專利名稱：：抑制表皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為抑制人類表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)，又叫基因沉默，是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，clsMA)誘發(fā)的、同源rn副A高效特異性降解的現(xiàn)象。它是一種在動(dòng)植物中廣泛存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默過程，是牛物基因組抵抗病毒之類的外來遺傳元件入侵的一種生物保護(hù)機(jī)制。生物體內(nèi)的雙鏈KNA可來自于RNA病毒感染、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、外源導(dǎo)入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)制，結(jié)果是病毒被清除，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)被阻斷，外源導(dǎo)入基因表達(dá)被阻斷，同時(shí)，與其內(nèi)源的細(xì)胞基因組中的基因也被阻斷。RNAi還具有很高的特異性。19個(gè)核苷酸的雙鏈RNA幾乎可以完全抑制基因的表達(dá)，而將其中的一個(gè)核苷酸突變掉后，它對(duì)基因的抑制作用就消失了(Brummelkamp.T.R，Bernads.R,Agami.R.AsystemforstableexpressionofshortintereringRNAsinMammaliancells.Science.2002;296:550-553)，這對(duì)雙鏈RNA的應(yīng)用是非常重要的，這可以避免雙鏈RNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。最有效的小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,以下簡(jiǎn)稱siRNA)是19個(gè)堿基大小、且3'端有兩個(gè)堿基突出(懸掛堿基)的雙鏈RNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)格，與靶mRNA之間的一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱基因沉默的效果(BrownD,JarvisR，PallottaVandetal.，RNAinterferenceinmammaliancellculture:design,executionandanalysisofthesi腿effect.Technotes,9(1):3-5:MiyagishiMandTairaK.，U-6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3'-overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatureBiotechnology,20:497-500)。快速發(fā)展的RNAi技術(shù)為惡性腫瘤機(jī)制的研究提供了有力工具，同時(shí)也推動(dòng)了以該技術(shù)為基礎(chǔ)的腫瘤治療策略的研發(fā)進(jìn)程。腫瘤分子生物學(xué)研究表明，腫瘤是由于基因異常引起的疾病，致病機(jī)理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及細(xì)胞周期的異常，腫瘤發(fā)病分子機(jī)理的進(jìn)一步闡明為腫瘤基因治療提供了可靠的理論依據(jù)。RNA干擾技術(shù)是近幾年興起的生物技術(shù)，用小分了下擾RNA抑制特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。人類表皮生長(zhǎng)因子受體(印idermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)家族是具有酪氨酸激酶活性的膜受體。EGFR廣泛表達(dá)于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織。在正常組織中調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化等重要牛理過程。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EGFR在許多人類腫瘤中有不同程度的過度表達(dá)，如頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和腦腫瘤等。且己證明EGFR與腫瘤的分化程度、惡性程度及浸潤(rùn)程度、放化療敏感性、腫瘤耐藥性及預(yù)后等密切相關(guān)(JeffreyA.K'DavjdA.S，etaletal.，pl85neuExpressioninHumanLungAdenocarcinomasPred丄ctsShortenedSurvival.CancerRes，1990，50:5184-5191;BattistaP，PizzicannellaG，etalctal.，Theepidermalgrowthfactorfamilyinpulmonarycarcinoids:Animmunahistochemicalevidenceofgrowth-promotingcircuits.ModPathol'1993，6(2):162-166.)。EGFR家族被認(rèn)為是抗腫瘤治療理想的分子靶點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供能在mRNA水平和蛋白水平上抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA.實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下-一種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCC-3'，反義鏈5'-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正義鏈5'-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3'，反義鏈5'-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正義鏈5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3，，反義鏈5'-CGACUAl]CUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'，或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈3'末端、反義鏈中5'末端對(duì)應(yīng)缺失1—6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。優(yōu)選地，所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'，反義鏈5'-AAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正義鏈5'-CAAGCAACAUGGUCAGUUU-3',反義鏈5'-AAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正義鏈5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGA-3'，反義鏈5'-UCUGGGUCUAUCAUCCAGC-3'。所述雙鏈RNA分子的3'末端還設(shè)有兩個(gè)脫氧核苷組成的懸掛堿基(Over-hang)，所述懸掛堿基例如可為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的dTdT或dTdC或dUdU等，以增加siRNA的活性。更優(yōu)選地，所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA為正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUdTdT-3'，反義鏈5'-AAUGAGGACAUAACCAGCCdTdT-3'。優(yōu)選地，上述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA為任意部分經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA分子；所述化學(xué)修飾包括對(duì)連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用其它任何化學(xué)建取代；化學(xué)修飾包括對(duì)這些siRNA分子核酸戊糖的2位上的0H作任何化學(xué)的修飾和改變。本發(fā)明的另一目的是提供上述siRNA在制藥中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下上述抑制EGFR基因表達(dá)的si腦A在制備預(yù)防或治療人類表皮生長(zhǎng)因了受體相關(guān)的疾病的藥物或制劑中的應(yīng)用。所述疾病為肺癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤的任一種或多種。RNA干擾技術(shù)是將一段雙鏈的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，使具有同源序列的基肉表達(dá)受到抑制，是腫瘤基因治療的新領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案中的siRNA序列的長(zhǎng)度均為19一25bp，這些siRNAs既足夠長(zhǎng)誘導(dǎo)基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主干擾素反應(yīng)。本發(fā)明所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA為制備預(yù)防或治療人類表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病的藥物或制劑提供了新的，較好的選擇。圖l是各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別作用于A549細(xì)胞后Rea.1-timeRT-PCR法檢測(cè)各處理組細(xì)胞中EGFRmRNA的表達(dá)量示意圖2是各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別作用于A549細(xì)胞后Westernb1ot法檢測(cè)各處理組細(xì)胞巾EGFR蛋白的表達(dá)量示意圖3是MTT法分析EGFRsiRNA1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響示意圖4是AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)EGFRsiRNAl實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)A5的細(xì)胞凋亡的影響示意圖5是活體成像監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同處理組裸鼠肺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況示意圖，其中1:空白對(duì)照組；2:NotargetsiKNA對(duì)照組；3:EGFRsiRNA治療組；圖6是各處理組裸鼠肺癌皮下移植瘤熒光值隨時(shí)間變化的關(guān)系示意圖7是實(shí)施例七中所述siRNA分子對(duì)EGFRmRNA表達(dá)的抑制效果示意圖；圖8是實(shí)施例八中所述siRNA分子對(duì)EGFRmRNA表達(dá)的抑制效果示意圖。具體實(shí)施例方式發(fā)明人采用siRNA設(shè)計(jì)法則，并結(jié)合發(fā)明人自主開發(fā)的設(shè)計(jì)軟件輔助設(shè)計(jì)抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA序列，通過實(shí)驗(yàn)篩選多條高效EGFRsiRNA序列其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3'，反義鏈5'-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正義鏈5'CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3，，反義鏈5，-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正義鏈5'-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3，，反義鏈5'-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'，或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈3'木端、反義鏈中5'末端對(duì)應(yīng)缺失1一6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。其中，任一對(duì)正義鏈3'末端、反義鏈中5'末端對(duì)應(yīng)缺失1一6個(gè)堿基是指正義鏈和相應(yīng)的反義鏈互補(bǔ)配對(duì)，例如，當(dāng)選擇的正義鏈為具有20個(gè)核苷酸時(shí)，則其互補(bǔ)配對(duì)的反義鏈也具有20個(gè)核苷酸。上述任一條抑制EGFR基因表達(dá)siRNA可用于制備預(yù)防或治療人類表皮牛長(zhǎng)因子受體相關(guān)的任何疾病的藥物或制劑。實(shí)施例一EGFRsiRNA的設(shè)計(jì)與合成。首先在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心IVCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人EGFRraRNA的序列全長(zhǎng)(序列號(hào)AY588246)，使用本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)三條EGFRsiRNA和一條陰性對(duì)照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，設(shè)計(jì)了dTdT兩個(gè)堿基的懸掛末端，以增加siRNA的穩(wěn)定性。設(shè)計(jì)的siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。表2設(shè)計(jì)的EGFRsiRNA及陰性對(duì)照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例二RealtimeRT-PCR檢測(cè)3條EGFRsiRNA對(duì)EGFRmRNA表達(dá)的抑制效果人肺腺癌細(xì)胞株A549常規(guī)培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5WC0"37。C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為lXl()V'孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)LipofectamineT"2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組、EGFRsiRNA2轉(zhuǎn)染組、EGFRsiRNA3轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250"0PTI-MEM中加入5uL,M的siRNA，室溫孵育5min。在250uLOPTI-MEM中加入5yLLipofcctamine2000，室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1,加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40nL無RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT)w為引物，lugRNA為模板，按Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6PL做模板，利用SYBRGreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的EGFRmRNA表達(dá)，并以無RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以P-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性]0s;94。C變性5s:退火30s;72。C延伸ls;45個(gè)循環(huán)。用2—AACT法計(jì)算和分析EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量，確定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。①EGFR基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為217bp，退火溫度為55.6'C。上游引物5'-AGGACCAAGCAACATGGTCA-3'下游引物5'-CCTTGCAGCTGTTTTCACCT-3'②P-Actin基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為452bp，退火溫度為6CTC。上游引物5'-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3'下游引物5'-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'結(jié)果見圖l。與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組比較，EGFR的三條siRNA均明顯抑制了EGFRmRNA的表達(dá)，其中EGFRsi腦Al的抑制效果最好，抑制率為85%左右。NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組相比無明顯差異。實(shí)施例三Westernblot檢測(cè)三條siRNA對(duì)EGFR蛋白表達(dá)的抑制效果人肺腺癌細(xì)胞株A549常規(guī)培養(yǎng)于含iOM胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5%0)2、37°C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為lX105/孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectamine"2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組、EGFRsiRNA2轉(zhuǎn)染組、EGFRsiRNA3轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250uLOPTI-MEM中加入5yL20wM的siRM，室溫孵育5min。在250liL0PTI-MEM中加入5iiLLipofectamine2000，室溫孵育5rain。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后48h的6孔板細(xì)胞，PBS洗兩遍，每份加160yLTNE裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，再加入40uL5XSDSloadingbuffer。各組分別取總蛋白25ug，經(jīng)8XSDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。加5%的脫脂牛奶封閉液封閉過夜。與特異性一抗(兔抗人EGFR多克隆抗體，兔抗人13-Actin多克隆抗體)室溫孵育2h，TBST洗膜三次，每次10min。與二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔丄gG)，室溫孵育lh，TBST洗膜三次，按1:2的比例加入底物BCIP和NBT進(jìn)行顯色，掃描圖片。結(jié)果見圖2。不同處理組中的P-Actin條帶亮度幾乎無差異，說明總蛋白量基本一致，NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組的EGFR蛋白表達(dá)有明顯條帶，而轉(zhuǎn)染了EGFRsiRNAl、EGFRsiRNA2、EGFRsiRNA3的細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到EGFR蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一歩證實(shí)了EGFRsiRNA在蛋白水平對(duì)靶基因表達(dá)的抑制及作用的特異性。實(shí)施例四MTT法分析轉(zhuǎn)染EGFRsiRNAl對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。人肺腺癌細(xì)胞株A549本實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)于含10W胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5%(]02、37。C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以每孔4乂103細(xì)胞接種于96孔板中，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)LipofectamineTM2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)宇白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)和EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)空。轉(zhuǎn)染方案為在25yL0PTI-MEM中加入O.25pL20uM的siRNA，室溫孵育5min。在25uL0PTI-MEM中加入O.25tiLLipofectamine2000，室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。48h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入80yL新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入新配制的5mg/mlMTT液20uL，于37。C、5%002飽和濕度下培養(yǎng)。4h后吸出培養(yǎng)液，每孔加入150uLDMSO，于振蕩器上震蕩10min。置酶標(biāo)儀570，處測(cè)定吸光度值(A值)。取3孔平均值，比較EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組A值的差異，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(％)=(1—實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)X100%。結(jié)果見圖3。與NotargetsiRM轉(zhuǎn)染組比較，EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。其抑制率為50%左右。由于轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin^2000有一定毒性，所以空白對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)明顯多于NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組。實(shí)施例五AnnexinV—FITC/PI雙染法分析轉(zhuǎn)染EGFRsiRMl對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響。人肺腺癌細(xì)胞株A549常規(guī)培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5%0)2、37°C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為1X10V孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectamine'M2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)和EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250uL0PTI-MEM中加入5uL20uM的si腿，室溫孵育5min。在250uL0PTI-MEM中加入5yLLipofectamine2000，室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后吸出各孔培養(yǎng)液，消化收集各孔細(xì)胞。按ArmexinV-FITC/PI檢測(cè)試劑盒操作指南..用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。比較EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率差異。結(jié)果見圖4?？瞻讓?duì)照組的細(xì)胞凋亡率為4.93%，NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為4.25%，EGFR1siRNAl轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為22.98%。與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組比較，EGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞率明顯增加，空白對(duì)照組與NotargetsiRNA轉(zhuǎn)染組之間比較無明顯差異。實(shí)施例六EGFRsiRNAl靶向抑制EGFR基因后對(duì)裸鼠肺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的作用研究。穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的人肺腺癌細(xì)胞A549-luc本實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、6(XHig/mLG418的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5訓(xùn)2、37。C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。BALB/c裸鼠，45周齡，體重20g左右，雌性，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于高度潔凈的SPF環(huán)境下。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-luc細(xì)胞，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，以1000r/min離心5min，棄上清液，PBS稀釋細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5X1(T/mL。取上述備好的A549-luc^細(xì)胞懸液0.2mL，用微量注射器注射至裸鼠右背側(cè)近腋部皮下。動(dòng)物接種數(shù)12只。A549-luc細(xì)胞接種5天后，每只裸鼠腹腔注射150uL30mg/mL熒光素酶底物，底物注射1025min后采用美國(guó)精諾真活體成像系統(tǒng)(IVIS200)，進(jìn)行活體成像，并定量檢測(cè)腫瘤接種部位的熒光值大小，根據(jù)熒光值大小將動(dòng)物均勻分為3組，每組3只，分別為①溶劑對(duì)照組:瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射70uL5%葡萄糖溶液；②NotargctsiRNA對(duì)照組瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射jetPEI/NotargetsiRNA復(fù)合物(15ugNotargetsiRNA，2.4uLjetPEI);③EGFRsiRNA治療組瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射jetPEI/EGFRsiRNA復(fù)合物(15ugEGFRsiRNAl,2.4yLjetPEI)，均每?jī)商旖o藥一次。每4天采用活體成像系統(tǒng)進(jìn)行活體成像，并定量分析比較各時(shí)間點(diǎn)各組的熒光值，待腫瘤出現(xiàn)表面壞死時(shí)，停止活體成像。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤接種部位單位面積熒光值為縱坐標(biāo)，繪制各組腫瘤皮下生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見圖5。給藥后0-12天之內(nèi)，各組腫瘤螢光值均呈進(jìn)行性增加，但與溶劑對(duì)照組和NotargetsiRNA對(duì)照組相比，EGFRsiRNA治療組腫瘤熒光值增加緩慢，說明EGFRsiRNA治療組腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于NotargetsiRNA對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。其中，A:0天(第一次處理前)；B:4大；C:8天；D:12天.本發(fā)明將上述針對(duì)EGFRmRNA編碼區(qū)不同位置的3條EGFRsiRNA序列(SEQ:7-12)和一條陰性對(duì)照siRNA(NotargetsiRNA)分別導(dǎo)入肺癌細(xì)胞株A549，結(jié)果顯示，與導(dǎo)入陰性對(duì)照siRNA相比，A549細(xì)胞中EGFR的mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯降低。雖然針對(duì)同一靶基因，但位置不同，效果不同。本發(fā)明從EGFR的mRNA和蛋白的表達(dá)得到的結(jié)果是一致的，3條EGFRsiRNA序列均能明顯抑制A549細(xì)胞中EGFR基因mRNA和蛋白的表達(dá)，其中EGFRsiRNAl的效果較EGFRsiRNA2禾QEGFRsiRNA3稍好。然后，我們采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI雙染法，從體外培養(yǎng)細(xì)胞水平，檢測(cè)了EGFRsiRNAl特異誘導(dǎo)EGFR基因抑制后，對(duì)A549細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，EGFRsiRNAl處理組的細(xì)胞凋亡率明顯增加，而細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制。最后，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的人肺腺癌細(xì)胞株A549-luc建立裸鼠皮下移植瘤模型，采用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)移植瘤的生長(zhǎng)情況，通過比較空白對(duì)照組、NotargetsiRNA陰性對(duì)照組和EGFRsiRNAl治療組之間的移植瘤熒光值，來反映移植瘤大小的差異。結(jié)果顯示，EGFRsiRNAl治療組移植瘤熒光值比空白對(duì)照組和NotargetsiRNA對(duì)照組增加緩慢，移植瘤的生長(zhǎng)速度也較空白對(duì)照組和NotargetsiRNA對(duì)照組明顯變慢，說明千擾EGFR基因表達(dá)對(duì)肺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。實(shí)施例七27個(gè)堿基的siRNA分子對(duì)EGFRmRNA表達(dá)的抑制效果。表3設(shè)計(jì)的EGFRsiRNA及陰性對(duì)照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>EGFR2849-2873GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCGACUAUCUGCGUCUAUCAUCC5，6si扁-27CGdTdTAGCdTdT人肺腺癌細(xì)胞株A549常規(guī)培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5WC02、37'C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為lX105/孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)Lipofectemine"2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、21bpEGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組、21bpEGFR化學(xué)修飾siRNA轉(zhuǎn)染組、27bpEGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250uL0PTI-MEM中加入5uL20uM的siRNA，室溫孵育5min。在250yL0PTI-MEM中加入5uLLipofectam丄ne'"2000，室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫孵育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40nL無RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dT),5為引物，lygRNA為模板，按卩romega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6liL做模板，利用SY服GreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的EGFRmRNA表達(dá)，并以無RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以P-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)(與實(shí)施例2相問)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為:95。C預(yù)變性10s;94。C變性5s;退火30s;72。C延伸ls;45個(gè)循環(huán)。用2—A^法計(jì)算和分析EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量，確定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。結(jié)果見圖7。實(shí)驗(yàn)分五組EGFRsiRNAl21bp未進(jìn)行化學(xué)修飾組，EGFRsiRNAl21bp—種化學(xué)修飾組，EGFRsi腿527bp(EGFRsiRNA4、6的結(jié)果示意圖效果與EGFRsi腿527bp相同，省略)未修飾組，NotargetsiRNA組，空白對(duì)照組。結(jié)果顯示，與NotargetsiRNA組相比，21bp修飾組及27bp未修飾組的沉默效果也很好。實(shí)施例八經(jīng)過化學(xué)修飾的siRNA分子對(duì)EGFRmRNA表達(dá)的抑制效果。對(duì)EGFRsiRNAl21bp，即SEQ6-7_進(jìn)行兩種修飾①有dTdT懸垂，正反義鏈3'、5'末端的三個(gè)堿基甲基化，反義鏈的5'末端磷酸化；②無懸垂，正義鏈所有堿基2'甲基化，反義鏈5'端磷酸化.人肺腺癌細(xì)胞株A549常規(guī)培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5%0)2、37°C飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，用O.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種密度為lX10&/孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30%50%。根據(jù)LipofectamineT"2000試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(NotargetsiRNA)、2丄bpEGFRsiRNAl轉(zhuǎn)染組、21bpEGFRl化學(xué)修飾①siRM轉(zhuǎn)染組、27bpEGFRsiRNA4轉(zhuǎn)染組、21bpEGFR化學(xué)修飾②siRM轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染方案為在250wL0PTI-MEM中加入5yL20iiM的siRM，室溫孵育5min。在250uL0PTI-MEM中加入511LLipofectamine2000,室溫孵育5min。將上述兩種稀釋液混勻，室溫辨育20min后加入細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后24-48h的細(xì)胞，6孔板每孔加入lmLTrizo1，加入氯仿和異丙醇按常規(guī)方法抽提細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于40yL無RNA酶水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各處理組RNA的含量和純度，并進(jìn)行凝膠電泳，觀察RNA完整性。以oligo(dTL為引物，lugRNA為模板，按Pr匿ga逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA。各取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物l.6ixL做模板，利用SYBRGreenI染料實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的EGFRmRNA表達(dá)，并以無RNA酶水作為陰性模板對(duì)照，以P-Actin作為內(nèi)參。引物序列根據(jù)GenBank公布的cDNA序列設(shè)計(jì)(與實(shí)施例2相同)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為:95'C預(yù)變性10s;94'C變性5s;退火30s;72'C延伸ls;45個(gè)循環(huán)。用2—A^法計(jì)算和分析EGFR基因的相對(duì)表達(dá)量，確定EGFR基因的mRNA被siRNA沉默的程度。結(jié)果見圖8。圖注實(shí)驗(yàn)分五組EGFRsiRNAl21bp未進(jìn)行化學(xué)修飾組，EGFRsiRNAl21bp第一種化學(xué)修飾組，EGFRsiRNA427bp未修飾組，EGFRsiRNAl21bp第二種化學(xué)修飾組，NotargetsiRNA組。結(jié)果顯示，與NotargetsiRNA組相比，21bp兩種修飾組及27bp未修飾組的沉默效果很好。系列表<110>中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〈120〉抑制表皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用〈160〉14〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>25212>腿<213>人工序列〈400〉1ggcugguuauguccucauugcccuc25<210>2,〈211>25<212〉腿<213〉人工序列〈400〉2g3gggC33Ug3gg3C3U33CC8gCC25〈210〉3<211〉25〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉3caagcaacauggucaguuuucucuu25<210〉4〈211〉25〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉4aagagaaaacugaccauguugcuug25〈210〉5〈211〉25<212>脂A〈213〉人工序列〈400〉5gcuggaugauagacgcagauagucg25<210〉6〈211〉25〈212〉畫〈213〉人工序列〈400〉6cgacuaucugcgucuaucauccagc25〈210〉7〈211〉19<212〉腿〈213>人工序列〈400>7ggcugguuauguccucaxiu1〈210〉8<211〉19〈212〉腿<213〉人工序列<400〉8〈210〉9〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉9caagcaacauggucaguuu19〈210>10〈211〉19〈212>腿<213〉人工序列〈400〉10aaacugaccauguugcuug〈210〉11<211>19<212>脂A〈213〉人工序列<400>11gcuggaugauagacgcaga<210〉12〈211>19〈212〉腿〈213〉人工序列<400〉12ucugcgucusucauccagc〈210〉13〈211〉19<212>腿〈213〉人工序列〈400〉13uucuccgascgugucacgu<210>14〈211〉19<212>腿〈213〉人工序列〈400〉14acgugacacguucggagaa191919權(quán)利要求1.一種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3’，反義鏈5’-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3’；正義鏈5’-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3’，反義鏈5’-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3’；正義鏈5’-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3’，反義鏈5’-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3’；或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈的3’末端、反義鏈中5’末端對(duì)應(yīng)缺失1-6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述抑制EGFR基因表達(dá)的si脂A，其特征是，其為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3''反義鏈5'-AAUGAGGACAUAACCAGCC-3';正義鏈5，-CAAGCAACAUGGUCAGUUU-3'，反義鏈5'-AAACUGACCAUGUUGCUUG-3';正義鏈5'-GCUGGAUGAMGACGCAGA-3'，反義鏈5'-UCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求l一2任一項(xiàng)所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述雙鏈RNA分子的3'末端還設(shè)有以兩個(gè)脫氧核苷的組合的懸掛堿基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，其為正義鏈5'-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUdTdT-3'，反義鏈5'-AAUGAGGACAUAACCAGCCdTdT-3'的雙鏈RNA分子。5.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述的siRNA為任意部分經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述化學(xué)修飾包括對(duì)連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用其它任何化學(xué)基團(tuán)取代。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，化學(xué)修飾為在siRNA分子核酸戊糖的2，位上的OH作化學(xué)的修飾和改變.8.根據(jù)權(quán)利要求7所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其特征是，所述2'位上的OH化學(xué)修飾的基團(tuán)為Cfta,F—'CH30CH2CH20—，CH3NHCH2CH20—。9.如權(quán)利要求1—8任一項(xiàng)所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病的藥物或制劑中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是，所述疾病為肺癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤的任一種或多種。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任一種正義鏈5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUUGCCCUC-3’，反義鏈5’-GAGGGCAAUGAGGACAUAACCAGCC-3’；正義鏈5’-CAAGCAACAUGGUCAGUUUUCUCUU-3’，反義鏈5’-AAGAGAAAACUGACCAUGUUGCUUG-3’；正義鏈5’-GCUGGAUGAUAGACGCAGAUAGUCG-3’，反義鏈5’-CGACUAUCUGCGUCUAUCAUCCAGC-3’；或上述三對(duì)核苷酸序列的任一對(duì)正義鏈的3’末端、反義鏈中5’末端對(duì)應(yīng)缺失1-6個(gè)堿基的雙鏈RNA分子。本發(fā)明所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA為制備預(yù)防或治療人類表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病的藥物或制劑提供了新的，較好的選擇。文檔編號(hào)A61P35/00GK101353656SQ20081002971公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者張必良,艷李申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院