專利名稱：蛋白質(zhì)改性的納米滴、組合物和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及納米滴，更具體地，涉及蛋白質(zhì)改性的納米滴和組合物以及制 備方法。
背景技術(shù)：
在本說明書中任何地方提及的所有參考文獻(xiàn)(包括文章、公開的專利申請(qǐng) 和專利)的內(nèi)容都通過引用并入本文。
純病毒衣殼蛋白可以圍繞納米級(jí)對(duì)象而自組裝，(Bancroft, J. B.; Hiebert, E.
/廠函a S函// S盧r/ca/ W環(huán)，腸/ogy 1967, 32, 354-356; Bancroft, J. B.; Hills, G. J.; Markham, R. ^Sh/辦t /" Ae <S^^^xygwZ /_y iVocaw " 6Vwa〃 5^/ e/^c"/ For聽ft》"y (9^ga"ized Sfrwc加my戶o附尸roto'" Sw^wra.to f"P ra/ogy 1967， 3/, 354-379; Hiebert， E.; Bancroft, J", B.; Bracker, C. E. T7 e o/5b附e
iS而〃 jS^/zm.c"/ J^iwas，坊Z)n'd P7myes， O決w iVwc/ec;prato'ra， P ra/ogy 1968, 3《492-508),通過稱為"包封，，的方法將納米級(jí)對(duì)象包封在蛋白質(zhì)外殼中。 (Douglas, T.; Strable, E.; Willits, D.; Aitouchen, A.; Libera, M.; Young, M. ZWez'"
2002, 74, 415-418; Douglas, T.; Young, M. //osf-Gwesf五Mcapsw/adow o/Wafen.afc fey ^^微Zj/^//Vofe/" Atowre 1998,卯J, 152-155; Douglas, T.; Young, M.
尸aWc/as as 7femp/atesMzter/a/s Sj^/zes^, Jt/u Ma欣1999, 679-681; Dragnea, B.; Chen, C.; Kwak， E. S.; Stein, B.; Kao, C. C. GWcf A/awopaWc/ay as2003, /25, 6374-6375 )。
通過展示病毒蛋白質(zhì)，殼體化的(encapsidated)納米物質(zhì)可以潛在地凈皮賦予所 希望的病毒功能性在特定組織中的優(yōu)先定位，這可以用于細(xì)胞靶向(Uchida, M.; Klem, M. T.; Allen, M.; Suci， P.; Flenniken, M; Gillitzer， E.; Varpness， Z.; Li鄰old， L. ().;Young, M.; Douglas, T. Bz'o/ogz.ca/ Co齒z-"era:尸rato'w Cages1 as Mw/^/i/wc/io"a/ iV朋o; /w/wms, ^dv. MafeK 2007, ", 1025-1042)。在殼體化的典型論證中，通過 將純衣殼蛋白質(zhì)與純RNA組合并且透析以改變pH和離子強(qiáng)度，在體外組裝有 傳染性的病毒(Bancroft, J. B.; Hiebert, E. Wro/ogy 1967， 32， 354-356)。類似地， 合成聚合物(Bancroft, J. B.; Hiebert， E.; Bracker, C. E. T7ze ^fecte o/ J^Wows /W，"/o"j o"幼g〃So膨Wmyay, Wra/ogy 1969， 3P， 924-930 )、對(duì)位多金屬氧酸鹽顆粒(Douglas, T.; Young, M. T/oW-GweW 五加a/ sw/油'ow o/ Mate由/s JMemWed Cages, iV^w/r 1998, 393，
152-155 )、固體金納米晶體(Dragnea， B.; Chen, C.; Kwak， E. S.; Stein， B.; Kao, C. C. GoW TVawo/^Wc/as1 as *S^e"msco/ /c五w/za"cera々r 附ra U/as ow 5Vwg/e ■/為.C7z置5bc 2003, "5, 6374-6375; Chen, C.; Daniel, M. C.; Quinkert， Z. T.; De, M.; Stein， B.; Bo麵an， V. D.; Chipman， P. R.; Rotello, V. M.; Kao, C. C.; Dragnea, B. iV""wo/ aWc/e-7fe附/ /她t/ y^柳6/y c /" F ra/尸rote/w Cages, 7Va"o Z欲 2006， 6, 611-615; Sun, J.; DuFort， C.; Daniel， M.-C.; Murali， A.; Chen， C.; Gopinath, K.; Stein, B.; De, M.; Rotello, V. M.; Holzenburg, A.等人，Cow-Cow/ra//ed 尸o/戸o^p/z/雄z'w Wrws-Zife尸"Wc/es， Prac. SW. t/.S.yl. 2007, /0《
1354-1359)和量子點(diǎn)(Dixit, S. K.; Goicochea， N. L.; Daniel, M.畫C; Murali， A.; Bronstein, L.; De， M.; Stein, B.; Rotello, V. M.; Kao, C. C.; Dragnea, B. /)W五顧p油"ow P ra/C，油，腸"批2006, 6, 1993-1999)已經(jīng)被殼體化， 以產(chǎn)生尺寸類似于天然病毒的病毒樣顆粒(VLP)。對(duì)于這樣的小VLP,電子顯微 鏡表明蛋白質(zhì)殼由單個(gè)亞單元組裝，組裝方式使人想起膠束形成(McPherson, A. Micelle jFbrmadow CV^sta〃izaf/ow as尸an2d/g附s々r F n^s ^^5^/w6/乂 5/OjEs^qys 2005, 27, 447-458 )為具有二十面體病毒特征的有序結(jié)構(gòu)(Zandi, R.; Reguera, D.;Bminsma, R. F.; Gelbart, W. M.; Rudnick, J. 6Wg7'w /cas*a/^ra/ S，総^y /" Wn^es, iVoc. Ato/.爿cad Scz'. t/.S.A 2004， JW， 15556-15560 )，包括具有五次和六 次對(duì)稱的突出環(huán)狀多聚體，或者說"衣殼體，，，(Caspar, D. L.; Klug, A. P/^si'caZ 尸n'"c^ /es1 z'" f/ze Cbw>stri/cf/ow Aegw/ar J^Vwses， Co/d 6^n'wg i/(3r6. Sym/ . gwaw^ 歷o/. 1962, 27, 1-24 )。但是，現(xiàn)有技術(shù)的殼體化材料和技術(shù)到目前為止實(shí)用性有 限。因此仍然需要改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的蛋白質(zhì)改性的滴包含含有液體物質(zhì)的滴， 以及被形成來至少部分包封所述滴的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)蛋 白質(zhì)分子，所述蛋白質(zhì)分子在形成所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中對(duì)所述滴的至少一 部分具有親和力，所述滴的最大尺寸為至少約lnm并且小于約1000nm。根據(jù)本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的組合物包含分散在含水溶液中的多個(gè)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方 案的蛋白質(zhì)改性的滴。
根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案的制備蛋白質(zhì)改性的滴的方法包括提供第一 和第二不相混:溶的液體物質(zhì)；向所述第 一和第二不相混溶的液體物質(zhì)中的至少 一種中加入穩(wěn)定劑；乳化所述第一和第二液體物質(zhì)以在所述第一液體物質(zhì)中形 成所述第二液體物質(zhì)的多個(gè)滴，所述多個(gè)滴通過所述穩(wěn)定劑穩(wěn)定化，所述多個(gè) 滴中的每個(gè)滴的最大尺寸為至少約lnm并且小于約lOOnm;在所述乳化之前或 之后的至少一種情況下加入蛋白質(zhì)分子；以及使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成來至少部分包 封所述多個(gè)滴中的每一個(gè)。所加入的穩(wěn)定劑和蛋白質(zhì)分子屬于在穩(wěn)定劑與滴結(jié) 合時(shí)彼此具有相互靜電吸引力的類型。


通過參考附圖閱讀以下的詳細(xì)描述，將更容易理解本發(fā)明，在附圖中
圖1為示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的、在水中由陰離子十二烷基硫酸 鈉(SDS)表面活性劑穩(wěn)定的油滴被純化的衣殼蛋白殼體化的示意圖，所述純化的衣殼蛋白來自魟豆#逸綠斑駁病毒(cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)。這是蛋 白質(zhì)改性的滴的一個(gè)示例。通過利用透析調(diào)節(jié)pH和離子強(qiáng)度I,可以誘導(dǎo)本體 溶液中的衣殼蛋白在帶負(fù)電荷的納米乳滴表面周圍聚集和組裝。
圖2(a)和2(b)示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案通過負(fù)染色TEM觀察到的衣 殼蛋白結(jié)構(gòu)。圖2(a)示出在用純化的CCMV蛋白混合和透析SDS穩(wěn)定的納米乳 液后，單個(gè)納米級(jí)滴與pH和NaCl的離子強(qiáng)度I的函數(shù)關(guān)系。緩沖劑為RNA-重組裝(R )(pH=7.2,1=0.1M);六角形片(H )(pH=6.2,1=0.1M); 二聚物(D)(pH:6.2, I=1.0M);多殼(M) (pH=4.8,I=0,lM);以及空殼(E)(pH^4.8， I=1.0M)。插圖(右 上方)在用R緩沖劑透析后覆蓋通過SDS穩(wěn)定的微米級(jí)硅油滴表面的FITC-標(biāo)記的CCMV蛋白質(zhì)(綠色)的熒光光學(xué)顯微照片。圖2(b)示出在用M緩沖劑透 析后觀察到的由1、2和3同心蛋白質(zhì)殼包裹的納米滴。比例尺=20眼(所有圖片)。
圖3示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的所觀察到的CCMV蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的典 型實(shí)例與使用RNA-重組裝緩沖劑透析后在單個(gè)殼體化的油納米滴的單側(cè)上的 滴直徑減斜體數(shù)字)的函數(shù)關(guān)系。TEM圖像已經(jīng)被去除背景并且經(jīng)過傅立葉過 濾，以增強(qiáng)所述滴表面上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在尺寸更接近天然病毒尺寸的更小的 納米滴表面上更經(jīng)常發(fā)現(xiàn)完整的蛋白質(zhì)"衣殼體，，(白色環(huán))。環(huán)狀衣殼體可以局 部變換成六重排列(深色圓)。在更大的滴上更?？吹綌U(kuò)展的深色槽狀"疤"(深色 圓)、有缺陷的衣殼體和衣殼蛋白(深色圓)的六角形網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)?？梢员挥行蛞?殼體的完美二十面體所殼體化的納米滴的容許三角剖分?jǐn)?shù)(triangulation number) T和預(yù)計(jì)的外徑以較低的比例示出。使用d(T)《28(T/3)^估算外徑(用nm表示)， 對(duì)于CCMV，符合t^28nm, T=3個(gè)病毒。
圖4(a)-4(c)示出在納米滴(由圖3中的深色圓放大)表面上觀察到的局部蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)具有不同的有序和無(wú)序程度。圖4(a)表示六重配位的衣殼體(中心處的點(diǎn)) 代表在較小的滴上最常見的高有序程度(左側(cè))。由被突出的白色區(qū)域包圍的拉 長(zhǎng)的深色區(qū)域(箭頭)組成的槽狀皰的示例(中間)。通常在較大的滴上看到的六 角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由被從界面突出的蛋白質(zhì)的互連白色網(wǎng)絡(luò)包圍的深色斑(點(diǎn))組 成(右側(cè))。圖4 (b)示出概率A和^分別與在六角形衣殼體的深色區(qū)域中心與網(wǎng)絡(luò)之間的距離r的關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)的深色斑之間的平均間距(4.7nm)大約為 衣殼體中心之間的距離(9.5nm)的一半。圖4 (c)示出網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(右側(cè))可以 通過在平坦表面上堆積緊密的蛋白質(zhì)二聚物(左上)的六角形衣殼體(左側(cè)) 來制備。低蛋白質(zhì)密度的區(qū)域在一個(gè)六角形單元中用黑色點(diǎn)標(biāo)出。
具體實(shí)施例方式
在描述附圖中所表示的本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)，為了清楚起見，使用特定的 術(shù)語(yǔ)。但是，本發(fā)明不限定于所選擇的特定術(shù)語(yǔ)。應(yīng)當(dāng)理解，每個(gè)具體要素包 括以類似方式操作、實(shí)現(xiàn)類似目的的所有技術(shù)等同物。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供一種用于產(chǎn)生被蛋白質(zhì)改性和/或覆蓋的 納米乳滴的方法。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)可以有效地提供可以盛裝選 定物質(zhì)的膠嚢或容器。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，這樣的容器可以提供藥物 遞送結(jié)構(gòu)。但是本發(fā)明的廣義構(gòu)思不4義僅限于藥物遞送。此外，其中含有液滴 的蛋白質(zhì)膠嚢僅是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)改性的滴的一個(gè)示例。例如， 蛋白質(zhì)膠嚢可以含有盛裝有選定物質(zhì)的納米多孔聚合物凝膠顆粒。
在天然病毒中，病毒的病毒外殼蛋白作為保護(hù)其內(nèi)容物的阻擋層，所述內(nèi) 容物即核酸RNA或DNA，是自繁殖(self-propagation)和基因組復(fù)制所必需的。 病毒具有容易穿透特定細(xì)胞的能力，所以本發(fā)明的一些實(shí)施方案可以包括通過 在滴表面上設(shè)計(jì)病毒外殼的類型將特定藥物靶向遞送到某些細(xì)胞。因此，本發(fā) 明的一些實(shí)施方案可以提供模仿天然病毒的某些方面的膠嚢。這在一些實(shí)施方 案中可以包括提供能夠穿透細(xì)胞阻擋層并將內(nèi)容物遞送到該細(xì)胞中的膠嚢。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使病毒生長(zhǎng)、分解以及將蛋白質(zhì)與遺傳物質(zhì)(RNA 或DNA)分離的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得了病毒衣殼蛋白。但是，本發(fā)明的更廣的構(gòu)思不限 于只有這樣的技術(shù)和這些特定的蛋白質(zhì)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，通過病毒RNA 的細(xì)菌表達(dá)可以更大量地獲得衣殼蛋白。然后，制備了疏水性油在水中的微米 級(jí)乳液或納米級(jí)乳液(納米乳液)。疏水性藥物分子容易溶解在油中。但是所述油 的分子量不會(huì)低到使乳液通過Ostwald熟化而失穩(wěn)。在油中藥物分子的濃度固
9定，然后使用承載藥物的油作為下一步驟的原料，下一步驟即通過剪切乳化制 備水包油乳液。在一個(gè)實(shí)施例中用來制備納米乳液的極乳化過程涉及使用市售 的高壓微流體裝置。根據(jù)本發(fā)明的方法，超聲波裝置和其他方法也可以使用。
根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案，通過幾種不同方法可以用病毒蛋白來包封由 液體構(gòu)成的滴，產(chǎn)生病毒蛋白包覆的 一種液體的滴在不同的不相混溶液體中的
分散體。根據(jù)本發(fā)明的一些方法包括以下步驟(1)將希望類型的油加入到病
毒衣殼蛋白的水分散體中，同時(shí)通過穩(wěn)定劑(例如表面活性劑、顆粒或聚合物)
的類型和濃度來控制所述滴的穩(wěn)定化，還控制pH值、離子含量(例如鹽或緩沖 劑的類型)以及離子強(qiáng)度(例如鹽或緩沖劑的濃度)，并且施加機(jī)械剪切等誘導(dǎo)可 以引起較大滴分裂成較小滴的流動(dòng)；(2)將現(xiàn)有的水包油乳液或納米乳液(通過 荷電表面活性劑、顆?；蚓酆衔锓€(wěn)定化)以合適的pH值、離子含量和離子強(qiáng)度 與病毒衣殼蛋白的含水分散體組合，并以不引起滴破壞而是按照慣例分布組分 的方式混合；和(3)將現(xiàn)有的水包油乳液或納米乳液與病毒衣殼蛋白的含7&* 體組合，然后使用半透膜透析以改變pH值、離子含量和離子強(qiáng)度，從而導(dǎo)致蛋 白質(zhì)吸附在滴表面上。
所述滴的液體物質(zhì)可以包括以下物質(zhì)中的一種或多種油、石圭油、烴油、 石油、燃油、蠟、脂肪、氟化油、非揮發(fā)油、揮發(fā)油、芳香油、源自植物材料 的油、源自動(dòng)物材料的油、源自天然源的油、蒸餾油、#是取油、烹調(diào)油、食用 油、潤(rùn)滑油、組分主要是烴的反應(yīng)物質(zhì)、環(huán)氧物質(zhì)、粘合物質(zhì)、可聚合物質(zhì)、 熱致型液晶、溶致型液晶、酸性油、堿性油、中性油、天然油、聚合物油和合 成油。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的生物活性劑可以包括但不限于藥物分子、抗 癌分子、治療分子、激素分子、激動(dòng)劑分子、拮抗劑分子、阻抑劑分子、抑制 劑分子、敏化劑分子、抗抑郁劑分子、抗病毒劑分子、抗真菌劑分子、抗菌劑 分子、生物利用度增強(qiáng)劑分子、毒素分子、染料分子、熒光劑分子、生物分子、 營(yíng)養(yǎng)劑、維生素、香料、酶、納米顆粒和成像對(duì)比增強(qiáng)劑。
可以加入表面活性劑，例如帶負(fù)電荷的十二烷基硫酸鈉，來賦予乳滴穩(wěn)定性，防止在通過流動(dòng)誘導(dǎo)破裂將較大滴破裂成較小滴之后乳滴在后續(xù)合并。作 為替代方案，工業(yè)混合器、混料器、膠體磨或流動(dòng)-聚焦;徵流體裝置可以用來產(chǎn) 生含有藥物分子的油的乳液或納米乳液。極端流動(dòng)的現(xiàn)有方法能夠產(chǎn)生小到半
徑約5-10nm的滴，^f吏得只有非常小量的藥物分子可以在給定的滴中。這些更小 的納米滴本身可以比通過孔的增強(qiáng)的擴(kuò)散和滲透而更容易穿透細(xì)胞膜和腸粘 膜，并且病毒外殼賦予它們通過細(xì)胞攝取的蛋白質(zhì)引發(fā)而穿過膜的堅(jiān)固、活性 的方式。由于在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中所述滴可以大量制備，所以病毒蛋白 常常是限制成分，常常不用存在的蛋白質(zhì)來乳化，盡管在本發(fā)明的一些實(shí)施方 案中可以這么做。替代地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，獲得所述滴、稀釋所 述滴并固定表面活性劑濃度，然后加入分解的病毒衣殼蛋白。然后通過改變?nèi)?液的離子強(qiáng)度和/或pH值，可以使得蛋白質(zhì)被吸引到滴表面上并在所述滴上組 裝外殼。在一些實(shí)施方案中，使用陰離子表面活性劑來穩(wěn)定所述滴，這使得所 述滴在其表面上具有負(fù)電荷。這模仿RNA和DNA，它們?cè)谌芙鉅顟B(tài)下也是帶 負(fù)電荷的。然后，加入分解的衣殼蛋白并改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和pH值，以使得 病毒外殼形成在滴的表面上。為了說明這一原理，使用陰離子表面活性劑十二 烷基硫酸鈉(SDS)和得自豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)(—種植物病毒)的衣殼蛋 白所包覆的硅氧烷納米乳液進(jìn)行納米滴的第一病毒包封實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)施例中沒 有加入特定的藥物分子。在其他實(shí)施例中，將其他油溶性分子加入到我們的納 米滴中，例如熒光染料。我們的透射電子顯《敬鏡圖像表示病毒蛋白在滴表面上 成功組裝?？梢詢?yōu)化pH值和離子強(qiáng)度，以便完全包覆所述滴而不會(huì)導(dǎo)致形成空 的病毒殼。這些空殼浪費(fèi)蛋白質(zhì)，因此它們通常是不希望的。在某些組成和組 裝的條件下，還觀察到若干內(nèi)部滴可以包封在圍繞它們形成的 一個(gè)蛋白質(zhì)外殼 內(nèi)?？傊?，我們描述了可以用來產(chǎn)生被病毒蛋白包覆的非常寬范圍尺寸的乳滴 和納米乳滴的方法，并且可以具有增強(qiáng)的引發(fā)快速穿透、靶向和遞送的能力。 在一些實(shí)施方案中通過控制滴的尺寸分布，可以控制藥物的釋放，因?yàn)檩^大的 滴比較小的滴穿透得慢。作為替代方案，通過已知方法合成或純化的其他蛋白 質(zhì)可以用來包覆所述滴。實(shí)施例1
在才艮據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施例中，我們-使用來自CCMV(豇豆 褪綠斑駁病毒)的衣殼蛋白，它由于靜電相互作用而在納米乳滴表面上自組裝。 在天然病毒中，帶正電荷的病毒內(nèi)部與一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的RNA聚陰離乎反 應(yīng)。因?yàn)榧{米乳滴在所述滴的外部具有帶負(fù)電荷的表面活性劑頭部基團(tuán)，所以 病毒蛋白在油滴的外部界面處組裝。
獲得衣殼蛋白的過程
采用了 Rao的純化CCMV蛋白的過程(Choi， Y. G.; Rao, A. L. N.， Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VII. Selective Packaging of BMV RNA 4 by Specific n-Terminal Arginine Residues. Wra/ogy 2000， 275, 207-217 )。首先以野生 型CCMV開始，在懸浮緩沖液中的濃度為約4mg/mL。將該CCMV在分解緩沖 液中透析2'4小時(shí)，以將CCMV分離成蛋白質(zhì)二聚物和RNA。將分解的CCMV 從緩沖液中移出并以l4,000 rpm (Eppendorf CentrifUge 580 4R)離心30分鐘，以 沉淀RNA。提取上清液中的蛋白質(zhì)，然后在RNA組裝緩沖液中進(jìn)一步透析24 小時(shí)，以在上清液中剩余的RNA周圍組裝。最后，以lOO，OOOrpm(BeckmanTLA 110UC)將上清液離心1: 40小時(shí)，并且該上清液的上部3/4(含有純CCMV蛋白) 用于進(jìn)一步研究。所得蛋白質(zhì)的純度和濃度使用UV-可見光光譜測(cè)量。所有的 工作在4°C進(jìn)行。
制備納米乳滴的過程
4吏用樣f流體注射系統(tǒng)(microfluidic injection system)的才及端剪切產(chǎn)生納米乳 液，即一種液相的滴通過表面活性劑穩(wěn)定在另一種不相混溶的液相中，直徑小 于100nm。納米乳滴的尺寸取決于所用表面活性劑的量和類型、液體注入到微 流體系統(tǒng)中的壓力以及液體的粘度。然后將納米乳液離心并分級(jí)，以獲得特定 尺寸分布的滴(Mason， T. G.， J. N. Wilking， K. K. Meleson, C. B. Chang和S. M. Graves. 2006. iV(3woeww/w.o"5v々 777a&o", sfrMcfwre， / /yAS7'ca/_prqpem.as， Journal200880014491.8 of Physics: Condensed Matter 18: R635-R666; Meleson, K., S. Graves禾口 T. Mason. 2004. Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. Soft Materials 2: 109-123 )。通常是制備水包油納米乳滴，其尺寸可以通過微流體裝置和其他組成 參數(shù)來控制。因此，該實(shí)施方案用于將疏水藥物包裹在滴內(nèi)部，所述滴又在病 毒衣殼內(nèi)。 s
組裝條件(將病毒蛋白與納米乳滴組合)
使用了各種組裝條件來在納米乳滴周圍組裝病毒蛋白。通過改變透析納米 乳滴和病毒蛋白的溶液的pH和離子強(qiáng)度，可以產(chǎn)生在外表面上具有單層、雙層 或多層病毒蛋白的滴(見圖2(b))。
EM照相過程
使用火棉膠(parlodoin)支持膜來制備400目尺寸的銅網(wǎng)(Ted Pella Inc., Redding, CA),然后涂碳。該銅網(wǎng)使用高壓交流電進(jìn)行輝光放電，然后立即進(jìn)行 樣品沉積。樣品沉積步驟包括將5pL樣品直接放在銅網(wǎng)上1分鐘，用Whatman4 濾紙吸，然后立即用1%乙酸鈾酰染色1分鐘。再吸，并且空氣干燥。在Hitachi H-7000電子顯微鏡下觀察樣品，加速電壓為75kV。將負(fù)片顯影并使用Minolta Dimage Scan MultiPro掃描器掃描，用于圖像分析。
結(jié)杲討論
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案制備由病毒蛋白覆蓋的滴的這種方法的優(yōu)點(diǎn)可 以包括精細(xì)調(diào)節(jié)納米乳液的尺寸的能力，所述納米乳液是病毒組裝的模板。 因此，能夠使該蛋白質(zhì)容器的尺寸從大約10 nm到100nm之間變化，例如低于 1/10微米，允許在未來的應(yīng)用中使用有尺寸特異性的變化方案。病毒衣殼蛋白 到滴表面上的吸附可以通過蛋白質(zhì)對(duì)油的親和性和滴表面上的表面活性劑來控 制，而不是通過滴尺寸控制。所以，如果有需要，也可以制備亞微米、微米級(jí)、 甚至更大的病毒包封的滴。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可以提供制備蛋白質(zhì)改性的滴的一些方法，所述蛋 白質(zhì)改性的滴用于通過攝取、注射、吸入或通過皮膚將生物活性的內(nèi)容物(疏 水藥物)遞送到有機(jī)體內(nèi)部。含有放射性物質(zhì)或高原子序數(shù)元素的分子可以插 入到納米滴中，用于癌癥治療或成像增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案在醫(yī) 療成〗象和藥物遞送方面都具有潛在的應(yīng)用。在醫(yī)療成^^方面， 一個(gè)應(yīng)用可以是 在跟蹤細(xì)胞內(nèi)的傳輸路徑方面使用該容器。在藥物遞送方面， 一個(gè)應(yīng)用可以是 使用包封在納米乳液中的治療劑并隨后在癌細(xì)胞進(jìn)入時(shí)遞送以治療癌癥。
實(shí)施例2
本實(shí)施例是對(duì)不可壓縮的球形納米滴或"納米乳液"的殼體化，所述納米滴或 "納米乳液"可以具有明顯延伸到野生型核之外的連續(xù)的尺寸范圍并且通過所吸 附的陰離子表面活性劑分子來穩(wěn)定化。我們表明，可以迫使衣殼蛋白自組裝成 球形外殼而沒有Caspar-Klug體系規(guī)定的理想二十面體的完美對(duì)稱性和離散的尺 寸(Caspar, D. L; Klug， A., Physical Principles in the Construction of Regular Viruses. CoW Spn'wgSymp. 歷o/. 1962, 27， 1-24 )，這需要特定整凄t倍
(1、 3、 4、 7、...)的60個(gè)蛋白質(zhì)。用十二烷基硫酸鈉(SDS)穩(wěn)定的水包硅 油(聚二曱基硅氧烷)納米乳液通過高壓均化制備(Meleson, K.; Graves, S.; Mason, T.G" Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. 5b/ M ten油 2004， 2, 109-123 ),與純豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)衣殼蛋白混合(Choi， Y G.; Rao, A. L N., Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VII. Selective Packaging of BMV RNA4 by Specific n-Terminal Arginine Residues. 2000， 275,207-217)，并透析以降低二價(jià)陽(yáng)離子濃度，引起蛋白質(zhì)自組裝(Adolph， K. W.; Butler, P. J. G" Reassembly of a Spherical Virus in Mild Conditions. A^a/wre 1975, 255,737-738)。在寬范圍的pH值和離子強(qiáng)度下，所述重組裝產(chǎn)生了被單一蛋白 質(zhì)殼包覆的病毒樣滴(VLD)。我們還探究了寬范圍的pH值和離子強(qiáng)度來控制在 納米滴周圍由衣殼蛋白形成的同心外殼的數(shù)量。在已經(jīng)形成空的多殼結(jié)構(gòu)的低 pH值和離子強(qiáng)度的限值下(Adolph， K. W.; Butler, P. J.， Studies on the Assembly ofa Spherical Plant Virus. 1. States of Aggregation of the Isolated Protein. J", ikfo/. B/o/. 1974， 88， 327-341 )，滴可以凈皮包裹在兩個(gè)或更多蛋白質(zhì)殼內(nèi)。
對(duì)于被單外殼包覆的VLD，透射電子顯微鏡(TEM)表明，蛋白質(zhì)在彎曲的 表面上自組裝，不僅形成有序化的衣殼體，而且形成各種其他結(jié)構(gòu)。隨著所述 滴表面曲率減小，有序化的衣殼體結(jié)構(gòu)變得更少，并且出現(xiàn)其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 有缺陷的衣殼體、六角形網(wǎng)和槽形疤。這些結(jié)構(gòu)中的一些似乎是由于在彎曲表 面上蛋白質(zhì)的干4尤引起(Liu, A. J.; Nagel, S. R., Jamming Is Not Just Cool Any More. Atowre 1998, 396, 21-22)并且表現(xiàn)出由固體微觀顆粒穩(wěn)定的宏觀滴上發(fā)現(xiàn) 的缺陷(Bausch， A. R. Bowick, M. J.; Cacciuto, A.; Dinsmore, A. D.; Hsu, M. F.; Nelson, D. R.; Nikolaides, M. G.; Travesset， A.; Weitz, D. A., Grain Boundary Scars and Spherical Crystallography. 5W認(rèn)e 2003， 299, 1716-1718; Bowick， M.; Cacciuto. A.; Nelson. D. R.; Travesset, A.， Crystalline Order on a Sphere and the Generalized Thomson Problem. iVz;^. i ev.2002, 89, Art. No. 185502 pp. l畫4; Tarimala, S.; Dai, L. L, Structure of Microparticles in Solid-Stabilized Emulsions.丄a"g羅^ 2004, 20,3492-3494)。但是，其他結(jié)構(gòu)，如六角形網(wǎng)，是由于與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白 質(zhì)-表面的相互吸引作用相關(guān)的特殊規(guī)則而產(chǎn)生的。在較大滴上的有序衣殼體的 數(shù)量的總體減小表明當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在較低曲率的不可壓縮表面上組裝時(shí)，在CCMV 的衣殼中的三種不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)不是以相同比例存在的(Speir， J. A.; Munshi, S.; Wang, G.; Baker, T. S.; Johnson, J. E.， Structures of the Native and Swollen Forms of Cowpea Chlorotic Mottle Virus Determined by X-Ray Crystallography and Cryo-Electron Microscopy. 1995, 3, 63-78 )。因此，表面曲率在確定蛋白
質(zhì)構(gòu)象方面具有重要作用，并且深度影響包裹不可壓縮對(duì)象的組裝蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)。
方法
蛋白質(zhì)純化
按照Choi和Rao的方法(Choi， Y. G.; Rao, A. L. N., Molecular Studies on Bromovirus Capsid Protein: VIL Selective Packaging of BMV RNA4 by Specificn-Terminal Arginine Residues),分離和純化了來自CCMV的衣殼蛋白。CCMV 具有單一的衣殼蛋白，所以提及"CCMV蛋白，，都是指CCMV的單一的獨(dú)特的衣 殼蛋白。將純化的CCMV在1.0 L的分解緩沖液(0.5 M CaCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5， 1.0 mM EDTA， 1.0 mM DTT, 0.5 mM PMSF )中透析24小時(shí)。將分離出 的病毒以14,000 RPM離心30分鐘以沉淀RNA。才是取蛋白質(zhì)上清液并在1.0 L 的RNA重組緩沖液(50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM KCl, 5.0 mM MgCl2, 1.0 mM DTT)中透析24小時(shí)。然后將溶液以100,000 RPM離心100分鐘，
并提取蛋白質(zhì)上清液。使用uv-可見光光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度和純度。所有
的工作都在4。C進(jìn)行。
納米乳液制備和分級(jí)
用高壓微流體裝置^f吏用極流(extreme flow)產(chǎn)生納米乳液(Meleson, K.; Graves, S.; Mason, T. G., Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extre'me Shear. &々2004, 2, 109-123)。 4吏用超離心對(duì)多分散乳液進(jìn)行尺寸分級(jí)，
以獲得更好的滴均勻性并確定SDS濃度CsDs。在與蛋白質(zhì)混合和透析之前，納 米乳液的CSDS = 1 mM SDS,大大低于臨界膠束濃度，并且^ = 0.05。 PDMS油 (10cSt粘度，由Gelest^是供)具有低蒸汽壓，所以它在這些顯微鏡測(cè)量的整個(gè) 時(shí)間范圍內(nèi)都不會(huì)蒸發(fā)，即使是不存在衣殼蛋白時(shí)也不會(huì)蒸發(fā)。
透析緩沖液
脂A重組i爰沖液(Adolph, K. W.; Butler， P. J.， Assembly of a Spherical Plant Virus.尸/zz7os. Trara. Sbc.丄ow/. 5 1976， 276, 113-122): Tris-HCl緩沖液，pH = 7.2 I = 0.10MNaCl, lOmMKCl, 5.0mMMgCl2以及1.0mMDTT。空殼緩沖液50 mM醋酸鈉緩沖液，pH = 4.8以及I = 1.0 M NaCl。 二聚物緩沖液50 mM磷酸 鈉緩沖液，pH = 6.2以及I = 1.0 MNaCl。多殼緩沖液50 mN醋酸鈉緩沖液， pH = 4.8以及1=0.1 MNaCl。六角形片緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液，pH = 6.2 以及I = 0.1 M NaCl。最后四種緩沖液還含有1.0 mM EDTA和1.0 mM DTT。殼體化過程
將10|nL試樣量的1.0 mM SDS且卸0.05的貯備納米乳液以0.15嗎/mL加入 到純化的CCMV蛋白質(zhì)中，得到200(aL的總反應(yīng)體積。在4。C下在l.OL的適當(dāng) 緩沖液中透析該混合物24小時(shí)。稀釋和透析后的SDS濃度大約為10-5M，因此 在本體溶液中的SDS-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合被最小化，同時(shí)仍然保持滴的穩(wěn)定 性。SDS的硫酸根頭部基團(tuán)在我們選取的整個(gè)pH范圍內(nèi)帶負(fù)電荷。在稀釋后， SDS在油-水界面的電荷密度估計(jì)為大約-0.1 e/nm2。
透射電子顯微術(shù)染色和分析
將400目尺寸和3.0mm OD的Pelco銅網(wǎng)(Ted Pella, Inc.)用火棉膠薄膜 和碳包覆。使用高壓、交流電對(duì)銅網(wǎng)進(jìn)行輝光放電，然后立即進(jìn)行樣品沉積。 我們將5)iL的樣品直接》文在銅網(wǎng)上1分鐘，然后用Whatman 4濾紙吸，并且立 即用乙S吏鈾酰在水中的1。/。溶液染色1分鐘。將樣品進(jìn)行空氣干燥并且在75 kV 的加速電壓下在Hitachi H-7000電子顯孩t鏡下觀察。將負(fù)片顯影并且使用Minolta Dimage Scan MultiPro掃描儀掃描，用于圖像分析。使用Adobe Photoshop來通 過減去強(qiáng)烈模糊的圖像而使圖像背景平面化(flatten)。使用具有深色中心的相 關(guān)核(對(duì)應(yīng)于衣殼體的深色微凹和白色外圈的尺寸)，應(yīng)用互相關(guān)傅立葉變換圖 像分析。
熒光顯微鏡
我們已經(jīng)以1.0 mg/ML制備了 FITC貯備液和5(6)-FAM, SE在DMSO中的 貯備液。將試樣量的5(6)-FAM， SE貯備液加入到pH值為7.2的RNA重組緩沖 液中的分離的CCMV蛋白質(zhì)中。將另一試樣量的FITC貯備液加入到分離的 CCMV蛋白質(zhì)中并在pH值為8.2的50mM磷酸鹽緩沖液中達(dá)到平衡。將該蛋白 質(zhì)和染料混合，在8小時(shí)后，將FITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)透析到RNA重組緩沖液中， pH值降低。將這兩組熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與10pL濃度為1.0mM的任一SDS(或CTAB)且小=0.05的微米級(jí)乳液混合，總的反應(yīng)體積為200nL,并且用RNA重 組緩沖液透析。通過在所述滴的邊緣的強(qiáng)熒光，熒光顯微圖像顯示在滴表面處 存在標(biāo)記的蛋白質(zhì)。沒有標(biāo)記蛋白質(zhì)的微米級(jí)乳液不顯示這種熒光。所以，比 天然病毒大得多的滴可以由雙層涂覆，所述雙層由陰離子表面活性劑的第 一 內(nèi) 層和病毒蛋白質(zhì)的第二外層組成。蛋白質(zhì)的吸附可能抑制了表面活性劑到滴界 面或從滴界面到滴界面的平衡交換。在包圍蛋白質(zhì)改性的滴的溶液中，在寬范 圍的離子強(qiáng)度下，這種蛋白質(zhì)吸附對(duì)于中性和酸性條件的pH通常是不可逆的。 在組裝后，通過使溶液條件進(jìn)入導(dǎo)致天然病毒顆粒分解的區(qū)域內(nèi)，可以使蛋白 質(zhì)改性的滴分解。
結(jié)果與討論
離子穩(wěn)定的納米滴提供了不可壓縮的帶電荷的模板，該模板提供可以組裝 衣殼蛋白的寬范圍曲率。通過極端乳化(extreme emulsification)，制備了水包油 納米乳液，其由可以與CCMV (內(nèi)徑為21nm且外徑為28nm ) —樣小的球形滴 組成(Mason, T. G; Wilking， J. N.; K. Meleson， K.; Chang, C. B.; Graves, S. M.， Nanoemulsions: Formation, Structure, and Physical Properties. /Co"<ims. Mater 2006, 18， R635-R666)。取決于乳化速度的不同，超離心尺寸分級(jí)提供均 勻才莫型納米乳液，其中滴的半徑為10nm<a<100nm (Meleson, K.; Graves, S.; Mason， T. G.， Formation of Concentrated Nanoemulsions by Extreme Shear. So々 Afoten'a/s 2004, 2, 109-123).此外，滴的體積分?jǐn)?shù)斧表面活性劑濃度CSDS可以獨(dú) 立地確定。Laplace壓力(對(duì)應(yīng)于克服表面張力和使滴變形所必需的應(yīng)力)通常 為10atm以上，所以在稀釋的^下滴是球形的。為了抑制Ostwald熟化(Taylor, P.， Ostwald Ripening in Emulsions: Estimation of Solution Thermodynamics of the Disperse Phase.爿dv. Co〃oW/"fer/ace SW. 2003， 106,261-285),選擇在連續(xù)液相中 是非常不可溶的被分散液體，其中，所述Ostwald熟化可能通過分子擴(kuò)散導(dǎo)致滴 發(fā)生不希望的生長(zhǎng)。
通過將純的分解CCMV衣殼蛋白與水包油納米乳液混合并通過透析改變緩沖液的pH值和NaCl離子強(qiáng)度I，產(chǎn)生了病毒樣滴，使得蛋白質(zhì)聚集在滴表面上(見圖1)。負(fù)染色的VLD的透射電子顯微鏡(TEM)表明，在各個(gè)滴表面上存在兩種有序的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括環(huán)狀衣殼體。為了探查結(jié)構(gòu)的多樣性，我們與蛋白質(zhì)的已知相行為相對(duì)應(yīng)地在5種不同的緩沖液條件下包裹SDS涂覆的納米滴(Adolph, K. W.; Butler， P. J.， Studies on the Assembly of a Spherical Plant Virus. I.States of Aggregation of the Isolated Protein. / M /.腸/. 1974， 88, 327-341; Adolph,K. W.; Butler， P. J.， Assembly of Spherical Plant Virus.戶/zz7os. Tha^w. i . 5bc. ￡ow<i. 51976, 276, 113-122; Bancroft, J. B.; Hills, G J.; Markham， R.， A Study of theSelf-Assembly Process in a Small Spherical Virus. Formation of Organized Structuresfrom Protein Subunits f" W/ra. F ra/ogy 1967, 31, 354-379 ): 'RNA國(guó)重組裝,(pH^7.2,I=0.1M),'六角形片，(pH=6.2， I=0.1M)， '二聚物，(pH:6.2， I=1,0M),'多殼，(pH-4.8,I二0.1M)和'空殼，(pH=4.8,I=1.0M)。在圖2a中，我們示出了這些緩沖液的負(fù)染色VLD的TEM圖像。蛋白質(zhì)包覆的納米滴可以與空的衣殼區(qū)分開，因?yàn)橐宜徕欟Ｈ旧粫?huì)穿透到包覆的滴的核中，所以它們?cè)谥行奶幟黠@更亮。由于在蒸發(fā)過程中隨著水接觸線后退而產(chǎn)生的染料捕獲的原因，存在圍繞滴邊緣的較深色的環(huán)。這種染色和干燥過程產(chǎn)生的TEM圖像僅提供了每個(gè)滴表面的一半的優(yōu)異視圖。由于這些圖像不含有在另一半上的蛋白質(zhì)的明顯信號(hào)，因此可以確認(rèn)和解釋在單個(gè)滴上的蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)，而不是必須依賴于假定為有序結(jié)構(gòu)的重建方法。
對(duì)于全部5種緩沖液，CCMV蛋白質(zhì)包裹納米滴，而無(wú)論它們的尺寸大小如何(圖2a)。 二聚體緩沖液和RNA-重組緩沖液高效地創(chuàng)造VLD,但沒有任何蛋白質(zhì)變成空殼的損失。對(duì)于多殼緩沖液，我們觀察到以單殼、雙殼(占主要)和三殼包覆的納米滴(圖2b)。對(duì)于空殼和多殼緩沖液條件，由于蛋白質(zhì)稍微超出包覆所述滴所需的量，我們觀察到殼體化的滴以及空殼。
為了證實(shí)蛋白質(zhì)不是在干燥過程中簡(jiǎn)單地沉積在滴表面上而實(shí)際上是在溶解狀態(tài)下圍繞所述滴組裝的，我們研究了用RNA組裝緩沖液透析后在微米級(jí)硅油滴上的熒光素異硫氰酸鹽(FITC)標(biāo)記的CCMV衣殼蛋白。強(qiáng)烈的熒光從滴表面上發(fā)出(圖2a插圖)，表明它們被所標(biāo)記的蛋白質(zhì)包覆。對(duì)比之下，在用陽(yáng) 離子十六烷基-三曱基溴化銨(CTAB )表面活性劑包覆的滴與FITC標(biāo)記的CCMV 蛋白質(zhì)混合并用相同方式透析時(shí)，沒有觀察到熒光，表明陽(yáng)離子表面活性劑通 常不適合于用該特定蛋白質(zhì)創(chuàng)造蛋白質(zhì)改性的滴。
對(duì)于RNA-重組裝條件，我們還研究了具有不同曲率的納米滴上蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)以及有序和無(wú)序的相對(duì)程度(圖3)。為了增強(qiáng)各VLD表面上的結(jié)構(gòu)的圖像， 我們?nèi)コ吮尘埃缓笫褂酶盗⑷~過濾降低高頻噪聲。我們將完整衣殼體標(biāo)識(shí) 為白色的環(huán)，其具有內(nèi)部的深色中心點(diǎn)，還有圍繞亮環(huán)的深色的外部溝槽。較 亮的區(qū)域表示從表面向外伸出的蛋白質(zhì)的較高的密度，較深色的區(qū)域一般表示 較低密度的蛋白質(zhì)，此處染色變得更加高度濃縮在局部凹陷中。隨著滴變得明 顯大于CCMV，完整的衣殼體變少并且在較小彎曲的不可壓縮表面上觀察到若 干其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。尤其是，觀察到不完整的衣殼體、線形疤樣缺陷和六角形 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與在野生型CCMV上的完美二十面體有序形成鮮明對(duì)比?；谀芰?最小化原理，當(dāng)?shù)蔚某叽鐚?duì)應(yīng)于允許的整數(shù)三角剖分?jǐn)?shù)T時(shí)，可以期望所述滴 被有序的衣殼體更大程度地相對(duì)覆蓋(Bruinsma， R. R; Gelbart, W. M.; Reguera， D.; Rudnick, J.; Zandi, R.， Viral Self-Assembly as a Thermodynamic Process. /Vz, 2003,卯，Art. No. 248101 pp. l畫4; Zandi, R.; Reguera, D.; Bminsma, R. R; Gelbart, W. M.; Rudnick, J.， Origin of Icosahedral Symmetry in Viruses.戶rac. Ato.
5W. 2004, 101, 15556-15560 )(見圖3-較低比例)，^f旦是這布i定衣殼體的結(jié)構(gòu) 和尺寸不受下面的核的曲率和可壓縮程度影響。盡管我們?cè)谒芯彌_液條件下 的實(shí)驗(yàn)沒有顯示出與允許的T相對(duì)應(yīng)的滴上更高程度的衣殼體有序，但是這可 能在與我們已經(jīng)研究的不同的pH和I下發(fā)生。
對(duì)于更接近天然病毒尺寸的更小的滴，如同在天然病毒上所看到的一樣， 我們確認(rèn)了衣殼體的局部六角形堆積(圖4a-左)。盡管我們找到圍繞中心衣殼 體的六個(gè)衣殼體的大量實(shí)例，但是在明顯大于CCMV的滴上沒有觀察到?jīng)]缺陷 的五重配位衣殼體。在相鄰的六重衣殼體之間的中心到中心距離的分布在圖4b 中示出，9.5 nm的平均距離與/人天然CCMV獲知的距離良好地吻合(Speir, J. A.;Munshi, S.; Wang, G.; Baker, T. S.; Johnson, J. E., Structures of the Native and Swollen Forms of Cowpea Chlorotic Muttle Virus Determined by X-Ray Crystallography and Cryo-Electron Microscopy, wcft^ 1995, 3, 63-78 )。
在一些較大的滴上，我們觀察到蛋白質(zhì)的六角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由互連的白色 邊界或"網(wǎng)絡(luò)"包圍的深色點(diǎn)的區(qū)域(圖4a-右)。具有衣殼體特征的深色外部溝槽 不存在。盡管該蛋白質(zhì)網(wǎng)通常具有局部的六重六角形有序，但是一般來說，它 可以由于缺陷而無(wú)序化。在該網(wǎng)絡(luò)中最近的相鄰點(diǎn)之間的平均距離僅為4.7 nm, 約為衣殼體中心之間的距離的一半(圖4b )。這與在比更高程度彎曲的可壓縮表 面更平的不可壓縮表面上的不同方式的衣殼體蛋白自組裝一致(Bancroft, J. B.; Hills, G. J.; Markham， R.， A Study of the Self-Assembly Process in a Small Spherical Virus. Formation of Organized Structures from Protein Subunits F 組 Wra/ogy 1967,31,354-379 )。
我們提出，通過考慮自組裝蛋白質(zhì)亞單元在較低曲率的不可壓縮表面上的 基礎(chǔ)對(duì)稱性和緊密堆積，可以理解蛋白質(zhì)的六角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理。已知 CCMV衣殼蛋白自組裝成緊密二聚體的六角形衣殼體(Tang， J.; Johnson, J. Dry den, K. A.; Young, M. J.; Zlotnick, A.; Johnson, J. E., The Role of Subunit Hinges and Molecular 'Switches' in the Control of Viral Capsid Polymorphism. / 飾/. 2006, 154, 59-67; Adolph, K. W.; Butler, P. J., Studies on the Assembly of a Spherical Plant Virus. I. States of Aggregation of the Isolated Protein. J. tW"o/. 5z'o/. 1974,88,327-341 ),這已經(jīng)通過X-射線晶體分析法確認(rèn)。在許多緩沖液條件下， 這些二聚體與單聚體相比在能量上是有利的； 一個(gè)蛋白質(zhì)的突出臂插入到其伙 伴的折疊區(qū)域中并通過吸引力保持，反之亦然。六個(gè)緊密結(jié)合的二聚體可以結(jié) 合在一起形成衣殼體，該衣殼體具有結(jié)構(gòu)與齒輪類似的六個(gè)突出臂(圖4c-左下)。 這樣的衣殼體結(jié)構(gòu)相對(duì)于二聚體的隨機(jī)組裝也是能量上有利的。當(dāng)二聚體的這 些齒輪狀六角形衣殼體自組裝、然后緊密堆積以覆蓋平坦表面時(shí)，它們能夠產(chǎn) 生衣殼體的六角形陣列，該陣列在相鄰衣殼體之間的中心到中心距離的一半處 具有無(wú)蛋白質(zhì)的區(qū)域。這種堆積的齒輪結(jié)構(gòu)會(huì)給出我們觀察的網(wǎng)狀的外形蛋白質(zhì)密度較低的深色點(diǎn)的六角形陣列和蛋白質(zhì)密度較高的明亮網(wǎng)絡(luò)的互連六角 形網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于蛋白質(zhì)在平坦表面上的自組裝，有理由假設(shè)折疊的衣殼蛋白和二 聚體只以單一的構(gòu)象存在，并且不變形為在具有比野生型病毒更高的曲率的核 結(jié)構(gòu)上組裝五重配位的衣殼體所需要的三種已知構(gòu)象。
除了有序的網(wǎng)以外，我們還觀察到拉長(zhǎng)的蛋白質(zhì)疤，其為由白色邊緣包圍
的深色槽(圖4a-中間)。這些蛋白質(zhì)絕與在彎曲液滴表面上的單分散固體球包 封(Bausch, A. R.; Bowick， M. J.; Cacciuto, A.; Dinsmore, A. D.; Hsu， M. F.; Nelson, D. R.; Nikolaides, M. G.; Travesset， A.; Weitz, D. A.， Grain Boundary Scars and Spherical Crystallography. 5We膨2003， 299， 1716-1718; Bowick, M.; Cacciuto， A.; Nelson, D. R.; Travesset, A., Crystalline Order on a Sphere and the Generalized Thomson Problem.i ev.2002， 89， Art. No. 185502 pp.1-4),即一種受控 種類的'Pickering乳'液，(Tarimala, S.; Dai, L. L., Structure of Microparticles in Solid-Stabilized Emulsions.丄a"g聽V 2004, 20, 3492-3494; Pickering, S. U., Emulsions. 乂 C7z綴7>畫.丄owd 1907, 91, 2001-2021; Subramaniam, A. B.; Abkarian, M.; Stone, H. A.， Controlled Assembly of Jammed Colloidal Shells on Fluid Droplets. Ato. AfoteK 2005， 4， 553-556 )中所發(fā)現(xiàn)的癥缺陷具有某些類似性， 但是衣殼蛋白疤明顯不同。蛋白質(zhì)疤不是簡(jiǎn)單地由不相稱尺寸的滴上完全形成 的六角形環(huán)狀衣殼體之間的線缺陷組成，相反，它們表明了在甚至比衣殼體單 元本身更小尺度的蛋白質(zhì)的無(wú)序。若干機(jī)理結(jié)合產(chǎn)生所述疤缺陷相對(duì)于與二 十面體結(jié)構(gòu)的允許T數(shù)對(duì)應(yīng)的那些的不相稱的滴尺寸，以及一旦表面凈皮完全覆 蓋就強(qiáng)烈抑制蛋白質(zhì)的重新定向和重新排列的蛋白質(zhì)表面干擾。
結(jié)果的討i侖
多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括二聚體、部分衣殼體和完整衣殼體，可以在曲率減 小的不可壓縮J求形表面上^皮干^t而成為局部無(wú)序狀態(tài)(Liu, A. J.; Nagel， S. .R., Jamming Is Not Just Cool Any More.胸騰1998, 396, 21-22 ),其方式類似于不平 衡的玻璃和凝膠。因?yàn)樵趪@RNA形成時(shí)高密度吸附的蛋白質(zhì)可能不能改變形態(tài)并重新組織為具有最低能量的有序狀態(tài)，所以可能產(chǎn)生附加的缺陷?？刂葡?對(duì)蛋白質(zhì)覆蓋率和研究殼體化過程動(dòng)力學(xué)將提供關(guān)于在VLD表面上如何產(chǎn)生有
序和無(wú)序蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的更有力的見解。通過調(diào)整pH和離子強(qiáng)度，可以用可控?cái)?shù)
量的衣殼包裹滴、納米顆粒和合成聚合物。
通過解釋各個(gè)殼體化納米滴的TEM圖像，我們揭示了在滴表面上的一些新 的結(jié)構(gòu)，包括有缺陷的衣殼體、六角形網(wǎng)和疤。這些結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)為彎曲表面上 的蛋白質(zhì)構(gòu)象的性質(zhì)提供了重要的新見解。此外還表明，由于不可壓縮的荷電 模板上的表面干擾，不平衡蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能存在于殼體化的納米物體上，并且 表明完美的二十面體殼的熱動(dòng)力學(xué)自組裝的照片可能僅在某些有限的情況下是 正確的。
用于制備蛋白質(zhì)改性的滴的蛋白質(zhì)可以由作為以下病毒家族中的成員的病 毒得到腺病毒科(Afe"ovzW&e)、指環(huán)病毒屬(^"e〃ov/my )、沙粒病毒科
(Jm2副V油e)、動(dòng)脈炎病毒科(J他n.vzW(i(3e )、嚢泡病毒科(Ac謂W(iae )、非 洲豬瘟病毒科(^y/"rWnWae)、星狀病毒科()、絝梨日斑類病毒科
(^fwm^raWae)、斥干習(xí)大病毒科(Bacw/ovzWdae )、桿菌狀核4唐核酸(RNA)病毒 科(5am"vzWdae )、甜菜壞死黃脈病毒屬(￡eM_yWms)、雙節(jié)4更RNA病毒科
(5z>w"v/r/(iae )、十專'爾纟內(nèi)病毒;f牛(^orwav/nWae )、雀麥花p十病毒-牛(5ro附oWn'(ifle )、 布尼亞病毒科(5w，av/rWae)、杯狀病毒考牛(Oz/Zc/vzWcfae )、花椰菜花葉病毒一牛
(Qjfw/z'movzW^^ )、櫻桃銼葉病毒屬(C7zeravzVws )、產(chǎn)黃青霉病毒科
(C7z，ovzWt/ae )、 圓環(huán)病毒科(C7/r顯W(ii3e )、長(zhǎng)線形病毒科(C7osterav/nV/iag )、 虹豆花葉病毒科(CowovzW(i3e)、冠狀病毒一牛(Cora"av/nVfoe)、覆蓋喧菌體科
(CbWcovzWobe )、囊^Rp筮菌-牛(C>wtovzW(i<3e )、 丁型肝炎病毒屬(De/tovz'ms )、 雙順反子病毒牙牛(D/c/WravzWdfle )、內(nèi)源RNA病毒屬(五"cfom"v/n^ )、絲4夫病 毒科(W/謂Wd"e )、黃病毒科(F/av/vzV油e )、線形病毒科(尸/ex/v/r油e )、真菌 傳桿狀病毒屬(FwraWn^r)、小紡錘形嗟菌體科(i^ye/fowWdae )、雙生病毒科
()、孩吏滴形嗟菌體科(GwftovzW&e )、嗜肝DNA (脫氧核糖核酸〕 病毒科 (T/ej9"ci""vzW(iag )、 肝炎病毒科 (//epevjV^ae )、 痕滲病毒科(//e，svz'r油e )、 大麥病毒屬(iib油/vz'ms1 )、低毒性病毒科(i^povzWcbe )、 傳染性軟腐病病毒屬(伊m;/n^)、絲桿狀噬菌體科(/"ovzWc^e)、虹彩病毒科 (7r/<i9vz>/(i<3e )、光)骨謹(jǐn)菌體-牛(丄ev/v/n'(iae )、月旨毛p藍(lán)菌體牙牛(丄^of/z^xvzW(iae )、 黃癥病毒科(Zwto9v/nWae )、海洋RNA病毒牙牛(J/l/(ar"av/n'c/ae)、變位病毒一牛 (i^fetavzW(iae )、樣l小p笪茵體一牛(MifcravzWdae )、 4以態(tài)病毒屬(M 'mz'vz'nw )、肌尾 口藍(lán)菌體科(綺ovzWdae )、矮縮病毒科(A^wovzW&e )、棵露RNA病毒科 (A^rwawWdae )、纟戔頭病毒科(iVz'wav7Wdae)、寶予田才十病毒牙牛(7Vod"vzWcfae)、蟲它 形病毒屬(Qp/n'owVw )、正#占病毒-牛((>Aow>aovzW<iag )、 歐爾密病毒屬 ((9wrm/aWz-iw )、 專L頭瘤病毒一+ (尸a/ /〃owavzWii(3e )、 副湊占病毒-牛 (尸araw少xovzWdae )、又又纟且分RNA病毒牙牛(尸aWz'"WnVfoe )、 細(xì)小病毒3牛 (i^rv頻W必e )、 花生叢蔟病毒屬(戶ec/謂'濯)、藻類 DNA 病毒-科 (P/zycocfwavzV油e )、 微小病毒科 (Pz'cor"avzV油e )、 芽生嗟菌體科 (尸/asmaWn'^^ )、 短尾謹(jǐn)菌體科(Pot/ovzWdae )、 多分體DNA病毒牙牛 (尸o/;^"avz'nWae)、多瘤病毒科(戶o/;;owavzW(iae)、馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒-牛 (尸asp/v/ro/dae )、馬鈴薯Y病毒牙牛(Po，/n'(iae )、痘病毒-牛(尸oxv/n'dae )、.前 病毒牙斗(尸MMdovzW(iae ) 、 p乎腸孤病毒牙+ (及eowW(iae )、 反壽爭(zhēng)錄病毒牙牛 (i e rovzWiiae )、彈^犬病毒一牛(i /za6<iov/n'(iag )、才艮前毛菌病毒屬(i /z/zW/oWnw )、 桿狀套病毒科(及om'wW^^)、小桿狀噬菌體科(i w&wWAe)、溫州蜜柑矮縮病 毒屬(Sa^wavZras )、 鹽末端蛋白謹(jǐn)菌體屬(Sa/terpravz'ras )、伴生病毒牙牛 (5"，/v/r油e )、 長(zhǎng)尾嗟菌體科(S一謂V油e )、 南方菜豆花葉病毒屬 (So6e附ov/n^ )、復(fù)層喧菌體牙牛(reWv/nWae )、纖細(xì)病毒屬(rem 'vz>7^ )、四體 病毒科(raravzWdae )、煙草花葉病毒屬(ro6awoWms )、煙草脆裂病毒屬 (7b6raWmsO、披膜病毒科(7bg謂V油e)、 番癡叢矮病毒科(r細(xì)Z^v/r油e )、 單組分RNA病毒科(rortWW&e)、蕪菁黃花葉病毒科(^/wov/nWae )、傘形病 毒屬([/附6rav/ms)和巨脈病毒屬(^r/cara;Wmy )。用于制備蛋白質(zhì)改性的滴的 蛋白質(zhì)也可以由未列出的其他病毒家族的成員以及仍然有待發(fā)現(xiàn)和研究的病毒 家族得到。除了來自病毒的蛋白質(zhì)，來自細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物和海綿的蛋白質(zhì)也 可以用于制備蛋白質(zhì)改性的滴，只要這些蛋白質(zhì)可以被有效地離析、分離以及 以通過蛋白質(zhì)與滴表面的相互吸引作用產(chǎn)生方式的使得它們與滴的表面接近的
方式操控。
用于制備蛋白質(zhì)改性的滴的蛋白質(zhì)可以具有多種功能，包括但不限于結(jié) 構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白、外殼蛋白、衣殼蛋白、核心蛋白、包膜蛋白、基質(zhì)蛋白、 跨膜蛋白、膜相關(guān)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白、核殼體蛋白、絲狀蛋白、加帽蛋白、交 聯(lián)蛋白、糖蛋白和動(dòng)力蛋白。
我們所提供的蛋白質(zhì)改性的滴的實(shí)例屬于由豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)純 化的單一衣殼蛋白，所述虹豆褪綠斑駁病毒是植物病毒家族雀麥花葉病毒科 (Brawov/r油e)的一員。
病毒可以具有多于一種衣殼蛋白。在我們所示出的具體實(shí)例中，我們使用 聚陰離子滴代替聚陰離子遺傳物質(zhì)作為蛋白質(zhì)組裝模板，多種多樣的病毒衣殼 蛋白可以被有效地吸引到帶電荷的滴的表面。因此，對(duì)于具有兩種或更多種衣 殼蛋白的病毒而言，不同種類蛋白質(zhì)的合適化學(xué)計(jì)量比無(wú)疑將提供足夠的結(jié)構(gòu) 特征來改性和/或包封所述滴。而且，對(duì)于天然產(chǎn)生兩種或更多種衣殼蛋白的病 毒而言，即使已經(jīng)被純化的單一種類的衣殼蛋白也足以改性和/或包封所述滴； 不需要使得所有不同種類的衣殼蛋白都從病毒中顯現(xiàn)出來。主要的要求是必須 調(diào)整所述滴表面上的電荷、溶液的pH值以及溶液的離子組成和離子強(qiáng)度，使得 蛋白質(zhì)經(jīng)受與所述滴表面的相互吸引作用，然后與所述滴表面保持接近。
一旦在所述滴周圍形成蛋白質(zhì)外殼，在特定應(yīng)用中可能有利的是還形成圍 繞蛋白質(zhì)層的脂質(zhì)外殼、脂蛋白外殼或脂質(zhì)-蛋白外殼，由此產(chǎn)生類似于包膜病 毒的總結(jié)構(gòu)。因此，該結(jié)構(gòu)包含內(nèi)部滴核心、通常吸附在所述核心上的表面活 性劑、圍繞所述滴核心和表面活性劑的蛋白質(zhì)層以及脂質(zhì)、脂蛋白或脂質(zhì)-蛋白 層。
在有包膜層和無(wú)包膜層的情況下，特定病毒在較高級(jí)的有機(jī)體內(nèi)被特定組 織和器官選擇性攝取和定位是眾所周知的，這在諸如"BasicVirology",第2版，E.K. Wagner和M丄Hewlett編著，Blackwdl出版(2004 )的書籍中進(jìn)行了討論。
同含有遺傳物質(zhì)的天然病毒顆粒一樣，蛋白質(zhì)改性的滴對(duì)生物有機(jī)體提供相同 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此蛋白質(zhì)改性的滴的優(yōu)先攝取和定位將發(fā)生在與展示相同蛋 白質(zhì)的天然病毒顆粒相同的組織和器官內(nèi)。
本發(fā)明不限于本文以實(shí)施例方式描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而是通過 權(quán)利要求書進(jìn)行限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的范圍和總 體構(gòu)思的情況下，可以對(duì)本文所討;侖的實(shí)施例進(jìn)行各種變化和替換。
權(quán)利要求
1、一種蛋白質(zhì)改性的滴，所述滴包含含有液體物質(zhì)的滴；和被形成來至少部分包封所述滴的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)蛋白質(zhì)分子，所述蛋白質(zhì)分子在形成所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中對(duì)所述滴的至少一部分具有親和力，以及其中，所述滴的最大尺寸為至少約1nm并且小于約1000nm。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述滴的最大尺寸為至 少約5nm并且小于約100nm。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴 包圍所述第 一液體物質(zhì)的核。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴包含疏水物質(zhì)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述滴的所述液體物質(zhì) 包含選自以下物質(zhì)集合的至少一種物質(zhì)油、硅油、烴油、石油、燃油、蠟、 脂肪、氟化油、不揮發(fā)油、揮發(fā)油、芳香油、源自植物材料的油、源自動(dòng)物材 料的油、源自天然源的油、蒸餾油、提取油、烹調(diào)油、食用油、潤(rùn)滑油、組成 主要是烴的反應(yīng)物質(zhì)、環(huán)氧物質(zhì)、粘合物質(zhì)、可聚合物質(zhì)、熱致型液晶、溶致 型液晶、酸性油、^堿性油、中性油、天然油、聚合物油和合成油。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述滴的所述液體物質(zhì) 還包含可分散在所述至少一種物質(zhì)中的生物活性劑。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述生物活性劑選自以 下物質(zhì)集合藥物分子、抗癌分子、治療分子、激素分子、激動(dòng)劑分子、拮抗 劑分子、阻抑劑分子、抑制劑分子、敏化劑分子、抗抑郁劑分子、抗病毒劑分 子、抗真菌劑分子、抗菌劑分子、生物利用度增強(qiáng)劑分子、RNA-結(jié)合分子、 DNA-結(jié)合分子、毒素分子、染料分子、熒光劑分子、生物分子、營(yíng)養(yǎng)劑、維生 素、香料、酶、》文射性同位素、非》文射性同位素、納米顆粒和成像對(duì)比增強(qiáng)劑。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是蛋白 質(zhì)分子單層。，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本上 ,其中，所述滴的所述液體物質(zhì)
9、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子形 成至少部分有序的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子 包含至少一個(gè)組裝的蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)，所述蛋白質(zhì)亞結(jié)構(gòu)選自以下亞結(jié)構(gòu)集合 蛋白二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、五鄰體、 六鄰體、纖維、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和衣殼體。
11、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多 個(gè)蛋白質(zhì)層。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，形成所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 的所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子是多個(gè)天然蛋白質(zhì)分子。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由病 毒衣殼蛋白形成，所述病毒衣殼蛋白已知優(yōu)先進(jìn)入并集中在選自特定類型的亞 細(xì)胞結(jié)構(gòu)、特定類型的細(xì)胞、特定生物組織和特定生物器官中的至少一個(gè)內(nèi)。
14、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述天然的多個(gè)蛋白 質(zhì)分子是多個(gè)病毒衣殼蛋白分子。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，形成所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 的所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子是多個(gè)合成多肽分子。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述滴在其組合物中 包含疏水性物質(zhì)。
17、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述滴包含吸附在所 述液體物質(zhì)上的兩親性表面活性分子，所述兩親性表面活性分子具有適合吸引 所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子的電荷。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，所述兩親性表面活性 分子是陰離子表面活性劑分子。
19、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，還包含與所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)連 接的選自脂質(zhì)分子、脂蛋白分子、膜蛋白和抗原中的至少一種。
20、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)改性的滴，還包含形成在所述蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)上的脂質(zhì)膜。
21、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)改性的滴，其中，形成所迷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 的所述多個(gè)蛋白質(zhì)分子包含多個(gè)不同類型的蛋白質(zhì)分子。
22、 一種組合物，所述組合物包含分散在含水溶液中的多個(gè)蛋白質(zhì)改性的 滴，其中每個(gè)所述蛋白質(zhì)改性的滴包含包含液體物質(zhì)的滴；和被形成來至少部分包封所述滴的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)蛋白質(zhì)分子，所述蛋白質(zhì)分子在形成所述 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中對(duì)所述滴的至少一部分具有親和力，以及 其中，所述滴的最大尺寸為至少約lnm并且小于約100nm。
23、 一種制備蛋白質(zhì)改性的滴的方法，所述方法包括 提供第 一和第二不相混溶的液體物質(zhì)；向第 一和第二不相混'溶的液體物質(zhì)中的至少 一種中加入穩(wěn)、定劑；乳化第一液體物質(zhì)和第二液體物質(zhì)，以在所述第一液體物質(zhì)中形成所述第 二液體物質(zhì)的多個(gè)滴，所述多個(gè)滴通過所述穩(wěn)定劑穩(wěn)定，所述多個(gè)滴中的每個(gè) 滴的最大尺寸為至少約lnm且小于約100nm;在所述乳化之前和之后的至少一種情況下加入蛋白質(zhì)分子；以及使蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)形成為至少部分包封所述多個(gè)滴中的每一個(gè)，其中，所加入的所述穩(wěn)定劑和所述蛋白質(zhì)分子屬于在所述穩(wěn)定劑與所述滴 結(jié)合時(shí)彼此具有相互靜電吸引力的類型。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的制備蛋白質(zhì)改性的滴的方法，其中，每個(gè)所述 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是位于相應(yīng)滴外部的外殼承載的結(jié)構(gòu)。
25、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的制備蛋白質(zhì)改性的滴的方法，還包括蒸發(fā)其中 已形成所述多個(gè)蛋白質(zhì)改性的滴的所述第一液體物質(zhì)，其中，所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 抑制所述蛋白質(zhì)改性的滴的合并。
26、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的制備蛋白質(zhì)改性的滴的方法，還包括使蛋白質(zhì) 分子聚集在所述第一液體物質(zhì)中，包括透析、滴定、混合、改變所述第一液體 物質(zhì)中的離子濃度、改變所述第一液體物質(zhì)的pH、改變所述第一液體物質(zhì)的緩 沖劑種類和4吏所述第 一液體物質(zhì)中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)中的至少一種。
全文摘要
一種蛋白質(zhì)改性的滴，包含含有液體物質(zhì)的滴和被形成來至少部分包封所述滴的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括多個(gè)蛋白質(zhì)分子，所述蛋白質(zhì)分子在形成所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中對(duì)所述滴的至少一部分具有親和力，所述滴的最大尺寸為至少約1nm并且小于約1000nm。一種組合物，包括分散在含水溶液中的多個(gè)蛋白質(zhì)改性的滴。
文檔編號(hào)A61K9/51GK101677966SQ200880014491
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者克尼爾·B·常, 托馬斯·G·馬森 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)