修飾的SiNA分子。舉例的預(yù)期對磷酸酯主鏈的修飾包括這樣的磷酸酯主鏈修飾，其包含一或多個(gè)硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸酯，包括甲基膦酸酯，磷酸三酯，包括烷基磷酸三酯，嗎啉代，酰胺氨基甲酸酯(amidatecarbamate)，羧甲基，乙酰胺，聚酰胺，磺酸酯，氨磺酰，氨基磺酸酯(sulfamate)，formacetal,thioformacetal和/或烷基甲硅烷基取代。關(guān)于寡核苷酸主鏈修飾的回顧見HunzikerandLeumann,1995,NucleicAcidAnalogues:SynthesisandProperties,inModemSyntheticMethods,VCH,331-417L^i,^Mesmaekeretal.,1994,NovelBackboneReplacementsforOligonucleotides,inCarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,ACS,24-39所述。舉例的預(yù)期對糖部分的修飾包括2'_烷基嘧啶，如2'-0-甲基、2'-氟、氨基和脫氧修飾等(見例如Amarzguiouietal.，2003，NucleicAcidsRes.31:589_595，美國專利出版物No.2007/0104688)。舉例的預(yù)期對堿基基團(tuán)的修飾包括無堿基糖(abasicsugars)，2-0-烷基修飾的嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶和5-(3-氨基烯丙基)_尿嘧啶等。也可以摻入鎖定核酸或者LNA'S。本領(lǐng)域已知許多其它修飾，只要符合上述標(biāo)準(zhǔn)即可使用。舉例的修飾也在美國專利No.5，684，143,5,858，988和6，291，438以及在美國出版的專利申請NO.2004/0203145A1中揭示，所述文獻(xiàn)并入本文參考。其它修飾在Herdewijn(2000)，AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:297_310，Eckstein(2000)AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:117_21,Rusckowskietal.(2000)AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:333_345,Steinetal.(2001)AntisenseNucleicAcidDrugDev.11317-25以及Vorobjevetal.(2001)AntisenseNucleicAcidDrugDev.1177-85中揭示，所述文獻(xiàn)并入本文參考。RNA可以通過酶處理或者通過部分/全部有機(jī)合成方法而產(chǎn)生，修飾的核糖核苷酸可以通過體外酶或有機(jī)合成方法導(dǎo)入。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)鏈均是化學(xué)制備的。合成RNA分子的方法為本領(lǐng)域已知。抗體舉例的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、雙特異性抗體以及異源綴合(heteroconjugate)抗體。術(shù)語“抗體”以其最廣泛的含義使用，特別包含例如單鏈抗Gprl2單克隆抗體(包括拮抗劑和中和抗體)、具有多肽表位特異性的抗_Gprl2抗體組合物、單鏈抗-Gprl2抗體，以及抗_Gprl2抗體的片段。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指得自一群充分均質(zhì)的抗體的抗體，即該群包含的各個(gè)抗體除了也許少量存在的可能天然發(fā)生的突變之外均相同?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)。舉例的抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(Zapataetal,ProteinEng.8(10)1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；以及從抗體片段中形成的多特異性抗體。“特異性結(jié)合”或者“特異于”特定多肽或者特定多肽上表位的抗體是結(jié)合該特定多肽或者特定多肽上表位的抗體，其基本上不結(jié)合任何其它多肽或多肽表位。抗-Gprl2抗體可包含多克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備多克隆抗體的方法。多克隆抗體可以在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生，例如通過一或多次注射免疫制劑以及如果需要的佐劑而產(chǎn)生。典型地，所述免疫制劑和/或佐劑通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射進(jìn)哺乳動(dòng)物中。所述免疫制劑可包含Gprl2多肽或者其融合蛋白。有益的是將所述免疫制劑與已知在被免疫的哺乳動(dòng)物中是免疫原性的蛋白質(zhì)綴合。舉例的這種免疫原性蛋白包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢允褂玫淖魟┑睦影‵reund's完全佐劑和MPL-TDM佐劑(一磷酰脂質(zhì)A，合成的trehalosedicorynomycolate)。所述免疫方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇而不需要過多的實(shí)驗(yàn)。所述抗_Gprl2抗體或者可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以通過使用雜交瘤方法制備，如KohlerandMiistein,Nature,256=495(1975)所述方法。在雜交瘤方法中，將小鼠、倉鼠或者其它合適的宿主動(dòng)物典型用免疫制劑免疫以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或者能產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫制劑的抗體?；蛘?，所述淋巴細(xì)胞可以在體外免疫。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本發(fā)明可以使用多種其它基因破壞技術(shù)。非限制性的例子是可以使用同源重組、顯性-陰性基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、正?；驑?gòu)建體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及靶基因中氨基酸序列的任何其它修飾。病毒載體也可以適當(dāng)應(yīng)用以輸送各種這樣的基因構(gòu)建體至腦細(xì)胞，且這種構(gòu)建體包括通過RNAi途徑起作用的一些構(gòu)建體(短發(fā)夾RNA，雙鏈RNA等)。配制物可以適當(dāng)配制Gprl2抑制劑化合物樣品并通過任何方式將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物中以使得樣品的足夠部分進(jìn)入細(xì)胞中。例如，所述抑制劑可以在緩沖液中配制，所述緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、脂質(zhì)體、膠束結(jié)構(gòu)和殼體。具有陽離子脂質(zhì)的siRNA配制物可用于促進(jìn)dsRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。例如，可以使用陽離子脂質(zhì)如Iipofectin(美國專利No.5，705，188，并入本文參考)，陽離子甘油衍生物以及聚陽離子分子如聚賴氨酸(出版的PCT國際申請W097/30731，并入本文參考)。合適的脂質(zhì)包括Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或者FuGene6(Roche)，所有這些脂質(zhì)均可以根據(jù)廠商指導(dǎo)使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Gprl2特異性siNA分子與聚乙烯亞胺(例如線性或分支PEI)和/或聚乙烯亞胺衍生物一起配制或復(fù)合，所述衍生物包括例如接枝的(grafted)PEI如半乳糖PEI、膽固醇PEI、抗體衍生的PEI以及聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(見例如Ogrisetal.，2001，AAPAPharmSci,3,1-11；Furgesonetal.,2003,BioconjugateChem.,14,840-847；Kunathetal.,2002,PharmaceuticalResearch,19,810-817；Choietal.,2001,Bull.KoreanChem.Soc,22,46-52；Bettingeretal.，1999，BioconjugateChem.,10,558-561；Petersonetal.,2002,BioconjugateChem.,13,845-854；Erbacheretal.,1999,JournalofGeneMedicinePreprint,1,1-18；Godbeyetal.，1999，PNASUSA,96,5177-5181；Godbeyetal.,1999,JournalofControlledRelease,60,149-160；Dieboldetal.,1999,JournalofBiologicalChemistry,274,19087-19094；ThomasandKlibanov，2002，PNASUSA，99，14640-14645；及Sagara，U.S.Pat.No.6，586，524，所述文獻(xiàn)并入本文參考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識(shí)到將Gprl2抑制劑分子導(dǎo)入細(xì)胞環(huán)境中的方法依賴于細(xì)胞類型及其環(huán)境的組成。例如，當(dāng)所述細(xì)胞在液體內(nèi)存在時(shí)，一種優(yōu)選的配制物是液體配制物如于lipofectamine中且所述抑制劑可以直接加入細(xì)胞的液體環(huán)境中。脂質(zhì)配制物也可以給動(dòng)物如通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者腹膜內(nèi)注射施用，或者通過口服或通過吸入或本領(lǐng)域已知的其它方法施用。當(dāng)所述配制物適于給動(dòng)物如哺乳動(dòng)物及更特別是人施用時(shí)，所述配制物也是藥物學(xué)可接受的。本領(lǐng)域已知且可以使用施用寡核苷酸的藥物學(xué)可接受的配制物。在一些情況中，優(yōu)選在緩沖液或鹽水溶液中配制所述抑制劑并且將配制的抑制劑直接注射至細(xì)胞中。也可以直接注射dsRNA雙鏈體。關(guān)于導(dǎo)入siRNA的合適方法見美國公布的專利申請No.2004/0203145A1，所述專利并入本文參考。所述Gprl2抑制劑包含藥理學(xué)有效量。藥理學(xué)或治療有效量是指有效產(chǎn)生指定藥理學(xué)、治療或預(yù)防結(jié)果的抑制劑的量。短語“藥理學(xué)有效量”和“治療有效量”或者簡單地“有效量”是指有效產(chǎn)生指定藥理學(xué)、治療或預(yù)防結(jié)果的抑制劑的量。例如，如果當(dāng)與疾病或病癥相關(guān)的可測量參數(shù)有至少20%的降低則認(rèn)為指定的臨床處理是有效的時(shí)候，則治療該疾病或病癥的藥物的治療有效量是實(shí)現(xiàn)該參數(shù)至少20%降低必需的量。必須導(dǎo)入適量抑制劑且這些量可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。典型地，細(xì)胞環(huán)境中各種siRNA的有效濃度是大約50納摩爾或者低于10納摩爾或更低，或者可以使用其中大約為1納摩爾或更低濃度的組合物。在其它實(shí)施方案中，在許多情況中可以使用利用大約200皮摩爾或更低以及甚至大約50皮摩爾或更低濃度的方法。通常地，siRNA的合適劑量單位是在每個(gè)受體大約0.001至大約0.25mg/kg體重/天的范圍，或者在大約0.01至大約20μg/kg體重/天的范圍，或者在大約0.01至大約10μg/kg體重/天的范圍，或者在大約0.10至大約5μg/kg體重/天的范圍，或者在大約0.1至大約2.5μg/kg體重/天的范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Gprl2抑制劑可以一天施用一次。然而，該配制物也可以含有在一天中以適當(dāng)間隔施用的2、3、4、5、6或更多個(gè)亞劑量的劑量單位給予。在這種情況中，在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)亞劑量中含有的抑制劑必須相應(yīng)較少以達(dá)到總計(jì)每天劑量單位。該劑量單位也可以是幾天的單次劑量的復(fù)合劑量，例如使用常規(guī)緩釋配制物，在幾天內(nèi)持續(xù)及一致地釋放siRNA。緩釋配制物為本領(lǐng)域熟知。在這個(gè)實(shí)施方案中，劑量單位含有相應(yīng)的多個(gè)每日劑量。無論配制物如何，所述藥物組合物必須含有足夠量的抑制劑以抑制Gprl2基因在動(dòng)物中的表達(dá)。數(shù)據(jù)可以得自細(xì)胞培養(yǎng)物測定以確定合適的劑量范圍。本發(fā)明組合物的劑量在較低或無毒性的循環(huán)濃度包括ED5tl(通過已知方法確定)的范圍內(nèi)。根據(jù)應(yīng)用的劑型以及施用途徑，劑量可以在此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以從細(xì)胞培養(yǎng)物測定中估算。血漿中抑制劑的水平可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法測量，例如通過高效液相層析測量。所述方法可通過將所述SiRNA組合物加入細(xì)胞可生活的任何細(xì)胞外基質(zhì)中而進(jìn)行，條件是配制所述siRNA組合物以便足夠量的siRNA可以進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其作用。例如，所述方法可用于存在于液體如液體培養(yǎng)物或者細(xì)胞生長培養(yǎng)基中、在組織外植體中或者在完整生物體包括動(dòng)物如哺乳動(dòng)物、特別是人中的細(xì)胞。輸送方法編碼特異于基因靶序列的反義鏈或siRNA的DNA序列被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。為了靶向基因中一個(gè)以上的序列(如不同的啟動(dòng)子區(qū)序列和/或編碼區(qū)序列)，可以將特異于每個(gè)靶向基因序列的單獨(dú)的siRNA編碼DNA序列同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以暴露于靶向基因中多個(gè)序列的多個(gè)siRNA。本發(fā)明的Gprl2抑制劑可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式施用，例如通過胃腸外途徑，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、氣道(氣霧劑)、直腸、陰道和局部(包括口腔和舌下)施用方式。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物通過靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)灌注或注射方式施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于使用將本發(fā)明的核酸分子輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的方法。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)神經(jīng)元在體內(nèi)對核酸的有效攝取。作為將核酸局部施用給神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)例，Sommeretal.，1998，AntisenseNuc.AcidDrugDev.,8,75描述了這樣的研究，其中將c-fos的15聚體硫代磷酸酯反義核酸分子通過顯微注射大腦施用給大鼠。作為將核酸系統(tǒng)施用給神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)例，Epaetal.,2000,AntisenseNuc.AcidDrugDev.，10，469描述了體內(nèi)小鼠研究，其中β-環(huán)糊精-金剛烷-寡核苷酸綴合物用于靶向神經(jīng)元分化的PC12細(xì)胞中的ρ75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體。在IP施用兩周后，在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞中觀測到ρ75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體反義核酸的顯著攝取。此外，在DRG神經(jīng)元中觀測到Ρ75的明顯和一致的下調(diào)。將核酸靶向神經(jīng)元的其它方法在Broaddusetal.，1998，J.Neurosurg.，88(4)，734；Karleetal.，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannaietal.,1998,BrainResearch,784(1,2),304；Rajakumaretal.,1997,Synapse,26(3)，199；ffu-pongetal.，1999，BioPharm,12(1),32；Bannaietal.，1998，BrainRes.Protoc,3(l),83；Simantovetal.，1996，Neuroscience，74(1)，39中描述。本發(fā)明的核酸分子因此適于輸送至神經(jīng)細(xì)胞并且被其攝取。通過各種不同策略輸送靶向候選基因的本發(fā)明的核酸分子?？梢允褂玫膫鹘y(tǒng)CNS輸送方法包括但不限于鞘內(nèi)和腦室內(nèi)施用，植入導(dǎo)管和泵，在損傷或損害部位直接注射或灌注，注射進(jìn)腦動(dòng)脈系統(tǒng)，或者通過化學(xué)或滲透性方式使血腦屏障開放。其它方法可包括使用各種轉(zhuǎn)運(yùn)和載體系統(tǒng)，例如通過使用綴合物和生物可降解的聚合物。此外，基因治療方法如Kaplittetal.，U.S.Pat.No.6，180,613和Davidson，WO04/013280所述方法可用于在CNS中表達(dá)核酸分子。術(shù)語“導(dǎo)入”包含在體外或在體內(nèi)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的各種方法。這種方法包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和感染。載體是可用且優(yōu)選的將編碼siRNA分子的DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的物質(zhì)。所述導(dǎo)入可以通過使用至少一種載體而實(shí)現(xiàn)?？赡艿妮d體包括質(zhì)粒載體和病毒載體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體，或者其它載體如腺病毒載體或者腺伴隨病毒載體。本發(fā)明也可以使用將SiRNA分子或者編碼siRNA分子的DNA輸送至細(xì)胞或組織中的另一輸送系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體、化學(xué)溶劑、電穿孔、病毒載體、胞飲作用、吞噬作用及其它形式自發(fā)或誘導(dǎo)的外源物質(zhì)的細(xì)胞攝取，以及本領(lǐng)域已知的其它輸送系統(tǒng)。合適的啟動(dòng)子包括這樣的啟動(dòng)子，其一旦與編碼干擾RNA分子的序列可操縱地結(jié)合或連接則促進(jìn)所述干擾RNA分子表達(dá)。如本領(lǐng)域所已知，這種啟動(dòng)子包括細(xì)胞啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是RNAPolIII啟動(dòng)子，其優(yōu)選位于編碼干擾RNA分子的DNA序列的立即上游。如本領(lǐng)域所已知，可以使用各種病毒啟動(dòng)子，包括但不限于病毒LTR，以及腺病毒、SV40和CMV啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用哺乳動(dòng)物TORNAPolIII啟動(dòng)子，更優(yōu)選使用人TOsnRNAPolIII啟動(dòng)子，其先前已經(jīng)用于在人細(xì)胞中表達(dá)短的指定核酶轉(zhuǎn)錄物(Bertrandetal.,1997；Goodetal.，1997)。發(fā)現(xiàn)所述U6PolIII啟動(dòng)子及其簡單的終止序列(4-6個(gè)尿苷)在細(xì)胞中表達(dá)siRNA?？梢詫⑦m當(dāng)選擇的干擾RNA或siRNA編碼序列插入轉(zhuǎn)錄盒中，提供檢測RNA分子的內(nèi)源表達(dá)和功能的最佳系統(tǒng)。表汰測量Gprl2基因的表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的及后來揭示的任何合適方法確定?？梢砸庾R(shí)到用于測量靶基因表達(dá)的方法依賴于靶基因的性質(zhì)。例如，當(dāng)靶基因編碼蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語“表達(dá)”可以是指衍生自所述基因的蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物。在這種情況中，靶基因的表達(dá)可以通過測量相應(yīng)于靶基因的mRNA的量或者通過測量該蛋白質(zhì)的量而確定。蛋白質(zhì)可以在蛋白質(zhì)測定中測量，如通過染色或者免疫印跡，或者如果所述蛋白質(zhì)催化可以測量的反應(yīng)，在通過測量反應(yīng)速度而確定。所有這些方法均為本領(lǐng)域已知且可以使用。在基因產(chǎn)物是RNA的情況中，表達(dá)可以通過確定相應(yīng)于基因產(chǎn)物的RNA的量而測量。所述測量可以對細(xì)胞、細(xì)胞提取物、組織、組織提取物或者任何其它合適源材料進(jìn)行。Gprl2基因的表達(dá)是否降低的確定可以通過能可靠地檢測基因表達(dá)變化的任何合適方法進(jìn)行。實(shí)施例實(shí)施例1-情景和痕跡條件反射(traceconditioning)用誘導(dǎo)微弱記憶的情景條件反射范式(contextualconditioningparadigm)訓(xùn)練小鼠(圖1,也見Tully，Τ.，etal,NatRevDrugDiscov2，267-77(2003))。圖Ia示出了訓(xùn)練次數(shù)對于情景記憶形成的作用。用逐漸增加次數(shù)的成對CS-US訓(xùn)練小鼠，4天后評估情景記憶。用IX或2X成對CS-US訓(xùn)練誘導(dǎo)次最大記憶。痕跡條件反射隨著CS與US之間時(shí)間間隔延長而變得越來越難。在痕跡恐懼條件反射(tracefearconditioning)中使用逐漸延長的長痕跡(longtraceinterval)訓(xùn)練小鼠并與延遲條件反射對比音調(diào)記憶。圖Ib示出痕跡間隔對于時(shí)間記憶形成的作用。30秒或更長的痕跡間隔導(dǎo)致對于音調(diào)CS的長期記憶不佳(5、15、30、60、100和120秒的延遲條件反射和痕跡間隔分別為η=29、η=20、η=25、η=18、η=28、η=16和η=12)。事實(shí)上，如果CS與US之間的痕跡間隔是60秒或更長，則C57BL/6小鼠示出不佳的記憶(圖lb)。實(shí)施例2訓(xùn)練后海馬中Gprl2RNA水平為了評估情景記憶，使用最初為了評估CREB敲除小鼠記憶開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)化情景恐懼條件反射任務(wù)(Bourtchuladzeetal.，1994Cell79,59-68)0在訓(xùn)練當(dāng)天，將小鼠置于條件反射室(MedAssociates,Inc.，VA)中2分鐘，之后給予非條件刺激(US)，持續(xù)2秒的0.5mA足部電擊。對于微弱訓(xùn)練(2個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn))，在電擊之間以1分鐘試驗(yàn)間隔重復(fù)兩次US。對于強(qiáng)力訓(xùn)練(5個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn))，在電擊之間以1分鐘試驗(yàn)間隔給予5次足部電擊(Bourtchouladzeetal,1998LearnMem5，365-374·)、(Scottetal，2002JMoINeurosci19，171-177)、(Tullyetal，2003NatRevDrugDiscov2，267_277)。使用自動(dòng)化軟件包進(jìn)行訓(xùn)練(MedAssociates,Inc.,VA)0在最后一個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)后，將小鼠置于條件反射室中額外30秒，然后返回其自己籠子中。訓(xùn)練后24小時(shí)檢測情景記憶。將小鼠置于相同訓(xùn)練室中，通過對僵直行為評分評估條件反射。僵直(freezing)定義為在5秒期間完全沒有運(yùn)動(dòng)((FanselowandBolles,1979JCompPhysiolPsychol93，736-744.)、(Bourtchuladzeetal,1994Cell79,59-68)>(Bourtchouladzeetal,1998LearnMem5,365-374))全部檢測時(shí)間持續(xù)3分鐘。在檢測每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象之后，用75%乙醇、水對實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行徹底清潔及干燥、通風(fēng)。拍攝每個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。所有實(shí)驗(yàn)者均為藥物和訓(xùn)練條件雙盲。設(shè)計(jì)所有行為實(shí)驗(yàn)并以平衡方式進(jìn)行，意味著(i)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件均使用等量實(shí)驗(yàn)小鼠和對照小鼠；(ii)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件均重復(fù)多次，累加重復(fù)天數(shù)產(chǎn)生最終對象數(shù)目。拍攝每個(gè)期間的行進(jìn)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者不知道(不知情)在訓(xùn)練和檢測期間對象的處理情況。使用軟件包(StatView5.0.1；SASInstitute,Inc)通過Student's不成對t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。除非特別指出，文中和圖中所有數(shù)值均以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。對于痕跡條件反射訓(xùn)練，使用標(biāo)準(zhǔn)化小鼠情景恐懼條件反射設(shè)備(MedAssociates,Inc.,VA；(Bourtchuladzeetal.,1994Cell79,59-68)、(Bourtchouladzeetal.，1998LearnMem5,365-374)在訓(xùn)練當(dāng)天，將小鼠置于條件反射室中2分鐘，之后給予條件刺激(CS)，在75dB持續(xù)20秒的2800Hz音調(diào)。在該音調(diào)結(jié)束后60秒，給予動(dòng)物0.5mA電擊非條件刺激(US)2秒。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明這個(gè)訓(xùn)練范式在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)不佳的痕跡恐懼記憶，且這種記憶可以通過CREB途徑的增強(qiáng)劑而促進(jìn)。在室內(nèi)額外30秒之后，將小鼠返回其自己的籠子中。在檢測每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象之后，用75%乙醇、水對實(shí)驗(yàn)設(shè)備徹底清潔，并干燥和通風(fēng)幾分鐘。在位于另一操作室內(nèi)的新室內(nèi)進(jìn)行檢測以避免情景條件反射的混淆影響。除去內(nèi)部的條件反射室，用小鼠籠子代替。將不同顏色帶子置于每個(gè)籠子的后面以彼此區(qū)分。交替使用三個(gè)不同籠子以降低對象之間氣味污染的可能性。將30瓦的燈置于室內(nèi)以保證訓(xùn)練和檢測之間的照明差異。將籠子使用肥皂溶液而非乙醇進(jìn)行清潔。每次檢測以僅2分鐘光照開始(pre-CS)，然后給予20秒音調(diào)(CS)，隨后再僅光照30秒(post-CS)。以與訓(xùn)練期間相同方式，每次對一只小鼠在5秒期間的“僵直”評分，由避免此上述的情景條件反射。拍攝每個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。特異于聽覺記憶的僵直應(yīng)答的比例通過從CS僵直中減去preCS僵直(非特異性)而確定。在訓(xùn)練和檢測后，收集小鼠海馬組織。使用QIAgenRNeasy試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行各個(gè)RNA制備。使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AppliedBiosystems)產(chǎn)生cDNA。使用AffymetrixGene芯片分析法分析cDNA，獲得對初次實(shí)驗(yàn)小鼠的相對表達(dá)水平。通過Affymetrix芯片分析鑒別的在痕跡恐懼條件反射之后1小時(shí)的表達(dá)變化通過Nimble-芯片分析(NimbleGenSystems,Madison,Wl,USA)證實(shí)。通過Affymetrix-芯片分析鑒別的情景恐懼條件反射(5個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn))1小時(shí)后的表達(dá)變化通過另一個(gè)AfTy-芯片分析以及qPCR證實(shí)。表2比較時(shí)間點(diǎn)P值(ρ<0.05顯著)|ES值pPCR相對定量Γ￥____練的與初次實(shí)驗(yàn)的)延遲條件反射的與~~6h0.0008-1.81~次實(shí)驗(yàn)的_____痕跡條件反射的與初10.0383NSUAqPCR驗(yàn)證~~0.70次實(shí)驗(yàn)的___\ig)__表2鑒定Gprl2作為海馬中記憶調(diào)節(jié)基因。示出P值和ES值(Affymetrix基因_芯片分析)和對初次實(shí)驗(yàn)的相對表達(dá)(pPCR驗(yàn)證)實(shí)施例3使用Neuro2A細(xì)胞篩詵靶向Gprl2的siRNA實(shí)時(shí)PCR的表達(dá)譜表明Gprl2mRNA在小鼠和人CNS中表達(dá)，在周圍組織中幾乎無表達(dá)(圖2)。Gprl2廣泛存在于小鼠CNS中(圖2a)，在丘腦、腦干和小腦中具有最高表達(dá)水平，這些腦區(qū)域參與攝食和感覺信息整合(丘腦)、運(yùn)動(dòng)控制(小腦)和自主功能(腦干)。高水平的Gprl2也在海馬和新皮質(zhì)中觀測到，這是記憶形成的兩個(gè)關(guān)鍵腦部區(qū)域(Fanselow2005JCompPhysiolPsychol93,736-744)這些結(jié)果與在小鼠CNS中原位雜交觀測的結(jié)果相似(Ignatov2003JNeurosci23,907-914)在小鼠中，Gprl2表達(dá)在除了肝之外的大多數(shù)周圍組織中低于檢測水平。在人CNS中，Gprl2表達(dá)在海馬、新皮質(zhì)和小腦中最高(圖2b)。與Gprl2最近同源的Gpr3和Gpr6存在于小鼠和人的CNS中(圖2a/b)。然而，人CNS中Gprl2mRNA水平比Gpr3和6的高很多。這與在小鼠中的情況相反，其中在海馬、丘腦和新皮質(zhì)中Gpr6表達(dá)極為顯著。體內(nèi)級siSTABLEsiRNA(DharmaconInc.，Lafayette,USA)用于評估小鼠CNS中的Gprl2功能。對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性。21聚體siSTABLE非靶向siRNA用作對照。為了評估siRNA效力，使用siGENOMEsiRNA禾ΠDharmafect3(Dharmacon,Lafayette,USA)轉(zhuǎn)染Neuro2A細(xì)胞。如針對海馬組織所述，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后分離RNA及合成cDNA。每次處理進(jìn)行三個(gè)單獨(dú)的RNA制備和cDNA合成。對每次cDNA復(fù)制以一式兩份確定靶mRNA水平，平均每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的ΔCT值(n=3RNA/cDNApreps；每個(gè)數(shù)值均代表兩次qPCR確定的平均值)。鑒別了在體外有效降低Gprl2mRNA的三個(gè)siRNA(圖3)。在處理24小時(shí)后，siRNA2使Gprl2mRNA水平降低為載體對照組的31%，選擇其在體內(nèi)評估Gprl2。Gpr12-2siRNA的體內(nèi)級siSTABLEsiRNA得自Dharmacon(Lafayette，USA)。使用Neuro2a細(xì)胞在體外通過bDNA測定(QuantiGenebDNA測定試劑盒，Bayer)檢測對Gprl2的一些未修飾的(siGENOME)siRNA。使用多成分合理設(shè)計(jì)算法(Reynoldsetal.，(2004).NatBiotechnol22，326-330)設(shè)計(jì)siRNA并通過BLAST檢索控制對于Gprl2的特異性。選擇如下siRNA進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)鑒定Gpt12siRNA2有義鏈GAGGCACGCCCAUCAGAUAUU;SEQIDNO7Gpr12siRNA2反義鏈UAUCUGAUGGGCGUGCCUCUU;SEQIDNO8非靴向siRNA有義鏈UAGCGACUAAACACAUCAAUU；SEQIDNO9非靴向siRNA反義鏈UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU；SEQIDNO10實(shí)施例4合成的Gorl2siRNA在小鼠中的體內(nèi)輸送動(dòng)物和環(huán)境使用年輕成年(10-12周齡)C57BL/6雄性小鼠(Taconic，NY)。在達(dá)到時(shí)，將小鼠分組(5只)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室籠子中飼養(yǎng)，保持12:12小時(shí)光照-黑暗周期。實(shí)驗(yàn)總是在光照階段進(jìn)行。在手術(shù)插管之后，將小鼠單獨(dú)圈養(yǎng)在單獨(dú)的籠子中并飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。除了訓(xùn)練和檢測時(shí)間，小鼠自由攝食和飲水。在與美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的指導(dǎo)方針一致且由美國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)(theInstitutionAnimalCareandUseCommittee)許可的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)和繁殖小鼠。動(dòng)物手術(shù)與siRNA灃射為了灃射siRNA，用20mg/kgAvertin麻醉小鼠并將33號(hào)導(dǎo)管雙側(cè)植入背側(cè)海馬(坐標(biāo):A=-1.8mm,L=+/-1.5mm，深度1.2mm)或者植入杏仁核(坐標(biāo):A=-1.58mm,L=+/-2.8mm，深度4.Omm)(FranklinandPaxinos,1997TheMouseBraininStereotaxicCoordinates)。在手術(shù)恢復(fù)后5-9天，為動(dòng)物注射siRNA。將siRNA在5%葡萄糖中稀釋為0.5μg/μ1并與6當(dāng)量的22kDa線性聚乙烯亞胺(Fermentas)混合。在室溫保溫10分鐘后，將2μ1通過經(jīng)聚乙烯管與顯微注射器連接的灌注管注入每個(gè)海馬中。全部灌注程序需要2分鐘，輕輕手持動(dòng)物以使得應(yīng)激(stress)最小化。在3天內(nèi)共灌注3次siRNA(lμgsiRNA/海馬/天)。siRNA介導(dǎo)的Gprl2敲低(knockdown)可導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)損害。評估siRNA處理的腦的海馬形態(tài)學(xué)。在行為實(shí)驗(yàn)后一天處死注射了siRNA的動(dòng)物。將冷凍的腦切片成15μπι切片并用甲酚紫染色。在連續(xù)切片的照片上評估海馬形態(tài)學(xué)。為了進(jìn)行插管檢驗(yàn)，為動(dòng)物注射Ιμ甲基藍(lán)染料，之后立即處死。將冷凍的腦切片成15μπ切片。利用顯微鏡確定染料染色的位置并對比(FranklinandPaxinos,1997TheMouseBraininStereotaxicCoordinates)。插管檢驗(yàn)是在對于對象的處理不清楚的情況下進(jìn)行的。在非靶向siRNA(圖6a)與Gprl2siRNA處理的小鼠(圖6b)之間海馬形態(tài)學(xué)無明顯差異。因此，Gprl2siRNA不導(dǎo)致腦形態(tài)學(xué)的任何明顯改變。對于錐體細(xì)胞層的損害限于插管區(qū)域。注意，圖6中可見的損害(中間部分)是由于除去海馬插管引起的。其不代表海馬形態(tài)學(xué)中實(shí)際手術(shù)導(dǎo)致的改變，其被認(rèn)為是最小的損害且不影響實(shí)驗(yàn)對象的行為能力。為了證實(shí)siRNA在體內(nèi)的靶敲低作用，在海馬內(nèi)用siRNA處理小鼠3天，在最后一次siRNA灌注后2天和3天確定Gprl2mRNA水平(圖7)。為了評估體內(nèi)Gprl2敲低，集合每組6只小鼠的注射siRNA的海馬組織。使用QIAgenRNeasy試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行6次單獨(dú)的RNA制備。使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AppliedBiosystems)產(chǎn)生cDNA。使用ABIprism和SDS2.1軟件對每次RNA/cDNA復(fù)制進(jìn)行2個(gè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。請求式ABI測定(AppliedBiosystems)用于檢測Gpr12的mRNA水平。確定每個(gè)cDNA樣品的平均CT值。然后將數(shù)據(jù)根據(jù)TATA結(jié)合蛋白(TBP)標(biāo)準(zhǔn)化并確定ACT值。根據(jù)非靶向?qū)φ誷iRNA處理的對照組標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平。當(dāng)與非靶向?qū)φ誷iRNA(η=6)對比時(shí)，在處理后2天Gprl2siRNA(η=6)顯著降低海馬Gprl2的mRNA水平(ρ<0.01)。在處理后3天，Gprl2siRNA無顯著作用，表明Gprl2mRNA敲低是短暫的(ρ=0.25)。這些結(jié)果證實(shí)siRNA在體內(nèi)降低海馬中Gprl2mRNA。然而，靶mRNA和蛋白質(zhì)水平也許受到Gprl2siRNA的不同影響。在siRNA處理后，Gprl2的實(shí)際蛋白質(zhì)水平可以極大程度降低且持續(xù)較長時(shí)間。實(shí)施例5:siRNA介導(dǎo)的Gprl2敲低,對情景和痕跡條件射的影口向?yàn)榱嗽u估情景記憶，使用最初為了評估CREB敲除小鼠記憶而開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)化情景恐懼條件反射任務(wù)(Bourtchuladzeetal.，1994Cell79，59-68)。在訓(xùn)練當(dāng)天，將小鼠置于條件反射室(MedAssociates,Inc.，VA)中2分鐘，之后給予非條件刺激(US)，持續(xù)2秒的0.5mA足部電擊。對于微弱訓(xùn)練(2個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn))，在電擊之間以1分鐘試驗(yàn)間隔重復(fù)兩次US。對于強(qiáng)力訓(xùn)練(5個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn))，在電擊之間以1分鐘試驗(yàn)間隔給予5次足部電擊(Bourtchouladzeetal,1998LearnMemJ，365-374·)、(Scottetal，2002JMoINeurosci19，171-177)、(Tullyetal，2003NatRevDrugDiscov2，267_277)。使用自動(dòng)化軟件包進(jìn)行訓(xùn)練(MedAssociates,Inc.,VA)。在最后一個(gè)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)后，將小鼠置于條件反射室中額外30秒，然后返回其自己籠子中。訓(xùn)練后24小時(shí)檢測情景記憶。將小鼠置于相同訓(xùn)練室中，通過對僵直行為評分評估條件反射。僵直定義為在5秒期間完全沒有運(yùn)動(dòng)((FanselowandBolles,1979JCompPhysiolPsychol93，736-744.)、(Bourtchuladzeetal,1994Cell79,59-68)>(Bourtchouladzeetal.,1998LearnMem5,365-374))全部檢測時(shí)間持續(xù)3分鐘。在檢測每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象之后，用75%乙醇、水對實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行徹底清潔及干燥、通風(fēng)。拍攝每個(gè)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)者均為藥物和訓(xùn)練條件雙盲。設(shè)計(jì)所有行為實(shí)驗(yàn)并以平衡方式進(jìn)行，意味著(i)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件均使用等量實(shí)驗(yàn)小鼠和對照小鼠；(ii)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件均重復(fù)多次，累加重復(fù)天數(shù)產(chǎn)生最終對象數(shù)目。拍攝每個(gè)期間的行進(jìn)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者不知道(不知情)在訓(xùn)練和檢測期間對象的處理情況。使用軟件包(StatView5.0.1；SASInstitute,Inc)通過Student's不成對t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。除非特備指出，文中和圖中所有數(shù)值均以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先研究情景記憶中海馬Gprl2的功能。將非靶向siRNA(η=19)或Gprl2siRNA(η=20)注入小鼠海馬中。在最后一次注射siRNA之后3天，用設(shè)計(jì)的情景條件反射范式訓(xùn)練動(dòng)物以誘導(dǎo)弱情景記憶(Scottetal.,2002JMoINeurosci19，171-177.)、(Tullyetal，2003NatRevDragDiscov2,267-277)在訓(xùn)練24小時(shí)后，Gprl2DM-2siRNA處理的動(dòng)物證實(shí)顯著增強(qiáng)的情景記憶(24小時(shí)記憶p<0.05，圖4a)。接下來研究杏仁核中Gprl2對于情景記憶形成的功能。在小鼠杏仁核中灌注非靶向siRNA(η=20)或者Gprl2siRNA(η=21)并檢測情景記憶。正如海馬中Gprl2敲低一樣，在訓(xùn)練后24小時(shí)，Gprl2siRNA處理的動(dòng)物證實(shí)顯著增強(qiáng)的情景記憶(24小時(shí)記憶:p<0.01，圖4b)。有4只小鼠由于錯(cuò)誤插管而排除在該分析之外(2X非靶向siRNA，2XGpr12-2siRNA)。對于痕跡條件反射訓(xùn)練，使用標(biāo)準(zhǔn)化小鼠情景恐懼條件反射設(shè)備(MedAssociates,Inc.,VA；(Bourtchuladzeetal.,1994Cell79,59-68)、(Bourtchouladzeetal.，1998LearnMem5,365-374)在訓(xùn)練當(dāng)天，將小鼠置于條件反射室中2分鐘，之后給予條件刺激(CS)，在75dB持續(xù)20秒的2800Hz音調(diào)。在該音調(diào)結(jié)束后60秒，給予動(dòng)物0.5mA電擊非條件刺激(US)2秒。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明這個(gè)訓(xùn)練范式在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)不佳的痕跡恐懼記憶，且這種記憶可以通過CREB途徑的增強(qiáng)劑而促進(jìn)。在室內(nèi)額外30秒之后，將小鼠返回其自己的籠子中。在檢測每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象之后，用75%乙醇、水對實(shí)驗(yàn)設(shè)備徹底清潔，并干燥和通風(fēng)幾分鐘。在位于另一操作室內(nèi)的新室內(nèi)進(jìn)行檢測以避免情景條件反射的混淆影響。除去內(nèi)部條件反射室，用小鼠籠子代替。將不同顏色帶子置于每個(gè)籠子的后面以彼此區(qū)分。交替使用三個(gè)不同籠子以降低對象之間氣味污染的可能性。將30瓦的燈置于室內(nèi)以保證訓(xùn)練和檢測之間的照明差異。將籠子使用肥皂溶液而非乙醇進(jìn)行清潔。每次檢測以僅2分鐘光照開始(pre-CS)，然后給予20秒音調(diào)(CS)，隨后再僅光照30秒(post-CS)。以與訓(xùn)練期間相同方式，每次對一只小鼠在5秒期間的“僵直”評分，由避免此上述的情景條件反射。拍攝每個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。特異于聽覺記憶的僵直應(yīng)答的比例通過從CS僵直中減去preCS僵直(非特異性)而確定。研究了海馬Gprl2在痕跡恐懼記憶中的功能。如情景條件反射所述，在小鼠海馬中灌注非靶向siRNA(η=20)或者Gprl2siRNA(η=23)。當(dāng)用一組CS/US配對和60秒痕跡間隔訓(xùn)練時(shí)，Gprl2DM-2siRNA處理的動(dòng)物證實(shí)顯著增加的痕跡條件反射(CS-preCS:p<0.01，圖5)。重要地，Gpr12siRNA而非對照siRNA處理的動(dòng)物增加其對于呈現(xiàn)的音調(diào)CS的僵直應(yīng)答。因此，與情景條件反射相似，siRNA-介導(dǎo)的海馬Gprl2敲低促進(jìn)痕跡條件反射。在痕跡恐懼條件反射期間，Gprl2siRNA不顯著影響即時(shí)僵直(immediatefreezing)(非靶向siRNA3.3士1.5%；Gprl2siRNA5.1士1.6%；ρ=0.44；數(shù)據(jù)未示出)。綜合這些結(jié)果示出Gprl2在海馬和杏仁核中均是記憶形成的負(fù)調(diào)節(jié)物，這是小鼠以及人記憶形成中關(guān)鍵的兩個(gè)顳葉結(jié)構(gòu)。重要地，Gprl2siRNA誘導(dǎo)“功能增益(gainoffunction)”(即記憶形成增強(qiáng))。這種對于行為可塑性的作用不太可能是由Gprl2siRNA的副作用誘導(dǎo)的。因此，Gprl2是海馬和杏仁核中記憶的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。實(shí)施例6:Gprl2敲除小鼠Gpr12敲除小鼠Gpr12敲除小鼠得到Deltagen(SanCarlos,CA94070，U.S.A)許可。通過雄性Gprl2+/_小鼠與雌性C57B1/6小鼠(TaconicFarms,USA)繁殖產(chǎn)生優(yōu)勢C57B1/6背景(C57B1/6中5次回交)中雜合Gprl2K0小鼠(稱作Gpr12+/"小鼠)以及WT同窩出生的對照小鼠。通過聚合酶鏈反應(yīng)確定小鼠基因型。將性別平衡的3-6月齡的雄性和雌性小鼠用于行為分析。評估Gpr12+/-小鼠海馬中Gpr12和對照mRNA水平海馬分離自Gpr12+/-小鼠(n-3)、Gprl2-/_小鼠(η=2)和WT同窩出生的對照小鼠(η=3)。使用QIAgenRNeasy試劑盒(Qiagen)分離RNA。使用TagMan逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AppliedBiosystems)產(chǎn)生cDNA。使用請求式ABI測定(AppliedBiosystems)確定Gprl2、Crebl和Grinl的mRNA水平并根據(jù)TATA結(jié)合蛋白(TBP)標(biāo)準(zhǔn)化。新目標(biāo)識(shí)別訓(xùn)練與檢測手持動(dòng)物3-5分鐘，進(jìn)行3天。在訓(xùn)練前一天，將各個(gè)動(dòng)物置于位于暗光房間的訓(xùn)練設(shè)備中(Plexiglas箱，L=48cm,W=38cm,H=20cm)，使其習(xí)慣環(huán)境15分鐘(也見Bourtchouladze,2003所述)。在習(xí)慣環(huán)境后24小時(shí)開始訓(xùn)練。將動(dòng)物置于含有兩個(gè)相同目標(biāo)(例如小圓錐形目標(biāo))的訓(xùn)練箱中，使其探查這些目標(biāo)。將目標(biāo)置于箱子中心區(qū)，在對象之間均衡目標(biāo)的空間位置(左-右側(cè))。訓(xùn)練動(dòng)物10、15或20分鐘。將花費(fèi)少于2秒探查的小鼠從該分析中排除。為了檢測長期記憶保持，在訓(xùn)練后24小時(shí)觀測小鼠10分鐘。為了檢測短期(轉(zhuǎn)錄非依賴性)記憶，在訓(xùn)練后3小時(shí)觀測小鼠10分鐘(Bourtchouladze,2003)。為動(dòng)物呈現(xiàn)兩個(gè)目標(biāo)，一個(gè)目標(biāo)在訓(xùn)練期間使用，-并因此是“熟悉的”，另一目標(biāo)是新的(例如小錐形目標(biāo))。確定目標(biāo)記憶指數(shù)為((新探查-熟悉探查)/總探查X100)。為了控制對于探查的非特異性作用，也計(jì)算檢測期間總探查時(shí)間。為了保證辨別目標(biāo)無氣味差異，在每次實(shí)驗(yàn)后，用90%乙醇徹底清潔設(shè)備和目標(biāo)、干燥并通風(fēng)幾分鐘。開場(Openfield)這是測量動(dòng)物運(yùn)動(dòng)活件和探杳件的常用檢測方法(Logue，1997，Barad，1998)。在開始檢測之前1小時(shí)將動(dòng)物從一般動(dòng)物居處移至實(shí)驗(yàn)室中。與先前所述(Barad，1998)相似地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)開放場所中，使用計(jì)算機(jī)跟蹤系統(tǒng)(EthoVisionbyNoldus,Inc.，VA)觀測30分鐘。兩個(gè)箱子同時(shí)進(jìn)行，對動(dòng)物行進(jìn)距離(步行)和直立行為評分。在各個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間，用75%乙醇徹底清潔設(shè)備、干燥并通風(fēng)幾分鐘。由不知情的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對每個(gè)實(shí)驗(yàn)的行進(jìn)均錄像。量化如下測量1)在開放場地的水平活動(dòng)(步行)，2)垂直活動(dòng)(直立)。表3示出結(jié)果證實(shí)Gprl2是海馬中記憶調(diào)節(jié)基因。圖中示出Affymetrix基因-芯片分析的P值和delta(相對表達(dá)的log2)。痕跡條件反射數(shù)據(jù)通過Nimble-芯片分析獨(dú)立地證實(shí)。情景條件反射數(shù)據(jù)通過重復(fù)Affymetrix-芯片及通過qPCR證實(shí)。表3比較時(shí)間點(diǎn)P值(p<0.05限制性)|Delta(l0g2值)證實(shí)痕跡條件反射的~~0.033-0.14Nimble-芯片次實(shí)驗(yàn)的(籠養(yǎng))_____情景條件反射與初次Ih0.0003-0.28Affy-芯片，qPCR實(shí)驗(yàn)(籠養(yǎng))_____Gprl2在雜合KO小鼠(Gprl2+/_小鼠)中的慢性抑制作用siRNA數(shù)據(jù)表明在完整的成年小鼠中Gprl2的急性抑制作用促進(jìn)長期記憶。為了檢測Gprl2的慢性系統(tǒng)性廣泛的抑制作用對于長期記憶的影響，分析Gprl2+/_小鼠。先前已經(jīng)分析了純合Gprl2敲除小鼠(Gprl2-/_小鼠)。純合敲除小鼠呈現(xiàn)出削弱的運(yùn)動(dòng)、削弱的在Rotarod上的運(yùn)動(dòng)能力、在莫里斯水迷宮(MorrisWaterMaze)中削弱的運(yùn)動(dòng)功能和學(xué)習(xí)(游泳)能力、痛覺過敏(hyperanalgesia)，且其示出肝腎疾病的跡象(專利申請WO2005/027628,Carlton,2005)。另一項(xiàng)研究證實(shí)純合Gprl2敲除小鼠發(fā)生血脂異常和肥胖(BjUrSell，2006)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)示出純合Gprl2敲除小鼠具有許多一般性和發(fā)展性誘導(dǎo)的健康問題。預(yù)期在這些突變體中由于一般健康問題而發(fā)生認(rèn)知功能削弱。雖然未獲得關(guān)于雜合Gprl2K0小鼠(Gprl2+/_)的數(shù)據(jù)，但是從先前的這些研究(Carlton,2005；Bjursel1，2006)中預(yù)期在這些小鼠中長期記憶被削弱，盡管程度較純合突變體低。然而，未曾預(yù)料的結(jié)果是在Gprl2+/_小鼠中長期記憶是否被加強(qiáng)。兩個(gè)Gprl2等位基因在Gprl2-/_小鼠中均是無活性的，這些小鼠無可檢測的Gprl2mRNA表達(dá)(WT對照組0%)，Crebl表達(dá)略降低，而Grinl水平正常(分別為81士1%和102士2%對照組；圖8a)。兩個(gè)Gprl2等位基因中僅一個(gè)基因在Gprl2+/_小鼠中是無活性的，這些小鼠呈現(xiàn)51士8%的WTGprl2mRNA0Gprl2mRNA水平因此與純合敲除小鼠不同。在Gprl2+/_小鼠中，Crebl和Grinl的mRNA不受影響(分別為102士8%和101士4%;圖8a)。通過甲酚紫染色對Gprl2+/_海馬進(jìn)行總體組織學(xué)分析未表明雜合突變體與WT對照之間的任何明顯差異(圖8b)。雜合Gwl2敲除小鼠Φ—般運(yùn)云M舌件和開放場所探杳件講行開放場所檢測丨以檢測是否如先前從純合KO小鼠的結(jié)果中預(yù)期的那樣Gprl2+/_小鼠中一般運(yùn)動(dòng)活性和探查性被削弱。測量開放場所中的水平活動(dòng)(步行)，發(fā)現(xiàn)雜合突變體與WT小鼠之間運(yùn)動(dòng)活性無差異(所有時(shí)間點(diǎn)ρ>0.05；student'st-檢驗(yàn)；圖9a)。在Gpr12+/-小鼠和WT對照之間垂直活動(dòng)(直立)也無差異(所有時(shí)間點(diǎn)ρ>0.05；student'st_檢驗(yàn)；圖9b)。這些結(jié)果表明在雜合Gprl2突變小鼠中運(yùn)動(dòng)活性和探查性是正常的。在雜合GDrl2敲除小鼠中新目標(biāo)識(shí)別記憶目標(biāo)識(shí)別是小鼠和大鼠的行為學(xué)相關(guān)任務(wù)，其非得自負(fù)性強(qiáng)化(足部電擊)。這個(gè)任務(wù)依賴于嚙齒動(dòng)物探查其環(huán)境中的新目標(biāo)而非熟悉目標(biāo)的天然好奇心。顯然，對于目標(biāo)是“熟悉的”，則動(dòng)物必須在之前已經(jīng)經(jīng)歷其并記住。因此，具有較好記憶的動(dòng)物將致力于并探查新目標(biāo)而非熟悉目標(biāo)。近來在人體中進(jìn)行的神經(jīng)影像學(xué)研究證實(shí)目標(biāo)識(shí)別中的記憶包含前額皮層(Deibert，1999)，這是由于年老而受顯著影響的結(jié)構(gòu)(Hedden，2004)。對猴子和嚙齒動(dòng)物進(jìn)行的其它研究提示海馬在新目標(biāo)識(shí)別中是重要的(Teng，2000；Mumby，2001)。因此，新目標(biāo)識(shí)別提供了良好的行為學(xué)模型以評估藥物_化合物對于與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬和皮質(zhì)功能相關(guān)認(rèn)知任務(wù)的影響。與情景和痕跡條件反射一樣，目標(biāo)識(shí)別的長期記憶依賴于訓(xùn)練條件(Bourtchouladze,2003)o為了建立保持對于目標(biāo)識(shí)別訓(xùn)練的短期記憶而非長期記憶的條件，對與Gprl2突變小鼠相同遺傳背景的WT小鼠(η=19)訓(xùn)練10分鐘、15分鐘或20分鐘(圖10)。當(dāng)24小時(shí)后檢測時(shí)，訓(xùn)練10分鐘的小鼠示出對于新目標(biāo)無優(yōu)選性(記憶評分2.2士8.0)，而訓(xùn)練15分鐘或20分鐘的小鼠證實(shí)對于新目標(biāo)的優(yōu)選性(記憶評分訓(xùn)練15分鐘和20分鐘分別為21.0士7.0和34.3士4.9)。因此，10分鐘的訓(xùn)練不足以誘導(dǎo)長期目標(biāo)識(shí)別記憶。接著，檢測Gpr12+/"(η=15)和WT同窩出生小鼠(η=16)中在訓(xùn)練10分鐘后的長期目標(biāo)識(shí)別記憶(圖11)。當(dāng)在24小時(shí)后檢測時(shí)，Gprl2+/-小鼠而非WT對照小鼠證實(shí)長期目標(biāo)識(shí)別記憶(記憶評分=WT小鼠與Gprl2+/"小鼠分別為6.0士8.2與28.7士4.9；P<0.05，student's不成對t_檢驗(yàn)；圖Ila)。訓(xùn)練(ρ=0.34)和檢測(ρ=0.63)期間總探查性無差異，表明Gprl2+/_小鼠中長期記憶的促進(jìn)不是由于探查活性的一般性增加所致(圖lib)。在Gprl2+/_小鼠(η=6)和WT同窩出生小鼠(η_8)中也進(jìn)行短期目標(biāo)識(shí)別記憶(圖12)。當(dāng)在訓(xùn)練后3小時(shí)檢測時(shí)，突變體與對照之間短期目標(biāo)識(shí)別記憶相似(記憶評分=WT小鼠與Gprl2+/_小鼠分別為25.6士6.6與18.2士4.8;p=0,41,student's不成對t-檢驗(yàn)；圖12a)。在檢測期間組間總探查性無差異(ρ=0.28;圖12b)。重要地且與先前的研究(BOurtChOuladze，2003)—致的是WT小鼠證實(shí)在訓(xùn)練10分鐘后目標(biāo)記憶的顯著短期保持。然而，僅Gprl2+/_小鼠示出長期保持(圖11)，表明Gprl2的雜合敲低特異性增強(qiáng)長期記憶。因此，雜合Gprl2突變小鼠(具有一個(gè)功能性Gprl2等位基因)的運(yùn)動(dòng)活性和探查性不具有明顯缺陷。對長期目標(biāo)識(shí)別記憶的分析揭示了未曾預(yù)料的發(fā)現(xiàn)，即在雜合Gprl2敲除小鼠中長期記憶鞏固是增強(qiáng)的。相反，短期記憶正常。這些發(fā)現(xiàn)與在海馬和杏仁核中siRNA對Gprl2抑制作用之后的情景和時(shí)間記憶的促進(jìn)是一致的。本說明書中用于闡明本發(fā)明背景以及在特定情況中提供關(guān)于實(shí)施的額外詳細(xì)描述而提及的所有出版物、專利和專利申請?jiān)诖艘悦總€(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾執(zhí)囟ê蛦为?dú)并入?yún)⒖嫉南嗤潭炔⑷氡疚淖鲄⒖肌ｋm然結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方案特別揭示和描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解在不偏離所附權(quán)利要求書包含的本發(fā)明范圍的前提下可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改變。權(quán)利要求一種包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gpr12活性的藥劑的方法。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是成年哺乳動(dòng)物。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致長期記憶形成調(diào)節(jié)。5.權(quán)利要求4的方法，其中長期記憶形成被增強(qiáng)。6.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括檢測所述長期記憶形成中的所述調(diào)節(jié)作用。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述調(diào)節(jié)作用的所述檢測是檢測對海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述調(diào)節(jié)作用的所述檢測是檢測對杏仁核依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述調(diào)節(jié)作用的所述檢測是檢測對海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)和杏仁核依賴性認(rèn)知任務(wù)的調(diào)節(jié)作用。10.權(quán)利要求1的方法，其中Gprl2活性的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gprl2蛋白表達(dá)。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致認(rèn)知功能增強(qiáng)。12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在足以使得特定認(rèn)知任務(wù)的執(zhí)行能力(performance)改良的條件下訓(xùn)練所述哺乳動(dòng)物的步驟。13.權(quán)利要求12的方法，其中相對于在沒有所述施用的條件下單獨(dú)通過訓(xùn)練獲得的所述認(rèn)知任務(wù)的執(zhí)行能力而獲得執(zhí)行能力增益。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述訓(xùn)練包括多個(gè)訓(xùn)練期。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述訓(xùn)練包括有間隔的訓(xùn)練期。16.權(quán)利要求12的方法，其中所述藥劑在每個(gè)訓(xùn)練期之前和/或期間施用。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑包含一或多種有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物學(xué)活性Gprl2反義片段和/或有效量的特異于Gprl2蛋白的抗體。18.一種方法，其包括如下步驟(a)將感興趣的藥劑導(dǎo)入表達(dá)Gprl2蛋白的宿主細(xì)胞中；(b)確定Gprl2功能，其中在(b)中確定的Gprl2功能與未施用所述藥劑的(a)的宿主細(xì)胞中Gprl2功能相對比的差異鑒定所述藥劑是能調(diào)節(jié)Gprl2功能的藥劑。19.一種方法，其包括如下步驟(a)給哺乳動(dòng)物施用調(diào)節(jié)Gprl2功能的藥劑；(b)在足以在所述哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生長期記憶形成的條件下訓(xùn)練步驟(a)的哺乳動(dòng)物和與其相同物種的未給予所述藥劑的對照哺乳動(dòng)物；(c)評估在步驟(b)中訓(xùn)練的哺乳動(dòng)物中長期記憶形成；(d)對比步驟(c)中評估的哺乳動(dòng)物中長期記憶形成，其中評估的施用所述藥物的哺乳動(dòng)物中長期記憶形成相對于評估的對照哺乳動(dòng)物中長期記憶形成的差異確定所述藥劑是能調(diào)節(jié)長期記憶形成的藥劑。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是成年哺乳動(dòng)物。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述長期記憶形成是海馬依賴性長期記憶形成。23.權(quán)利要求19的方法，其中所述長期記憶形成是杏仁核依賴性長期記憶形成。24.權(quán)利要求19的方法，其中所述長期記憶形成是海馬依賴性和杏仁核依賴性長期記憶形成。25.權(quán)利要求19的方法，其中Gprl2活性的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中Gprl2蛋白表達(dá)。26.權(quán)利要求19的方法，其中所述訓(xùn)練包含多個(gè)訓(xùn)練期。27.權(quán)利要求19的方法，其中所述訓(xùn)練包含有間隔的訓(xùn)練期。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述藥劑在每個(gè)訓(xùn)練期之前和/或期間施用。29.權(quán)利要求19的方法，其中所述藥劑包含一或多種有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物學(xué)活性Gprl2反義片段和/或有效量的特異于Gprl2蛋白的抗體。全文摘要本發(fā)明提供了篩選藥劑的方法，所述藥劑具有調(diào)節(jié)長期記憶形成、海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)執(zhí)行能力或Gpr12功能的能力。本發(fā)明也提供了通過調(diào)節(jié)Gpr12-依賴性蛋白質(zhì)表達(dá)從而調(diào)節(jié)長期記憶形成或者海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)執(zhí)行能力的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過抑制Gpr12功能治療長期記憶形成缺陷的方法以及通過抑制Gpr12功能治療海馬依賴性認(rèn)知任務(wù)執(zhí)行能力缺陷的方法。文檔編號(hào)A61K31/70GK101808647SQ200880023965公開日2010年8月18日申請日期2008年5月15日優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日發(fā)明者M(jìn)·彼得斯,R·E.·M.·斯科特,T·P.·塔利申請人:海利空醫(yī)療公司