專利名稱：用于治療威爾森氏癥的銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于血液凈化的吸附介質(zhì)的制備方法，具體說是一種用于治療威爾森 氏癥(Wilson' s disease)的銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
威爾森氏癥(Wilson' s disease)是一種具有遺傳特點(diǎn)的銅離子代謝紊亂疾病， 它導(dǎo)致人體器官中銅離子含量的積累增加，從而造成多種器官損傷，尤其是肝臟和大腦的 損傷。該病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率大約為1/30000。威爾森氏癥具有多種臨床表現(xiàn)，其中 最普遍的是慢性肝炎或者爆發(fā)性肝衰竭，其它癥狀包括神經(jīng)或精神癥狀、溶血性貧血、內(nèi)分 泌紊亂和腎結(jié)石等。威爾森氏癥的診斷通常基于以下一些標(biāo)準(zhǔn)(l)眼睛是否存在克氏環(huán) (Keyser-Fleischer ring) ;(2)血槳銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin)含量；(3)肝臟中銅離子 含量；(4)24小時(shí)尿液銅離子含量；(5)是否具有典型的神經(jīng)癥狀等等。威爾森氏癥的治療
包括以下方法(l)鰲合療法，服用可以鰲合體內(nèi)積累的銅離子的鰲合劑的方法，此類鰲合 劑包括右旋青霉胺(D-penicillamine)、三亞乙基四胺(Triethylene tetramine)、四硫鉬 酸銨(Ammonium tetrathiomolybdate)等等；(2)鋅療法，食用含鋅藥物，如醋酸鋅(Zinc acetate),以減少腸道對銅離子的吸收；(3)肝臟移植，通過器官移植技術(shù)，將患者受損害 的肝臟換成健康肝臟；(4)飲食調(diào)節(jié)，控制飲食中銅離子的含量，避免攝取銅含量高的食 物，以避免體內(nèi)銅含量的積累增高(Gitlin， N. ， J. H印atol. 1998， 28， (4) ， 734.)。
近幾年，一種基于血液凈化的療法被引入到威爾森氏癥的治療當(dāng)中，該方法利用 人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)作為分子吸附劑，吸附威爾森氏癥患者血漿內(nèi) 高含量的銅離子。在健康正常的人體當(dāng)中，血漿中超過95%的銅離子被結(jié)合在銅藍(lán)蛋白 (Ceruloplasmin)上，每個(gè)銅藍(lán)蛋白分子可以結(jié)合六個(gè)銅離子(Mak， C. M. ;Lam， C. W. ， Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2008,45， (3) ， 263.)。但是在威爾森氏癥患者體內(nèi)，由于銅離子代謝 出現(xiàn)紊亂，血漿內(nèi)銅離子含量大量增加，同時(shí)患者血漿內(nèi)的銅藍(lán)蛋白含量發(fā)生降低，因此產(chǎn) 生大量非銅藍(lán)蛋白結(jié)合的銅離子，這些銅離子大部分結(jié)合于人血清白蛋白的N端結(jié)合位點(diǎn) (N-terminal site, NTS)上，少部分結(jié)合于人血清白蛋白的多金屬結(jié)合位點(diǎn)(Multimetal binding site, MBS)上(Rozga， M. ， et al. ， J. Biol. Inorg. Chem. 2007， 12， (6) ，913.)。研 究人員利用人血清白蛋白可以結(jié)合銅離子的特點(diǎn)，在血液凈化療法中使用人血清白蛋白作 為分子吸附劑，吸附和去除威爾森氏癥患者血漿內(nèi)的銅離子，取得了較好的效果(Collins, K. L. ， et al. ， Pediatr. N印hrol. 2008， 23， (6) ， 1013.)。 人血清白蛋白由于來源于人血槳，不但價(jià)格昂貴，而且來源有限，因此影響了它在 威爾森氏癥治療中的大范圍推廣應(yīng)用。具有特異性吸附銅離子作用的吸附介質(zhì)的制備有著 重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于治療威爾森氏癥的銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法是將銅離子鰲合劑通過共價(jià)鍵結(jié)合在多孔高分 子微球材料上，從而通過一步化學(xué)反應(yīng)制備得到銅離子鰲合吸附介質(zhì)。 所述的制備方法中使用的銅離子鰲合劑為三亞乙基四胺 (Triethylenetetramine)或四亞乙基五胺(Tetraethylenepentamine)。
所述的制備方法中使用的多孔高分子微球材料為含有環(huán)氧基團(tuán)的高分子聚合物 微球。該環(huán)氧基團(tuán)由高分子單體甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidalmethacrylate， GMA)提供。 所述的制備方法中的共價(jià)鍵結(jié)合過程是通過將銅離子螯合劑三亞乙基四胺或四
亞乙基五胺分子的伯氨基團(tuán)與多孔高分子微球上的環(huán)氧基團(tuán)通過開環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，從而制備 得到固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)或固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)。 所述的制備方法中的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)是通過將三亞乙基四胺和
含有環(huán)氧基團(tuán)的多孔高分子微球在20°C -ll(TC溫度下，在100-300轉(zhuǎn)/分鐘的磁力攪
拌下一步開環(huán)反應(yīng)8小時(shí)制備得到，反應(yīng)中多孔高分子微球與銅離子螯合劑的比例為
lg : 5-20ml。 反應(yīng)過程如下 所述的制備方法中的固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)是通過將四亞乙基五胺和
含有環(huán)氧基團(tuán)的多孔高分子微球在20°C -ll(TC溫度下，在100-300轉(zhuǎn)/分鐘的磁力攪
拌下一步開環(huán)反應(yīng)8小時(shí)制備得到，反應(yīng)中多孔高分子微球與銅離子螯合劑的比例為
lg : 5-20ml。 反應(yīng)過程如下<formula>formula see original document page 5</formula> 所制備的得到的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)或固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)
在血液凈化療法中用于威爾森氏癥(Wilson's disease)的治療，去除威爾森氏癥患者血液
內(nèi)積累的銅離子。 本發(fā)明的特點(diǎn)在于 1.所制備的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)和固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)對銅 離子的鰲合作用具有特異性。 2.所述的制備固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)和固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)方 法具有操作過程簡單、易于制備的特點(diǎn)。 3.所述的制備固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)和固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)方 法中所使用的三亞乙基四胺和四亞乙基五胺銅離子鰲合劑具有價(jià)格相對低廉特點(diǎn)(相對 于人血清白蛋白)，吸附介質(zhì)制備成本低。 4.所制備的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)和固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)對銅 離子具有快速的吸附特點(diǎn)，在0. 5小時(shí)基本已達(dá)到吸附平衡 5.所制備的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)和固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)對銅 離子具有理想的吸附效率，具有在威爾森氏癥治療中應(yīng)用的前景。


圖1為固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)的掃描電鏡圖； 圖2為固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)的掃描電鏡圖； 圖3為固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)靜態(tài)吸附銅離子性能評價(jià)結(jié)果； 圖4為固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)靜態(tài)吸附銅離子性能評價(jià)結(jié)果； 圖5為固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià)結(jié)果； 圖6為固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià)結(jié)果。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)的制備及靜態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) (1)聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多孔高分子微
球的制備[Poly(Trimethylolpropane trimethacrylate_co_glycidalmethacrylate)，
Poly(TRM-co-GMA)] Poly (TRIM-co-GMA)多孔高分子微球的制備采用種子乳液溶脹聚合方法，制備方
5案包擴(kuò)聚苯乙烯種子高分子微球的制備和聚苯乙烯種子微球吸收三羥甲基丙烷三甲基丙 烯酸酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯單體及致孔劑乳液溶脹聚合制備Poly (TRIM-co-GMA)兩個(gè) 階段。 (i)聚苯乙烯種子高分子微球的制備 0.624g聚乙烯吡咯烷酮、290mg偶氮二異丁氰溶于32mL 95% (v/v)乙醇水溶液 中，加入8mL苯乙烯單體，在0°C _201:溫度下超聲溶解，得到透明溶液，該溶液用氮?dú)夤呐?吹掃15min。在7(TC和150r. p. m.的機(jī)械攪拌下反應(yīng)24小時(shí)，得到單分散聚苯乙烯微球。 無水乙醇洗滌三次后，在4(TC真空干燥24小時(shí)。 (ii)聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯_甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物微球的制 備[Poly(TRM-co-GMA)] 0.45g聚苯乙烯種子分散于15mL含聚乙烯醇(分子量13000-23000，水解度 87% -89% )為1% (w/V)，含十二烷基硫酸鈉為0. 2%的水溶液中。 144mg偶氮二異丁氰溶于14. 4g致孔劑甲苯中，加入7. 2g甲基丙烯酸縮水甘油酯 (GMA)單體和7. 2g三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)單體，混和均勻后，加入150mL含 聚乙烯醇(分子量13000-23000，水解度87% -89% )為1%，含十二烷基苯硫鈉為0. 2% 的水溶液，得到油水分離的兩相溶液，經(jīng)超聲乳化(超聲5秒，間隔5秒，重復(fù)30次)后得 乳濁液。 將制備的乳濁液在100r. p. m.的機(jī)械攪拌下， 一次加入種子溶液中，于3(TC溶脹 18小時(shí)，得到溶脹微球。升溫至7(TC，反應(yīng)24小時(shí)，得到聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸 酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多孔高分子微球。制備的高分子微球用無水乙醇、丙酮和水依 次洗滌三次，在4(TC真空干燥24小時(shí)。
(2)固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)的制備 3. 5g Poly(TRIM-co-GMA)微球加入35mL三亞乙基四胺，在90。C下反應(yīng)24小時(shí)。制
備得到的固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)用丙酮、無水乙醇和純水依次洗滌三次后，在7(TC
下干燥24小時(shí)備用，固定化三亞乙基四胺掃描電鏡圖片如圖1所示。 (3)固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)用于靜態(tài)吸附溶液中的銅離子 使用生理鹽水(0.9^NaCl溶液)配制濃度為50mM的硝酸銅(硝酸銅為
Cu(N03)2 31120，純度為98. 0% -102. 0% )溶液1L，作為銅離子儲(chǔ)備液。 準(zhǔn)確稱取5份固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)各30mg，分別向其中加入6mL 50mM
的硝酸銅溶液，在37t:搖床中于200r. p. m.下振蕩，分別于振蕩0. 5小時(shí)、1. 5小時(shí)、3. 5小
時(shí)、5. 5小時(shí)和8小時(shí)后取出其中1份溶液經(jīng)過6000r. p. m.離心后，取上清液在300nm處
用紫外-可見分光光度儀測定其吸光值，然后通過銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定銅離子溶液中
的銅離子被固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)吸附后的濃度。結(jié)果如圖3所示，固定化三亞
乙基四胺吸附介質(zhì)對銅離子的吸附在0.5小時(shí)已達(dá)到平衡，通過換算，吸附的平均效率為
80. 4±2. 8mg銅離子/g吸附介質(zhì)(37。C )。 實(shí)施例2 固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)的制備及靜態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) (1)聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多孔高分子微球的制備方法與實(shí)施例l相同。
(2)固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)的制備 3. 8gPoly(TRM-co-GMA)微球加入40mL四亞乙基五胺，在9(TC下反應(yīng)24小時(shí)。制 備得到的固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)用丙酮、無水乙醇和純水依次洗滌三次后，在7(TC 下干燥24小時(shí)備用，固定化四亞乙基五胺掃描電鏡圖片如圖2所示。
(3)固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)用于靜態(tài)吸附溶液中的銅離子
吸附實(shí)驗(yàn)的過程與實(shí)施例1相同，區(qū)別在于所使用的吸附介質(zhì)為固定化四亞乙基 五胺。結(jié)果如圖4所示，固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)對銅離子的吸附同樣在0. 5小時(shí)已 達(dá)到平衡，通過換算，吸附的平均效率為80. 4±6. lmg銅離子/g吸附介質(zhì)(37°C )。
實(shí)施例3 固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)的制備及動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) (1)聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多孔高分子微球的制備方法與實(shí)施例l相同。 (2)固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)的制備方法與實(shí)施例1相同。
(3)固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)用于動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) 準(zhǔn)確稱取3份固定化三亞乙基四胺吸附介質(zhì)各將75mg，將其分別填充到2. 5mL的
一次性醫(yī)用高分子注射器中，兩端用聚四氟乙烯膜封閉，做成固定化三亞乙基四胺吸附介
質(zhì)吸附柱，在室溫下將15mL實(shí)施例1中所配制的50mM銅離子溶液在重力作用下通過吸附
柱，回收濾液。在300nm處用紫外-可見分光光度儀測定其吸光值，然后通過銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲
線法測定濾液中的銅離子的濃度。三次測定結(jié)果如圖5所示，通過換算，吸附的平均效率為
73. 5±1. 7銅離子/g吸附介質(zhì)(室溫下)。 實(shí)施例4 固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)的制備及動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) (1)聚三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多孔高分子微球的制備方法與實(shí)施例l相同。 (2)固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)的制備方法與實(shí)施例2相同。
(3)固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)用于動(dòng)態(tài)吸附銅離子性能評價(jià) 固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)吸附柱的制備過程與實(shí)施例3相同，區(qū)別在于所使
用的是固定化四亞乙基五胺吸附介質(zhì)。在室溫下將15mL實(shí)施例1中所配制的50mM銅離子
溶液在重力作用下通過吸附柱，回收濾液。在300nm處用紫外-可見分光光度儀測定其吸
光值，然后通過銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定濾液中的銅離子的濃度。三次測定結(jié)果如圖6所示，
通過換算，吸附的平均效率為74. 1 ± 1. 3銅離子/g吸附介質(zhì)(室溫下)。
權(quán)利要求
用于治療威爾森氏癥的銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法，其特征在于將銅離子螯合劑通過一步反應(yīng)共價(jià)鍵合到含有環(huán)氧基團(tuán)的多孔高分子微球材料上。
2. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述銅離子螯合劑為三亞乙基四胺 或四亞乙基五胺。
3. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述多孔高分子微球上的環(huán)氧基團(tuán) 由甲基丙烯酸縮水甘油酯單體提供。
4. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述共價(jià)鍵合反應(yīng)是銅離子螯合劑 上的伯胺基團(tuán)與多孔高分子微球材料上的環(huán)氧基團(tuán)之間的開環(huán)反應(yīng)。
5. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于將含有環(huán)氧基團(tuán)的多孔高分子微球與銅離子螯合劑混合，在20°C -ll(TC溫度下，在100-300轉(zhuǎn)/分鐘的磁力攪拌下反應(yīng)8-24 小時(shí)，過濾、洗滌，干燥得到固定化三亞乙基四胺或四亞乙基五胺吸附介質(zhì)；多孔高分子微 球與銅離子螯合劑的混合比例為lg : 5-20ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在血液凈化療法中用于治療威爾森氏癥(Wilson’sdisease)的銅離子鰲合吸附介質(zhì)的制備方法。該方法是將銅離子鰲合劑三亞乙基四胺或四亞乙基五胺通過與高分子微球上的環(huán)氧基團(tuán)之間的開環(huán)反應(yīng)一步鍵合在多孔高分子微球上，得到銅離子鰲合吸附介質(zhì)。該制備方法操作簡單，易于實(shí)現(xiàn)，制備成本低。制備得到的固定化三亞乙基四胺或四亞乙基五胺吸附介質(zhì)對于銅離子具有快速的吸附特點(diǎn)(0.5小時(shí)達(dá)到吸附平衡)和理想的吸附效果(吸附量可達(dá)到80.4±2.8mg銅離子/g吸附介質(zhì))，通過該制備方法所得到的固定化三亞乙基四胺或四亞乙基五胺吸附介質(zhì)在威爾森氏癥治療中具有良好應(yīng)用的前景。
文檔編號A61K31/131GK101745116SQ20081022988
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者于志遠(yuǎn), 吳仁安, 鄒漢法 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所