專(zhuān)利名稱(chēng)：文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種文蛤活性多肽，尤其是涉及一種文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
應(yīng)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方法將是腫瘤治療的主要途徑之一。因此，尋找能有效誘導(dǎo)凋亡或 損傷癌細(xì)胞的藥物成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。另一方面，細(xì)胞持續(xù)分裂和不斷增殖是癌細(xì)胞的重 要特征，考察對(duì)癌細(xì)胞增殖活動(dòng)的抑制作用是鑒定外源性物質(zhì)抗腫瘤作用的一項(xiàng)主要指標(biāo)。 文蛤不僅肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有極高的藥用價(jià)值[丁源，丁偉，張吉德.我國(guó)藥用海 產(chǎn)貝類(lèi)名錄及其應(yīng)用[J].海洋藥物，1984， 3: 34]。
近代研究表明文蛤有清熱利濕、.化痰、散結(jié)功效，對(duì)肝癌、肺癌、胃癌等有明顯的抑 制作用。對(duì)小鼠肉瘤S-180的抑制率僅為30Q/。[上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，中國(guó)人民解放軍海軍后 勤衛(wèi)生部編.中國(guó)藥用海洋生物[M].上海人民出版社，1977， 76-77]，對(duì)肝癌腹水型和肝癌 實(shí)體型的抑制率在40%至50%[中國(guó)藥用動(dòng)物志協(xié)作組.中國(guó)藥用動(dòng)物志[M].天津科學(xué)技術(shù) 出版社，1997， 36-37]。同時(shí)，文蛤提取物對(duì)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫具有明顯的增強(qiáng)作 用，而且使用劑量較大時(shí)能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[何雅軍，吳謙，朱瑞斐.文蛤 多糖抗癌免疫藥理作用的研究[J].中國(guó)海洋藥物，1995， 3: 20-21]。 Schmeer首先報(bào)道指出， 普通可食蛤、圓蛤及其他貝類(lèi)中既含有腫瘤抑制因子，通過(guò)適當(dāng)提取方法，得到腫瘤抑制因 子，對(duì)小鼠S-180肉瘤有顯著的抑制作用，并且對(duì)小鼠無(wú)毒性。他將這一活性物質(zhì)稱(chēng)為"蛤素" (Mercenene) [Schmeer MR. Growth-inhibiting agents from mercenaria extracts: chemical and biological properties[J]. Science, 1964， 144: 413-414]。 Stavinski等人于1982年從蛤肝中提 取到一種分子量為76.0 kD的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白腫瘤抑制作用，指出文蛤中的抗癌因子并 不全由小分子物質(zhì)組成 [Stavinski SS. Isolation and characterization of the water soluble antineoplastic principles of the common quahog， Mercenaria Mercenaria[J]. UMI Proquest Digital Dissertations, 1982: 163-164]。
本申請(qǐng)人已經(jīng)從文蛤中提取得到分子量為3144.7 dalton的文蛤活性多肽[Bo Leng， Xiao-Dan Liu, Qing-Xi Chen. Inhibitory effect of anticancer peptide from Mercenaria on the
3BGC-823 cells and several enzymes [J]. FEBS letters, 2005， 579: 1187-1190]，并對(duì)該多肽的性質(zhì) 進(jìn)行了研究。但是，文蛤多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549的作用研究至今未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，文蛤多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549具有特異
的誘導(dǎo)殺死效應(yīng)，對(duì)肺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作用，由此可見(jiàn)，文蛤活性多肽可用于制
備抗肺癌藥物。


圖1為文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制效應(yīng)。在圖1中，橫坐標(biāo)為文蛤活性多肽 濃度Peptide concentration (pg/mL)，縱坐標(biāo)為抑制率Inhibitory late (%);文蛤活性多肽作 用肺癌細(xì)胞的時(shí)間分別為a為24h， b為48h， c為72h。
圖2為文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的影響。在圖2中，橫坐標(biāo)為處理時(shí)間Time (d)，縱坐標(biāo)為活細(xì)胞數(shù)Cell number (104/mL); A為對(duì)照組，B為文蛤活性多肽(mer2)。
圖3為文蛤活性多肽對(duì)肺癌A549形態(tài)的影響(48 h,X 100)。在圖3中，A為對(duì)照組，B 為經(jīng)文蛤多肽處理組(30ng/mL)。
圖4為文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549核染色質(zhì)形態(tài)學(xué)變化的影響(48 h，X400)。在圖4 中，A為對(duì)照組，B為經(jīng)文蛤多肽處理組(30ng/mL)。
圖5為文蛤活性多肽對(duì)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響。在圖5中，A為對(duì)照組，B為 經(jīng)文蛤多肽處理組(30pg/mL);橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度P1 (道數(shù))，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)Count (個(gè))； 細(xì)胞周期分別為G， H， I， J。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 本發(fā)明所述的文蛤活性多肽可采用以下的分離純化方法
1) 將新鮮文蛤冰凍2h，冰凍溫度可為一20'C，取出蛤肉，加入水，按質(zhì)量比，蛤肉 水為l:l，于高速組織搗碎機(jī)勻漿3次，每次30s，獲得勻漿液。
2) 15000gX30min離心得上清，20%硫酸銨鹽析后4。C過(guò)夜，15000gX30min離心取上 清，獲得第一次提取物。
3) 加入4倍體積乙醇抽提過(guò)夜，15000gX30min離心得上清，獲得第二次提取物。
4) 40'C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除第二次提取物中乙醇后，冷凍干燥濃縮成干粉，制備成初提物備用。
5) 初提物按0.5%的濃度用蒸餾水溶解，用0.45^un膜過(guò)濾去除雜質(zhì)和不溶物，所得溶液以蒸餾水為流動(dòng)相，以280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在SephadexG-25分子篩上進(jìn)行柱層析，所收集 得到的各蛋白吸收峰用MTT法驗(yàn)證抗癌活性；收集第二峰物質(zhì)，冷凍干燥濃縮成干粉即為文 蛤活性多肽，并命名為mer2。
本發(fā)明采用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別研究了文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制作 用。結(jié)果顯示，文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作用，處理72h， 30 Mg/mL文 蛤活性多肽可以使肺癌細(xì)胞A549的抑制50%，而濃度達(dá)50 ng/mL可使肺癌細(xì)胞死亡率達(dá) 92%，(見(jiàn)圖1)，顯示該文蛤多肽對(duì)肺癌細(xì)胞有極強(qiáng)的殺死作用。通過(guò)光學(xué)顯微鏡、Hoechst 染色和流式細(xì)胞技術(shù)等方法，可研究文蛤多肽對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì) 胞周期的影響。圖2給出文蛤活性多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明文蛤多肽 處理后的細(xì)胞外形變化明顯，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞群體數(shù)量顯著稀疏，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少， 出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落(見(jiàn)圖3) 。 Hoechst染色結(jié)果表明經(jīng)文蛤多肽處理的細(xì)胞其細(xì)胞核呈 致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白，出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)(見(jiàn)圖4)。細(xì)胞周期的檢測(cè) 結(jié)果也說(shuō)明，經(jīng)該多肽處理的肺癌A549細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，但細(xì) 胞周期未出現(xiàn)明顯阻滯現(xiàn)象(見(jiàn)圖5)。表明文蛤多肽對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與細(xì)胞凋亡 有關(guān)。這些結(jié)果充分說(shuō)明，文蛤抗癌活性多肽能有效抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)，并能改變 肺癌細(xì)胞A549形態(tài)學(xué)特征。表明該多肽具有良好的抗肺癌藥物開(kāi)發(fā)前景。
權(quán)利要求
1. 文蛤活性多肽的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟1)將新鮮文蛤冰凍2h，冰凍溫度為—20℃，取出蛤肉，加入水，按質(zhì)量比，蛤肉∶水為1∶1，于高速組織搗碎機(jī)勻漿3次，每次30s，獲得勻漿液；2)15000g×30min離心得上清，20％硫酸銨鹽析后4℃過(guò)夜，15000g×30min離心取上清，獲得第一次提取物；3)加入4倍體積乙醇抽提過(guò)夜，15000g×30min離心得上清，獲得第二次提取物；4)40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除第二次提取物中乙醇后，冷凍干燥濃縮成干粉，制備成初提物備用；5)初提物按0. 5％的濃度用蒸餾水溶解，用0.45μm膜過(guò)濾去除雜質(zhì)和不溶物，所得溶液以蒸餾水為流動(dòng)相，以280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在SephadexG-25分子篩上進(jìn)行柱層析，所收集得到的各蛋白吸收峰用MTT法驗(yàn)證抗癌活性；收集第二峰物質(zhì)，冷凍干燥濃縮成干粉即為文蛤活性多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離純化方法所制備的文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用，涉及一種文蛤活性多肽，尤其是涉及一種文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。提供一種文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。采用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，文蛤多肽對(duì)肺癌細(xì)胞A549具有特異的誘導(dǎo)殺死效應(yīng)，對(duì)肺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作用，由此可見(jiàn)，文蛤活性多肽可用于制備抗肺癌藥物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101496817SQ200810189188
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者康勁翮, 陳清西 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)