專利名稱：：檢測(cè)和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗有絲分裂劑的敏感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于腫瘤對(duì)P微管蛋白的表達(dá)的特征來(lái)篩選腫瘤對(duì)抗有絲分裂劑的敏感性的方法，以及涉及用于調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中e微管蛋白，特別是II類、III類或IVb類15微管蛋白的表達(dá)的方法。本發(fā)明還涉及用于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷和環(huán)氧聚微管素等微管蛋白結(jié)合劑以及對(duì)其它抗癌劑的敏感性的分子和方法。
背景技術(shù)：
：微管是真核細(xì)胞中細(xì)胞分裂所必需的，并且充當(dāng)確保染色體分開(kāi)和隔離的紡錘體的一部分。微管的主要成分是形成異二聚體的a和13微管蛋白。目前為止已鑒定出至少7種不同的|3微管蛋白同種型。根據(jù)羧基端域的序列將這些同種型劃分如F(羅馬數(shù)字的類別數(shù)是指蛋白同種型而括號(hào)中為人類基因分類)I類(麗40)、II類(H緣III類(H|54)、I:Va類(H:5|5)、]:Vb類(H|32)、V類禾PV]:類(HP1)。不同的同種型展示出不同的組織表達(dá)模式。例如，III類13微管蛋白通常僅在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)。微管蛋白結(jié)合劑是包括卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、晚期神經(jīng)母細(xì)胞瘤和各種淋巴瘤在內(nèi)的許多人類癌癥的治療中的重要組成部分。這些重要臨床藥劑包括如紫杉醇(paclitaxel(Taxol))等的紫杉垸(Taxane)、環(huán)氧聚微管素(印othilone)和如長(zhǎng)春花堿(vinblastine)等的長(zhǎng)春花生物堿(vincaalkaloid)，這些藥劑與來(lái)自a/|3微管蛋白的P微管蛋白結(jié)合并千擾微管動(dòng)力學(xué)從而誘導(dǎo)有絲分裂停滯和細(xì)胞凋亡。與微管蛋白結(jié)合后，己知紫杉烷和環(huán)氧聚微管素會(huì)增進(jìn)微管組裝,從而導(dǎo)致有絲分裂中聚合微管的穩(wěn)定化、異常紡錘體酯和細(xì)胞周期的停滯。相反，長(zhǎng)春花生物堿是第二類微管蛋白結(jié)合劑，這類微管蛋白結(jié)合劑通過(guò)阻斷參與微管蛋白二聚體連接的區(qū)域來(lái)誘導(dǎo)聚合微管蛋白的去穩(wěn)定化，從而阻止微管組裝?；阢K的DNA損傷劑是結(jié)合并修飾DNA的一大類抗癌藥,它們對(duì)治療各種不同癌癥有效且通常在與微管蛋白結(jié)合劑的組合療法中進(jìn)行施用。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)如紫杉烷、環(huán)氧聚微管素和長(zhǎng)春花生物堿等微管結(jié)合劑的抗性的發(fā)展是許多化學(xué)治療方案成功的重大障礙。肺癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥,每年診斷出超過(guò)一百萬(wàn)例肺癌，且其仍然是男性和女性中癌癥死亡的主要原因。晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占這些病例中超過(guò)8()%。超過(guò)半數(shù)的這些患者在診斷時(shí)已發(fā)展到腫瘤轉(zhuǎn)移，因此化學(xué)療法仍然是最有效的治療選擇。在上個(gè)十年中，如紫杉醇和長(zhǎng)春瑞濱等化學(xué)治療劑作為單一藥劑或作為組合化學(xué)治療方案的一部分在2期研究中的使用已顯示出可觀的活性和一年的延長(zhǎng)存活率。然而，由于耐藥性腫5瘤細(xì)胞的出現(xiàn)顯著限制了這些藥物在肺癌治療中的臨床應(yīng)用，故患者的預(yù)后總體而言仍然很差。于是，顯然需要對(duì)抗和克服這種抗性的方法和途徑以保證抗有絲分裂劑在癌癥治療中的連續(xù)療效。在不同的組織表達(dá)和所有物種中高度保守序列的基礎(chǔ)上，已提出每種15微管蛋白同種型可以提供在微管中賦予功能性差異的獨(dú)特特征。盡管在選用于抵抗包括紫杉醇、多烯紫杉醇和雌二醇氮芥在內(nèi)的抗微管劑的細(xì)胞系中已顯示出微管蛋白同種型表達(dá)的改變，但可用數(shù)據(jù)仍集中在！3lll微管蛋白在抗紫杉醇中的作用。對(duì)eill微管蛋白在細(xì)胞對(duì)其它類型的微管蛋白結(jié)合劑的響應(yīng)中的相關(guān)性或非e]::[:[微管蛋白同種型在對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的響應(yīng)中的相關(guān)性理解得很少。例如，II類13微管蛋白見(jiàn)于正常乳腺組織和腫瘤乳腺組織中，這表明它可能不是這些腫瘤的良好生物標(biāo)記。此外，盡管DNA損傷劑常用于與長(zhǎng)春花生物堿的組合療法中，但尚未確定PIII微管蛋白表達(dá)在這些藥劑的療效上的效果。耐藥性細(xì)胞研究的-個(gè)特別的難點(diǎn)是確定在抗性細(xì)胞中可能觀察到的13微管蛋白表達(dá)的變化是否促成抵抗表型或作為二級(jí)機(jī)制出現(xiàn)。對(duì)于多藥物抗性細(xì)胞而言進(jìn)行多重細(xì)胞變化是很平常的，因此它們可能弓i入不止一種抵抗機(jī)制。鑒于上述,對(duì)于治療性應(yīng)用而言，需要增強(qiáng)腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑和/或其它抗有絲分裂劑或DNA損傷劑的敏感性的藥劑。另外，理想的是能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行篩選以在開(kāi)始用眾多微管蛋白結(jié)合劑和/或其它抗有絲分裂劑治療之前和在治療療程期間預(yù)測(cè)它對(duì)的這些藥物的敏感性或潛在敏感性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人現(xiàn)已證實(shí)了在NSCLC細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的II類、III類或IVb類13微管蛋白與這些細(xì)胞對(duì)各種微管蛋白結(jié)合劑的響應(yīng)的相關(guān)性。于是，在第一方面，本發(fā)明提供了篩選用于抵抗或潛在抵抗微管蛋白結(jié)合劑的方法，所述方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的任何-種或多種，其中ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)表明腫瘤細(xì)胞具有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性或潛在抗性。在一個(gè)實(shí)施方式中，微管蛋白結(jié)合劑是微管去穩(wěn)劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，微管蛋白結(jié)合劑是微管穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的任何兩種II類、III類和IVb類e微管蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的II類、i]::[類和ivb類e微管蛋白。在某些實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的-種或多種的表達(dá)的檢測(cè)歩驟包括檢測(cè)ii類、in類和ivb類p微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、IH類和IVb類|3微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)的檢測(cè)步驟包括檢測(cè)n類、:i:n類和]:vb類e微管蛋白m:RM中的一種或多種的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)的檢測(cè)步驟可包括對(duì)微管蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量。腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)的檢測(cè)步驟可包括比較由腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類e微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)與由對(duì)照細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)。對(duì)照細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞，例如取自腫瘤周圍的組織的細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞可以是對(duì)微管蛋白結(jié)合劑抵抗的腫瘤細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞可以是對(duì)微管蛋白結(jié)合劑敏感的腫瘤細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞可以是其中II類、IH類和IVb類P微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)降低的腫瘤細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供了評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法。所述方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的類、:[i:i類和:[vb類e微管蛋白或類、]::[:[類和]:vb類e微管蛋白mRNA的量。由此獲得受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量。將受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量與對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量進(jìn)行比較從而確定微管蛋白量差異。對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量是對(duì)照細(xì)胞中II類、HI類和IVb類e微管蛋白或II類、IH類和IVb類e微管蛋白mRNA中的任何一種或多種各自的量?；谖⒐艿鞍琢坎町悂?lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性。在某些實(shí)施方式中，對(duì)II類、IH類和IVb類|3微管蛋白量的檢測(cè)是檢測(cè)II類、in類和ivb類e微管蛋白的量。在特定實(shí)施方式中，對(duì)II類、III類和IVb類P微管蛋白量的檢測(cè)是僅檢測(cè)III類13微管蛋白的量。在其它實(shí)施方式中，對(duì)II:類、III:類和IVb類15微管蛋白mRNA量的檢測(cè)是檢測(cè)II類、III類和IVb類13微管蛋白mRNA的量。在特定實(shí)施方式中，對(duì)II類、III類和IVb類P微管蛋白mRNA中的任何一種或多種量的檢測(cè)是僅檢測(cè)III類P微管蛋白mRNA的量。因而，當(dāng)檢測(cè)到"一種"II類、III類和IVb類13微管蛋白或mRNA時(shí)，也就檢測(cè)到了II類、III類和IVb類e微管蛋白或ra:RM中的任何一種或多種。在另-方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)至少-種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的方法，所述方法包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入有效量的至少一種包含對(duì)II類、III類和IVb類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體減少了腫瘤細(xì)胞中i]:類、in類和ivb類e微管蛋白的表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療受試對(duì)象中的腫瘤的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用有效量的至少一種包含對(duì)II類、III類和IVb類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體和對(duì)受試對(duì)象施用至少一種微管蛋白結(jié)合劑，其中所述核酸構(gòu)建體減少了腫瘤細(xì)胞中ii類、:n:[類和]:vb類e微管蛋白的表達(dá)從而增加了腫瘤對(duì)至少-一種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，將核酸構(gòu)建體和至少一種微管蛋白結(jié)合劑同時(shí)施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，將核酸構(gòu)建體和至少一種微管蛋白結(jié)合劑并行施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將核酸構(gòu)建體在至少一種微管蛋白結(jié)合劑之前施用。在上述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸序列是反義序列。在另--個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸序列是siRNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸序列是短發(fā)夾RNA。在再一個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸序列是核酶序列。7在上述任一方面的特定實(shí)施方式中，所述核苷酸序列對(duì)IVb類|3微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述核苷酸序列對(duì)II類P微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述核苷酸序列對(duì)III類15微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性。在上述任一方面的特定實(shí)施方式中，至少一種微管蛋白結(jié)合劑可以是至少一種微管去穩(wěn)劑。所述至少一種微管去穩(wěn)劑可以選自任何一種或多種長(zhǎng)春花生物堿劑、多拉司他汀(dolastatin)、秋水仙堿、念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)、curacinA、2-甲氧雌二醇和它們的衍生物、類似物或前藥。在特定實(shí)施方式中，微管去穩(wěn)劑是長(zhǎng)春花生物堿劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述長(zhǎng)春花生物堿劑選自任何-種或多種長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱或其衍生物、類似物或前藥。在上述任一方面的特定實(shí)施方式中，至少一種微管蛋白結(jié)合劑可以是至少一種微管穩(wěn)定劑。所述至少一種微管穩(wěn)定劑可以選自任何一種或多種紫杉烷和環(huán)氧聚微管素。紫杉烷可以是紫杉醇或多烯紫杉醇。環(huán)氧聚微管素可以是環(huán)氧聚微管素A、環(huán)氧聚微管素13或環(huán)氧聚微管素D。在上述方面的特定實(shí)施方式中，微管蛋白結(jié)合劑是長(zhǎng)春花生物堿劑、多拉司他汀、秋水仙堿、念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)、curacinA、2-甲氧雌二醇或環(huán)氧聚微管素。在特定實(shí)施方式中，受試對(duì)象是人。在另一方面，本發(fā)明提供了至少一種包含對(duì)ii類、in類和ivb類e微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體在制備用于增加腫瘤細(xì)胞對(duì)至少--種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的藥物中的使用，其中所述構(gòu)建體能減少腫瘤中II類、III類和IVb類|3微管蛋白的表達(dá)。此外，本發(fā)明還提供了用于增加腫瘤細(xì)胞對(duì)至少一種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種包含對(duì)i:i類、:n:[類和]:vb類e微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體以及藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述構(gòu)建體能減少腫瘤中ii類、in類和ivb類e微管蛋白的表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明提供了用于評(píng)估腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種包含對(duì)i:i類、:ni:類和]:vb類e微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體被用于檢測(cè)腫瘤中的ii類、in類和ivb類e微管蛋白表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含一種或多種微管蛋白結(jié)合劑。在特定實(shí)施方式中，對(duì)腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的診斷是體外診斷。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于評(píng)估腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含至少--種對(duì)任何一種ii類、in類和ivb類e微管多肽具有特異性的抗體，其中所述抗體被用于檢測(cè)腫瘤中的ii類、in類和ivb類p微管蛋白表達(dá)。在另一方面,本發(fā)明提供了用于治療腫瘤的試劑盒，所述試劑盒包括(i)包含至少一種包含對(duì):n類、in類和ivb類e微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體以及藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物，和任選的(ii)-種或多種微管蛋白結(jié)合劑。本發(fā)明還提供了用于增加腫瘤對(duì)一種或多種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的獸醫(yī)組合物，所述獸醫(yī)組合物包含至少一種包含對(duì)II類、III類和IVb類|3微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體以及可接受載體、稀釋劑或賦形劑。在另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)干擾與II類、IH類和/或IVb類|3微管蛋白相關(guān)的微管動(dòng)力學(xué)的藥劑進(jìn)行篩選的方法，所述方法包括將疑為干擾與i:i類、in:類或]:vb類e微管蛋白相關(guān)的微管動(dòng)力學(xué)的候選藥劑對(duì)表達(dá)至少一種II類、III類或ivb類e微管蛋白的第一細(xì)胞暴露并檢測(cè)所述細(xì)胞對(duì)候選藥劑的響應(yīng)，將候選藥劑暴露于其中細(xì)胞內(nèi)至少一種II類、in類或IVb類e微管蛋白的表達(dá)降低的相同類型的第二細(xì)胞并檢測(cè)第二細(xì)胞對(duì)候選藥劑的響應(yīng)，并比較第一細(xì)胞和第二細(xì)胞對(duì)候選藥劑的響應(yīng)，其中，與第一細(xì)胞的響應(yīng)相比改變的第二細(xì)胞的響應(yīng)象征了候選藥劑在干擾與ii類、in類和/或ivb類e微管蛋白相關(guān)的微管動(dòng)力學(xué)中的活性。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞的響應(yīng)是凋亡率的增加或降低。P-2微球蛋白異硫氰酸熒光素甘油醛3-磷酸脫氫酶非小細(xì)胞肺癌短發(fā)夾RNA短千擾RNAP2MFITCGAPDHNSCLCshRNAsiRNA定義在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"特異"在與反義、核酶、shRNA或siRNA構(gòu)建體的核苷酸序列相關(guān)使用時(shí)意味著基本特異但不必為專有特異。即，當(dāng)對(duì)II類、III類或IVb類P微管蛋白基因產(chǎn)物特異時(shí)，核苷酸序列也可與其它P微管蛋白同種型基因產(chǎn)物序列以足以抑制其表達(dá)的量交叉雜交?？赡軆?yōu)選的是,所述核苷酸序列不減少非II類、III類和/或ivb類e微管蛋白同種型的表達(dá)，或其使其它同種型的表達(dá)減少的比例小于使II類、III類和Z或IVb類13微管蛋白同種型的表達(dá)減少的比例。此外，例如，siRNA構(gòu)建體的核苷酸序列可能展示出小于100X的與II類、III類或IVb類13微管蛋白基因的序列一致性然而卻保留了其特異性。術(shù)語(yǔ)"特異"在與對(duì)II類、III類和/或IVb類13微管多肽特異的抗體相關(guān)使用時(shí)意在涵蓋能例如在EL]:SA或Western印跡測(cè)試中將這類微管多肽同種型中的--種與其它微管多肽同種型區(qū)分開(kāi)的抗體。在對(duì)IVb類13微管多肽"特異"的抗體的情形中，所述抗體將識(shí)別IV類13微管蛋白同種型的多肽，而不識(shí)別II類或III類P微管蛋白同種型。對(duì)IVb類13微管蛋白同種型特異的抗體不必能夠區(qū)分IVa類和IVb類13微管多肽。本文所用術(shù)語(yǔ)"有效量"在其含義內(nèi)包括了提供期望治療或預(yù)防效果的藥劑或化合物的足夠的量。所需確切量會(huì)根據(jù)如待治療物種、受試對(duì)象的年齡和一般狀況、待治療的病況的嚴(yán)重性、待施用的具體藥劑和施用模式等因素而對(duì)不同受試對(duì)象有所不同。因而，不可能指定確切的"有效量"。然而，對(duì)于任何給定情況，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適當(dāng)?shù)?有效量"。優(yōu)選的是，有效量在對(duì)腫瘤有毒性的同時(shí)對(duì)受試對(duì)象基本無(wú)毒。如本文所用，"減少"細(xì)胞中II類、IH類和/或IVb類P微管蛋白的"表達(dá)"的構(gòu)建體意在不僅涵蓋這些基因中任何一種、任何兩種或所有三種的表達(dá)的完全抑制，而且涵9蓋足以增加細(xì)胞對(duì)一種以上的微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的微管蛋白基因產(chǎn)物或多肽表達(dá)的減少。因而，考慮了與未暴露于所述構(gòu)建體的細(xì)胞相比至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%細(xì)胞中II類、III類和/或]:vb類e微管蛋白ra:RM或多肽的表達(dá)的減少?？蓛?yōu)選的是，細(xì)胞中類、:i:n類和/或ivb類e微管蛋白表達(dá)的減少足以獲得細(xì)胞對(duì)一種以上的微管去穩(wěn)劑的敏感性的最大增加。可以理解，所述構(gòu)建體對(duì)II類、III類和/或IVb類P微管蛋白的表達(dá)的減少可能是永久性的，例如當(dāng)所述構(gòu)建體被穩(wěn)定引入其所暴露的體細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的基因組內(nèi)時(shí)，或可能僅是臨時(shí)性的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"包含"是指"包含但不必僅包含"。此外，如"包含"一詞的變化形式具有相應(yīng)變化的含義。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，對(duì)于"一個(gè)"要素的指代不排除復(fù)數(shù)，除非上下文另外確定。例如，對(duì)"一個(gè)核酸構(gòu)建體"的指代不應(yīng)被解讀為排除多個(gè)拷貝的這種核酸構(gòu)建體的可能性。相似地，在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中對(duì)"--個(gè)腫瘤細(xì)胞"的指代意在解讀為包括單個(gè)腫瘤細(xì)胞或多個(gè)腫瘤細(xì)胞，例如獲自腫瘤的細(xì)胞集合。術(shù)語(yǔ)"II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的任何一種或多種"意在涵蓋II類e微管蛋白、:[i]:類e微管蛋白、]:vb類e微管蛋白、:[:[類和類e微管蛋白、:[]:類和ivb類e微管蛋白、III類和ivb類e微管蛋白以及II類、III類和ivb類e微管蛋白中的任何一種。在腫瘤細(xì)胞與微管蛋白結(jié)合劑或DNA損傷劑之間的相互作用的背景下，術(shù)語(yǔ)"敏感性"和如"靈敏"等對(duì)應(yīng)術(shù)語(yǔ)意在涵蓋腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑或DNA損傷劑的抗有絲分裂活性和Z或細(xì)胞毒性活性的響應(yīng)。因而，帶有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的增強(qiáng)的敏感性的腫瘤細(xì)胞可能顯示出更大的有絲分裂抑制程度，和/或可能在暴露于微管蛋白結(jié)合劑時(shí)比更不靈敏的腫瘤細(xì)胞顯示出更大的細(xì)胞死亡程度。替代性地或除此以外，具有對(duì)于微管蛋白結(jié)合劑增加的或增強(qiáng)的敏感性的腫瘤細(xì)胞可能響應(yīng)于其此前不響應(yīng)的微管蛋白結(jié)合劑的抗有絲分裂活性和/或細(xì)胞毒性活性。另外或替代性地，具有對(duì)于微管蛋白結(jié)合劑增加的或增強(qiáng)的敏感性的腫瘤細(xì)胞可能在暴露于微管蛋白結(jié)合劑時(shí)顯示出對(duì)電離輻射和/或DNA損傷劑的增加的敏感性。具有對(duì)于微管蛋白結(jié)合劑增加的或增強(qiáng)的敏感性的腫瘤細(xì)胞也可能比更不靈敏的細(xì)胞在更低的微管蛋白結(jié)合劑濃度下響應(yīng)于微管蛋白結(jié)合劑的抗有絲分裂活性和/或細(xì)胞毒性活性。在體外或原位腫瘤細(xì)胞的背景F，對(duì)于一種或多種微管蛋白結(jié)合劑增強(qiáng)的敏感性可能表現(xiàn)為培養(yǎng)物中或原位活細(xì)胞數(shù)量減少地更多、腫瘤增大進(jìn)程減少地更多或在用一種或多種微管蛋白結(jié)合劑治療時(shí)腫瘤尺寸減少地更多。相反，術(shù)語(yǔ)"抵抗"和諸如"抗性"等類似術(shù)語(yǔ)具有與"靈敏"對(duì)應(yīng)但相反的含義?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)可利用的各種方法來(lái)直接評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑或DNA損傷劑的抗性。這類技術(shù)的實(shí)例包括將腫瘤細(xì)胞暴露于一系列微管蛋白結(jié)合劑或DNA損傷劑的稀釋溶液并確定觀察到50%死亡時(shí)的濃度、或凋亡率增加時(shí)的濃度或細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)的抑制或者細(xì)胞分裂速率降低時(shí)的濃度。合適的測(cè)試描述于例如Verrills等(2003)ChemistryandBiology10:597-607禾口Gan等(2007)CancerResearch67:(19)9356-9363中，此處通過(guò)引用引入其內(nèi)容。類似地，當(dāng)描述腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的"響應(yīng)"時(shí)，考10慮到該響應(yīng)可能包括腫瘤細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)或者腫瘤細(xì)胞分裂速率的降低或停止的任何一禾中^ffi禾中。術(shù)語(yǔ)"微管蛋白結(jié)合劑"意在包括調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白聚合和/或解聚動(dòng)力學(xué)的分子，并且包含微管去穩(wěn)劑和微管穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)"微管蛋白去穩(wěn)劑"意在廣泛涵蓋與微管蛋白二聚體結(jié)合并使微管蛋白二聚體形成為微管去穩(wěn)定化的化合物類別。微管蛋白和微管由于其功能常常在許多癌癥類型中失調(diào)而經(jīng)常被化學(xué)療法作為靶標(biāo)。靶向微管蛋白或微管的試劑由目前用于延長(zhǎng)患有晚期疾病的受試對(duì)象的生存時(shí)間的抗癌劑中最有效的化學(xué)治療劑類別組成。通常，微管去穩(wěn)劑可以結(jié)合微管蛋白的長(zhǎng)春花域或秋水仙堿域。包括各種微管去穩(wěn)劑的與微管蛋白相互作用的各種抗有絲分裂劑描述于IIamel(1996)Med.Res.Rev.16:207-231中，此處通過(guò)引用引入其全部?jī)?nèi)容。微管去穩(wěn)劑可以是長(zhǎng)春花生物堿劑、多拉司他汀、秋水仙堿、念珠藻環(huán)肽(crypt邵hycin)、curacinA、2-甲氧雌二醇和它們的衍生物、類似物或前藥。術(shù)語(yǔ)微管去穩(wěn)劑并非意在涵蓋如紫杉烷(包括紫杉醇和多烯紫杉醇)和環(huán)氧聚微管素等結(jié)合微管聚合物并穩(wěn)定微管的化合物。術(shù)語(yǔ)"長(zhǎng)春花生物堿劑"意在廣泛涵蓋最初源自長(zhǎng)春花屬的植物的生物堿化合物類別，這類化合物擁有抗微管活性并且充當(dāng)有絲分裂抑制劑。這類化合物的成員包括但不限于長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱及其半合成或合成類似物或衍生物。術(shù)語(yǔ)"微管穩(wěn)定劑"意在涵蓋與聚合的微管相結(jié)合并抑制聚合的微管的解聚的那些化合物。微管穩(wěn)定劑化合物包含但不限于紫杉垸和環(huán)氧聚微管素?，F(xiàn)在將僅通過(guò)實(shí)施例的方式并參考附圖對(duì)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，其中圖1顯示了針對(duì)(directedagainst.)PII或PIVb微管蛋白的siRNA特異性抑制了其各自的表達(dá)。圖IA展示了在以25nM和100nM的量分別針對(duì)PII和PIVb的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染后48h時(shí)通過(guò)半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR聚丙烯酰胺凝膠確定的13II(H|39)和13IVb(HP2)在兩個(gè)NSCLC細(xì)胞系Calu-6和H:46()中的基因產(chǎn)物(niRNA)表達(dá)。將表達(dá)水平相對(duì)恒定的管家基因|3-2微球蛋白(132M)用于將各個(gè)微管蛋白mRNA的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。圖IB展示了轉(zhuǎn)染后72h通過(guò)蛋白印跡鑒定的13II和13IVb微管蛋白的表達(dá)。將GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)多肽的表達(dá)作為加載對(duì)照同時(shí)檢測(cè)。M:模擬轉(zhuǎn)染；C:對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染；|3II:11類13微管蛋白si:RM轉(zhuǎn)染；|3:[Vb:IVb類|3微管蛋白siRNA轉(zhuǎn)染；|32M:|52微球蛋白對(duì)昭。圖2顯示了所用siRNA的特異性，如蛋白印跡中所示。圖2A展示了I311siRNA特異性。圖2B展示了0IVbsiRNA特異性。對(duì)|3II或0IVb敲弱(knockdown)細(xì)胞中的其它e微管蛋白同種型沒(méi)有觀察到蛋白表達(dá)水平的顯著變化。圖3顯示了II類|3微管蛋白敲弱在兩個(gè)NSCLC細(xì)胞系Calu_6和H460對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性上的影響。在模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)心圓，實(shí)線)、對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(空心方塊，實(shí)線)和0IIsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)心菱形，虛線)上進(jìn)行克隆(clonogenic)測(cè)試。該圖顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的暴露于A)長(zhǎng)春新堿、B)紫杉醇和C)環(huán)氧聚微管素的克隆存活細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示了至少4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。圖4顯示了IVb類|3微管蛋白敲弱在兩個(gè)NSCLC細(xì)胞系Calu-6和H460對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性上的影響。在模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)心圓，實(shí)線)、對(duì)照si:RM轉(zhuǎn)染細(xì)胞(空心方塊，實(shí)線)和eiVbsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)心菱形，虛線)上進(jìn)行克隆測(cè)試。該圖顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的暴露于A)長(zhǎng)春新堿、B)紫杉醇和C)微管穩(wěn)定劑環(huán)氧聚微管素B的克隆存活細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示了至少4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。圖5提供了培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系Ca:lu-6的菌落的照片，顯示了Calu-6轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(左列)和紫杉醇(右列)的劑量響應(yīng)。轉(zhuǎn)染24h后，將各個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞群的約600個(gè)細(xì)胞接種至含有遞增濃度的微管蛋白結(jié)合劑的6孔板內(nèi)。當(dāng)形成可見(jiàn)菌落時(shí)用結(jié)晶紫對(duì)板進(jìn)行染色。轉(zhuǎn)染使得用PIVbsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿過(guò)分敏感，但與對(duì)照相比轉(zhuǎn)染對(duì)紫杉醇敏感性沒(méi)有影響。圖6提供了顯示模擬轉(zhuǎn)染的、對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的以及|3IVbsiRNA轉(zhuǎn)染的Calu-6和H460細(xì)胞中[3H]長(zhǎng)春新堿的細(xì)胞攝取和保留的圖。PIVb敲弱細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞在胞內(nèi)長(zhǎng)春新堿含量上沒(méi)有顯著差異?？招闹文M和對(duì)照SiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；實(shí)心柱形15IVbsi:RM轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所顯示值是至少4次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。圖7提供了顯示在用長(zhǎng)春新堿或紫杉醇處理時(shí)IBII或13IVb敲弱在微管網(wǎng)絡(luò)上的影響的顯微照片。siRNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí)用a微管蛋白固定并染色Calu-6細(xì)胞。PII和PIVb轉(zhuǎn)染物都展示出正常的微管細(xì)胞骨架。圖7A展示出長(zhǎng)春新堿處理在0II或PIVbsi:RM轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微管上的效果。當(dāng)用i()nM長(zhǎng)春新堿處理時(shí)in:]:和e]:vb轉(zhuǎn)染物與對(duì)照相比都顯示出微管的極大破壞。圖7B展示了紫杉醇在！3II轉(zhuǎn)染物的微管上的效果。在與lOnM紫杉醇溫育后，PII轉(zhuǎn)染物的微管網(wǎng)絡(luò)與對(duì)照相當(dāng)。圖8顯示了13II和PIVb轉(zhuǎn)染的II460細(xì)胞在暴露于長(zhǎng)春新堿后的細(xì)胞周期分析。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與5nM或4()nM的長(zhǎng)春新堿溫育24h;用碘化丙啶固定并染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。圖8A展示出！3II轉(zhuǎn)染物顯示與對(duì)照相當(dāng)?shù)腉fM積聚。圖8B展示出在以更高濃度的長(zhǎng)春新堿處理后PIVb耗竭終止了G2-M中的細(xì)胞積聚，并反而促進(jìn)了細(xì)胞的亞G:l組分的增加。所示直方圖表示進(jìn)行的3個(gè)實(shí)驗(yàn)。圖9A顯示了PIII微管蛋白siRNA在25nniol/L(Calu-6)或l()()nraol/L(H460)轉(zhuǎn)染48h后通過(guò)RT-PCR對(duì)eill微管蛋白基因表達(dá)的分析。！32微球蛋白(|32M)"管家"基因的表達(dá)充當(dāng)內(nèi)部對(duì)照。圖9B顯示了PlII微管蛋白轉(zhuǎn)染后72h的eill微管蛋白的蛋白表達(dá)。將"管家"GAPDH多肽的表達(dá)用作加載對(duì)照。圖9C顯示了13III微管蛋白siRNA的特異性。在i類、i:i類和i:v類e微管蛋白同種型以及總的e微管蛋白在蛋白水平的表達(dá)上沒(méi)有觀察到顯著變化。M，模擬；C，對(duì)照siRNA;13III，|3III微管蛋白siRNA。圖10顯示了與10廳1/L紫杉醇(中)和10nmol/L長(zhǎng)春新堿(右)溫育lh的siRNA轉(zhuǎn)染Calu-6細(xì)胞中的微管形態(tài)。微管通過(guò)a微管蛋白免疫熒光染色而顯示。當(dāng)用紫杉醇或長(zhǎng)春新堿處理ei:[i轉(zhuǎn)染物時(shí)出現(xiàn)了極大的微管破壞。帶有異常形態(tài)的細(xì)胞用箭頭標(biāo)出。圖11顯示了在微管結(jié)合劑或DNA損傷劑存在下的克隆測(cè)試結(jié)果。用模擬(實(shí)心圓，實(shí)線)、對(duì)照siRNA(空心方塊，實(shí)線)和！3III轉(zhuǎn)染細(xì)胞(實(shí)心菱形，虛線)進(jìn)行克隆測(cè)試。圖IIA顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的用紫杉醇處理的克隆存活情況。圖11B顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的用長(zhǎng)春新堿處理的克隆存活情況。圖iic顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的用如順鉑(上)、阿霉素(中)和足葉乙甙(下)等DM損傷劑處理的克隆存活情況。圖11D顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的用長(zhǎng)春瑞濱對(duì)Calu-6(上)和H46()細(xì)胞(下)處理的克隆存活情況。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示至少4次單獨(dú)測(cè)試的平均值。線段表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)比較各個(gè)藥物濃度下siRNA處理細(xì)胞與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存貨分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。*，P<0.05;**，P<()005:林氺，P<0.005。圖12顯示了用紫杉醇(A)或長(zhǎng)春新堿(B)處理的eI:[:[微管蛋白耗竭的H460細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。在藥物處理24h后收集細(xì)胞并隨即通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)其DNA含量進(jìn)行測(cè)試。顯示了多次試驗(yàn)的代表圖。圖13A和13B是顯示紫杉醇處理后(圖13A)和順鉑處理后(圖13B)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞(白色柱形)和15微管蛋白siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞(黑色柱形)中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。與藥物溫育48h后收集細(xì)胞并隨即通過(guò)流式細(xì)胞儀用膜連蛋白V-FITC染色對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)進(jìn)行測(cè)試。各個(gè)柱形表示至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，同時(shí)線段表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，*，P<0.05;**,P<0.01。圖14顯示了在微管蛋白結(jié)合劑環(huán)氧聚微管素的存在下的克隆測(cè)試結(jié)果。在模擬(實(shí)心圓，實(shí)線)、對(duì)照siRNA(空心方塊，實(shí)線)和eill轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(空心菱形，虛線)上進(jìn)行克隆測(cè)試。圖11顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的用環(huán)氧聚微管素處理H460細(xì)胞(上)或Calu-6細(xì)胞(下)的克隆存活情況。圖15顯示了用于敲弱13:[I]:微管蛋白表達(dá)的兩種不同27聚體siRNA的特異性，如蛋白印跡所示。對(duì)PillH460敲弱細(xì)胞中的其它13微管蛋白同種型沒(méi)有觀察到蛋白表達(dá)水平的顯著變化。圖16顯示了在微管蛋白結(jié)合劑紫杉醇(上)或長(zhǎng)春新堿(下)存在下H460細(xì)胞的克隆測(cè)試結(jié)果。在模擬(實(shí)心三角，實(shí)線)、對(duì)照siRNA(空心方塊，實(shí)線)和使用不同27聚體siRNA(seq8——實(shí)心菱形，虛線；seq11——實(shí)心方塊，實(shí)線)的PIII轉(zhuǎn)染細(xì)胞上進(jìn)行克隆測(cè)試。圖16顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的克隆存活情況。對(duì)各個(gè)eill27聚體siRNA與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ID50值的比較顯示出對(duì)于指向III類13微管蛋白的不同27聚體siRNA的對(duì)兩種微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的增加。**，:P<().005;***，P<()0005。圖17顯示了導(dǎo)入H460細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生其中穩(wěn)定敲弱了PIII微管蛋白表達(dá)的3個(gè)克隆體(克隆體4、59和60)的短發(fā)夾RNA的特異性。如蛋白印跡所示，對(duì)于PIIIH460敲弱克隆體中的其它P微管蛋白同種型沒(méi)有觀察到蛋白表達(dá)水平的顯著變化。觀察到這些穩(wěn)定敲弱克隆體中e微管蛋白的蛋白表達(dá)量的一定程度的改變。[翻]圖18顯示了在微管蛋白結(jié)合劑紫杉醇(上)或DNA損傷劑順鉑(下)的存在下其中穩(wěn)定敲弱了PIII微管蛋白表達(dá)H460細(xì)胞克隆體的克隆測(cè)試結(jié)果。在對(duì)照siRNA(實(shí)心方塊或?qū)嵭娜牵瑢?shí)線)和3個(gè)不同的13III穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆體(克隆體4:實(shí)心朝下三角，虛線；克隆體59:實(shí)心菱形，實(shí)線；克隆體6():實(shí)心方塊，虛線)上進(jìn)行克隆測(cè)試。圖18顯示了以存活分?jǐn)?shù)表達(dá)的克隆存活情況。在穩(wěn)定敲弱了PIII微管蛋白的各個(gè)不同克隆體中觀察到了對(duì)紫杉醇和DNA損傷劑的敏感性的增加。帶有最大量的eill微管蛋白敲弱的克隆體(如圖17所示)似乎顯示出對(duì)各個(gè)藥劑的敏感性的最大增加。13圖19顯示了選用于抵抗2-甲氧基雌二醇的3種不同白血病細(xì)胞亞系(7R、14R、28R)的相對(duì)微管蛋白同種型表達(dá)。將蛋白印跡中所示蛋白表達(dá)對(duì)母細(xì)胞系的對(duì)照表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化并作圖。所有抗性細(xì)胞都展示出II類P微管蛋白表達(dá)的增加。圖20顯示了II:類13微管蛋白敲弱后H460細(xì)胞的II類|5微管蛋白表達(dá)水平的變化(A)，和在2-甲氧基雌二醇或秋水仙堿存在下其中敲弱了II類13微管蛋白的H460細(xì)胞的克隆測(cè)試結(jié)果(B)。II類13微管蛋白的敲弱極大增加了附60細(xì)胞對(duì)2-甲氧基雌二醇或秋水仙堿的敏感性。具體實(shí)施例方式在一方面，本文提供了對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性進(jìn)行篩選的方法。該方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的II類、III類和IVb類|3微管蛋白中的任何一種或多種，其中由腫瘤細(xì)胞對(duì)II:類、類和IVb類|3微管蛋白的表達(dá)對(duì)于對(duì)微管結(jié)合劑的抗性或潛在抗性具有預(yù)測(cè)性。此外，本發(fā)明還提供了評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法。所述方法包括檢測(cè)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的II類、III類和IVb類|3微管蛋白或II類、III類和IVb類15微管蛋白ra:RM的量。由此獲得對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量。將受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量與對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量進(jìn)行比較從而確定微管蛋白量差異。對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量是對(duì)照細(xì)胞中的II類、IH類和IVb類13微管蛋白或II類、IH類和IVb類13微管蛋白mRNA中的任何一種或多種各自的量?；谖⒐艿鞍琢坎町悂?lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性。"受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞"僅為源自作為抗性評(píng)估的受試對(duì)象的樣品腫瘤的腫瘤細(xì)胞。且如--匕所述，對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量?jī)H為在所述方法中檢測(cè)到的II類、III類和IVb類13微管蛋白或II類、III類和IVb類0微管蛋白mRNA中的任何一種或多種的量。"對(duì)照細(xì)胞"是帶有已知量的i]:類、]:]:i類和/或:[vb類e微管蛋白或類、:[n類和/或IVb類13微管蛋白mRNA以及已知的對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性水平的細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞是下文討論的對(duì)照腫瘤細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞可以獲自生物(或器官)或使用本發(fā)明的方法進(jìn)行衍生化。對(duì)照細(xì)胞可以是通過(guò)使細(xì)胞暴露于多種不同劑量的微管蛋白結(jié)合劑而產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線的一部分。而且，腫瘤細(xì)胞的抗性評(píng)估方法本身可以用于產(chǎn)生這種劑量響應(yīng)曲線。在某些實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞是哺乳動(dòng)物對(duì)照細(xì)胞，如人對(duì)照細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量是對(duì)應(yīng)于對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量的II類、III類和./或IVb類e微管蛋白或II類、III類和/或IVb類13微管蛋白mRNA的量。例如，當(dāng)對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量是從對(duì)象腫瘤細(xì)胞檢測(cè)到的II類和III類13微管蛋白的量時(shí)，對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量是對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的II類和III類P微管蛋白的量。從腫瘤細(xì)胞抗性評(píng)估方法的上述說(shuō)明中顯而易見(jiàn)，"微管蛋白量差異"僅為受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量與對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量之間的差異。從本文所述方法的說(shuō)明中顯而易見(jiàn)，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量大于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，在某些實(shí)施方式中，將受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞評(píng)估為具有比對(duì)照細(xì)胞更大的對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞III類微管蛋白量大于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷、環(huán)氧聚微管素或DNA損傷劑具有更大的抗性(和更小的敏感性)。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞II類微管蛋白量大于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿或2-甲氧基雌二醇具有更大的抗性(和更小的敏感性)。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞:[Vb類微管蛋白量大于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿具有更大的抗性(和更小的敏感性)而對(duì)環(huán)氧聚微管素具有更小的抗性(和更大的敏感性)。相反，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量小于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，在某些實(shí)施方式中，可以將受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞評(píng)估為具有比對(duì)照細(xì)胞更小的對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性(和更大的敏感性)。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞III類微管蛋白量小于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷、環(huán)氧聚微管素或DNA損傷劑具有更小的抗性(和更大的敏感性)。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞II類微管蛋白量小于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿或2-甲氧基雌二醇具有更小的抗性(和更大的敏感性)。例如，當(dāng)受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞IVb類微管蛋白量小于對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量時(shí)，將受試對(duì)象細(xì)胞評(píng)估為對(duì)長(zhǎng)春花生物堿具有更小的抗性(和更大的敏感性)而對(duì)環(huán)氧聚微管素具有更大的抗性(和更小的敏感性)。對(duì)藥劑有已知抗性的對(duì)照腫瘤細(xì)胞可以是例如從在用所述藥劑治療成功之前的個(gè)體分離的腫瘤細(xì)胞。可以例如從分離自一組用所述藥劑治療成功和治療失敗之前的個(gè)體的腫瘤細(xì)胞來(lái)集合在對(duì)藥劑的抗性范圍內(nèi)的一系列對(duì)照腫瘤細(xì)胞。如本文所示，腫瘤細(xì)胞中某些類別的微管蛋白的存在促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)抗有絲分裂劑(如微管蛋白結(jié)合劑)或DNA損傷劑的使用的響應(yīng)性。于是,對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)I]:類、I]:I類和IVb類13微管蛋白中的任何-一種或多種的表達(dá)的評(píng)估為腫瘤細(xì)胞對(duì)于不同微管蛋白結(jié)合劑或DNA損傷劑的微管蛋白依賴性響應(yīng)提供了指導(dǎo)，并提供了可以用于選擇治療腫瘤的藥劑的方法。腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抵抗可以為完全抵抗或部分抵抗。如果腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的施用沒(méi)有響應(yīng)，則可將其視為對(duì)微管蛋白結(jié)合劑"抵抗"。不響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞可以在暴露于其濃度對(duì)非腫瘤細(xì)胞或?qū)ξ⒐艿鞍捉Y(jié)合劑敏感的腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性的微管蛋白結(jié)合劑時(shí)展示出例如不變的細(xì)胞分裂速率、不變的凋亡速率或不變的細(xì)胞形態(tài)。腫瘤細(xì)胞可能抵抗體外施用的微管蛋白結(jié)合劑。腫瘤細(xì)胞可能抵抗原位施用的微管蛋白結(jié)合劑。在某些實(shí)施方式中，如果腫瘤細(xì)胞與對(duì)微管蛋白結(jié)合劑有己知抗性的對(duì)照腫瘤細(xì)胞相比展示出對(duì)于微管蛋白結(jié)合劑的施用降低的響應(yīng)，則可將該腫瘤細(xì)胞視為對(duì)微管蛋白結(jié)合劑"抵抗"。為了提供用于比較目的的對(duì)照細(xì)胞，可以產(chǎn)生帶有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性范圍和微管蛋白表達(dá)范圍的來(lái)自單一腫瘤的對(duì)照腫瘤細(xì)胞。通過(guò)例如取已知對(duì)所述藥劑抵抗的對(duì)照腫瘤細(xì)胞、將所述細(xì)胞分組并用例如本文所述的siRNA或shRNA方法來(lái)穩(wěn)定調(diào)節(jié)各細(xì)胞組中II類、III類和IVb類13微管蛋白中至少--種的表達(dá)可以產(chǎn)生帶有敏感性范圍的細(xì)胞。如本文所示，通過(guò)產(chǎn)生其中以受控方式使II類、III類和IVb類中的至少一種的表達(dá)穩(wěn)定減少的不同細(xì)胞組,可以產(chǎn)生具有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性范圍的來(lái)自單一腫瘤的細(xì)胞?？梢詤⒖荚谌祟愂茉噷?duì)象中治療性使用的微管蛋白結(jié)合劑的濃度來(lái)評(píng)估腫瘤的抗性。在某些實(shí)施方式中，如果腫瘤細(xì)胞展示出與對(duì)微管蛋白結(jié)合劑有已知抗性的對(duì)照腫瘤細(xì)胞的響應(yīng)相似的對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的響應(yīng)，則將該腫瘤細(xì)胞視為對(duì)微管蛋白結(jié)合劑"抵抗"?？梢岳鐝挠梦⒐艿鞍捉Y(jié)合劑治療失敗之前的受試對(duì)象中分離出對(duì)微管蛋白結(jié)合劑有已知抗性的對(duì)照腫瘤。替代性地，可以通過(guò)用微管蛋白結(jié)合劑以造成大于90%細(xì)胞死亡的濃度對(duì)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞或體外腫瘤細(xì)胞系治療至少一次并選擇在治療中存活的細(xì)胞來(lái)從原發(fā)性腫瘤細(xì)胞或體外腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生抗性對(duì)照腫瘤細(xì)胞。如果腫瘤細(xì)胞疑似對(duì)微管結(jié)合劑抵抗或開(kāi)始抵抗，則其為"潛在抗性"。所述方法包括"檢測(cè)"腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、iii類和ivb類e微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)腫瘤細(xì)胞中由特定技術(shù)檢測(cè)到的特定微管蛋白的存在的鑒定可能足以將腫瘤評(píng)估為對(duì)微管蛋白結(jié)合劑抵抗,而反之，對(duì)腫瘤細(xì)胞中由特定技術(shù)檢測(cè)到的特定微管蛋白的缺乏的鑒定可能足以將腫瘤評(píng)估為對(duì)微管蛋白結(jié)合劑敏感。在這些實(shí)施方式中，可能不必為了評(píng)估腫瘤細(xì)胞的抗性而進(jìn)行對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的微管蛋白量的確定。在其它實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞對(duì):n類、:[i]:類和:[vb類e微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)的檢測(cè)將涉及對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的任何-種或多種這類微管蛋白量與至少一種抗性已知的細(xì)胞表達(dá)的任何一種或多種這類微管蛋白量的比較。在特定實(shí)施方式中，所述比較是與有不同已知抗性的多個(gè)對(duì)照細(xì)胞表達(dá)的微管蛋白量的比較。如本文提供的實(shí)施例中所示，在至少某些實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞的程度或抗性可能與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的微管蛋白量成正比(例如，iii類e微管蛋白和的長(zhǎng)春花生物堿的情形)或反比(例如，IVb類P微管蛋白和環(huán)氧聚微管素的情形)。于是，可以對(duì)從例如多個(gè)對(duì)照腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線來(lái)進(jìn)行比較。因而，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)i:i類、]:]:i:類和]:vb類p微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)可以包括檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中微管蛋白mRNA的存在或缺乏或者微管多肽的存在或缺乏。替代性地，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、in類和ivb類p微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)可以包括確定腫瘤細(xì)胞表達(dá)的微管蛋白mRNA的相對(duì)量或微管多肽的相對(duì)量。所述相對(duì)量可以是與已知敏感性對(duì)照腫瘤的細(xì)胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的豐度的比較。所述相對(duì)量可以是與已知抗性對(duì)照腫瘤的細(xì)胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比較。所述相對(duì)量可以是與有敏感性范圍的對(duì)照腫瘤細(xì)胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比較。所述相對(duì)量可以是與取自腫瘤周圍組織的非腫瘤細(xì)胞中微管蛋白mRNA量或微管多肽量的比較。所述相對(duì)量可以為歸一化量或通過(guò)如下確定可以使用對(duì)任何-一種lI類、III類和IVb類|3微管蛋白特異的一種或多種探針或弓I物通過(guò)RT-PCR、定量PCR、半定量PCR或嚴(yán)格條件下原位雜交中的任何一種或多種來(lái)檢測(cè)微管mRNA的存在、缺乏或相對(duì)量?？捎糜赗T-PCR或半定量PCR技術(shù)的多核苷酸的實(shí)例描述于Kavallaris等(1997)JClinInvest100，1282-1293中，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。在特定實(shí)施方式中，使用RT-PCR例如采用Kavallaris等(1997)JClinInvest100，1282-1293中所述的方法學(xué)和特定引物來(lái)檢測(cè)mRNA的存在或缺乏。當(dāng)需要測(cè)定微管蛋白mRNA的相對(duì)量時(shí)，可以采用如實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒?6應(yīng)等已知技術(shù)來(lái)逆轉(zhuǎn)錄RNA然后用實(shí)時(shí)PCR對(duì)所得cRNA進(jìn)行定量。在Ding和Cantor(2004)JBiochemMolBiol37(1):1_10禾口Bust.in等，(2005)JournalofMolecularEndocrinology34:579-601中對(duì)用于評(píng)估RNA表達(dá)的定量技術(shù)進(jìn)行了綜述，此處通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容?？梢允褂玫鞍子≯E、ELISA或本領(lǐng)域中可利用的其它標(biāo)準(zhǔn)定量或半定量技術(shù)中的任何一種或多種或者鑒定特定多肽的現(xiàn)有技術(shù)的組合來(lái)檢測(cè)微管多肽的存在、缺乏或相對(duì)量。在例如Hirsch等，(2004)AmJPhysiolLungCellMolPhysiol278:L1-L23中對(duì)眾多定量和半定量蛋白組學(xué)技術(shù)進(jìn)行了綜述，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。特別考慮了依賴于一種或多種微管蛋白同種型多肽的抗體識(shí)別的技術(shù)。在-個(gè)特定實(shí)施方式中，可以用包含半定量蛋白印跡的技術(shù)(例如，使用本文所述實(shí)施例2中所述蛋白印跡技術(shù))對(duì)微管多肽的存在、缺乏或相對(duì)豐度進(jìn)行檢測(cè)。在其它特定實(shí)施方式中，可以用包含微管多肽的抗體捕獲與所捕獲多肽的電泳拆分的組合的技術(shù)(例如，使用IsonosticTM測(cè)試(TargetDiscovery,Inc.))對(duì)微管多肽的存在、缺乏或相對(duì)豐度進(jìn)行檢測(cè)。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)檢測(cè)為表達(dá)13-III微管蛋白的腫瘤細(xì)胞據(jù)預(yù)測(cè)對(duì)長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷、環(huán)氧聚微管素或DM損傷劑有抗性。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)檢測(cè)為表達(dá)13-:[:[微管蛋白的腫瘤細(xì)胞據(jù)預(yù)測(cè)對(duì)長(zhǎng)春花生物堿或2-甲氧基雌二醇有抗性。在特定實(shí)施方式中，經(jīng)檢測(cè)為表達(dá)e-ivb微管蛋白的腫瘤細(xì)胞據(jù)預(yù)測(cè)對(duì)長(zhǎng)春花生物堿有抗性并且對(duì)環(huán)氧聚微管素敏感。在某些實(shí)施方式中，微管蛋白結(jié)合劑是微管穩(wěn)定劑，如紫杉垸或環(huán)氧聚微管素。在某些實(shí)施方式中，微管蛋白結(jié)合劑是微管去穩(wěn)劑,如長(zhǎng)春花生物堿或2-甲氧基雌二醇。本文所述的篩選或評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法可以在施用抗癌劑之前進(jìn)行以便確定腫瘤細(xì)胞是否會(huì)對(duì)一種或多種微管蛋白結(jié)合劑響應(yīng)，或可在治療療程期間進(jìn)行以便確定腫瘤細(xì)胞是否發(fā)展出對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在腫瘤中導(dǎo)入包含對(duì)II類、III類或IVb類|3微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體減少了II類、in類或:[vb類e微管蛋白的表達(dá)。盡管本文所述的包含核苷酸序列的核酸構(gòu)建體實(shí)例是siRNA或shRNA序列，顯然可以理解的是使用如反義序列、siRNA序列、shRNA序列和核酶序列等選擇性靶向并抑制II類、III類和/或IVb類13微管蛋白基因表達(dá)的任何分子都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)II類、III類和/或]:vb類e微管蛋白基因的靶向破壞。i:i類、i:i]:類和/或:[vb類e微管蛋白基因的"表達(dá)"意在涵蓋n類、iii類和/或ivb類e微管蛋白序列的轉(zhuǎn)錄和Z或翻譯。于是，對(duì)n類、III類或IVb類13微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核酸序列也意在涵蓋對(duì)II類、III類或IVb類13微管蛋白mRNA的至少一部分具有特異性的核酸序列。"檢測(cè)...表達(dá)"意在不僅涵蓋檢測(cè)II類、]:I:I類或IVb類15微管蛋白mRNA或蛋白的存在也在某些實(shí)施方式中涵蓋了1I類、III類或IVb類13微管蛋白mRNA或蛋白的量。"檢測(cè)"II類、IH類或IVb類P微管蛋白mRNA或蛋白的"量"意在包括檢測(cè)所述mRNA或蛋白的絕對(duì)水平，或在某些實(shí)施方式中包括所述mRNA或蛋白的相對(duì)量。所述相對(duì)量是相對(duì)于一種或多種其它細(xì)胞蛋白或mRNA，如細(xì)胞中的其它微管蛋白或mRNA或者管家基因蛋白或mRNA。因而在某些實(shí)施方式中，相對(duì)其它細(xì)胞蛋白或mRNA對(duì)所述量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用于設(shè)計(jì)、合成和輸送反義核酸的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。反義分子可以為DNA、RNA或者其部分或完全合成類似物?？梢援a(chǎn)生從其長(zhǎng)度上至所討論的基因區(qū)至少基本互補(bǔ)的反義構(gòu)建體。反義構(gòu)建體與其互補(bǔ)細(xì)胞序列的結(jié)合可能干擾轉(zhuǎn)錄、RNA加工、運(yùn)輸、翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性。合適的反義寡核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備。通常會(huì)在自動(dòng)合成儀上合成反義寡核苷酸。合適的反義寡核苷酸可以包含設(shè)計(jì)來(lái)改善其細(xì)胞內(nèi)輸送、其進(jìn)入細(xì)胞后的穩(wěn)定性和/或其與適當(dāng)靶標(biāo)的結(jié)合的修飾。例如，可以通過(guò)添加--個(gè)或多個(gè)硫代磷酸鍵或在主鏈內(nèi)加入一個(gè)或多個(gè)嗎啉環(huán)來(lái)修飾反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可以具有io30個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度且將是ii類、in類和/或ivb類e微管蛋白基因的靶標(biāo)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，反義寡核苷酸序列將具有不超過(guò)9()%的與其它已知微管蛋白同種型的序列-一致性。就實(shí)際問(wèn)題而言，任何特定核酸分子是否具有不超過(guò)90%的與例如其它已知微管蛋白同種型的核苷酸序列的一致性可以用如Bestfit程序(威斯康辛序列分析包，Unix用第8片反，GeneticsComputerGroup，UniversityResearchPark"5"75ScienceDrive，Madison,Wis.53711)等已知計(jì)算機(jī)程序來(lái)常規(guī)確定。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法來(lái)尋找兩個(gè)序列之間的最佳同源性片段(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列比對(duì)程序來(lái)確定特定序列是否具有例如90%的與參考序列的一致性時(shí)，設(shè)定參數(shù)從而在參考核苷酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算一致性百分比并且允許最多達(dá)參考序列中核苷酸總數(shù)的5%的同源性間隔?？梢允褂没贐rutlag及其同事的算法(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的FASTDB計(jì)算機(jī)程序來(lái)確定用于確定査詢序列與目標(biāo)序列之間的最佳總體匹配的優(yōu)選方法(也稱作全局序列比對(duì))。在序列比對(duì)中，查詢序列與目標(biāo)序列都是:[)NA序列?？梢酝ㄟ^(guò)將U轉(zhuǎn)換為T(mén)來(lái)比較RNA序列。所述全局序列比對(duì)的結(jié)果以百分比--致性表示。計(jì)算百分比一致性的DNA序列的FASTDB比對(duì)中所用優(yōu)選參數(shù)為矩陣=一元，k-tuple=4，錯(cuò)配懲罰=1，連接懲罰=30，隨機(jī)化組長(zhǎng)度=0，截留評(píng)分=1，間隔懲罰=5,間隔尺寸懲罰=0.05，窗口尺寸=500或目標(biāo)核苷酸序列的長(zhǎng)度中較短者。如果目標(biāo)序列因5'或3'缺失而非內(nèi)部缺失而比查詢序列短，則必須對(duì)結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)校正。這是因?yàn)镕ASTDB程序在計(jì)算百分比一致性時(shí)不考慮目標(biāo)序列的5'或3'截短。對(duì)于在5'或3'末端截短的目標(biāo)序列而言,通過(guò)計(jì)算未經(jīng)匹配/比對(duì)的作為目標(biāo)序列的5'和3'的查詢序列的堿基數(shù)在查詢序列的總堿基中的百分比來(lái)校正百分比一致性。通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定核苷酸是否經(jīng)匹配/'比對(duì)。然后從用指定參數(shù)通過(guò)上述FASTDB程序計(jì)算的百分比一致性中減去該百分比以得到最終的百分比一致性評(píng)分。為了手動(dòng)調(diào)整百分比一致性評(píng)分的目的，僅計(jì)算未與查詢序列匹配/比對(duì)的、由FASTDB比對(duì)所顯示的目標(biāo)序列的5'和3'堿基之外的堿基。如果待靶向的特定序列對(duì)于II類、III類和/或IVb類|3微管蛋白基因序列獨(dú)特時(shí)可能有利。這些人類0微管蛋白同種型的氨基酸序列描述于Verdier-Pinard等，(2005)Biochemistry44:15858-15870中，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。對(duì)應(yīng)cDNA和/或基因18組DNA序列也是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能容易地確定給定序列是否對(duì)II類、IH類和/或lVb類P微管蛋白基因序列特異。小干擾RNA(siRNA)序列是通常為雙鏈的小RNA寡核苷酸，例如長(zhǎng)度為21、27或29個(gè)堿基且?guī)Щ虿粠怀龆说碾p鏈RNA寡核苷酸，si:RM與感興趣的RNA序列特異性雜交并充當(dāng)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的底物?？梢院铣善渲幸粭l鏈與待沉默的mRNA轉(zhuǎn)錄物的特定區(qū)域相同的雙鏈RNA分子，且可以將該雙鏈RNA直接導(dǎo)入。替代性的是，可以采用對(duì)應(yīng)的dsDNA,該dsDNA—旦出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)則被轉(zhuǎn)化為dsRNA。合成用于RNA干擾(RNAi)和實(shí)現(xiàn)后轉(zhuǎn)錄基因沉默的合適siRNA分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且現(xiàn)在已有設(shè)計(jì)和制備siRNA的商業(yè)性服務(wù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以不用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序基于對(duì)受討論的基因序列的認(rèn)識(shí)來(lái)鑒定和產(chǎn)生能夠抑制ii類、in類和/或ivb類|3微管蛋白表達(dá)的多種合適的siRNA構(gòu)建體。如本文所示，指向特定15微管蛋白的不同非重疊區(qū)的各種siRNA或stiRNA序列能影響該微管蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在靶標(biāo)序列與siRNA序列之間不必有100%的核苷酸序列匹配。對(duì)錯(cuò)配的容忍力極大依賴于序列內(nèi)錯(cuò)配的位置。在某些情況下，2個(gè)或3個(gè)核苷酸錯(cuò)配是可接受的，但在其它情況下單個(gè)核苷酸錯(cuò)配足以抵消si:RM的有效性?？梢圆挥眠M(jìn)行實(shí)驗(yàn)而用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序來(lái)確定特定siRNA分子的適用性。盡管反義核酸和siRNA在對(duì)RNA或蛋白表達(dá)的特異性抑制上的最大效果相當(dāng)，siRNA通常會(huì)產(chǎn)生更持久的效果?？梢酝ㄟ^(guò)載體將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)(例如通過(guò)如腺相關(guān)病毒載體等病毒介導(dǎo)的輸送機(jī)制)，或可以將si:RM外源性輸送(例如作為脂質(zhì)體復(fù)合物的一部分進(jìn)行輸送)。在Akhtar和Benter(2007)J.CHn.Invest117:3623-3632中對(duì)用于合成siRNA的體內(nèi)非病毒輸送的技術(shù)進(jìn)行了綜述，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。已對(duì)'用于對(duì)小鼠(Yanoetal，(2004)ClinicalCancerResearch10:772卜7726)、對(duì)靈長(zhǎng)類(Zimraermannetal，(2006)Nature441(7089):111-114)和對(duì)人類(Nogawa等(2006)JClinInvestl15:978-985)局部或系統(tǒng)性施用siRNA序列的技術(shù)進(jìn)行了描述(見(jiàn)例如，Akhtar和Benter(2007)JClinInvest.117:3623-3632的綜述)，這些文獻(xiàn)表明這類分子可以用于減少靶標(biāo)基因的體內(nèi)表達(dá)。本文通過(guò)參考引入每篇引用文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容。設(shè)想了如膽固醇-si:RM偶聯(lián)物、包括陽(yáng)離子納米顆粒、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物或肽輸送系統(tǒng)的陽(yáng)離子輸送系統(tǒng)或殼聚糖-siRNA偶聯(lián)物等siRNA輸送系統(tǒng)的使用。已顯示siRNA的系統(tǒng)性使用可造成siRNA在包括肝和肺的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)中的積聚，因而這在施用siRNA用于治療肺腫瘤時(shí)可能有利。如錘頭或發(fā)夾核酶等核酶能定向催化切割和剪接包括mRNA和基因組RNA序列的特定RNA序列。在例如Vaish，Kore禾卩Eckstein(1998)NucleicAcidsResearch26:5237-5242;Lieber和Strauss(1995)Mol.Cell.Biol.15:540-551;以及Usman和Blatt(2000)JClinInvest106:1197-1202中對(duì)用于輸送核酶的設(shè)計(jì)和方法進(jìn)行了綜述，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。在本領(lǐng)域中描述了核酶靶向特定腫瘤和使其退化的應(yīng)用，例如Zhang等(2000)GeneTher7:2041-2050。通常，當(dāng)諸如通過(guò)靜脈內(nèi)途徑、作為丸劑或通過(guò)皮下持續(xù)釋放技術(shù)等對(duì)人類或動(dòng)物受試對(duì)象系統(tǒng)性施用時(shí)，或當(dāng)對(duì)腫瘤細(xì)胞直接施用或者注射至腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍時(shí)，每種這類分子都受到良好耐受。特別對(duì)于肺腫瘤而言，還考慮了以包含可吸入型多核苷酸構(gòu)建體的制劑向肺輸送。用于治療呼吸道合胞體病毒感染而通過(guò)霧化器將siRNA作為氣溶膠的施用目前在臨床試驗(yàn)中(A:l.nylaraALN-RSV()l，Bitco等，(2005)NatMed11:50-55),并且已表現(xiàn)出安全性、耐受性和抗病毒活性的療效。于是，考慮了將siRNA向肺輸送以調(diào)節(jié)肺腫瘤中特定的微管蛋白表達(dá)。可以將適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嵝蛄泄铝⒌鼗蛟诤怂針?gòu)建體中施用。所述構(gòu)建體可以是質(zhì)粒載體、病毒載體或經(jīng)改造用于插入外來(lái)序列并導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)的任何其它合適的載器。所述載體可以是能將DNA序列的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入RNA內(nèi)的表達(dá)載體。病毒表達(dá)載體包括例如，基于艾伯斯坦_巴爾病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體是游離的。合適的游離載體的使用提供了將靶標(biāo)細(xì)胞中的多核苷酸序列維持在染色體外高拷貝數(shù)的方法，從而消除了染色體整合的潛在影響。在本發(fā)明的背景下，可優(yōu)選將所述多核苷酸構(gòu)建體以使其永久性并入其施用到的體細(xì)胞的基因組內(nèi)的形式施用，以允許暫時(shí)控制對(duì)ii類、in類和./或ivb類e微管蛋白表達(dá)的抑制。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)提及如多核苷酸構(gòu)建體或核酸序列等多核苷酸時(shí)，可以理解其意在涵蓋非天然存在的多核苷酸和核酸，條件是它們保留了在細(xì)胞中特異性相互作用的能力同時(shí)擁有低毒性。例如,某些非天然存在的核酸的使用提供了增加的對(duì)核酸酶消化的抵抗,這反過(guò)來(lái)可以增加核酸在施用后的半衰期。例如，在目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的核酶"ANGIOZYME"中已展示出減少核酸酶消化的化學(xué)穩(wěn)定化。當(dāng)要將外源性多核苷酸構(gòu)建體輸送至孤立細(xì)胞或受試對(duì)象時(shí)，可以將它們配制在如鹽水等適當(dāng)稀釋劑中。為了促進(jìn)核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可以將所述構(gòu)建體封裝在脂質(zhì)體中和/或與促進(jìn)對(duì)期望靶標(biāo)細(xì)胞的識(shí)別和/或?qū)|(zhì)膜的滲透的配體或靶向分子偶聯(lián)。例如，與細(xì)胞滲透肽偶聯(lián)的siRNA的使用已顯示出可增加siRNA的細(xì)胞攝取(Veldhoen等(2006)NucleicAcidsRes34:656卜6573)。本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于增加施用核酸的轉(zhuǎn)染效率的其它技術(shù)包括生化方法,如DEAE-葡聚糖的使用、siRNA與納米顆粒的偶聯(lián)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和/或如直接顯微注射、電穿孔或基因槍輸送等物理轉(zhuǎn)染方法。如本文所述的多核苷酸構(gòu)建體的導(dǎo)入涵蓋了聚陽(yáng)離子試劑的使用，聚陽(yáng)離子試劑是能用于將siRNA輸送至癌細(xì)胞的化合物。如本文所公開(kāi)，可以將聚陽(yáng)離子試劑低分子量化合物聚乙烯亞胺(PEI)用作輸送核酸構(gòu)建體的輸送載器。PEI具有通過(guò)首先將siRNA壓縮為帶正電的顆粒而將siRNA輸送至細(xì)胞的能力，所述顆粒能與細(xì)胞表面的陰離子蛋白多糖相互作用并促進(jìn)通過(guò)胞吞進(jìn)入細(xì)胞。其次，siRNA與PEI的非共價(jià)絡(luò)合有效地穩(wěn)定了siRNA并對(duì)給定濃度而言提供了更高的作用效率。如本文所示，特定的13微管蛋白同種型帶來(lái)了改變的對(duì)微管蛋白結(jié)合劑和DNA損傷劑的敏感性?？梢詫⒋诵畔⒂脕?lái)利用不同細(xì)胞類型之間的同種型組成的天然差異以便將特定藥物靶向特定腫瘤?？赡芤蛭⒐芗捌湎嚓P(guān)蛋白中的修飾而由增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡途徑和由缺陷性有絲分裂造成細(xì)胞的過(guò)敏性，因而增強(qiáng)了這些細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性。盡管本文描述了包含對(duì)II類和/或IVb類0微管蛋白基因具有特異性的多核20苷酸序列的核酸構(gòu)建體用于增強(qiáng)特定NSCLC細(xì)胞系和白血病細(xì)胞系對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的使用，但由于所述核酸構(gòu)建體的作用模式的特異性，據(jù)預(yù)期表達(dá)II類、III類和/或ivb類e微管蛋白基因的任何其它腫瘤細(xì)胞類型在以相同方式治療時(shí)也將展示出對(duì)至少一種微管去穩(wěn)劑的敏感性增強(qiáng)。例如，抗紫杉醇的卵巢腫瘤可以表達(dá)增加的II:類和/或IVb類13微管蛋白水平，成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞可以表達(dá)高水平的II類13微管蛋白，而白血病細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞也可表達(dá)II類和/或IVb類P微管蛋白。如本文所用，腫瘤細(xì)胞是贅生細(xì)胞，且意在不僅涵蓋見(jiàn)于固體腫瘤中的細(xì)胞而且還涵蓋孤立贅生細(xì)胞或如白血病細(xì)胞等循環(huán)贅生物。在本領(lǐng)域中可以利用許多方法來(lái)確定任何特定腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)II類、in類和/或lVb類P微管蛋白基因，所述方法包括施用商購(gòu)微管蛋白同種型特異性抗體和/或同種型特異性核酸引物和/或探針。當(dāng)暴露于核酸構(gòu)建體時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以在體外、在從受施對(duì)象移除的腫瘤中的原位或體內(nèi)。腫瘤細(xì)胞可以源自哺乳動(dòng)物，且在-個(gè)實(shí)施方式中源自人類。在一個(gè)實(shí)施方式中，在開(kāi)始用一種或多種微管去穩(wěn)劑治療之前將核酸構(gòu)建體序列導(dǎo)入。核酸構(gòu)建體序列的導(dǎo)入時(shí)機(jī)取決于所述構(gòu)建體的施用途徑和相關(guān)靶標(biāo)的II類、III類和/或]:vb類e微管蛋白基因的抑制動(dòng)力學(xué)?？梢岳缬没罱M織檢查標(biāo)本和對(duì)n類、in類和/或ivb類e微管蛋白基因表達(dá)具有特異性的實(shí)時(shí)pcr來(lái)監(jiān)測(cè)II類、III類和/或lVb類P微管蛋白基因表達(dá)的水平。對(duì)于siRNA的細(xì)胞施用而言，最大基因抑制發(fā)生在siRNA進(jìn)入細(xì)胞后約72h，且此時(shí)細(xì)胞對(duì)所述一種或多種微管去穩(wěn)劑具有最大敏感性。于是，可以優(yōu)選在任何時(shí)間開(kāi)始施用微管去穩(wěn)劑從而在腫瘤細(xì)胞的i]:類和/或ivb類e微管蛋白基因表達(dá)被最大地抑制時(shí)所述藥劑存在。本發(fā)明設(shè)想了涉及使用包含本文所述的核酸構(gòu)建體的組合物和包含所述核酸構(gòu)建體的藥物組合物的治療方法。通常，可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法和步驟來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的方法使用的合適組合物，因而所述組合物可以包含藥物可接受載體、稀釋劑和/或佐劑?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)途徑施用所述組合物。通常，可以通過(guò)胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi))、口服或局部途徑施用所述組合物?？梢赃M(jìn)行系統(tǒng)性、區(qū)域性或局部施用。在任何給定情況下所用的特定施用途徑將取決于多種因素，包括待治療的病況性質(zhì)、病況的嚴(yán)重性和程度、待輸送的具體化合物的所需劑量和所述化合物的潛在副作用。通常，可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備合適的組合物，且所述組合物可以包含藥物可接受稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。就與組合物中的其它成分的相容性而言，所述稀釋劑、佐劑和賦形劑必須"可接受"，且不能對(duì)其接受者有害。除了上述可增加轉(zhuǎn)染效率的試劑以外，藥物可接受載體或稀釋劑的實(shí)例是脫礦水或蒸餾水；鹽水溶液；如花生油、紅花油、橄欖油、棉花籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油等植物類油；硅油，包括如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷等聚硅氧烷；揮發(fā)性硅油；如液體石蠟、軟石蠟或角鯊?fù)?sqim:l.ane)等礦物油；如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素等纖維素衍生物；低級(jí)烷醇，例如，乙醇或異丙醇；低級(jí)芳烷醇；低級(jí)聚亞烷基二醇或低級(jí)亞烷基二醇，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、l，3-丁二醇或甘油；如棕櫚酸異丙酯、豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯等脂肪酸酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍膠或阿拉伯膠和石油凝膠。通常，載體形成組合物的10重量％99.9重量％。本發(fā)明的組合物可以為適于通過(guò)注射施用的形式、適于口服吞咽的劑型(例如，膠囊、片劑、囊片、酏劑等)、適于局部施用的軟膏、乳膏或洗劑形式、適于作為滴眼液輸送的形式、適于通過(guò)吸入(如鼻內(nèi)吸入或口腔吸入)施用的氣溶膠形式、適于胃腸外施用的形式即皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。對(duì)于作為可注射溶液或懸浮液的施用而言，無(wú)毒的胃腸外可接受稀釋劑或載體可以包括林格氏液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1,2-丙二醇。用于口服使用的合適的載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的某些實(shí)例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服制劑可以包含合適的調(diào)味劑和著色劑。當(dāng)以膠囊形式使用時(shí)，可以用如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯等延遲崩解的化合物涂布膠囊。佐劑通常包括潤(rùn)滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。用于口服施用的固體形式可以包含人類和獸醫(yī)藥物實(shí)踐中可接受的粘合劑、甜味劑、崩解劑、稀釋劑、調(diào)味劑、涂布劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑和./或延遲劑。合適的粘合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤(rùn)土、海藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、橙或紅莓調(diào)味料。合適的涂布劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲(chóng)膠或谷膠。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、a-生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石粉。合適的延遲劑包括甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于口服施用的液體形式出上述試劑外可以包含液體載體。合適的液體載體包括水、如橄欖油、花生油、芝麻油、葵花籽油、紅花油、落花生油、椰子油等油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。用于口服施用的懸浮液可以進(jìn)一步包含分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯垸酮、海藻酸鈉或乙酰醇。合適的分散劑包括卵磷脂、如硬脂酸等脂肪酸的聚氧化乙烯酯、聚氧化乙烯山梨糖醇單油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等。用于口服施用的乳化液可以進(jìn)-一步包含-一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括如上列舉的分散劑或如瓜爾膠、阿拉伯膠或黃蓍膠等天然膠。用于制備可在胃腸外施用的組合物的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的,且在例如Remington的PharmaceuticalScience,15thed.，MackPublishing'Company,Easton，Pa.中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述,本文通過(guò)參考引入。本發(fā)明的局部制劑包含活性成分以及一種或多種可接受載體，且可選地包含任何其它治療成分。適于局部施用的制劑包含適于滲透穿過(guò)皮膚至需要治療的位點(diǎn)的液體或半液體制劑，如搽劑、洗劑、乳膏、軟膏或糊劑以及適于施用至眼、耳或鼻的滴劑。在例如美國(guó)專利第6，825，174號(hào)中描述了反義核苷酸組合物在對(duì)肺的施用中的使用以及適于該使用的組合物，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。其中所述方法可以用于制備用于可吸入輸送或鼻內(nèi)輸送的適當(dāng)組合物。本發(fā)明的滴劑可以包含無(wú)菌水溶液、油性溶液或懸浮液。這些可以通過(guò)將活性成分溶解于殺菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其它合適的防腐劑的水溶液中來(lái)制備，且所述水溶液可選地包含表面活性劑。然后通過(guò)過(guò)濾使所得溶液澄清，轉(zhuǎn)移至合適的容器并消毒?？梢酝ㄟ^(guò)過(guò)濾、接著通過(guò)無(wú)菌技術(shù)轉(zhuǎn)移至容器進(jìn)行消毒。適于包含在滴劑中的殺菌劑和殺真菌劑的實(shí)例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、苯扎氯銨(0.01%)和乙酸氯己定(0.01%)。用于制備油性溶液的合適溶劑包括甘油、稀釋的醇和丙二醇。本發(fā)明的洗劑包括適于對(duì)皮膚或眼睛施用的那些洗劑。洗眼劑可以包含可選地含有殺菌劑的無(wú)菌水溶液并且可以通過(guò)與制備滴劑有關(guān)的上述方法相似的方法來(lái)制備。用于對(duì)皮膚施用的洗劑或搽劑還可包含如醇或丙酮等加速干燥并冷卻皮膚的試劑和z或如甘油等增濕劑、或如蓖麻油或落花生油等油。本發(fā)明的乳膏、軟膏或糊劑是用于外部施用的活性成分的半固體制劑。它們可以通過(guò)將細(xì)分或粉末形式的活性成分單獨(dú)混合或在具有油脂性或非油脂性基底的水性或非水性流體的溶液或懸浮液中混合而制成。所述基底可以包含如硬石蠟、軟石蠟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂等烴類；膠漿；如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄欖油等源自天然的油；羊毛脂或其衍生物，或者與如丙二醇或聚乙二醇等醇混合的如硬脂酸或油酸等脂肪酸。所述組合物可以并入如陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑(如脫水山梨糖醇酯或其聚氧化乙烯衍生物)任何合適的表面活性劑。其中還可包含如天然膠、纖維素衍生物等懸浮劑或如硅酸鹽質(zhì)(silicaceous)氧化硅等無(wú)機(jī)材料以及如羊毛脂等其它成分。可以將所述組合物以脂質(zhì)體的形式對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞施用或輸送。脂質(zhì)體通常源自磷脂或其它脂類物質(zhì)，并且由分散于水性介質(zhì)中的單層或多層水化液晶形成。用于將組合物施用或輸送至靶標(biāo)細(xì)胞的脂質(zhì)體的具體實(shí)例是摩爾比分別為55:20:io:is或48:20:2:3()的合成膽固醇(Sigma)、磷脂l，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC;AvantiPolarLipids)、PEG脂3_N_[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲?；鵠_1，2_二豆蔻酰氧基-丙胺(PEG-cDMA)和陽(yáng)離子酯1，2-二-o-十八酰氧基-3-(N，N-二甲基)氨基丙烷(D0DMA)或1,2-二亞油酰氧基-3-(N，N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA),PEG-cDMA、D()固A和I)Lin:DMA?？梢允褂萌魏螣o(wú)毒、生理學(xué)可接受且可代謝的能形成脂質(zhì)體的脂類。脂質(zhì)體形式的組合物可以包含穩(wěn)定劑、防腐劑和賦形劑等。優(yōu)選的脂類是天然及合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。用于形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且與此有關(guān)具體參考Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology,VolumeXIV，AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，p.33etseq.，本文通過(guò)參考引入其內(nèi)容。還考慮了D0TAP和Z或其它陽(yáng)離子脂類介導(dǎo)的核酸輸送系統(tǒng)的使用。D0TAP已被用于基因間接用siRNA的系統(tǒng)性輸送，例如，Sorenson等，(2003)J.Mol.Biol.327:76卜766，本文通過(guò)參考弓I入其全部?jī)?nèi)容。23可以將所述組合物與聚陽(yáng)離子試劑偶聯(lián)以將所述組合物輸送至細(xì)胞內(nèi)。聚陽(yáng)離子試劑的一個(gè)實(shí)例是聚(乙烯酰亞胺)，或PEI。PEI是將如siRNA等短核酸鏈壓縮為與細(xì)胞的陰離子表面相互作用的帶正電的顆粒的低分子量化合物。PEI可以單獨(dú)使用或進(jìn)而與PEG偶聯(lián)使用。聚陽(yáng)離子試劑在將組合物輸送至細(xì)胞中的使用是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且與此有關(guān)具體參考Judge等(2005).Nature25:457-462，本文通過(guò)參考引入其內(nèi)容。也可以將所述組合物以微粒的形式施用。從聚乳酸(PLA)、聚乳酸_乙醇酸共聚物(PLGA)和e-己內(nèi)酯形成的可生物降解的微粒已被廣泛用作藥物載體以增加質(zhì)粒半衰期并從而延長(zhǎng)療效(Kuraar，M.，2000，JPharmPhar慰eutSci.3(2)234-258)。已將微粒配制用于輸送包括疫苗、抗生素和DNA的許多候選藥物。而且，已將這些制劑發(fā)展用于包括胃腸外皮下注射、靜脈內(nèi)注射和吸入的各種輸送途徑。所述組合物可以包含納米顆粒。已據(jù)顯示如含PEG納米顆粒等納米顆粒因其尺寸而可輕易被細(xì)胞攝取。當(dāng)本文所述組合物例如通過(guò)所述組合物和納米顆粒表面上的互補(bǔ)電荷而與納米顆粒相關(guān)時(shí),可以通過(guò)由納米顆粒提供的細(xì)胞輸送性質(zhì)來(lái)增進(jìn)所述組合物在細(xì)胞內(nèi)的輸送。所述組合物可以包含由乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)和有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物組成的控釋基質(zhì)。可以向載器添加聚合物添加劑作為釋放調(diào)節(jié)劑以進(jìn)一步增加粘度并減緩釋放速率。SAIB是公知的食品添加劑。它是非常疏水的、以6個(gè)異丙酯基2個(gè)乙酯基的普通比例完全酯化的蔗糖衍生物。作為混合酯，SAIB不會(huì)結(jié)晶但作為澄清粘稠液體存在。將SAIB與如乙醇或芐醇等藥物可接受有機(jī)溶劑混合使混合物的粘度降低至足可用于注射?？梢韵騍AI:B輸送載器添加活性藥物成分以形成SAI:B溶液或懸浮液制劑。當(dāng)將所述制劑在皮下注射時(shí)，溶劑從基質(zhì)擴(kuò)散從而使得SAIB-藥物或SAIB-藥物-聚合物混合物能建立在原位形成的貯庫(kù)。出于本發(fā)明的目的，可以將分子和藥劑作為組合物對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行治療性或預(yù)防性施用。在治療性應(yīng)用中，將組合物以足以治愈或至少部分阻止疾病及其并發(fā)癥的量對(duì)已患有疾病的患者施用。所述組合物應(yīng)該提供足以有效治療患者的量的分子或藥劑。對(duì)于任何特定患者的治療有效劑量水平取決于各種因素，這些因素包括待治療病癥和該病癥的嚴(yán)重性；所采用的分子或藥劑的活性；所采用的組合物；患者的年齡、體重、普通健康狀況、性別和飲食；施用時(shí)間；施用途徑；所述分子或藥劑的隔離速率(rateofsequestration);治療持續(xù)時(shí)間；與治療組合或同時(shí)使用的藥物，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的其它相關(guān)因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定治療可適用的疾病和病況所需的有效、無(wú)毒的藥劑或化合物量。可以理解,確定腫瘤細(xì)胞對(duì)微管去穩(wěn)劑的敏感性是否得到增強(qiáng)的方法可以包括檢驗(yàn)任何一種或多種細(xì)胞凋亡標(biāo)記、腫瘤縮小程度和腫瘤細(xì)胞在暴露于微管去穩(wěn)劑時(shí)的代謝活動(dòng)變化?？梢詫?yáng)性TUNEL標(biāo)記的細(xì)胞凋亡標(biāo)記的存在或DNA梯帶的存在用于確定腫瘤中的細(xì)胞是否經(jīng)歷了凋亡?？梢允褂萌缟渚€數(shù)字成像、包括X射線乳腺攝影的X射線技術(shù)、磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描、Y相機(jī)成像、超聲成像、內(nèi)窺成像和臨床評(píng)估等臨床醫(yī)師容易利用的技術(shù)來(lái)確定腫瘤尺寸的改變。也可以使用腫瘤特定抗體或通過(guò)采用特定探針24的原位雜交來(lái)評(píng)估循環(huán)系統(tǒng)中或活檢組織中腫瘤特定標(biāo)記的存在或水平。例如，可以使用正電子發(fā)射斷層掃描來(lái)測(cè)定原位腫瘤代謝活性。實(shí)施例所述實(shí)施例意在用于說(shuō)明本發(fā)明而不應(yīng)被視為對(duì)整個(gè)說(shuō)明書(shū)中描述的公開(kāi)的一般性質(zhì)的限制。統(tǒng)計(jì)分析用GraphPadPrism程序完成。當(dāng)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，結(jié)果以至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM來(lái)表達(dá)。將雙尾Student測(cè)試用于確定各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)差異，并將P<().()5認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)顯著的。實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染將人NSCLC細(xì)胞系Calu-6和H460(ATCC:Calu6目錄號(hào)HTB_56，NCI-H460目錄號(hào)HTB-177)作為單層培養(yǎng)物分別保持在Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和RPMI中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充有1()%的胎牛血清(FCS)和2mM的L-谷氨酰胺。細(xì)胞在37。C的帶有5%CA的濕潤(rùn)氛圍中生長(zhǎng)。在本文所述的實(shí)施例中使用了各種siRNA或shRNA。III類P微管蛋白(正式代號(hào)TUB:B3)，也稱作MCIR;TUBB4;P-4SMA:RTpoo:[,人TU:BB4，雨_006086(111類P微管蛋白)DharmaconRNATechnologiesIII類P微管蛋白序列1正義序列GGGCGGAGCUGGUGGAUUCUU(SEQIDNO:1)(327245位，346347位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-GAAUCCACCAGCUCCGCCCUU(SEQIDN0::2)III類P微管蛋白序列2正義序列GUACGUGCCUCGAGCCAUUUU(SEQIDNO:3)(174192位)反義序列5Phos-AAUGGCUCGAGGCACGUACUU(SEQIDN0::4)III類P微管蛋白序列3正義序列GCGGCAACUACGUGGGCGAUU(SEQIDNO:5)(98116位)反義序列5Phos-UCGCCCACGUAGUUGCCGCUU(SEQIDN0::6)III類P微管蛋白序列4正義序列AGGAGUAUCCCGACCGCAUUU(SEQIDNO:7)(470488位)反義序列5Phos-AUGCGGUCGGGAUACUCCUUU(SEQIDN0:8)III類P微管蛋白序列5正義序列CAAGGUGCGUGAGGAGUAUUU(SEQIDNO:9)(459477位)反義序列5Phos-AUACUCCUCACGCACCUUGUU(SEQIDN0::10)靶標(biāo)序列為該正義序列，以T代替U。27聚體eIIIsiRNA序列IntegratedDNATechnologies(IDT)27聚體PIIIsiRNA序列8AGACAGAGACAGGAGCAGCUCACACGU(SEQIDNO:11)5Phos-GUGUGAGCUGCUCCUGUCUCUGUCT(SEQIDNO:12)(耙標(biāo)序列，以T代替U;1545位)27聚體PIIIsiRNA序列11UCUCACUCCAGCUGCGAGCAGCUUCAC(SEQIDNO:13)5:Phos-GAAGCUGCUCGCAGCUGGAGUGAGA(SEQIDNO:14)(革巴標(biāo)序列，以T代替U;1376位)PIIIshRNA表達(dá)pRS載體Origene15211352-IDNO:15)(15211549位)II類IM敫管蛋白(正式代號(hào)TUB:B2A)，也稱作TUBB;TUB:B2;dJ4()E16.7siGenoMEON-窗GETp:[usSMARTpool,人TUBB2A，雨J)01069DharmaconRNATechnologies1I類P微管蛋白序列7正義序列GCUGGUAACAAAUAUGUACUU(SEQIDNO:16)(163183位；182位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-GUACAUAUUUGUUACCAGCUU(SEQIDNO:17)1I類P微管蛋白序列8正義序列GAUCAAUCGUGCAUCCUUAUU(SEQIDNO:18)(13501370位;1369位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-UAAGGAUGCACGAUUGAUCUU(SEQIDNO:19)1I類P微管蛋白序列9正義序列GAACUUCUGUUGUCCUCAAUU(SEQIDNO:20)(13711389位；13901391位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-UUGAGGACAACAGAAGUUCUU(SEQIDNO:21)II類P微管蛋白序列IO正義序列GAAAUUCACACUGUUGAUGUU(SEQIDNO:22)(14391458位；1459位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-CAUCAACAGUGUGAAUUUCUU(SEQIDNO:23)靶標(biāo)序列為該正義序列，以T代替U。IVb類0微管蛋白(正式代號(hào)TU:BB2C)，也稱作TUBB2siGenoME雙鏈體，人TUBB2，雨006088DharmaconRNATechnologiesIVb類|3微管蛋白序列526正義序列GGGCAGUGCGGCAACCAAAUU(SEQIDNO:24)(2847位；48位處錯(cuò)配)反義序列5Phos-UUUGGUUGCCGCACUGCCCUU(SEQIDNO:25)靶標(biāo)序列為該正義序列，以T代替U。對(duì)于siRNA轉(zhuǎn)染，在24孔板上接種3X1045X104細(xì)胞/孔并用II類|3微管蛋白siRNAON-TargetplusSMARTpool試劑在最高達(dá)lOOnMsiRNA下轉(zhuǎn)染(Dha皿con，Chicago,IL)。將不帶與任何已知人類基因序列的序列同源性的非沉默對(duì)照siRNA在所有實(shí)驗(yàn)中用作負(fù)對(duì)照(Qiagen，Valencia,CA)，僅27聚體eIIIsiRNA實(shí)驗(yàn)例外。用PIIIsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞至最終濃度為25nM(Calu-6)和100nM(M60)。用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)照實(shí)驗(yàn)通過(guò)用不帶與任何已知人類基因序列的序列同源性的非沉默對(duì)照si:RM(Qiagen，Valencia,CA)在與靶標(biāo)siRNA等同濃度下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染來(lái)平行完成。除非另外指明，在轉(zhuǎn)染48h72h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)都涉及單Lipofectamine對(duì)照(模擬轉(zhuǎn)染)和非沉默對(duì)照siRNA(負(fù)對(duì)照)的使用。實(shí)施例2:|3微管蛋白同種型的分析用對(duì)|3微管蛋白同種型的逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)分析并通過(guò)蛋白印跡來(lái)對(duì)siRNA轉(zhuǎn)錄在P微管蛋白同種型的表達(dá)上的影響進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄分析而言，用Trizol試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商說(shuō)明分離總RNA。將RNA樣品用DM酶處理，并用Kavallaris等(1997)JC:l.in]:nvest100,1282-1293中所述方法和特定引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄用于RT-PCR分析，本文通過(guò)參考引入其全部?jī)?nèi)容。對(duì)于HP9(II類)、H513(IVa類)禾PHP2(IVb類)基因而言，基于半定量PCR的測(cè)試涉及建立兩個(gè)單獨(dú)的PCR管以用于靶標(biāo)(13微管蛋白)和對(duì)照(h微球蛋白)基因序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物在12.5%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行解析并通過(guò)溴化乙錠染色用Ge:[Docl()()()成像系統(tǒng)可視化，并用Quantity()ne軟件4.()版(Bio-Rad，Hercules,CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用兩個(gè)獨(dú)立的cDNA制備物以三等分樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)于蛋白印跡，將來(lái)自轉(zhuǎn)染細(xì)胞(10ug)的總細(xì)胞蛋白在12%SDS-PAGE上解析并用標(biāo)準(zhǔn)方法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。如前所述(Don等(2004)MolCancerTher3，1137-1146)并細(xì)微修改，用I類13微管蛋白的單克隆抗體(1:5，000;由Dr.R.Luduena，UniversityofTexas，SanAntonio,TX惠贈(zèng))或替代性地使用抗e-I微管蛋白(AbCam)、抗II類P微管蛋白(1:1，000，Covance，Richmond,CA)、抗III類|3微管蛋白(1:1，000,Covance)、抗IV類0微管蛋白(1:500,SigmaChemicalCo.-Aldrich，StLouis,MO)和抗總|3微管蛋白(1:500，Sigma)進(jìn)行免疫印跡。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)進(jìn)行檢測(cè)。將印跡用Typhoon掃描儀掃描并用ImageQuant.軟件5.2版(MolecularDynamicsInc，Sunnyvale,CA)進(jìn)行定量。用分離自3次獨(dú)立提取物的蛋白以三等分試樣重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如圖1A所示，當(dāng)用最優(yōu)量的siRNA處理時(shí)，e]:]:微管蛋白(H:|39)表達(dá)在兩個(gè)細(xì)胞系中在基因水平極大地降低，而在IVb類siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到|3IVb(H|32)表達(dá)的完全抑制。在72h時(shí)，蛋白印跡分析表明II類P微管蛋白和IV類P微管蛋白的水平分別在用0II或0IVb微管蛋白的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中顯著降低，但在對(duì)照siRNA中沒(méi)有降低(圖IB)。如圖2所述，II類13微管蛋白(圖2A)或IVb類13微管蛋白(圖2B)的下調(diào)沒(méi)有影響其它P微管蛋白同種型的內(nèi)源性水平。實(shí)施例3:耐藥性克隆測(cè)試將細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h并將約600個(gè)細(xì)胞(對(duì)Calu-6而言)或150個(gè)細(xì)胞(對(duì)H460而言)接種至6孔板的各孔內(nèi)并讓其附著4h6h。本研究所用細(xì)胞系沒(méi)有接受預(yù)先藥物選擇，且易于表現(xiàn)出在肺癌中觀察到的內(nèi)在耐藥性。然后用濃度遞增的各種抗有絲分裂藥物處理細(xì)胞。在37。C溫育3天后，除去含藥培養(yǎng)基并代以新鮮的完整培養(yǎng)基。在7天1()天中每隔3天4天更換培養(yǎng)基直至形成可見(jiàn)菌落。以類似的培養(yǎng)基變化對(duì)對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行相同處理。將存活菌落同時(shí)固定并用0.5%的結(jié)晶紫的甲醇溶液染色，用水清洗以除去過(guò)量染色并空氣千燥過(guò)夜。對(duì)各孔中的菌落手動(dòng)計(jì)數(shù),并將結(jié)果根據(jù)下式以存活分?jǐn)?shù)表示存活分?jǐn)?shù)計(jì)算如下菌落數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)X平板接種效率)，其中平板接種效率等同于菌落數(shù)除以無(wú)藥培養(yǎng)基中接種的細(xì)胞數(shù)。對(duì)各個(gè)藥物-細(xì)胞系組合作出劑量響應(yīng)曲線并用GraphPadPrism程序(GraphPadSoftware，第4版，SanDiego，CA)從所述曲線中推導(dǎo)出抑制劑量(ID5。)值。ID5。被定義為將經(jīng)藥物處理的孔中的菌落數(shù)減少至相關(guān)未經(jīng)處理的對(duì)照孔中的菌落數(shù)的5()%所需的藥物濃度。1:[)5。值是至少4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。本測(cè)試的結(jié)果表明|3II和13IVb微管蛋白的敲出顯著增加了長(zhǎng)春花生物堿而非紫杉烷的細(xì)胞毒性。如圖3AB所示，eil敲弱使兩個(gè)細(xì)胞系對(duì)長(zhǎng)春新堿而非紫杉醇明顯更敏感。令人驚訝的是，！3IVb微管蛋白的下調(diào)導(dǎo)致用長(zhǎng)春新堿處理時(shí)存活菌落陡然下降(圖4A和圖5)。與類轉(zhuǎn)染物的觀察類似，e:[vb下調(diào)沒(méi)有顯著增加紫杉醇在這些細(xì)胞中的細(xì)胞毒性(圖4B)。為了排除這些影響可能是由于紫杉醇與特定13微管蛋白同種型的某種獨(dú)特相互作用的可能性，在分析中包含了另一種微管穩(wěn)定劑環(huán)氧聚微管素B。環(huán)氧聚微管素B處理沒(méi)有引起用eIIsi:RM轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞的藥物敏感性的顯著變化(圖3C)，這與紫杉醇數(shù)據(jù)一致。相反，IVb類轉(zhuǎn)染物對(duì)環(huán)氧聚微管素B明顯更抵抗(圖4C)。此外，還測(cè)試了額外的長(zhǎng)春花生物堿以確證觀察到的長(zhǎng)春新堿在II類和IVb類轉(zhuǎn)染物上的過(guò)敏效果。這些測(cè)試的結(jié)果如表婦IIsiRNA)和表1B(PIVbsiRNA)中所示。對(duì)所有受測(cè)長(zhǎng)春花生物堿所獲得的結(jié)果在兩個(gè)NSCLC細(xì)胞系中均一致，盡管僅顯示了H460細(xì)胞數(shù)據(jù)。盡管可以在基因表達(dá)(mRNA)水平對(duì)IVa類(H5|3)和IVb類(HP2)表達(dá)進(jìn)行特異性區(qū)分，但目前沒(méi)有區(qū)分IVa類與IVb類蛋白的商購(gòu)抗體，因此在本研究中沒(méi)有檢驗(yàn)這些多肽的區(qū)別表達(dá)。期望使用IV類13微管蛋白特異性抗體的親和捕獲和如毛細(xì)管區(qū)域電泳技術(shù)等高分辨電泳技術(shù)的組合可以對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行分辨并可以對(duì)其進(jìn)行區(qū)別定量。在用IVb類siRNA轉(zhuǎn)染的Calu-6細(xì)胞中觀察到約40X50X的H513基因表達(dá)的減少，但在H460IVb類轉(zhuǎn)染物中沒(méi)有觀察到顯著變化。由于兩個(gè)細(xì)胞系顯示出相同的克隆結(jié)果，所獲藥物響應(yīng)可歸因于IVb類而非IVa類抑制。NSCLC細(xì)胞中|5:[:[或|5:[Vb的抑制沒(méi)有顯著增強(qiáng)紫杉醇的細(xì)胞毒性。這一結(jié)果與下述觀察一致用I、II或IVb類|3微管蛋白對(duì)CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染沒(méi)有帶來(lái)對(duì)紫杉醇的抵抗。本研究中所用siRNA導(dǎo)致各個(gè)靶向|3微管蛋白同種型表達(dá)的特異性下調(diào)，且沒(méi)有28觀察到其它I微管蛋白同種型水平的變化。這些結(jié)果突出了各種個(gè)體13微管蛋白同種型在確定細(xì)胞的化學(xué)敏感性中的不同貢獻(xiàn)。基于這些結(jié)果，我們提出每種13微管蛋白同種型就藥物相互作用而言是獨(dú)特的，且細(xì)胞的同種型組成影響其對(duì)抗微管劑的響應(yīng)。由于eIVb同種型在所有組織中組成性表達(dá)，因而在13IVb轉(zhuǎn)染物中觀察到的長(zhǎng)春新堿敏感性的戲劇性效果令人感興趣?？梢韵胂螅琍微管蛋白組成的差異可能影響微管與細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的其它元件的相互作用并因此決定包括對(duì)化學(xué)治療劑的細(xì)胞響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞行為。對(duì)敏感性機(jī)制的另一個(gè)可能解釋是藥物結(jié)合親和力的改變；然而，由于長(zhǎng)春花生物堿(包括長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春瑞濱)與13微管蛋白同種型都以相似的親和力結(jié)合，因而因不同同種型組成而引起的藥物結(jié)合親和力的改變不太可能是基礎(chǔ)機(jī)制。實(shí)施例4:微管蛋白的免疫熒光染色使轉(zhuǎn)染的Calu-6細(xì)胞在無(wú)菌室玻片上生長(zhǎng)直至6()%7()%合流。然后將細(xì)胞用10nM的紫杉醇和長(zhǎng)春新堿處理lh。將細(xì)胞在甲醇中固定并如前所述(Don等(2004)見(jiàn)上，帶細(xì)微修改)處理用于染色。將固定的細(xì)胞用a微管蛋白(5XFCS/PBS中1:400，Sigma)染色30分鐘，接著用Cy2抗小鼠熒光標(biāo)記抗體(5%FCS/PBS中1:1，000，GEHealthcare)染色。用DAPI:II復(fù)染劑(VysisInc.，DownersGrove,IL)將玻片安置于蓋玻片上。用帶Image-ProPlus4.1軟件(MediaCybernetics,L.P.，SilverSpring，MD)的ZeissAxioplan2免疫熒光顯微鏡(Mannheim,Germany)觀察玻片。如圖7A所述，未經(jīng)處理的13II轉(zhuǎn)染物和0IVb轉(zhuǎn)染物都沒(méi)有顯示出可觀察到的微管形態(tài)變化。然而，與l()nM長(zhǎng)春新堿溫育后，與對(duì)照siRNA相比，e]:]:和|5IVbsi:RM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都顯示出極大的微管細(xì)胞骨架的破壞。在PII和eiVbsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，微管極大程度地解聚并且大多數(shù)細(xì)胞僅由零星的剩余微管的殘余物圍繞。相反，對(duì)照細(xì)胞的形態(tài)受長(zhǎng)春新堿的影響較小。盡管在不存在長(zhǎng)春新堿時(shí)的en和eivb轉(zhuǎn)染物中微管形態(tài)沒(méi)有改變，但與對(duì)照相比低濃度的長(zhǎng)春新堿在這些細(xì)胞中造成極大的微管破壞。也檢測(cè)了紫杉醇處理在PII轉(zhuǎn)染物上的效果，將PIIsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在用lOnM紫杉醇處理lh后用a微管蛋白染色。與克隆數(shù)據(jù)一致的是，經(jīng)PIIsiRNA處理的細(xì)胞的微管沒(méi)有呈現(xiàn)出與經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞的微管的顯著不同(圖7B)。實(shí)施例5:長(zhǎng)春新堿的胞內(nèi)積聚的檢測(cè)為了確定藥物積聚是否有助于藥物過(guò)敏性，以MRP1陽(yáng)性MCF7-VP16作為正對(duì)照，在13IVbsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中測(cè)定了[3H]-長(zhǎng)春新堿的積聚。用如前所述(Verrills，N.M.，F(xiàn)le咖ing,C.L.,Liu，M.,Ivery，M.T.,Cobon，G.S.,Norris,M.D.,Haber,M.,andKavallaris，M.(2003)ChemBiol10,597-607)并細(xì)微修改的放射性標(biāo)記藥物對(duì)胞內(nèi)長(zhǎng)春新堿積聚進(jìn)行定量。簡(jiǎn)言之，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37t:在[3H]-長(zhǎng)春新堿(5.20Ci/mmo1;最終濃度為50nmol)(MoravekBiochemicalsInc，California)的存在下溫育2h。將細(xì)胞洗滌、水解并如前所述對(duì)[3H]放射活性進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞裂解物的等分試樣用BCA測(cè)試試劑盒(Pierce,Rockford，IL)平行確定細(xì)胞蛋白濃度。對(duì)二等分樣品確定了胞內(nèi)長(zhǎng)春新堿積聚并以pmol長(zhǎng)春新堿/mg蛋白表達(dá)。將MCF7-VP16細(xì)胞(Schneider等CancerRes.(1994)54(1):152-8)包括作為正對(duì)照，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞此前已顯示出對(duì)多種藥物抵抗相關(guān)蛋白1(MRP1)的過(guò)表達(dá)。MCF7-VP16細(xì)胞在[3H]_長(zhǎng)春新堿的積聚中顯示出顯著減少(數(shù)據(jù)未顯示)。在Calu-6和M60中，在PIVb敲弱與對(duì)照之間沒(méi)有胞內(nèi)[3H]-長(zhǎng)春新堿水平的顯著差異。這些結(jié)果表明長(zhǎng)春新堿在PIVb敲弱中的增強(qiáng)的敏感性并非歸因于藥物積聚的增加。實(shí)施例6:細(xì)胞周期分析通過(guò)流式細(xì)胞儀確定了13II或13IVb微管蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞中的DNA含量分布。轉(zhuǎn)染72h后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于濃度為5nM或40nM的長(zhǎng)春新堿中24h。在分析當(dāng)日，收集粘著細(xì)胞和流動(dòng)細(xì)胞,用PBS洗滌然后在37。C用含0.4%TritonX-100(Sigma)、50g/ml碘化丙啶(Sigma)和2ug/ral的無(wú)DNA酶的RNA酶(Roche,]:ndianapo:l.is,IN)的溶液在黑暗中染色15分鐘。通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，SanDiego，CA)可以測(cè)定DNA含量。流速為<200核/秒且分析了來(lái)自各個(gè)樣品的10，000個(gè)細(xì)胞。在相同的儀器設(shè)定下進(jìn)行測(cè)定。用CellQuest程序?qū)Ω鱾€(gè)細(xì)胞周期階段中的細(xì)胞分布進(jìn)行定量亞Gi(凋亡細(xì)胞)、Gi、S和G2/M。如圖8A和8B所示，與對(duì)照相比，僅|3II或PIVb微管蛋白的抑制不會(huì)顯著影響未經(jīng)處理的H460細(xì)胞的細(xì)胞周期概況。然而，用5nM長(zhǎng)春新堿處理后，PII和PIVb轉(zhuǎn)染物都顯示出G2/M和亞Gi群體的增加。在用40nM長(zhǎng)春新堿處理時(shí)，與對(duì)照處理的細(xì)胞相似，II類轉(zhuǎn)染物顯示出更大的G2/M積聚，而亞Gi群體沒(méi)有顯著差異(圖8A)。另--方面，在用等同濃度的長(zhǎng)春新堿處理時(shí)，IVb類轉(zhuǎn)染物沒(méi)有經(jīng)歷G"M停止并展示出G。-Gi群體的相伴增加(圖8B)。盡管有絲分裂的阻斷不顯著，但細(xì)胞展示出由亞Gi群體的增加所表示的凋亡。實(shí)施例7:用于|3:[I]:微管蛋白敲弱研究的細(xì)胞毒性藥物下列實(shí)施例描述了其中研究了13III微管蛋白敲弱在腫瘤細(xì)胞的敏感性上的作用的研究。制備儲(chǔ)備濃度為2mM的紫杉醇(Calbiochem，MerckBiosciences,Nottingham,U.K.)的二甲亞砜(DMS())溶液。制備儲(chǔ)備濃度為2raM的長(zhǎng)春新堿(Sigraa-Aldrich，StLouis,MO)的鹽水(0.9X重量/體積NaCl)溶液；將長(zhǎng)春瑞濱(DrBHill，PierreFabre，F(xiàn)rance惠贈(zèng))以2rnM的儲(chǔ)備濃度溶解于水中。制備儲(chǔ)備濃度為3.45mM的阿霉素(阿霉素鹽酸鹽；Pfizer,Sydney,Australia)的鹽水溶液。制備儲(chǔ)備濃度為68mM的足葉乙甙(VP-16;Sigma-Aldrich)的DMS()溶液，并制備儲(chǔ)備濃度為3.3mM的順鉬(Pharmacia,Rydal匿e，Australia)的鹽水溶液。實(shí)施例8:NSCLC細(xì)胞系中P111微管蛋白的沉默通過(guò)RT-PCR和蛋白印跡評(píng)估了|3III微管蛋白siRNA轉(zhuǎn)染在該同種型的基因和蛋白表達(dá)上的影響。對(duì)于RT-:PCR，用Trizol試劑(:[nvitrogen)根據(jù)制造商說(shuō)明從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取總RNA。將RNA樣品用DNA酶處理、用此前詳細(xì)描述的方法和特定引物(K纖llaris等(1997)JClinInvest100,1282-1293)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以用于RT-PCR分析。將P-2-微球蛋白(e2M)用作內(nèi)部mRNA對(duì)照。如下進(jìn)行蛋白裂解物的制備和蛋白印跡分析。簡(jiǎn)言之，將總細(xì)胞蛋白在4X15X的SDS-PAGE上分離并用標(biāo)準(zhǔn)方法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用指向PI微管蛋白(克隆體SAP4G5，AbeamLtd.，Cambridgeshire,UK)、eII微管蛋白(克隆體7B9，Chemicon，Temecula，CA)、|3III微管蛋白(克隆體TUJ1，Chemicon)和PIV微管蛋白(克隆體ONS1A6，Sigma-Aldrich)、GAPDH(AbeamLtd.)的單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。用山葵過(guò)氧化物酶連接的二抗(AmershamPharmaciaBiotech,U卯sala，Sweden)檢領(lǐng)!j-一抗，并且用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光儀(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)進(jìn)行檢測(cè)。將印跡用Typhoor^.掃描儀掃描并用ImageQuant軟件5.2版(MolecularDynamicsInc，Sunnyvale,CA)進(jìn)行定量。與模擬及對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用13III微管蛋白siRNA對(duì)H460和Calu-6細(xì)胞的處理造成PIII微管蛋白mRNA水平的顯著敲弱(圖9A)。該結(jié)果與在蛋白水平觀察到的下降一致(圖9B)。如蛋白印跡所示，13]::[:[微管蛋白siRNA特異性靶向13:[I]:微管蛋白并且沒(méi)有與受測(cè)的其它13微管蛋白同種型的交叉反應(yīng)性(圖9C)。另外，eill微管蛋白的沉默沒(méi)有導(dǎo)致受測(cè)的其它同種型的補(bǔ)償性變化。實(shí)施例9:111類|3微管蛋白沉默在紫杉醇或長(zhǎng)春新堿處理時(shí)對(duì)微管的破壞為了評(píng)估|3:[I]:下調(diào)在微管組織上的影響，在轉(zhuǎn)染的Ca:lu-6細(xì)胞上如下進(jìn)行免疫熒光染色。簡(jiǎn)言之,將siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞平板接種至玻璃室玻片上并讓其達(dá)到70%合流。然后用10nM的紫杉醇或長(zhǎng)春新堿將細(xì)胞處理1小時(shí)。接著通過(guò)用PBS洗滌細(xì)胞除去藥物并用10%FCS/PBS封閉。對(duì)于雙重染色而言，首先將細(xì)胞用III類13微管蛋白的抗體標(biāo)記，將其對(duì)在37°C的濕潤(rùn)室中溫育了30分鐘的細(xì)胞暴露。在室溫用0.1%Tween20/PBS洗滌后，在濕潤(rùn)室中將玻片與Cy3抗小鼠熒光標(biāo)記抗體(GEHealthcare)在室溫和黑暗中溫育40分鐘。溫育后，再次用0.1%Tween20/PBS洗漆玻片。此后用a微管蛋白和Cy2抗小鼠熒光標(biāo)記抗體(GEHealthcare)進(jìn)行染色。用MPIII復(fù)染劑(VysisInc.,DownersGrove,IL)將玻片安置于蓋玻片上。進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀測(cè)并用Sensicam電荷耦合裝置相豐幾(PC0Imaging,Kelheim，Bavaria，Germany)禾口Image—ProPlus4.1軟j牛(MediaCybernetics,LP.，SilverSpring，MD)獲取圖像。|3IIIsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒(méi)有顯示出可觀察到的微管形態(tài)變化。與蛋白印跡數(shù)據(jù)一致的是，當(dāng)在相同條件下成像時(shí)，與對(duì)照siRNA及模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在e微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞中觀察到III類13微管蛋白免疫熒光強(qiáng)度的明顯下降。與eill敲弱相比對(duì)照細(xì)胞(模擬及對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)表達(dá)了相似水平的III類13微管蛋白，而PIII微管蛋白的表達(dá)水平則幾乎無(wú)法由熒光顯微鏡檢測(cè)。為了檢驗(yàn)微管蛋白結(jié)合劑在eIII微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞上的影響，將細(xì)胞對(duì)lOnM紫杉醇或長(zhǎng)春新堿暴露lh然后檢驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)。如圖10所示，與對(duì)照處理的細(xì)胞相比，PIIIsiRNA轉(zhuǎn)染的Calu-6細(xì)胞顯示出微管細(xì)胞骨架的極大破壞。大多數(shù)|3IIIsiRNA處理的細(xì)胞變圓并且許多這些細(xì)胞展現(xiàn)出異常細(xì)胞形態(tài)或核形態(tài)(圖10箭頭所示)。對(duì)照處理的細(xì)胞偶爾顯示出極小的通常與紫杉醇處理相關(guān)的微管束集，而與eIII轉(zhuǎn)染物相比圓形細(xì)胞的出現(xiàn)頻率和微管破壞程度極小。實(shí)施例10:P111微管蛋白沉默增加對(duì)微管蛋白結(jié)合劑和DNA損傷劑的敏感性前述實(shí)施例中的數(shù)據(jù)表明沉默13III微管蛋白表達(dá)可能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的敏感性。為了對(duì)藥物敏感性的任何變化進(jìn)行定量，進(jìn)行了藥物處理的克隆測(cè)試。在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞并平板接種至6孔板6h，然后添加如圖例中指明的各種藥物。溫育72h后，除去含藥培養(yǎng)基并代以完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在710天中每3天更換培養(yǎng)基直至形成可見(jiàn)菌落。將菌落同時(shí)固定并用0.5%的結(jié)晶紫甲醇溶液染色，并手動(dòng)計(jì)數(shù)。對(duì)各孔中分別染色的菌落計(jì)數(shù)并如下計(jì)算存活分?jǐn)?shù)菌落數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)X平板接種效率)，其中平板接種效率等同于菌落數(shù)除以無(wú)藥培養(yǎng)基中接種的細(xì)胞數(shù)。如前Verrills，等，JNatlCancerInst2006;98:1363-74中所述測(cè)定氣代底物[3H]-紫杉醇和[3H]-長(zhǎng)春新堿的細(xì)胞攝取和保留。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞在12孔板中轉(zhuǎn)染48h。通過(guò)在2h中在37。C將[311]-紫杉醇(14.7Ci/mmol;最終濃度為50nM;MoravekBiochemicals]:nc，Brea,CA)禾P[3H:]-長(zhǎng)春新堿(7.ICi/iranol;最終濃度為12.5nM;GEHealthcare)添加至轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)監(jiān)測(cè)藥物攝取。如前述實(shí)施例所述將細(xì)胞洗滌、水解并計(jì)數(shù)。對(duì)三等分樣品確定細(xì)胞中積聚的氚代藥物的量并將其以pmol藥物/mg蛋白表達(dá)。進(jìn)行至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中包括了相關(guān)正對(duì)照，包括耐長(zhǎng)春新堿成神經(jīng)細(xì)胞瘤(BE/VCR10)和耐VP-16乳腺癌細(xì)胞(MCF7-VP16)，已知它們分別過(guò)表達(dá)多種藥物抵抗物l(MDRl)和多種藥物抵抗相關(guān)蛋白1(MRP1)。與免疫熒光觀察一致的是，PIII微管蛋白沉默造成了對(duì)紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的敏感性的顯著增加(圖IIA和11B)。另外，與對(duì)照相比，13III微管蛋白被沉默的細(xì)胞展示出對(duì)長(zhǎng)春瑞濱的增加的敏感性(圖IID)。所述增加的敏感性不是由于改變的藥物積聚造成，這是因?yàn)榕c模擬和對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞相比，在13III微管蛋白siRNA處理的Calu-6或M60NSCLC細(xì)胞中胞內(nèi)藥物積聚水平?jīng)]有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。此外還用DM損傷劑、VP-16、順鉑和阿霉素進(jìn)行了藥物處理的克隆測(cè)試。有趣的是，13III:微管蛋白沉默造成了對(duì)在H460細(xì)胞中測(cè)試的所有3種DM損傷劑的敏感性的增加。用Calu-6細(xì)胞獲得了相似結(jié)果。由于H460具有野生型p53而Calu-6細(xì)胞帶有突變的p53，因而對(duì)這些藥物的敏感性似乎不依賴于p53基因型。實(shí)施例11:|311I微管蛋白敲弱對(duì)紫杉醇及長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的G2/M停滯的廢止和對(duì)亞G1群體的增加的誘導(dǎo)為了確定|3III微管蛋白沉默是否影響細(xì)胞周期概況，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了細(xì)胞周期分析。通過(guò)用siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞72h并在藥物處理后24h收集(粘著的和懸浮的)細(xì)胞來(lái)確定細(xì)胞周期分析。用含0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich)、50yg/ml溴化乙錠(Sigma-Aldrich)禾B2ug/ml的無(wú)DNA酶的RNA酶(Roche,Indianapolis,IN)的溶液在37。C將DNA內(nèi)含物染色15分鐘。然后用FACSCalibur(Bect.on-Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes,NJ)分析細(xì)胞的細(xì)胞周期擾動(dòng)。用CellQuest程序?qū)Ω鱾€(gè)細(xì)胞周期階段中的細(xì)胞分布進(jìn)行定量亞Gi(凋亡細(xì)胞)、Gi、S和G2/M。I--1460細(xì)胞的細(xì)胞周期概況未受|3III微管蛋白沉默影響。為了確定微管蛋白結(jié)合劑是否影響13III微管蛋白siRNA轉(zhuǎn)染物的細(xì)胞周期概況，用紫杉醇或長(zhǎng)春新堿處理細(xì)胞。與5nM紫杉醇溫育24h后，13III微管蛋白被沉默的細(xì)胞與對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞(p<0.05)相比具有更高的亞Gi(凋亡細(xì)胞)含量(圖12A)，盡管與未處理的樣品相比13III微管蛋白siRNA和對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞都具有相似的G/M含量的增加。用40nM紫杉醇時(shí)觀察到主要差異，其中對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞顯示出顯著的G2/M阻斷而PIII微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞在反映凋亡細(xì)胞的亞Gi群體中出現(xiàn)顯著增加(圖12A)。當(dāng)將siRNA處理的細(xì)胞暴露于長(zhǎng)春新堿時(shí)觀察到類似結(jié)果(圖12B)，表明存在當(dāng)15III微管蛋白沉默后增強(qiáng)紫杉垸和長(zhǎng)春花生物堿的效果的共有機(jī)理。實(shí)施例12:在紫杉醇或順鉑存在下13III微管蛋白敲弱增加細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性進(jìn)行膜連蛋白V-FITC染色以及隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析以確定在PIII微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞中對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的暴露是否與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的增加有關(guān)。如前Ther2004;3:1301-10中所述，通過(guò)用siRNA轉(zhuǎn)染h460細(xì)胞72h并在藥物處理后48h收集(粘著的和懸浮的)細(xì)胞來(lái)確定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，將1X105個(gè)細(xì)胞與膜連蛋白V-FITC和溴化乙錠在黑暗中溫育15分鐘(Becton-Dickinson)，接著立即用FACSCalibur(Becton-Dickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。用CellQuest軟件進(jìn)行細(xì)胞直方圖分析。將H460細(xì)胞與紫杉醇溫育48h，以lnM的紫杉醇在|3III微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并以5nM的紫杉醇在對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖13A)。而且，在所有受試紫杉醇濃度下(1nM、2nM和5nM),|5III微管蛋白si:RM處理的細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞(圖13A)。相似地，在暴露于順鉑48h的PIII微管蛋白siRNA處理的細(xì)胞中，與對(duì)照相比在0.4iiM或1yM順鉑處理的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖13B)。所述數(shù)據(jù)共同表明在NSCLC中用微管蛋白結(jié)合劑和DM損傷劑處理后15III微管蛋白沉默使細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)敏感。實(shí)施例13:III類|3微管蛋白沉默增加對(duì)微管蛋白穩(wěn)定劑環(huán)氧聚微管素的敏感性如前述實(shí)施例中所述進(jìn)行H460和Calu-6細(xì)胞的III類|3微管蛋白敲弱，并用微管蛋白穩(wěn)定劑環(huán)氧聚微管素B進(jìn)行藥物處理的克隆測(cè)試。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖14所示。兩個(gè)細(xì)胞系中的III類13微管蛋白敲弱增加了這些細(xì)胞對(duì)環(huán)氧聚微管素B的敏感性。實(shí)施例14:III類13微管蛋白沉默的替代性siRNA為了研究由其他siRNA進(jìn)行的微管蛋白表達(dá)的敲弱是否在響應(yīng)于微管蛋白結(jié)合劑時(shí)能誘導(dǎo)等價(jià)水平的III類e微管蛋白沉默的變化，用稱為序列8(SEQIDN0:ll和12)或序列l(wèi)l(SEQIDNO:13和14)的27聚體siRNA試劑敲弱M60細(xì)胞中的III類P微管蛋白表達(dá)。這些siRNA識(shí)別III類13微管蛋白mRNA序列的不同區(qū)域。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖15和16以及表2中所示。圖15所示蛋白印跡顯示每種這些siRNA在不同程度有效敲弱了III類13微管蛋白表達(dá)，而同時(shí)不會(huì)影響其它微管蛋白同種型的表達(dá)。圖16和表2顯示經(jīng)敲弱的細(xì)胞液展示出不同程度的對(duì)紫杉醇和長(zhǎng)春新堿的靈敏度的增加，表明多種siRNA可以用于成功提高腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性。實(shí)施例15:用于III類15微管蛋白沉默的短發(fā)夾RNA(shRNA)使用短發(fā)夾RNA構(gòu)建體(SEQIDNO:15)來(lái)試圖穩(wěn)定敲弱H460細(xì)胞中的III類|3微管蛋白表達(dá)。鑒定出稱作克隆體4、克隆體59和克隆體60的3個(gè)克隆體,其中觀察到穩(wěn)定的III類e微管蛋白敲弱。如圖17所示，每個(gè)這些克隆體都顯示出不同水平的:[:[i類e微管蛋白同種型的敲弱(如標(biāo)準(zhǔn)化蛋白印跡中檢測(cè)到的in類e微管蛋白的強(qiáng)度變化所示)，而不明顯改變其他微管蛋白同種型的表達(dá)。當(dāng)在克隆測(cè)試中檢驗(yàn)這些經(jīng)穩(wěn)定敲弱的克隆體對(duì)紫杉醇或DNA損傷劑順鉑(C證)的敏感性時(shí)(圖18和表3)，發(fā)現(xiàn)所有克隆體都展現(xiàn)出對(duì)每種所述試劑的敏感性增加。各個(gè)克隆體的敏感性似乎與:[i:i類e微管蛋白的敲弱程度相關(guān)，而克隆體4似乎具有最大的敲弱量和最大的對(duì)這些試劑的敏感性。實(shí)施例16:白血病細(xì)胞中的2-甲氧基雌二醇抵抗性與II類13微管蛋白相關(guān)微管蛋白結(jié)合劑2-甲氧基雌二醇(2ME2)與秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)附近的P微管蛋33白結(jié)合、抑制微管聚合并誘導(dǎo)有絲分裂停滯。選擇顯示出對(duì)2ME2增加的抵抗性的CCRF-CEM白血病細(xì)胞，并選擇4個(gè)高度抵抗2ME2的白血病細(xì)胞亞系用于詳細(xì)分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)在3.6yM28.8iiM的2ME2中選擇的2ME2細(xì)胞的2ME2抵抗性為母系細(xì)胞的11107倍。2ME2抵抗性細(xì)胞對(duì)環(huán)氧聚微管素B過(guò)敏，僅抵抗性最低的亞系CEM/2ME2-3.6:R對(duì)秋水仙堿和長(zhǎng)春新堿交叉抵抗。2ME2抵抗性細(xì)胞沒(méi)有展示出如親本細(xì)胞所示的G2/M細(xì)胞周期停滯，并且顯示出比親本細(xì)胞更高的聚合微管蛋白水平。對(duì)于I類P微管蛋白突變而言，在2ME2抵抗性細(xì)胞中檢測(cè)到S25N、D197N、A248T和L350N。S25N突變?cè)趞3微管蛋白上的紫杉醇結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，而A248T和L35()N在秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，然而所述抵抗性細(xì)胞不對(duì)紫杉醇或秋水仙堿交叉抵抗。這表明所述突變可能在所述結(jié)合位點(diǎn)具有誘導(dǎo)的構(gòu)象改變。另外，據(jù)顯示2ME2抵抗性亞系己將其II類13微管蛋白的表達(dá)上調(diào)(圖19)。為了確定II類13微管蛋白的水平是否能預(yù)測(cè)敏感性并有助于抵抗性，在藥物敏感的H460(NSCLC)細(xì)胞中進(jìn)行siRNA介導(dǎo)的II類|3微管蛋白敲弱。II類|3微管蛋白的敲弱顯著增加了翻細(xì)胞對(duì)2ME2和秋水仙堿的敏感性。實(shí)施例17:對(duì)受試對(duì)象施用核酸構(gòu)建體對(duì)診斷或懷疑具有NSCLC腫瘤的受試對(duì)象進(jìn)行腫瘤活組織檢查。用本文所述或如前所述(Kavallariset.al.(1997)JClinInvest.100:1282)的特定商購(gòu)單克隆抗體或核酸通過(guò)RT-PCR檢測(cè)活檢組織以確定腫瘤是否表達(dá)13II、PIII或PIVbP微管蛋白mRNA或蛋白。如果腫瘤表達(dá)PII、0III或13IVbf3微管蛋白，則根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行治療。將指向II類、III類或IVb類13微管蛋白的一種或多種siRNA構(gòu)建體以2X109構(gòu)建體/注射的劑量直接注射到腫瘤內(nèi)，每?jī)商爝M(jìn)行注射并重復(fù)3或5次，其中所注射的siRNA構(gòu)建體被封裝于如前所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中(Nogawaetal.(2005)見(jiàn)上)、與納米顆粒偶聯(lián)或懸浮于鹽水中并可選地用核酸酶抵抗性化學(xué)修飾進(jìn)行合成。替代性的是將與納米顆粒偶聯(lián)的構(gòu)建體系統(tǒng)性施用，其中利用了納米顆粒將構(gòu)建體定位到肺的能力。為了監(jiān)測(cè)腫瘤中II類、III類或IVb類P微管蛋白表達(dá)的抑制，可以在約72小時(shí)再進(jìn)行活組織檢查并如上所述檢驗(yàn)組織的基因表達(dá)。當(dāng)腫瘤中ii:類、i]::[類或ivb類e微管蛋白的表達(dá)基本被抑制后，采用標(biāo)準(zhǔn)施用率對(duì)受試對(duì)象施用標(biāo)準(zhǔn)劑量的用于所討論腫瘤類型的微管蛋白結(jié)合劑。表1A.長(zhǎng)春花生物堿存在下13IIsiRNA轉(zhuǎn)染的NSCLCH460細(xì)胞的克隆存活*id5。=殺死50%細(xì)胞的藥物濃度(id5。)；tStudentt測(cè)試(兩側(cè))。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>P值通過(guò)比較模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的ID5。與siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的ID5。而確定表IB.長(zhǎng)春花生物堿存在下13IVbsiRNA轉(zhuǎn)染的NSCLCH460細(xì)胞的克隆存活<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表2.用27聚體13IIIsiRNA進(jìn)行PIII沉默后在H460細(xì)胞上的藥物處理克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表3.II4600III-shRNA穩(wěn)定細(xì)胞的藥物處理克隆測(cè)試<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>1抑制50%的菌落形成所需藥物濃度。2相對(duì)敏感性(RS)是與對(duì)照克隆1相比的siRNA處理細(xì)胞的敏感性倍數(shù)。RS通過(guò)用對(duì)照克隆體1的ID5。除以13III穩(wěn)定克隆體或?qū)φ湛寺?的PIII而確定。NS——不顯著。權(quán)利要求一種篩選腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法，所述方法包括檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類β微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)，其中所述II類、III類和IVb類β微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)表明所述腫瘤細(xì)胞具有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性或潛在抗性。2.如權(quán)利要求i所述的方法，其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)i:i類、i:n類和]:vb類e微管蛋白中的任何--種或多種的表達(dá)包括檢測(cè)所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的任何兩種的表達(dá)。3.如權(quán)利要求i所述的方法,其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、in類和ivb類p微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)包括檢測(cè)所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類e微管蛋白的表達(dá)。4.如權(quán)利要求i所述的方法，其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、in類和ivb類p微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)包括檢測(cè)所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類p微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)。5.如權(quán)利要求i所述的方法，其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)包括檢測(cè)所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類p微管蛋白mRNA中的任何一種或多種的表達(dá)。6.如權(quán)利要求i所述的方法，其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)]:i類、]::[:[類和:[vb類e微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)包括對(duì)所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)水平進(jìn)行定量。7.如權(quán)利要求i所述的方法,其中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)包括將所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述ii:類、in類和]:vb類e微管蛋白中的--種或多種的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞對(duì)所述ii類、in類和ivb類e微管蛋白中的一種或多種的表達(dá)進(jìn)行比較。8.—種評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法,所述方法包括檢測(cè)由所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)的所述:n類、in類和ivb類e微管蛋白中的任何一種或多種或所述II類、IH類和IVb類13微管蛋白mRNA中的任何一種或多種的量并由此獲得受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量，將受試對(duì)象腫瘤細(xì)胞微管蛋白量與對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量進(jìn)行比較從而確定微管蛋白量差異，其中所述對(duì)照細(xì)胞微管蛋白量是對(duì)照細(xì)胞中]::[類、:[i]:類和:[vb類e微管蛋白或1I類、III類和IVb類13微管蛋白mRNA中的任何一種或多種各自的量，禾口基于所述微管蛋白量差異來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法,其中所述對(duì)照細(xì)胞是對(duì)照非腫瘤細(xì)胞。10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述對(duì)照細(xì)胞是對(duì)照腫瘤細(xì)胞。11.如權(quán)利要求io所述的方法，其中所述對(duì)照腫瘤細(xì)胞是抵抗所述微管蛋白結(jié)合劑的腫瘤細(xì)胞。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述對(duì)照腫瘤細(xì)胞是對(duì)所述微管蛋白結(jié)合劑敏感的腫瘤細(xì)胞。13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中檢測(cè)II類、III類和IVb類13微管蛋白中的任何一種或多種的量是檢測(cè)II類、III類和IVb類P微管蛋白的量。14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中檢測(cè)II類、III類和IVb類13微管蛋白中的任何一種或多種的量是僅檢測(cè)III類P微管蛋白的量。15.如權(quán)利要求9所述的方法,其中檢測(cè)II類、IH類和IVb類e微管蛋白mRNA中的任何一種或多種的量是檢測(cè)II:類、III類和IVb類15微管蛋白ra:RM的量。16.如權(quán)利要求9所述的方法,其中檢測(cè)II類、IH類和IVb類13微管蛋白mRNA中的任何一種或多種的量是僅檢測(cè)III類P微管蛋白mRNA的量。17.—種增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的方法，所述方法包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入有效量的至少一種核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含對(duì)類、i:n類或:[vb類e微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列，其中所述構(gòu)建體減少了腫瘤細(xì)胞中ii類、in類或ivb類e微管蛋白的表達(dá)并從而增加了腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性。18.—種治療受試對(duì)象中的腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用有效量的至少一種核酸構(gòu)建體，和對(duì)受試對(duì)象施用微管蛋白結(jié)合劑，所述核酸構(gòu)建體包含對(duì)]::[類、III類或IVb類e微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列，其中所述核酸構(gòu)建體減少了腫瘤中ii類、in類或ivb類13微管蛋白的表達(dá)從而增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性。19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中將所述核酸構(gòu)建體和微管蛋白結(jié)合劑同時(shí)施用。20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中將所述核酸構(gòu)建體和微管蛋白結(jié)合劑并行施用。21.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中將所述核酸構(gòu)建體在微管蛋白結(jié)合劑之前施用。22.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述核苷酸序列選自反義序列、siRNA序列、短發(fā)夾RNA序列和核酶序列。23.如權(quán)利要求17或18所述的方法,其中所述核苷酸序列對(duì)]:Vb類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少--部分具有特異性。24.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述核苷酸序列對(duì)II類P微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性。25.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述核苷酸序列對(duì):[I]:類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性。26.如權(quán)利要求125中任一項(xiàng)所述的方法，其中微管蛋白結(jié)合劑是微管去穩(wěn)劑。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述微管去穩(wěn)劑選自長(zhǎng)春花生物堿、多拉司他汀、秋水仙堿、念珠藻環(huán)肽、curacinA、2-甲氧雌二醇。28.如權(quán)利要求125中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微管蛋白結(jié)合劑是微管穩(wěn)定劑。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述微管穩(wěn)定劑選自紫杉烷和環(huán)氧聚微管素。30.如權(quán)利要求129中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述腫瘤細(xì)胞是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。31.如權(quán)利要求130中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞。32.至少一種包含對(duì)II類、III類或IVb類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體在制備用于增加腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的藥物中的應(yīng)用，其中所述構(gòu)建體能減少腫瘤細(xì)胞中ii類、in類或ivb類e微管蛋白的表達(dá)。33.—種用于增加腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種核酸構(gòu)建體以及藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑,所述核酸構(gòu)建體包含對(duì)n類、in:類或ivb類|5微管蛋白基因的至少一部分具有特異性的核苷酸序列，其中所述構(gòu)建體能減少腫瘤中II類、III類或IVb類13微管蛋白的表達(dá)。34.—種用于評(píng)估腫瘤對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種核酸構(gòu)建體,所述核酸構(gòu)建體包含對(duì)II類、III類或IVb類13微管蛋白基因產(chǎn)物的至少一部分具有特異性的核苷酸序列；或包含至少一種抗體,所述抗體對(duì)至少一種或多種II類、III類或IVb類|3微管蛋白具有特異性，其中所述構(gòu)建體或抗體用于檢測(cè)腫瘤中的II類、III類或IVb類e微管蛋白的表達(dá)。35.如權(quán)利要求34所述的試劑盒,所述試劑盒還包含微管蛋白結(jié)合劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種篩選腫瘤細(xì)胞對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性的方法，所述方法包括檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)II類、III類和IVb類β微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)，其中II類、III類和IVb類β微管蛋白中的任何一種或多種的表達(dá)表明腫瘤細(xì)胞具有對(duì)微管蛋白結(jié)合劑的抗性或潛在抗性。文檔編號(hào)A61K31/7088GK101778637SQ200880014915公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2007年3月5日發(fā)明者瑪麗亞·卡瓦拉里斯,顏佩佩申請(qǐng)人:新南創(chuàng)新私人有限公司