專利名稱：黃芩苷在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃芩苷的新用途，尤其涉及在制備預(yù)防和治療紅斑狼瘡腎炎、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎和血管炎的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是一種免疫細(xì)胞介導(dǎo)的危害人類健康的疾病，常伴有多器官和 多系統(tǒng)的損傷，重者威脅到生命。激素等免疫抑制劑作為目前治療的一線藥物，常 因?yàn)閲?yán)重的副作用使病情加重，甚至治療終止。而隨著環(huán)境污染和生活工作壓力等 的改變，自身免疫性疾病的發(fā)病率在逐年增加。尋找安全有效的治療自身免疫病的 藥物已經(jīng)成為世界范圍深入研究的課題。
自身免疫性疾病常伴有免疫耐受的破壞。免疫耐受對(duì)于維持體內(nèi)免疫平衡和防 止自身免疫性疾病很重要。胸腺首先會(huì)清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，如果胸腺不能完全去 除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，牝時(shí)健康個(gè)體并沒(méi)有發(fā)生自身免疫性疾病，因?yàn)榇嬖谟型庵苊?疫耐受。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起關(guān)鍵作用， 可防止自身免疫性疾病的發(fā)生。越來(lái)越多的研究支持自身免疫性疾病如紅斑狼瘡、 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等都伴有Treg細(xì)胞數(shù)量的減低，而促進(jìn)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的藥物 對(duì)治療自身免疫性疾病將會(huì)起重要作用。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead/ winged helix transcription factor (Foxp3))，是Treg細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的核心轉(zhuǎn) 錄因子，調(diào)控幼稚性T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Fo鄧3基因敲處的小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的自 身免疫性疾病，說(shuō)明Foxp3在維持免疫耐受和防止自身免疫性疾病的發(fā)生中起重要作 用。目前為止公認(rèn)的具有上調(diào)Foxp3的藥物寥寥無(wú)幾，天然藥物至今未有發(fā)現(xiàn)。
分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞(Thl7)是新近發(fā)現(xiàn)的一新T細(xì)胞亞群，其主要通過(guò)分泌 白,胞介素-17A (IL-17A),白細(xì)胞介素-17F (IL-17F),腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和白細(xì)胞介素-6 (IL-6)等細(xì)胞因子刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌粘附分子，介導(dǎo)炎 細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)和組織的損傷；同時(shí)Thl7細(xì)胞也可以分泌細(xì)胞毒物質(zhì)直接損傷組 織。越來(lái)越多的研究表明Thl7細(xì)胞在一些自身免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑 狼瘡、銀屑病和多發(fā)性硬化的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。因此尋找同時(shí)能夠抑制Thl7細(xì)胞
3亞群的藥物就有可能緩減自身免疫性疾病。黃芩是傳統(tǒng)的清熱解毒中藥，味苦，性 寒，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用于治療濕熱痞滿、肺熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥。黃芩苷(7-glucuronic acid-5，6-dihydroxyflavone)是黃芩的主要成份，分子式為C2孔Ab分子量為 446.35，結(jié)構(gòu)式
在以往的應(yīng)用和研究中，已知黃芩苷具有保肝利膽、降壓、利尿、抗菌的作用， 但黃芩苷在調(diào)控T細(xì)胞向Treg和Thl7轉(zhuǎn)化中的作用未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)在治療系統(tǒng)性 紅斑狼瘡腎炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供黃芩苷在制藥中的新用途。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供黃芩苷在制備預(yù)防和治療紅斑狼 瘡腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和Thl7細(xì)胞介導(dǎo)的血管炎的藥物中的應(yīng)用。
下面用黃芩苷的藥理實(shí)驗(yàn)和結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
黃芩苷體外誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制向Thl7轉(zhuǎn)化首先我們用流式 細(xì)胞儀分選小鼠脾臟中的幼稚T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25—)， 96孔板中培養(yǎng)，每孔1X106 個(gè)細(xì)胞，同時(shí)加入2^g/ml的anti-CD3和2^g/ml的anti-CD28。加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF-{3 ) 5ng/ml誘導(dǎo)向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化；加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-e ) 5ng/ml + 白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 20ng/ml誘導(dǎo)向Thl7細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)在培養(yǎng)液中加入20幽 的黃芩苷(溶解在二甲基亞砜(DMSO))。細(xì)胞培養(yǎng)3天后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4+Fo鄧3+和CD4+IL-17+的T細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的百分率，結(jié)果如圖1所示。該圖說(shuō) 明了黃芩苷能夠體外調(diào)控T細(xì)胞向Treg和Thl7細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
、黃芩苷上調(diào)Fo鄰3 mRNA的表達(dá)首先我們用流式細(xì)胞儀分選小鼠脾臟中的幼稚 T淋巴細(xì)胞，96孔板中培養(yǎng)，每孔1X1(T個(gè)細(xì)胞，設(shè)三復(fù)孔。同時(shí)加入2^g/ml的 anti-CD3和2Pg/ml的anti-CD28。單獨(dú)加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-P ) 5ng/ml、 20, 的黃芩苷或兩者同時(shí)加。細(xì)胞培養(yǎng)3天后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(實(shí)時(shí)定量 PCR)檢測(cè)Foxp3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。該圖說(shuō)明了黃芩苷能夠上調(diào)Foxp
發(fā)明內(nèi)容
4mRNA的表達(dá)。
黃芩苷改善自發(fā)性狼瘡小鼠的腎臟損傷12只五月齡自發(fā)性狼瘡小鼠
(MRL/lpr)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。治 療組腹腔注射100mg/kg/天黃芩苷(溶解在生理鹽水，保存在-2(TC的冰箱)，連續(xù) 治療9周。分別在第O周、3周、6周和9周收集小鼠24小時(shí)尿液，檢測(cè)尿蛋白含 量，計(jì)算相對(duì)尿蛋白增加=待測(cè)時(shí)間尿蛋白-第0周尿蛋白。如圖3所示，*〈0.001， 說(shuō)明黃芩苷能夠改善狼瘡小鼠的24小時(shí)尿蛋白。第9周處死動(dòng)物，取腎臟做病理蘇 木素一伊紅(HE)和Masson三色染色了解腎臟損傷情況，如圖4所示，說(shuō)明黃芩苷 能夠改善狼瘡小鼠的腎臟損傷。取脾細(xì)胞檢測(cè)黃芩苷是否能促進(jìn)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞 的轉(zhuǎn)化，如圖5所示，說(shuō)明黃芩苷能夠促進(jìn)狼瘡小鼠體內(nèi)T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化。
黃芩苷緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)損傷18只8周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自中 國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。造模使用100ri含有 熱休克的10mg/ml的結(jié)核桿菌的完全佛式佐劑免疫小鼠后足，小鼠2周后關(guān)節(jié)炎癥 狀到達(dá)高峰，此時(shí)開(kāi)始腹腔注射100mg/kg/天的黃芩苷1周。取關(guān)節(jié)組織行病理切 片評(píng)價(jià)治療效果，如圖6所示，說(shuō)明黃芩苷能夠改善關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)損傷，取小 鼠關(guān)節(jié)組織通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)黃芩苷對(duì)白細(xì)胞介素-17 (IL-17) mRNA的影響， 如圖7所示，說(shuō)明黃芩苷能夠抑制關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)組織中IL-17mRNA的表達(dá)。
黃芩苷抑制IL-17誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎癥因子的表達(dá) HUVEC培養(yǎng)在6孔板中，待細(xì)胞至80%融合時(shí)，加入50ng/ml IL-17和20幽黃苳苷， 并繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)黃芩苷對(duì)細(xì)胞間粘附分 子-l(ICAM-1)，血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子-1 (VCAM-1)和IL-17 mRNA表達(dá)的影響， 并以18SrRNA作為內(nèi)參。結(jié)果如圖8所示，說(shuō)明黃芩苷能夠抑制IL-17誘導(dǎo)的粘附 分子mRNA的表達(dá)。
黃芩苷抑制IL-17誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附人臍靜脈血 管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在12孔板中，待細(xì)胞至80%融合時(shí)，加入50 ng/ml IL-17和20MM 黃芩苷，并繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后；然后以5:1的比例加入人白血病淋巴細(xì)胞(Jurkat)， 繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后以生理鹽水洗去未粘附的淋巴細(xì)胞，顯微鏡下觀察粘 附細(xì)胞。如圖9所示，說(shuō)明黃芩苷能夠抑制IL-17誘導(dǎo)的T細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
本發(fā)明以調(diào)控T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷調(diào)控T細(xì)胞轉(zhuǎn)化在治療自身免疫性 疾病中的應(yīng)用，其具體優(yōu)點(diǎn)如下1、 本發(fā)明對(duì)已知化合物黃芩苷發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2、 黃芩苷促進(jìn)T細(xì)胞向抗炎作用的Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和抑制T細(xì)胞向促炎作用 的Thl7轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化；
3、 黃芪苷可以進(jìn)一步抑制由Thl7細(xì)胞誘導(dǎo)的血管炎；
4、 黃芩苷的免疫調(diào)節(jié)作用可以應(yīng)用在廣泛的自身免疫性疾病上。


圖1為小鼠T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖2為小鼠T細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)圖； 圖3為小鼠24小時(shí)尿蛋白定量檢測(cè)圖； 圖4為小鼠腎臟蘇木素一伊紅和Masson三色染色圖； 圖5為小鼠脾臟CD4+Foxp3+細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖； 圖6為小鼠關(guān)節(jié)組織蘇木素一伊紅染色圖； 圖7為小鼠關(guān)節(jié)組織IL-17mRNA表達(dá)的聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)圖； 圖8為黃芩苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子mRNA表達(dá)的聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)圖； 圖9為黃芩苷抑制T細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1:黃芩苷的提取
采用唇形科黃芩屬植物黃芩2.5kg，用95voP/。的乙醇在65'C提取兩次，每次兩 小時(shí)，提取液在7(TC減壓濃縮，得到的濃縮液冷卻到室溫，離心，過(guò)濾，濾液在70 'C減壓濃縮，得到的濃縮液加入乙醇至85voP/。進(jìn)行醇沉，醇沉液靜置過(guò)濾，取上清 液，，過(guò)濾去掉雜質(zhì)，在7(TC減壓濃縮，噴霧干燥，紫外滅菌，得到黃芩苷。
實(shí)施例2:膠囊的制備
將實(shí)施例1得到的黃芩苷300g，加入300g聚乙二醇(PEG-400)， 30g三乙醇胺， 20g羥丙基-(3-環(huán)糊精20g和甘油40g，混合溶解制成溶液，采用壓膜法制備軟膠囊， 軟膠囊經(jīng)冷風(fēng)固化、干燥，用適當(dāng)?shù)娜軇┫赐?、終干，即得。
本發(fā)明還可以通過(guò)常規(guī)方法制備其他劑型，如軟膠囊、腸溶膠囊、微囊、粉劑、 顆粒劑、糖漿、注射劑、栓劑、丸劑、凝膠劑、貼劑、乳劑、懸浮液、溶液等。本 發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。本發(fā)明中的藥用輔料包括 用于固體制劑的賦形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶液、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤(rùn)膚劑、 乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥ffl添加劑如防腐劑、抗氧化劑、著色 劑、甜味劑和調(diào)味劑等。
權(quán)利要求
1.黃芩苷在制備治療或預(yù)防紅斑狼瘡腎炎的藥物中的應(yīng)用。
2. 黃芩苷在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
3. 黃芩苷在制備治療或預(yù)防Thl7細(xì)胞介導(dǎo)的血管炎中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃芩苷在制藥中的應(yīng)用。黃芩苷通過(guò)上調(diào)Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞向具有免疫抑制作用的Treg的轉(zhuǎn)化；同時(shí)黃芩苷抑制具有促炎作用的Th17，抑制Th17介導(dǎo)的血管炎。其抑制Th17的主要機(jī)制是通過(guò)抑制IL-6介導(dǎo)的Th17的擴(kuò)增。同時(shí)我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明黃芩苷作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，在治療紅斑狼瘡腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮很好的療效。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK101491533SQ20081020729
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者明 李, 驥 楊 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院