專利名稱：減毒腸毒素c2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種減毒腸毒素C2超抗原突變 蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen， SAg)是一組由細(xì)菌或病毒編碼的，并在極低濃 度下對人體或其他哺乳動物T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生極強免疫刺激活性的蛋白質(zhì)分 子。不像傳統(tǒng)的抗原，超抗原不需要抗原遞呈細(xì)胞的加工處理，在抗原遞 呈細(xì)胞外側(cè)的抗原結(jié)合區(qū)與MHC II(組織相容性復(fù)合物)分子和T細(xì)胞V(3區(qū) 結(jié)合形成復(fù)合物，從而激發(fā)大量的T淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致在體外或體 內(nèi)釋放產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和其它效應(yīng)分子。正因為超級抗原存在這種特 殊的生物活性和作用機理，所以致使其可以作為一種臨床上的免疫調(diào)節(jié)劑 和抗腫瘤藥物，用于表達(dá)MHC II分子的腫瘤治療。
金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2) 是一類具有代表性的微生物外毒素。由于其極強的T細(xì)胞激活功能，成為 一類典型微生物超抗原，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。但是，由于腸毒素 C2超抗原的作用必須依賴于與免疫系統(tǒng)中的MHC II分子相結(jié)合，這必然 會導(dǎo)致其在人體中可能與來自正常組織或細(xì)胞的MHCII分子的結(jié)合，從而
對正常細(xì)胞也產(chǎn)生一定的毒性作用；此外，由于金黃色葡萄球菌腸毒素是 一種細(xì)菌外毒素，因此在對人體會產(chǎn)生一定的毒素綜合癥(TSS)和食物中毒 癥狀，并在臨床上表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、以及致熱等癥狀，因此限制了其臨 床應(yīng)用和治療可得效果。
因此，為減少腸毒素C2作為細(xì)菌外毒素所帶來的邊際效應(yīng)和對人體的 毒副作用，進(jìn)而提高腸毒素C2在未來抗腫瘤方面的開發(fā)潛力，本發(fā)明通過 基因定點突變技術(shù)對SEC2中與毒性相關(guān)的位點進(jìn)行突變，從而達(dá)到減毒的 目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法 和應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白 具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15中堿基序列。
所述減毒腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 16中氨基酸序列。
減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F: 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和sec2 (C93A)-R: 5' -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3， ； sec2 (C93A) -F: 5， -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA -3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物,釆用上 述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有 序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ' 和 sec2 (D83A)-R: 5，-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ' ; sec2 (D83A)-F: 5，-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3，和sec2-R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突 變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2_F和sec2-R為引物，釆 用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得 具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3， 和sec2(H47A)-R: 5， - GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3' ; sec2 (H47A)-F: 5， -TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'分別擴增獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述 獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序 列表SEQ ID NO: 5中堿基序列sec2 (H47A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組MA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3， 和sec2 (H118A)-R: 5， -GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3， ； sec2 (H118A)-F: 5， -GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上 述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有 序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2(H118A)突變基因；
以具有序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因為模板， 釆用引物對 sec2-F: 5 ， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和 sec2(C93A/C110A)-R: 5 ， - CCTCCATACATAG CAGTTTTACCAC-3 ，； sec2(C93A/C110A)-F: 5， -TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 9中堿基序列sec2(C93A/C110A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3'和sec2 (H122A)-R: 5， -CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3，； sec2 (H122A)-F: 5，-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3，和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè) 的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 11中堿基序列sec2(H122A)突變基因；
以SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2 (H118A)突變基因為模板，采用引物對 sec2-F: 5， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H118A/H122A) -R: 5， -CCATTATCAAAGGCG TTTCCTTC-3 ， ； sec2(H118A/H122A)-F: 5 ， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC- 3 ' 和 sec2-R: 5 ' -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因；
以序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因為模 板，釆用引物對sec2-F: 5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H47A) -R: 5'-GTTATAAATTAAATCTGCTGCCAAA-3 ， ； sec2 (H47A)-F:
5'-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC -3， 和 sec2-R:
5'-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 15中堿基序列sec2(H47A/H118A/H122A)突變基因；
而后將具有序列表SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15 +堿 基序列中的堿基序列分別克隆入表達(dá)載體pET-28a,以大腸桿菌BL21(DE3) 為宿主菌，分別構(gòu)建成異源表達(dá)減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng) 誘導(dǎo)后在培養(yǎng)基中異源表達(dá)得具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16中氨基酸序列中的堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白。
所述的誘導(dǎo)方法是通過以IPTG為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。所述將所得 蛋白分離純化的純蛋白。所述離純化方法為Ni親和層析法，所用的介質(zhì)為 瓊脂糖凝膠樹脂。
減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的應(yīng)用具有序列表SEQIDNO:l、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID N0:13或SEQ ID NO: 15中堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白可 作為抗腫瘤免疫的藥物或作為防止催吐、腹瀉的藥物。 本發(fā)明所具有如下優(yōu)點1. 本發(fā)明為人工構(gòu)建的系列編碼超抗原突變蛋白的核苷酸序列，獲知 其基因全序列的組成。
2. 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，突變構(gòu)建了一系列編碼減毒超抗原突變 蛋白的核苦酸基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)獲得的一系列超抗原突變 蛋白經(jīng)檢驗具有超抗原活性(如圖3和圖4所示)。
3. 本發(fā)明構(gòu)建并獲得的系列超抗原突變蛋白由于顯著降低了其催吐、 腹瀉活性，因此更適合用于將來的臨床免疫治療；此外突變位點還涉及到
畫C II結(jié)合區(qū)，因此降低了其對人體表達(dá)MHC II分子的正常組織的毒性，
從而降低了其對人體的毒副作用。
4. 本發(fā)明提供的表達(dá)及制備大量減毒超抗原腸毒素C2突變蛋白的方法 能使該系列蛋白達(dá)到高效表達(dá)及純化，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
5. 本發(fā)明通過基因工程技術(shù)對野生型SEC2進(jìn)行定點改造，并結(jié)合細(xì)胞
生物學(xué)實驗和體內(nèi)動物試驗篩選獲得具有超抗原活性，并且毒性作用降低 的腸毒素C2突變蛋白，使其有可能開發(fā)為一種新的臨床抗腫瘤藥物。


圖l為本發(fā)明野生型SEC2和八種腸毒素C2突變蛋白基因的PCR產(chǎn)物核 酸電泳圖譜(其中M代表DL2000 marker, 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9依 次代表野生型SEC2基因和序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15八種突變基因的PCR產(chǎn)物)。
圖2為本發(fā)明野生型SEC2和八種突變蛋白基因編碼蛋白純品的電泳圖 譜(其中M代表蛋白marker, 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9依次代表野生型 SEC2和具有序列表SEQ IDNO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16序歹'J
的八種編碼蛋白)。
圖3為本發(fā)明八種超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的超抗原活性檢 測實驗結(jié)果圖(其中圖3.A為與二硫環(huán)相關(guān)的兩種突變蛋白SEC2(C93A)和 SEC2(C93A/C110A)與野生型SEC2刺激小鼠T淋巴細(xì)胞結(jié)果比較圖(其中橫
坐標(biāo)為本發(fā)明活性檢測中超抗原突變蛋白的檢測劑量，縱坐標(biāo)為增值指 數(shù))；其中圖3.B為與MHC II分子結(jié)合相關(guān)的六種突變蛋白SEC2 (H47A)、 SEC2(D83A) 、 SEC2(H118A) 、 SEC2(H122A) 、 SEC2 (H118A/H122A)、 SEC2 (H47A/H118A/H122A)與野生型SEC2刺激小鼠T淋巴細(xì)胞結(jié)果比較圖(其 中橫坐標(biāo)為本發(fā)明活性檢測中超抗原突變蛋白的檢測劑量，縱坐標(biāo)為增值 指數(shù)。))。
圖4為本發(fā)明八種超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的抑瘤活性檢測 結(jié)果圖。(其中縱坐標(biāo)為陰性對照牛血清白蛋白(BSA)、系列突變蛋白和陽 性對照SEC2;橫坐標(biāo)為抑瘤率。)。
圖5A和B為本發(fā)明超抗原SEC2突變蛋白基因編碼蛋白的抑瘤活性檢測結(jié)果圖。
具體實施方式
實施例l
具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15 "^堿基序列 的八種減毒超抗原突變蛋白基因序列和具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQIDN0:16氨基酸序列的八種減毒超抗原突變蛋白基(參見序列 表)
具有序列表SEQ ID NO:l堿基序列的超抗原突變蛋白基因 001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtacg
101 cagcaactaa
151 tataacatta
201 gttattaaat
251 tgtatggatc
301 gtaggtaaag
351 axatgaagga
401 gagtttatga
451 aagaaaagtg
501 aattaata^ia
551 g"atataaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
701 ttacaacaaa
atgggtaata agttatgtct gtgataaaaa gaagatttag aaattactat ttacaggtgg aaccactttg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggUg
tgaaatattt gtagataaat actaaaaaat caaagaagta gtaaacgcct taaaacttgt ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aata^cggca gtttgaccaa attctaaaag
atatgatgat ttttggcaca tatgacaaag caaagatgaa atttttcatc "gtatggag cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactUttg tctaaatatt tgtgaagata
cattatgtat tgatttaatt tgaaaacaga gtagttgatg caaagataat gaataacaaa gtact tataa gcaaactgat ggaatttUt tatgaaaxag gtatgatatg taatgatgta gaagtccEicc
gaatgga
SEQ ID NO. 1的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度717堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型c腿
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(&a*2ococcus aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 3堿基序列的超抗原突變蛋白基因
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt 051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat101 cagcaactaa
151 tataacatta
201 gttattaaat
251 tgtatggatc
301 gtaggtaaag
351 acatgaagga
401 gagtttatga
451 aagaaaagtg
501 aattaataaa
551 gatatataaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
701 ttacaacaaa
agttatgtct gtgataaaaa gaagatttag aaattactat tt編ggtgg aaccact t tg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggttg
gtagataaat actaaaaaat caaagaagta gtaaactgct taaaacttgt ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
ttttggcaca tatgacaaag caaagatgaa atttttcatc atgtatggag cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactttttg tctaaatatt tgtgaag由
tgatttaatt tgaaaacaga gtagttgctg caaagataat gaataacaaa gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatgatatg taatgatgta gaagtccacc
ga"gga
SEQ ID NO. 3的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度717堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S帥A一coccus紐eus ) 具有序列表SEQ ID N0:5堿基序列的超抗原突變蛋白基因
001 gagagtcaac
051 tactggtacg
101 cagcaactaa
151 tataacatta
201 gttattaaat
251 tgtatggatc
301 gtaggtaaag
351 acatgaagga
401 gagttUtga
451 aagaaaagtg
501 aattaataaa
551 gatatataaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
cagaccctac atgggtaata agttatgtct gtgataaaaa gaagatttag aaattactat ttacaggtgg aaccactt tg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggttg
gccagatgag tgaaatattt gtagataaat taaaaaa t caaagaagta gtaaactgct taaaact tgt ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagt t taa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
Ugcacaaat atatgatgat ttttggcagc tatgacaaag caaagatgaa atttttcatc atgtatggag ct tacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagt tcacca atactttttg tctaaatatt tgtgaagata
caagtgagtt cattatgtat agatttaatt tgaaaacaga gUgttgatg caaagataat gaataacaaa gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gUtgatatg taatgatgta gaagtccacc701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID N0.5的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度 *類型 *鏈型
717堿基對 核酸 雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S帥/2一coccl;s證譜) 具有序列表SEQ ID N0:7堿基序列的超抗原突變蛋白基因
001 gagagtcaac
051 tactggtacg
101 cagcaactaa
151 tataacatta
201 gttattaaat
251 tgtatggatc
301 gtaggtaaag
351 agctgaagga
401 gagtttatga
451 aagaaaagtg
501 aattaataaa
551 gatat"aaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
701 ttacaacaaa SEQ ID NO
cagaccctac atgggtaata agttatgtct gtgataaaaa gaagatttag aaattactat ttacaggtgg aaccactttg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggttg gaatgga 7的信息(4 序列特征
gccagatgag tgaaatattt gtagataaat actaaaaaat caaagaagta gtaaactgct taaaacttgt ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
^見序列表)
ttgcacaaat atatgatgat ttttggcaca tatgacaaag caaagatgaa atttttcatc atgtatggag cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactttttg tctaaatatt tgtgaagata
caagtgagtt cattatgtat tgatttaatt tgaaaacaga gUgttgatg caaagataat gaataacaaa gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatgatatg taatgatgta gaagtccacc
*長度717堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S帥/]一coc譜紐ei/s) 具有序列表SEQ ID N0:9堿基序列的超抗原突變蛋白基因001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgaxaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg 251 tgtatggatc aaattactat gtaaacgcct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaactgct atgtatggag gaataacaaa
351 acatgaagga
401 gagtttatga
451 aagaaaagtg
501 aattaataaa
551 gatatataaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
701 ttacaacaaa SEQ ID NO
aaccactttg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt "ttattgaa caggcgataa aaaacggttg gaatgga 9的信息U 序列特征
"aatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
^見序列表)
cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactttttg tctaaatatt tgtgaagata
gtaxttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatgatatg taatgatgta gaagtccacc
*長度717堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stapi3Wococcus aureus) 具有序列表SEQ ID NO:ll堿基序列的超抗原突變蛋白基因
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt
051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat
101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt
151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga
201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg 251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat
301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 acatgaagga aacgcctUg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa
401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
451 aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501 aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag
551 gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta 651 caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc 701 ttacaacaaa gaatgga
SEQ ID NO. 11的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度717堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Sta*2ococctiS紐eus) 具有序列表SEQ ID N0:13堿基序列的超抗原突變蛋白基因
001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt 051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat 101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt 151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga 201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg 251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
ataatgggaa cttacaaaat aacacaattt cttttgaagt agaactagac ataaaagcta atgagtttaa cagttcacca aataacggca "actttttg gtttgaccaa tctaaatatt attctaaaag tgtgaagata
351 agctgaagga 401 gagtttatga 451 aagaaaagtg 501 aattaataaa 551 gatatataaa 601 atgcctgcac 651 caacgacaat 701 ttacaacaaa gaatgga SEQ ID NO. 13的信息( (a)序列特征
aacgcctttg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggttg
gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatg""g taatgatgta gaagtccacc
二見序列表)
長度 類型 鏈型
717堿基對
核酸
雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Sta*Jococcus aureus) 具有序列表SEQ ID N0:15堿基序列的超抗原突變蛋白基因 001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt 051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat 101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcagc agatttaatt 151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga 201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg 251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa
351 agctgaagga aacgcctttg 401 gagtttatga aa"aaaaga 451 aagaaaagtg taacagctca 501 aattaataaa aaaaatttgt 551 gatatataaa atttattgaa 601 atgcctgcac caggcgataa 651 caacgacaat aaaacggttg 701 ttacaacaaa gaatgga SEQ ID NO. 15的信息( (a)序列特征
ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
參見序列表)
cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactttttg tctaaatatt tgtgaagata
gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatgatatg taatgatgta gaagtccacc
長度 類型 鏈型
(b)
(c)
(d)
(e)
717堿基對 核酸 雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 分子類型cDNA 假設(shè)否 反義否
最初來源金黃色葡萄球菌(S"pi2y7ococcus aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16中氨
基酸序列的八種減毒超抗原突變蛋白基因編碼蛋白
具有序列表SEQ ID NO:2氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白 001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde 101 vgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki SEQ ID N0.2的信息(參見序列表) (a)序列特征:
vvdvygsnyy vnayfsskdn vlirvyenkr ntisfevqtd yetgyikfie nngntfwydm evhlttkng*長度239個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(^api]y2ococcus aureus) 具有序列表SEQ ID N0:4氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvavygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skyl隱yndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 4的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Sz;a由2ococcLis aureus) 具有序列表SEQ ID N0:6氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflaadli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID N0.6的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(^api3:^ococcus aureus) 具有序列表SEQ ID N0:8氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkaeg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 8的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
具有序列表SEQ ID NO: 10氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白: 001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vnayfsskdn 101 vgkvtggkta myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
SEQ ID NO. IO的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(^ap/]yiococc"s aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 12氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkheg nafdngnlqii vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 12的信息(參見序列表) (a)序列特征 ' *長度239個氨基酸 *類型肽鏈*鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S"pi3y7ococci7S aureus) 具有序列表SEQIDN0:14氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 14的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Wapi^kcocciis aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 16氨基酸序列的超抗原突變蛋白基因編碼蛋白:
001 esqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkflaadli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie rmgntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 16的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度239個氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
(b) 分子類型成熟肽鏈 (c )假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stapi^iococcus aureus) 實施例2
減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法 ①金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37'C搖床過夜培 養(yǎng)，取l. 5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基 因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D. D.穆爾， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美 國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 )。
②PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件
分別設(shè)計合成PCR引物用來擴增八種超抗原突變蛋白基因片斷，以金 黃色葡萄球菌基因組DNA為模板；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和sec2 (C93A) -R: 5' -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3， ； sec2 (C93A)-F: 5， -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA -3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上 述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有 序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ' 和 sec2 (D83A)-R: 5，-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ' ; sec2 (D83A)-F: 5，-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3，和sec2-R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突 變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆 用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得 具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 , 和sec2 (H47A)-R: 5， - GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3， ； sec2 (H47A)-F: 5， -TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述 獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序 列表SEQ ID NO: 5中堿基序列sec2(H47A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3， 和sec2 (H118A)-R: 5， -GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3， ； sec2 (H118A)-F: 5， -GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上 述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有 序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2(H118A)突變基因；
以具有序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因為模板， 釆用引物對 sec2-F: 5 '-CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和sec2 (C93A/C110A)-R: 5 ， - CCTCCATACATAG CAGTTTTACCAC-3 ，； sec2(C93A/C110A)-F: 5， -TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左惻和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 9中堿基序列sec2(C93A/C110A)突變基因；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3'和sec2 (H122A)-R: 5， -CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3，； sec2 (H122A) -F: 5，-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3，和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3' 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè) 的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 11中堿基序列sec2(H122A)突變基因；
以SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2 (H118A)突變基因為模板,釆用引物對 sec2-F: 5， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H118A/H122A) -R: 5， -CCATTATCAAAGGCG TTTCCTTC-3 ' ; sec2(H118A/H122A)-F: 5 ' -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC- 3 ' 和 sec2-R: 5 ' -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因；
以序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因為模 板，釆用引物對sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H47A) -R: 5,-GTTATAAATTAAATCTGCTGCCAAA-3 ' ; sec2 (H47A)-F:
5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC -3， 和 sec2-R:
5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 15中堿基序列sec2(H47A/H118A/H122A)突變基因；
各基因片斷的PCR反應(yīng)體系均為IO x PfuDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液10 ja 1、dNTP 8uL、上下游引物各20pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組腿50ng、 Pfu DNA聚合酶2U，無菌超純水補齊體積至100 ju 1。
各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為
第一階段95°C, 5分鐘；
第二階段94。C， 30秒；55°C， 30秒；72°C, 90秒；共30個循環(huán)； 第三階段72。C, IO分鐘；
③SEC2八種超抗原突變蛋白基因的鑒定各片斷PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)l. 5% 瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見圖l,如圖所示，經(jīng)PCR擴增和定點突變，獲得了特異性的八種突變蛋白基因，經(jīng)電泳檢測其大小與野生SEC2基因大 小一致。進(jìn)一步的序列測定確認(rèn)突變基因構(gòu)建成功，可用于下一步表達(dá)載
體的構(gòu)建。)，分別切下大小為717bp的基因片段，按博大泰克生物技術(shù)公司 膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；回收產(chǎn)物分別與PGEM-T克隆載體連 接，構(gòu)建成八種減毒超抗原突變蛋白基因克隆載體PGEM-T- SEC2- SF.Q ID NO: 1、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 3、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 5、 pGEM-T-SEC2- SEQ ID NO: 7、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO:9、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO:11、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 13、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 15。連 接反應(yīng)按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T試劑盒使用說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5oc感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓， D.D.穆爾，J.G.塞德曼，LA.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實 驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 ),篩選 陽性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測定DNA序列。 超抗原突變蛋白的表達(dá)
1) 八種超抗原腸毒素C2突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建分別將基因克隆 載體pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 1、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 3、 pGEM-T-SEC2- SEQ ID NO: 5、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO:7、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 9、 pGEM-T-SEC2-SEQ IDNO: 11、 pGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 13、 pGEM-T-SEC2- SEQ ID NO: 15質(zhì)粒DNA以腸仏EoJ雙酶切，膠回收試劑盒分別 回收序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15 if的八種腸毒素 C2突變蛋白基因。以T4 DNA連接酶分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表 達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 1、 pET-28a- SEC2- SEQ ID NO: 3、 pET-28a- SEC2-SEQ ID NO: 5、 pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 7、 pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 9 、 pET-28a-SEC2-SEQ ID NO:11 、 pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 13、 pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 15。轉(zhuǎn)化co" BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端終止法測序鑒定正確重組克 隆。
2) 超抗原突變蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化分別接種轉(zhuǎn)化了各表達(dá)載體質(zhì) 粒的BL21 (DE3)單菌落于含50 pg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活 化培養(yǎng)，以1% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接下一級，37。C搖床培養(yǎng)至OD,為0.5， 加入終濃度1. Ommol/L的IPTG(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)， 3(TC誘導(dǎo)表達(dá)4小時。
分別離心收集菌體，并將各收集的菌體重懸于1/5體積的平衡緩沖液 (lOmM Tirs-HCl， 0. 5M NaCl, 20mM咪哇，pH7. 9 ),分別釆用Ni親和層析 柱對各目的產(chǎn)物進(jìn)行純化，即獲得具有序列表SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO:16中氨基酸序列的八種腸毒素C2減毒突變蛋白；純化時以O(shè). 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含 40mM咪唑的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最 后以洗脫緩沖液(20mMTirs-HCl,O. 5MNaCl， 250mM咪唑，.pH7. 9 )洗脫下 目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白 大小及純度(參見圖2，如圖所示，大腸桿菌BL21(DE3)重組表達(dá)菌株經(jīng)過 IPTG誘導(dǎo)，并經(jīng)Ni-親和層析柱純化后，獲得了高純度的突變蛋白，能夠滿 足進(jìn)一步的實驗需要。)。
實施例3
超抗原活性檢測
取SPF級純系小鼠Balb/c,通過頸推處死后在無菌條件下取其脾臟， 輕輕壓碎后過200目篩網(wǎng)。然后將過篩網(wǎng)后的細(xì)胞懸液在1000rpm/min轉(zhuǎn)速 下離心5min收集細(xì)胞沉淀，用5mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置5min后于 1000rpm/min離心5min。再以不含血清的1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)清 洗細(xì)胞l-2次，最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(購自Gibco公 司)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以8xl()5cells/孔加到96孔板中。分別將經(jīng)純化的各具 有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種 超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別以lng/ml、 10ng/ml、 100ng/ml 、 1000ng/ml、 10000ng/ml的終濃度加入各孔。以BSA作為陰性對照，SEC2 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)72h后，加入25ul/孔的 MTT液(購自Sigma公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h, 1500r/min離心5分鐘后棄上清培 養(yǎng)液，收集細(xì)胞，加入濃度為120ul/孔的二甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min 后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值(參見圖3，八種突變蛋白在不同 濃度范圍均能夠有效地刺激小鼠T細(xì)胞增殖。除SEC2(H118A)、 SEC2(H122A) 、 SEC2 (H118A/H122A)三種突變蛋白刺激能力與野生型SEC2 活性接近外，其他五中突變蛋白的T細(xì)胞刺激活性均有不同程度的下降， 在體外能有效刺激小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性)。
本發(fā)明所用到小鼠為SPF級BALB/c純系小鼠，是一種體內(nèi)外均無寄生 蟲和特珠病原菌的近交系小鼠，實驗結(jié)果精度高，可比性好,應(yīng)激反應(yīng)均一。
實施例4
SEC2突變蛋白的抗腫瘤活性檢測
將小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化， 用含10°/。FBS的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為5 x 105cells/mL的單細(xì)胞懸液， 然后以2. 5 x 1(Tcells/孔培養(yǎng)在96孔板。將按實施例3中方法分離獲得的 小鼠脾淋巴細(xì)胞以5 x 105cells/well加入到上述含有Hepal-6細(xì)胞的96孔 板中，使效靶比達(dá)到20: 1。然后將經(jīng)純化的各具有序列表SEQ IDN0:2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別以IOO、 1000、 10000 ng/mL的終濃度加入各孔。以BSA作為陰 性對照，SEC2野生蛋白作為陽性對照，并設(shè)腫瘤細(xì)胞對照孔、淋巴細(xì)胞自 然釋放孔、空白對照孔及調(diào)零孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，按常規(guī)條件培養(yǎng) 72h，加入20ul/孔的MTT液(購自Sigma公司),繼續(xù)培養(yǎng)4h, 1000r/min 離心收集細(xì)胞，加入120ul/孔的二甲基亞砜溶液(DMSO),溶解15min后， 酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值。腫瘤抑制瘤計算公式如下IOO-[(蛋 白實驗孔吸光值-淋巴細(xì)胞自然釋放孔吸光值)/ (腫瘤細(xì)胞對照孔吸光值-空白對照孔吸光值)]xlOO% 。實驗結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示所有突變蛋 白與陰性對照BSA相比均有顯著的抗腫瘤活性，但抗腫瘤活性有不同程度 的下降。其中SEC2(H118A) 、 SEC2(H122A) 、 SEC2 (H118A/H122A)三種突變 蛋白的抑瘤活性與野生型SEC2接近。 實施例5
以健康大白兔(體重約2. 0-2. 5 kg)作為熱源活性試驗?zāi)Ｐ?。試驗?每只兔子體溫連續(xù)保持穩(wěn)定90分鐘，且起始體溫不超過38. 6 to 39. 5 ° C 的個體方可用于進(jìn)一步的試驗。將經(jīng)純化的各具有序列表SEQIDN0:2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八種超抗原突變蛋白基因編 碼蛋白分別經(jīng)0. 22,微孔濾膜過濾除菌后，用無菌PBS溶液分別稀釋至10 pg/ml,以10|ig/kg的劑量分別通過耳緣靜脈進(jìn)行注射。通過熱源試驗測定 儀觀察每組兔子體溫在4小時以內(nèi)的變化情況，并計算溫度變化差異(A Temperature)。以野生SEC2及無菌PBS緩沖液分別作為陽性和陰性對照， 每組測試3只兔子。結(jié)果如圖5.A和B所示，顯示本發(fā)明突變蛋白的熱源 活性均有不同程度的降低，其中SEC2(H118A)和SEC2(H122A)兩種突變蛋白 在保留較高超抗原活性基礎(chǔ)上(見實施例3和4),其致熱毒性有顯著的降低。 因此具有進(jìn)一步開發(fā)低毒性超抗原SEC2的潛力。
實施例6
SEC2突變蛋白的體內(nèi)催吐活性研究
以健康幼貓(8-10周，約500g)作為催吐活性試驗?zāi)Ｐ?。將純化獲得的 腸毒素突變蛋白分'別經(jīng)0. 22pm微孔濾膜過濾除菌后，用無菌PBS溶液稀釋 至相同濃度，然后以每只貓2mg的劑量進(jìn)行腹腔注射，然后觀察6小時以 內(nèi)的反應(yīng)，并記錄期催吐及腹瀉反應(yīng)(參見表l)。試驗過程中盡量減少對 其的干擾。表1為野生型SEC2和八種SEC2點突變蛋白的體內(nèi)催吐活性試 驗。如表l所示，與野生型SEC2相比較，八種腸毒素催吐活性和腹瀉活性 均有顯著的下降，本發(fā)明構(gòu)建的突變蛋白毒性有顯著的下降。表1.幼貓腹腔注射不同SEC2突變體蛋白催吐活性比較
樣品動物數(shù)嘔吐 動物 數(shù)潛伏期(min)嘔吐 次數(shù)腹瀉 動物 數(shù)潛伏期腹瀉 次數(shù)
SEC25552， 48， 86， 72， 364,2, 1， 3,4420,化783, 4， 1
SEC2(C93A)31672m1
SEC2 (93A/110A )31156111591
SEC2(H47A)529, 102， 22132， 672
SEC2簡A)31122211571
SEC2(H122A)5215， 82， 60-一
SEC2咖8A)30315， 329， 30800—一
NS (對照)30——0—-序列表.ST25. txt
SEQUENCE LISTING 〈110〉沈陽協(xié)合集團有限公司
〈120〉減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用
<130〉
<160〉 16
<170> Patentln version 3. 1
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<212〉 隱
<213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <220〉
<221〉 CDS
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agt Ser
Gin Pro
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48
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96
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144
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192
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240
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288
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336
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384115
120
125
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432
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480
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624
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<212> PRT
〈213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
〈400〉 2
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His Lys Ser Ser Glu 15
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<212> DNA
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<220〉 <221> <222> <223〉
CDS
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48
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192
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240
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288
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336100
105
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384
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432
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480
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624
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717
〈210> 4
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<212〉 PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400〉 4
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576
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672
717
〈400〉 8
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu
1
5 10
15
Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr
20 25
30
Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val
50
55 60
Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu
65 70 75
80Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100 105 110
Gly Gly lie Thr Lys Ala Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
<210> 9
<211> 717
<212> DNA
<213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220> <221> <222> <223>
CDS (1).
(717)
<400> 9
gag agt caa cca
Glu Ser Gin Pro
1
gac cct acg cca g3t gag ttg cac aaa tea agt gag Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu 5 10. 15
48
ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr 20 25 30
96
gta tea gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45
144
tta att tat aac att agt gat aaa aaa eta aaa aat tat gac aaa gtg 192 Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val50
55
60
Lys Thr 65
gag Glu
tta tta aa/t Leu Leu Asn 70
gaa gat Glu Asp
tta gca aag Leu Ala Lys 75
犯g tac Lys Tyr
犯s Lys
gat Asp
g犯 Glu 80
240
gta gtt gat gtg tat gga tea aat tac tat gta aac gcc tat ttt tea Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Ala Tyr Phe Ser 85 90 95
288
tec aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act get atg tat 336 Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Ala Met Tyr 100 105 110
gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta 384 Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432 Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get caa g犯eta gac 480 Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
ata aaa get agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt 528 lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac 576 Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt 624 Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat 672 Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga 717 Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
<210> 10
<211> 239
<212> PRT
<213> 金黃色蔔萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 10
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr 1 5
Pro Asp Glu Leu His 10
Lys Ser Ser Glu 15
Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Uu Tyr Asp Asp His Tyr 20 25 30
Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Ala Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Ala Met Tyr 100 105 110
Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
<210〉 11
<211〉 717
<212> DNA
〈213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220> <221> <222〉 <223>
CDS (l)..
(717)
<400> 11 gag 3gt cas
Glu 1
Ser Gin Pro
gac cct acg cca gat gag ttg cac幼a tea agt gag Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu 5 10 15
48
ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr 20 25 30
96
gta tea gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp
14435
40
45
tta 3tt Leu lie 50
tat Tyr
aac att 3gt Asn lie Ser
gat Asp 55
Lys Lys
eta Leu
犯a肪t Lys Asn 60
tat Tyr
gac Asp
Lys
gtg Val
ata aaa get agg aat ttt tta att aat a犯a犯幼t ttg tat gag ttt lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
gac c犯tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
tct犯a Ser Lys 225 , 、
agt Ser
gtg aag ata Val Lys lie 230
g￡L￡L
Glu
gtc Val
cac His
ctt Leu
Thr 235
Thr
犯g Lys
aat Asn
Gly
〈210〉 12
<211> 239
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
192
240
aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca犯g aag tac aaa ga/t gaa Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
gta gtt gat gtg tat gga tea aat tac tat gta aac tgc tat ttt tea 288
Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser
85 90 95
tec aaa gat'犯t gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat 336
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100105 110
gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac gcc ttt gat aat ggg aac tta 384
Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115120 125
caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130135 140
ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get caa gaa eta gac 480
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp
145 150 155 160
528
576
624
672
717
<400> 12
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu 15 10 15
Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr 20 25 30
Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60
Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100 105 110
Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
Gin Asn Val Uu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu A印 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
<210〉 13
<211〉 717
<212> 腿
<213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220> <221〉 <222> <223>
CDS (1).
(717)
<400> 13 gag agt caa Glu Ser Gin 1
cca gac cct acg ccs gat gag ttg cac aaa tea agt gag Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu 5 10 15
48
ttt act ggt acg atg ggt 3a/t 3tg a33 tat tta tat g3t gat cat tat Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr
9620
25
30
gta tea gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45
144
tt3 att t3t 33C 3tt 3gt g3t 333 333 Ct3 a33 33t ta/t g3C gtg
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60
192
saa acs g3g tt3 ttei犯t gaa gat tta gc3 33g犯g tsc sa3 gat gaa Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
240
gta gtt gat" gtg tat gga tea aat tac tat gta aac tgc tat ttt tea Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser 85 90 95
288
tec aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100 105 110
336
gga gga ata aca aaa get gaa gga aac gcc ttt gat aat ggg aac tta Gly Gly lie Thr Lys Ala Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
384
C33 33t gt3 Ctt 3t3 3g3 gtt tat g33 33t 333 ag3 aaC 3Ca 3tt tct
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
432
ttt gaa gtg caa act gat aag a33 agt gta aca get caa gaa eta gsc Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
480
ata aaa get agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
528
aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aa/t aac Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
576
ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
624
g3C CM tCt 333 tat tt3 Eltg 3tg t3C 33C g3C 3at aa3 3Cg gtt g3t
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 , 215 220
672
tct犯3 3gt gtg aag 3t3 g犯gtc cac ctt 3C3 3C3 aag sat gga Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
717
<210> 14
<211〉 239
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400〉 14
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His 1 5 10
Lys Ser
Ser 15
Glu
Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr
20 25
30Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Uu Ala His Asp 35 40 45
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60
Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100 105 110
Gly Gly lie Thr Lys Ala Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 235
<210> 15
<211> 717
<212〉 DNA
<213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220> <221〉 <222〉 <223>
CDS
(l).. (717)
〈400〉 15
gag agt caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa tea agt gag 48 Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu15 10 15
ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr
25 ——
20
30
gta tea gca act asa gtt 3tg tct gta gat aaa ttt ttg gca gca gat Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Uu Ala Ala Asp
35
40
45
tta att tat aac att agt gat aaa aaa eta aaa etat tat gac aaa gtg Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val
50
55
60
aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu
65
70
75
80
gta gtt gat gtg tat gga tea aat tac tat gta aac tgc tat ttt tea Val Val A印Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser
85
90
95
tec aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr
100
105
110
gga gga ata aca aaa get gaa gga aac gcc ttt gat aat ggg aac tta Gly Gly lie Thr Lys Ala Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu
115
120
125
caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser
130
135
140
ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get caa gaa eta gac Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp
145
150
155
160
ata aaa get agg aat ttt tta att aat aaa a犯aat ttg tat gag ttt lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe
165
170
175
33C 3gt tC3 CC3 t3t g3a 3C3 gg3 t3t at3 333 ttt 3"tt gaa 33t 33C
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn
180
185
190
ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe
195
200
205
gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp
210
215
220
tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly
225
<210> <2U> <212> <213>
230
235
16
239
PRT
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
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〈400〉 16
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu 15 10 15Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr 20 25 30
Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala Ala Asp 35 40 45
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60
Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
Val Val A印Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr 100 105 110
Gly Gly lie Thr Lys Ala Glu Gly Asn Ala Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 120 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 185 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 230 23權(quán)利要求
1.一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白，其特征在于所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15中堿基序列。
2. —種權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白，其特征在于 所述減毒腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16 ;氨基酸序列。
3. —種按權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方 法，其特征在于以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA—3 ， 和sec2 (C93A) —R: 5， -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3' ; sec2 (C93A)-F: 5， -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA -3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上 述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有 序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和 sec2 (D83A)-R: 5'-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ' ; sec2 (D83A)-F: 5,-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3，和sec2-R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突 變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆 用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得 具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列sec2(D83A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DM為模板，釆用引物對sec2-F: 5' -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ' 和sec2(H47A)-R: 5， - GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3, ; sec2(H47A) -F: 5， -TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'分別擴增獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述 獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序 列表SEQ ID NO: 5中堿基序列sec2(H47A)突變基因；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3， 和sec2(H118A)-R: 5， -GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3， ； sec2 (H118A)-F: 5， -GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3， 和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3， 分別擴增獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2(H118A)突變基因；以具有序列表SEQ ID N0:1中堿基序列sec2(C93A)突變基因為模板， 釆用引物對 sec2-F: 5 ， —CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3 ， 和 sec2(C93A/C110A)-R: 5 ， - CCTCCATACATAG CAGTTTTACCAC-3 ，； sec2 (C93A/C110A)—F: 5， -TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5, -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3， 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 9中堿基序列sec2(C93A/C110A)突變基因；'以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物對sec2-F: 5' CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3'和sec2 (H122A)-R: 5， -CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC3， ； sec2 (H122A)-F: 5， -GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3，和sec2-R: 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3' 分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè) 的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位 點左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 11中堿基序列sec2(H122A)突變基因；以SEQ ID NO: 7中堿基序列sec2 (H118A)突變基因為模板,采用引物對 sec2-F:5， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H118A/H122A) -R: 5， -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3 ， ； sec2(H118A/H122A)-F: 5 ， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC- 3 ' 和 sec2-R:5 ' -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因；以序列表SEQ ID NO: 13中堿基序列sec2 (H118A/H122A)突變基因為模 板，釆用引物對sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和sec2 (H47A) -R: 5，-GTTATAAATTAAATCTGCTGCCAAA-3 ， ； sec2 (H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC -3' 和 sec2-R:5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，分別擴增獲得突變位點左側(cè)和右側(cè)的 重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，釆用上述獲得突變位點 左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO: 15中堿基序列sec2(H47A/H118A/H122A)突變基因；而后將具有序列表SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15 +堿 基序列中的堿基序列分別克隆入表達(dá)載體pET-28a,以大腸桿菌BL21 (DE3) 為宿主菌，分別構(gòu)建成異源表達(dá)減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng) 誘導(dǎo)后在培養(yǎng)基中異源表達(dá)得具有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16中氨基酸序列中的堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白。
4. 按權(quán)利要求3減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征 在于所述的誘導(dǎo)方法是通過以IPTG為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
5. 按權(quán)利要求3所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法， 其特征在于所述將所得蛋白分離純化的純蛋白。
6. 按權(quán)利要求5所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法， 其特征在于所述離純化方法為Ni親和層析法，所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠 樹脂。
7. —種按權(quán)利要求1所述的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白的應(yīng)用， 其特征在于具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15 +堿基序列的減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白可作為抗腫瘤免疫的藥物或作為防 止催吐、腹瀉的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15中堿基序列。以金黃色葡萄球菌DNA為模板，以引物對進(jìn)行PCR擴增，然后以sec2-F和sec2-R為引物，以獲得PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增得到突變基因，將其克隆入pET-28a，構(gòu)建減毒腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌。本發(fā)明所述突變蛋白在保持一定超抗原活性的基礎(chǔ)上，其催吐和致熱活性較野生型腸毒素C2蛋白有顯著的降低，達(dá)到了降低毒副作用的目的。
文檔編號A61P1/12GK101560248SQ20081001328
公開日2009年10月21日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者劉昌孝, 張惠文, 徐明愷, 王小剛, 艷 陳, 陳巨余 申請人:沈陽協(xié)合集團有限公司