專利名稱：Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑的制作方法
Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑 相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2006年10月31日提交的美國臨時申請?zhí)?0/855，482 的權(quán)益，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。
關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的申明
本發(fā)明在政府支持下做出并且根據(jù)國家心臟、肺和血液研究所(美 國公共衛(wèi)生部，健康和人類服務(wù)部)授予的美國國立衛(wèi)生研究院項目 HL-36573和HL-67963,政府在本發(fā)明中享有權(quán)利。
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域和工業(yè)實用性
所鑒定的肽可用作用于治療癌癥和其他疾病的治療劑和/或作為 開發(fā)更好的治療劑的促進劑，在所述疾病中，Src和Src家族激酶或 者高度升高或者在遺傳上和/或功能上被降低。這些疾病狀態(tài)包括但不 限于，白血病、前列腺癌和乳腺癌、缺血/再灌注損傷、尿毒癥心肌病、 高血壓、心臟纖維質(zhì)生成和缺乏心肌收縮力。此外，如所鑒定的肽證 實的，可能利用新發(fā)現(xiàn)的Na+/K+-ATP酶/Src受體復(fù)合體作為靶標(biāo)用 于開發(fā)新的受體激動劑和拮抗劑以及新的Src和Src家族激酶抑制劑 和激活劑。
背景技術(shù)：
強心類固醇(CTS)由一組特異結(jié)合Na+/K+-ATP酶的化學(xué)物質(zhì)組 成。它們包括植物來源的毛地黃藥物(如地高辛和烏本苷)和脊推動 物來源的糖苷配基(如蟾蜍靈和海蟾蜍靈)。最近的研究已經(jīng)將烏本 苷和海蟾蜍靈鑒定為內(nèi)源類固醇，其產(chǎn)生和分泌受到多種生理和病理 學(xué)刺激，包括人類中的血管緊張肽II和腎上腺素的調(diào)控。這些類固醇可以激活蛋白質(zhì)激酶和調(diào)控細(xì)胞生長、基因表達、細(xì)胞內(nèi)鉤和活性氧
(R0S)濃度，從而在控制腎和心血管功能、保護缺血/再灌注損傷和 刺激或抑制細(xì)胞生長中起重要作用。
Src家族激酶是52-62 kDa膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶并且它們 應(yīng)答多種細(xì)胞外配體而參與幾種酪氨酸磷酸化相關(guān)的信號通路。例如， Src含有至少三個重要的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合到聚 脯氨酸基序并且SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的酪氨酸殘基相互作用。該激酶 結(jié)構(gòu)域與核苷酸反應(yīng)并磷酸化底物。蛋白質(zhì)配體與SH3或SH2結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合可以激活Src。也報導(dǎo)結(jié)合Src的激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠調(diào) 控Src活性。
Na+/K+-ATP酶——細(xì)胞鈉泵的分子機器，屬于在進化上遠古的酶 家族，其將ATP的水解與膜離子轉(zhuǎn)運相偶聯(lián)。現(xiàn)在認(rèn)為Na+/K+-ATP 酶具有雙重功能。它不僅將Na+和K+泵穿過細(xì)胞膜，而且通過不同激 活蛋白激酶將細(xì)胞外CTS信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。
特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶與Src和Src家族激酶相互作 用形成功能性受體。烏本苷與該受體的結(jié)合激活Src，其又磷酸化多 種效應(yīng)子，導(dǎo)致不同通路(包括Ras/Raf/ERKl/2和磷脂酶C/蛋白激 酶C級聯(lián))的裝配和激活以及細(xì)胞內(nèi)Ca'+和細(xì)胞R0S產(chǎn)生的增加。這 些信號通路的激活最終導(dǎo)致心臟和腎功能的改變，刺激細(xì)胞增殖和組 織纖維質(zhì)生成，保護組織抵抗缺血/再灌注損傷和抑制癌細(xì)胞生長。這 些效應(yīng)以組織/細(xì)胞特異性方式發(fā)生。
因為Src和Src家族激酶在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，所以許
多研究人員參與尋找激酶特異性和通路特異性抑制劑。迄今為止，已 經(jīng)開發(fā)了許多抑制劑，并且它們中的多數(shù)被開發(fā)為ATP類似物，其與 ATP竟?fàn)帉@些激酶的結(jié)合，導(dǎo)致對激酶活性的抑制。然而，缺乏通 路特異性是當(dāng)前的Src抑制劑的主要缺點。因為Src和Src家族激酶
對于許多細(xì)胞功能是必須的，因此一般性抑制可以損害治療的總體益 處。過去，這已經(jīng)通過這些抑制劑在動物研究中的嚴(yán)重副作用所證實。 此外，這些抑制劑中的一些顯示出對受體酪氨酸激酶的交叉活性。強心類固醇已經(jīng)被用作治療充血性心力衰竭和其他心臟病的藥
物，因為它們增加細(xì)胞內(nèi)Ca"從而增加收縮力。然而，這些化學(xué)品不 僅激活Na+/K+-ATP酶相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，而且抑制^+/1[+-人??？ 酶的離子泵功能。后者促進了它們的臨床副作用并且限制了這些藥物 的臨床應(yīng)用。內(nèi)源強心類固醇是調(diào)控腎臟和心血管功能的激素。已知 這些激素對新發(fā)現(xiàn)的Na+/K+-ATP酶/Src的過度刺激引起高血壓并在 腎臟上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)異常細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)組織纖維質(zhì)生成。
考慮到上述問題，清楚的是本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)通路(例如， Na+/K+-ATP酶)特異性Src抑制劑或激活劑的方法，所述抑制劑或激 活劑可以用于阻斷內(nèi)源CTS激活的Src通路或者刺激Na+/K+-ATP酶相 關(guān)的Src以模擬CTS效應(yīng)而不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。此外， 需要乾向新發(fā)現(xiàn)的Na+/K+-ATP酶/Src受體復(fù)合體以開發(fā)該受體的新 型激動劑或拮抗劑，從而使得Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體的受體功能 可以;故刺激以治療疾病，如充血性心力衰竭和缺血/再灌注損傷，或者 被抑制以治療疾病，如組織纖維質(zhì)生成和癌癥。
還需要監(jiān)測31:(;與^+/"47 酶的相互作用和激酶酶促活性的測
定法，所述測定法是靈敏的、容易使用，并且適應(yīng)于高通量篩選方法。 還需要分離參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的操作上確定的配體和 最佳地鑒定一組詳盡的參與配體結(jié)合的含有模塊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的方 法。
然而，如果這種方法可以得到，這種方法將可用于分離具有任何 目的功能結(jié)構(gòu)域的功能形式的任何多肽。
此類一般性方法將具有巨大的實用性，因為可以鑒定相關(guān)蛋白的 完整家族，其中每個蛋白具有其自身形式的目的功能結(jié)構(gòu)域。此類相 關(guān)蛋白質(zhì)的知識將為我們理解多種生理學(xué)過程貢獻巨大，所述生理學(xué) 過程包括細(xì)胞生長或死亡、惡性腫瘤、腎臟/心血管功能和免疫反應(yīng)，等等。
此類方法將也促進開發(fā)更有效的具有更少副作用的治療劑、診斷 劑或預(yù)防劑。根據(jù)本發(fā)明，提供了這樣的方法。 發(fā)明概述
一方面，本文提供了調(diào)控Src及其下游信號傳導(dǎo)通路的方法，其 包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結(jié)合。
另一方面，本文提供了誘導(dǎo)烏本苷引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，其包 含Na+/K+-ATP酶/Src或Src家族激酶的復(fù)合體。
另一方面，本文提供了靶標(biāo)，其包含^+/"-ATP酶和Src或Src 家族激酶之間的相互作用位點。
另一方面，本文提供了藥物組合物，其用于調(diào)控涉及控制細(xì)胞生 長、運動性、活性氧類別(R0S)的產(chǎn)生、por-膠原合成和肌肉收縮的 多種信號傳導(dǎo)通路，所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶 抑制劑或激活劑。在一些實施方案中，該組合物包含一種或多種肽或 肽片段，其抑制或刺激Na+/K+- ATP酶的信號傳導(dǎo)功能并且不抑制 Na+/K+- ATP酶的離子泵功能。而且，在一些實施方案中，所述抑制 劑不直接與ATP竟?fàn)帯?br> 另 一方面，本文提供了包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制 劑或激活劑，其干擾Src和Na+/K+- ATP酶之間的相互作用，通過與 ATP類似物不同的機理發(fā)揮作用，并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性 的。
另一方面，本文提供了治療組合物，其包含至少一種如本文所述 的肽Src抑制劑或激活劑。
另一方面，本文提供了開發(fā)小分子的方法，所述小分子模擬肽抑 制劑或激活劑，通過與ATP類似物不同的機理發(fā)揮作用，并且是通路 (Na+/K+-ATP酶)特異性的。
另一方面，本文提供了包含^+/1^+41 酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，其介導(dǎo) 與癌細(xì)胞生長、心臟纖維質(zhì)生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒 癥心肌病有關(guān)的一種或多種信號傳導(dǎo)通路。
另一方面，本文提供了包含在Src或Na+/K+-ATP酶oc 1亞基中發(fā)現(xiàn)的功能結(jié)構(gòu)域的組合物，其中Na+/K+~ATP酶介導(dǎo)的對Src的抑制是 由于所述a亞基或其他P型ATP酶的a亞基的N結(jié)構(gòu)域和Src激酶結(jié) 構(gòu)域之間的相互作用。
另一方面，本文提供了包含ND1肽，或其片段的組合物。
另一方面，本文提供了來自ND1的肽，其足夠結(jié)合Src以及其他 Src家族激酶，包括但不限于Lyn,和抑制它們的活性。
另一方面，本文提供了來自Src激酶結(jié)構(gòu)域(KDl)或來自其他Src 家族激酶的類似結(jié)構(gòu)域的肽，其能夠與Na+/K+-ATP酶結(jié)合并通過竟?fàn)?Src的結(jié)合基序而有效激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。
另 一方面，本文提供了用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性 Src或Src家族激酶的肽。
另一方面，本文提供了包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活 劑，所述肽或其片段靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用 而不是竟?fàn)嶢TP結(jié)合，和ii)提供Src活性的通路特異性調(diào)節(jié)的區(qū)域。
另一方面，本文提供了各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制 劑和/或激活劑，所述激酶包括具有序列或其片段的激酶，其中使用也 結(jié)合該激酶結(jié)構(gòu)域的Na+/K+-ATP酶的一個或多個cx亞基開發(fā)所述序 列或其片段。
另一方面，本文提供了小分子，其包含如本文所述的同種型特異 性Src抑制劑和/或激活劑。
另一方面，本文提供了用于大規(guī)模和高通量篩選的快速篩選測定 法，其包含Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互 作用。
另一方面，本文提供了治療蛋白激酶相關(guān)的疾病狀態(tài)的方法，該 方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的至少一種如本文所述的 組合物。
另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態(tài)涉及使用Src或 Src家族激酶作為效應(yīng)物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。 另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態(tài)涉及包括Src的細(xì)胞酪氨酸激酶。
另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態(tài)包括癌癥或者腎 臟或心血管相關(guān)的疾病。
另一方面，本文提供了物質(zhì)的組合物，其包含a)具有5到50 個氨基酸長度的肽，該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序 和b)第一種可檢測的部分，其中所述第一種可檢測的部分與該肽結(jié) 合。
另一方面，本文提供了組合物，其包含

圖19B中所示的序列[SEQ ID NO l]或者基于該序列開發(fā)。
另一方面，本文提供了組合物，其包含圖20B中所示的序列[SEQ ID NO 34]或者基于該序列開發(fā)。
另一方面，本文提供了組合物，其包含圖24A中所示的肽序列[SEQ ID NO 2]或者基于該肽序列開發(fā)。
另一方面，本文提供了組合物，其包含Na+/K+-ATP酶和Src或 Src家族激酶之間相互作用的結(jié)構(gòu)信息或者基于該信息開發(fā)。
另一方面，本文提供了小分子Src抑制劑或激活劑，其被開發(fā)以 耙向Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基于該相 互作用開發(fā)。
另一方面，本文提供了 Src抑制劑或激活劑，其基于NA+/K+-ATP 酶或其他P-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發(fā)。
另一方面，本文提供了開發(fā)鑒定的Na+/K+-ATP酶/Src受體復(fù)合
體的激動劑或拮抗劑的方法。
另一方面，本文提供了組合物，其包含基于Na+/K+-ATP酶/Src
復(fù)合體開發(fā)的激動劑或拮抗劑。
另一方面，本文提供了治療組合物，其包含至少一種如本文所述
的激動劑或拮抗劑。
另 一方面，本文提供了在培養(yǎng)的細(xì)胞中操作細(xì)胞Na+/K+-ATP酶的 方法，其包括用A4 siRNA表達栽體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而降低克隆的細(xì)胞中 Na/K-ATP酶的表達。另一方面，本文提供了至少部分沉默培養(yǎng)的細(xì)胞中內(nèi)源Otl的表
達的方法，其包括用A4 siRM表達載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而降低克隆的細(xì) 胞中ocl的表達。
另 一方面，本文提供了耗盡內(nèi)源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本 苷以迫使表達轉(zhuǎn)染的化+/1(+47 酶的方法，其包括使用A4 siRNA以 沉默來自希望的物種(包括人和豬)的細(xì)胞中的al表達。
另一方面，本文提供了包含GST-NT (氨基酸殘基6-90) [SEQ ID NO 51]的表達載體。
另一方面，本文提供了包含GST-CD2(氨基酸殘基152-288 ) [SEQ ID NO 52]的表達栽體。
另一方面，本文提供了包含GST-CD3(氨基酸殘基350-785 ) [SEQ ID NO 53]的表達載體。
另一方面，本文提供了包含GST-H+ /K+-CD3 [SEQ ID NO 54]的 構(gòu)建體。
另一方面，本文提供了包含GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]的構(gòu) 建體。
另一方面，本文提供了基于siRNA的測定法，其經(jīng)配置以測定 ^+/+47 酶的量和性質(zhì)的改變對基礎(chǔ)的和烏本苷刺激的Src活性的 影響。
另一方面，本文提供了用于測定外源的/突變的cxl的信號傳導(dǎo)功 能的a 1耗盡細(xì)胞，該細(xì)胞通過用oc 1表達栽體轉(zhuǎn)染敲減(knockdown) 的細(xì)胞來制備，所述載體中A4 siRNA靶向的序列被沉默突變，其中外 源al被敲入并且al的表達被恢復(fù)，不僅總的細(xì)胞^+/"-ATP酶蛋 白，而且Na+/K+-ATP酶活性都被恢復(fù)。
當(dāng)按照附圖閱讀時，根據(jù)下面優(yōu)選實施方案的詳述，本發(fā)明的多 種目標(biāo)和優(yōu)點將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。
附圖簡述
圖IA和B. LLC-PK1細(xì)胞中Na+ZK+-ATP酶和Src之間的相互作用。圖1A.在1024 X 1024像素分辨率下，1^0~ 0細(xì)胞中^+"+-人??？ 酶(紅色)和Src (綠色)的共定位。左邊和中間的圖像分別顯示了 Na+/K+-ATP酶a 1和Src的膜定位，合并的圖像(右邊)顯示了這兩 種蛋白質(zhì)的共定位。比例尺20 |am。
圖IB. LLC-PK1細(xì)胞中EYFP-大鼠al (黃色)和Src-ECFP (青 色)之間相互作用的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析。加方框的區(qū)域 (R0I1)被光漂白并且就FRET進行分析。發(fā)明人也測量了沒有被光漂 白的環(huán)形區(qū)域(ROI 2)處的FRET。在來自6個獨立實驗的16個細(xì)胞 中進行了相同的實驗。比例尺8 pm。
圖2A-D.純化的豬腎化+/1+4??？酶(PKE)與GST-Src的結(jié)合。 將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1% Triton X-100中。以100, 000 X g 離心后，將所示量的澄清的上清液與5 |ig GST-Src在0.5% Triton X-100存在下溫育30分鐘，接著用相同緩沖液洗滌四次。
圖2A和2B.考馬斯藍染色的GST-Src和純化的Na+/K+-ATP酶 (PKE)。
圖2C.來自三個獨立實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示了用抗 Na+/K+-ATP酶a 1抗體檢測的pulldown產(chǎn)物。
圖2D.進行與C中相同的pulldown測定法并將650 ng (總輸入 的三分之一)純化的^+/"4了？酶(PKE)酶直接作為輸入對照裝載。
圖3A-C.鑒定涉及與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src結(jié)構(gòu)域
圖3A. Src結(jié)構(gòu)的圖示。
圖3B. GST-Src、 GST-SH2、 GST-SH3、 GST-SH3SH2和GST激酶的 考馬斯藍染色。
圖3C. GST-Src、 GST-SH3SH2、 GST-激酶、GST-SH2，但非GST-SH3 結(jié)構(gòu)域與Na+/K+-ATP酶的結(jié)合。純化的Na+/K+-ATP酶的等分試樣(2
Ug)用于每個結(jié)合測定法。相同的實驗重復(fù)三次。
圖4A-D.鑒定涉及與Src相互作用的Na+/K+-ATP酶結(jié)構(gòu)域
圖4A.肘+/〖+41 酶的011亞基的圖示。NT， N-末端；CD2，胞質(zhì)
結(jié)構(gòu)域2; CD3，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域3; PD,磷酸化結(jié)構(gòu)域；ND，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域；CT， C-末端。
圖4B.四個獨立實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡顯示了當(dāng)使用200 ng Src時，純化的Src(缺少前84個氨基酸)與CD3結(jié)合，但是不與al 亞基的NT結(jié)合。
圖4C.蛋白質(zhì)印跡，顯示Src被Na+/K+-ATP酶(Na/K)和 NA+/K+-ATP酶(H/K)的GST-CD3拉下(pull down)但是沒有被來自 1 mg LLC-PK1細(xì)胞裂解物的SERCA拉下。
圖4D.蛋白質(zhì)印跡，顯示了 Na+/K+-ATP酶和Src之間的結(jié)構(gòu)域 相互作用。將不同的GST-融合的Na+/K+-ATP酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體與Src 的His標(biāo)記的SH3SH2結(jié)構(gòu)域或激酶結(jié)構(gòu)域溫育，并通過蛋白質(zhì)印跡分 析pull down產(chǎn)物。
圖5A-B. Na+/K+-ATP酶和GST-CD3對Src的調(diào)控
圖5A.將所示量的純化的Na+/K+-ATP酶(PKE)與重組Src (4.5 U)在PBS中溫育30分鐘，然后加入2mMATP/Mg2+并另外溫育5分鐘。 樣品在SDS-PAGE上分離后，用如所示的抗體探測膜。*與對照相比p < 0.05; **與對照相比p < 0.01。
圖5B.將GST (100 ng)或不同量的GST-CD3與重組Src (4. 5 U) 在PBS中溫育30分鐘。如A中分析Src的磷酸化。值為至少四次獨立 實驗的平均值土 SE。 *與對照相比p < 0.05。
圖6A-C.通過烏本苷刺激Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體
圖6A.將預(yù)先形成的Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體與不同濃度的烏 本苷在2 mM ATP/Mg2+存在下處理5分鐘，并使用如所示的位點特異 性抗體分析磷酸化的Src。值為至少四次獨立實驗的平均值土 SE。 ** 與對照相比p < 0. 01。
圖6B.用10 pM烏本苷處理Src或81:(;/^+/][+"^7 酶復(fù)合體， 并測量Src活性。"與對照相比p < 0.01。
圖6C.四次實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示了烏本苷和釩酸鹽對 Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體的影響。重復(fù)與A中相似的實驗以評估釩酸 鹽(Van)或釩酸鹽加烏本普(Oua)對Src磷酸化的影響。圖7A-D.通過從Na+/K+-ATP酶釋放激酶結(jié)構(gòu)域激活Src:
圖7A.對照實驗，顯示了 Src可以與Na+ZK+-ATP酶共同沉淀。在 0.5 ml PBS中用或不用5 pg Na+/K+-ATP酶溫育的Src (4.5 U)以 100, 000 X g離心30分鐘。將沉淀重懸浮在PBS中并進行如材料和方 法中所述的磷酸化測定。作為輸入對照，將4. 5USrc直接懸浮在PBS 中并測定pY418磷酸化。** p< 0.01。
圖7B.在PBS中將Src (4. 5 U)與5 n g純化的Na+/K+-ATP酶預(yù) 溫育然后暴露于IO jLiM烏本苷15分鐘。然后通過離心收集對照處理 的和烏本苷處理的Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體，重懸浮在PBS中，并 將其進行如A中的磷酸化測定。兩個代表性蛋白質(zhì)印跡在A和B中顯 示，值為至少三次獨立實驗的平均值土 SE。 ** p< 0.01。
圖7C.四次單獨實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示了烏本苷誘導(dǎo)激 酶結(jié)構(gòu)域從Na+/K+-ATP酶的釋放。將GST-Src、 GST-SH3SH2或GST -激酶在室溫下于500 /i 1 PBS中與1 p g純化的Na+/K+- ATP酶溫 育30分鐘。然后在谷胱甘肽珠上拉下(pull down)復(fù)合體，洗滌三 次，重懸浮在500 ialPBS中，并暴露于IO pM烏本苷15分鐘。隨 后將小珠用PBS再洗滌三次，用抗-al抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析拉 下(pull down)的Na+/K+-ATP酶。
圖7D.三次獨立實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示了 GST-激酶結(jié)構(gòu) 域融合蛋白對Src的激活。將GST、 GST-SH3SH2或GST-激酶(各5 ju g)與2 p g純化的Na+/K+-ATP酶在室溫下預(yù)溫育15分鐘。然后向混 合物加入重組Src (4.5 U)溫育額外的30分鐘。通過加入2 mM ATP/ Mg2+開始磷酸化反應(yīng)并如A中測量Src pY418。
圖8A-C.烏本苷在活細(xì)胞中從Na+/K+-ATP酶解離Src激酶結(jié)構(gòu)
域
圖8A. LLC-PK1細(xì)胞中烏本苷誘導(dǎo)的FRET信號改變的代表性跡線。
圖8B.用Src-Rluc和GFP- a 1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。用Rluc-GFP 融合蛋白轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用作陽性對照，并將Rluc和GFP-Na+/K+-ATP酶共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作陰性對照。
圖8C.烏本苷處理以依賴劑量的方式降低GFP-Na+/K+-ATP酶和 Src-Rluc之間的BRET信號。值為至少四次實驗的平均值± SE。 *p< 0. 05; ** p < 0. 01。
圖9A-D.烏本苷-激活的Na+/K+-ATP酶/Src砩酸化并募集下游 效應(yīng)物；
圖9 A.用l jaM烏本苷處理LLC-PK1細(xì)胞5分鐘，并用抗-a 1抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物并分析酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。
圖9B.用100 nM烏本普處理SYF和SYF + Src細(xì)胞5分鐘并如 A中進行分析。在A和B中顯示了三次實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡。
圖9C.對Src的抑制阻斷了烏本苷誘導(dǎo)的Src向Na+/K+-ATP酶 信號復(fù)合體的募集。將LLC-PK1細(xì)胞用1 juM PP2或PP3預(yù)處理15 分鐘，然后暴露于1 |iM烏本苷5分鐘。免疫沉淀并分析細(xì)胞裂解物。 值為至少四次獨立實驗的平均值土 SE。 * p < 0.05。
圖9D.在2 mM ATP存在或不存在下，如以前所述的(Wang等人， 2004)分離胞膜窖并用100 nM烏本苷處理5分鐘。之后，胞膜窖在RIPA 緩沖液中裂解，并通過離心使裂解物澄清并用抗窖蛋白-l抗體免疫沉 淀。通過蛋白質(zhì)印跡用al、 Src、和窖蛋白-1探測免疫沉淀物。顯示 了三個獨立實驗的代表性蛋白質(zhì)印跡。
圖10.圖示顯示了所鑒定的Na+/K+-ATP酶和Src (A)之間的相 互作用和烏本苷怎樣調(diào)控^+/![+- ATP酶/Src受體復(fù)合體(B)。
圖1H-B.通過siRNA對內(nèi)源Na+/K+-ATP酶的沉默
圖11A.通過SDS-PAGE分離來自不同細(xì)胞系的總細(xì)胞裂解物(30 jug/泳道)并通過蛋白質(zhì)印跡分析Na+/K+-ATP酶的a 1亞基的表達。 顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡(見表2中的定量數(shù)據(jù))。
圖11B.混合P-ll和PY-17細(xì)胞，共同培養(yǎng)24小時，然后如"實 驗步驟"中所述的用抗-al抗體(克隆CM64. 6)免疫染色。比例尺 代表5Q nm。
圖12A-B. AAC- 19細(xì)胞中Na+/K+-ATP酶的表達。圖12A.如"實驗步驟"中所述的用表達大鼠al的載體轉(zhuǎn)染PY-17 細(xì)胞產(chǎn)生克隆AAC-19。通過SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解物(來自P-ll和 AAC-19的15 iug和來自PY-17的60 ja g )并通過蛋白質(zhì)印跡分析。 印跡首先用識別豬和大鼠al亞基的抗體oc6F探測，然后剝離，用與 大鼠ocl特異反應(yīng)的抗MSE再次探測。
圖12 B.混合P-ll和AAC-19細(xì)胞，共同培養(yǎng)24小時，然后如 "實驗步驟"中所述的用抗-al抗體(克隆C464. 6)免疫染色。比例 尺代表5G inm。
圖13.烏本苷(卯a(chǎn))對Na+/K+-ATP酶活性的濃度依賴性作用。 如"實驗步驟"中所述的從P-ll和AAC-19細(xì)胞制備全細(xì)胞裂解物并 測定^+/1^+4了？酶活性。數(shù)據(jù)顯示為對照的百分比，并且每個點表示 為四次獨立實驗的平均值± S. E.。用GraphPad軟件進行曲線擬合分析。
圖14A-C. Na+/K+-ATP酶對Src活性的調(diào)控
圖14A和14B -通過SDS-PAGE分離來自不同細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物 (30 pg/泳道)并通過抗-c-Src (B-12)或抗-Tyr(P)"8- Src抗體分 析。定量數(shù)據(jù)是來自四次獨立實驗的平均值土 S. E. 。 *，相當(dāng)于對 P-ll的p < 0, 05。
圖14C.使培養(yǎng)的P-ll和TCN23-19細(xì)胞血清饑餓12h并使用抗 -Tyr(P)418-Src抗體免疫染色。如"實驗步驟"中所述的收集圖像。 比例尺代表50 pm。
圖15 A-D.無泵的Na+/K+-ATP酶對Src活性的調(diào)控
圖15A和15B，通過SDS-PAGE分離來自不同細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物 (30 jig/泳道)并通過抗-c-Src (B-12)或抗,71:( )"8- Src抗體分 析。定量數(shù)據(jù)是來自四次獨立實驗的平均值土 S. E. 。 *，相當(dāng)于對 P-ll的；？ < 0. 05。
圖15C. PY-17細(xì)胞用空載體(模擬物)、沉默突變的野生型大鼠 ocl (AAC)或D371E突變體瞬時轉(zhuǎn)染PY-17細(xì)胞。3化后，如所述的裂 解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡分析。顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡，相同的實驗重復(fù)四次。
圖15D.用表達EYFP-融合的ot 1 D371E突變體的載體 (pEYFP-D371E)瞬時轉(zhuǎn)染TCN23-19細(xì)胞。24h后，使細(xì)胞血清饑餓12h 并使用抗-Tyr(P)"s-Src抗體免疫染色。來自代表性實驗的圖像表明 突變pEYFP-D371E的表達降低了紅色(Tyr (P) "8-Src)熒光的強度(與 綠色和附近的非綠色細(xì)胞相比)。收集四次獨立實驗中來自40個不同 顯微鏡視野的Tyr(P)"8-Src的定量數(shù)據(jù)并表示為平均值± S. E. **， p < 0.01。比例尺代表22 jnm; W/0，無。
圖16 A-B. 3^和無泵化+/"-^7 酶之間的相互作用
圖16A和16B,用Src-ECFP和EYFP-大鼠al突變體(D371E)表達 栽體共轉(zhuǎn)染TCN23-19細(xì)胞。24h后，如"實驗步驟"中所述的進行FRET 分析。將加框的R0I-1(綠色)光漂白，并分析R0I-3 (黃色)膜區(qū)域的 FRET。選擇加框的R0I-2 (紫色)并用作非漂白對照。重復(fù)實驗三次， 并分析總共20個細(xì)胞。
圖16C.如A中用沉默突變的野生型大鼠ocl (^0或大鼠ocl無 泵突變體0^7H)表達載體瞬時轉(zhuǎn)染TCN23-19細(xì)胞。36h后，制備細(xì) 胞裂解物并用單克隆的抗-Src (克隆GD11)抗體進行免疫沉淀。使用 抗-NASE抗體(對于大鼠al)或抗-c-Src ( SRC2 )抗體通過蛋白質(zhì)印 跡分析免疫沉淀物。相同的實驗重復(fù)三次，并顯示了代表性蛋白質(zhì)印 跡。/ ，免疫沉淀。
圖17A-E.通過Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶對FAK磷酸化的
調(diào)控
圖17A.使培養(yǎng)的P-11和PY-17細(xì)胞血清饑餓U小時。然后用抗 磷酸酪氨酸抗體(4G10)免疫沉淀細(xì)胞裂解物，并通過抗-FAK抗體分析 免疫沉淀物。合并的定量數(shù)據(jù)來自三個獨立的實驗。
圖17B.通過SDS-PAGE分析來自不同細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物并通過 抗-Tyr (P) 925-FAK和抗-Tyr (P) "8-Src抗體分析。剝離相同的膜并用抗 c-Src (B-12)抗體再次探測。顯示了三個獨立實驗的代表性印跡。
圖17C.通過抗-pERK1/2或抗-ERK1/2抗體分析細(xì)胞裂解物。從四個獨立實驗計算定量數(shù)據(jù)(平均值± S.E.)作為pERK/ERK的相對比 例。
圖17D.用1 nM PP2處理P-ll和PY-17細(xì)胞0， 5和2小時。通 過使用特異性抗體測量FAK和Src激活。顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡， 相同的實驗重復(fù)三次。
圖17E.用空載體(模擬物)或D371E突變體瞬時轉(zhuǎn)染PY-17細(xì)胞。 36小時后，裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并如所示用特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分 析。顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡，相同的實驗重復(fù)三次。/戶，免疫沉淀物； /A，免疫印跡。*，相對于P-ll的p < 0.05。
圖18A-D.烏本苷對Src和ERKl/2的作用
圖18A和18B.將細(xì)胞暴露于100 nM烏本苦5或15分鐘，并通 過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞裂解物(50 jag/泳道)的活性Src或活性 ERK1/2。印跡首先用抗-Tyr(P)"8-Src或抗-pERK抗體探測，然后剝 離，并再次探測總的Src或ERK1/2以確保相等上樣。
圖18 C和18D.細(xì)胞用所示濃度的烏本苷處理5分鐘，如圖18A 和18B對總的細(xì)胞裂解物分析Tyr (P) "8-Src和總的Src或pERKl/2和 總的ERK1/2。顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡和組合的定量數(shù)據(jù)。相對于 P-ll細(xì)胞的對照條件計算來自三個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)(pSrc/Src 或pERK/ERK的相對比例)(平均值士 S. E.)。*，相對于每種細(xì)胞系的 各自對照條件，；？ < 0.05， c加，對照。
圖19.與Src相互作用并抑制Src的Na+/K+-ATP酶中特定結(jié)構(gòu) 域的進一步作圖
圖19 A. ^+/1[+-入了？酶al和CD3結(jié)構(gòu)域圖解。
圖19B. ND1的氨基酸序列[SEQ ID NO 1〗
VFQANQ1.
圖19C.使用GST-標(biāo)記的a 1截短和His-Src的體外結(jié)合測定法。
圖19D.序列，顯示了 ND1肽在不同物種和Na/K-ATP酶的不同同
厶號[SEQ ID NO: 2 一 33]從Swiss Prot數(shù)據(jù)庫得到。
圖20A-C.與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中特定結(jié)構(gòu)域的進一 步作圖
圖20A. Src和它的激酶結(jié)構(gòu)域的示意性結(jié)構(gòu)。 圖20B. KDl的氨基酸序列[SEQ ID: 34]
KLRHE!.
圖20C.使用GST標(biāo)記的Src截短和純化的Na+/K+-ATP酶的體外 結(jié)合測定法。
圖21.活性測定證實NDl和KDl涉及Src的Na+/K+-ATP酶介導(dǎo) 的調(diào)控。
圖22A-B. NDl在活細(xì)胞中有效阻斷Src活性。 圖22A.用YFP-標(biāo)記的NDl、 ND和CD3瞬時轉(zhuǎn)染LLC-PKl細(xì)胞24 小時。
圖22B.來自三次獨立實驗的定量數(shù)據(jù)。* p<0.05。
圖23. YFP-ND1抑制人前列腺癌細(xì)胞(DU145)生長。
圖24.來自NDl的抑制Src的20個氨基酸的肽(P-3)的作圖。
圖24 A. P-3的肽序列[SEQ ID 2]。
圖24B.當(dāng)將純化的Src與P-3肽在37匸溫育20分鐘并加入2 mM ATP后溫育額外的5分鐘時得到的結(jié)果。
圖25.表1-人Na+/K+-ATP酶-al亞基特異性siRNA的靶標(biāo)和 寡核苷酸序列，其中通過粗體字母標(biāo)記靶序列。[SEQ ID NO. 35-"]。 (見圖25-表4)。
圖26.表2-用于不同細(xì)胞系的DNA構(gòu)建體的相對otl亞基蛋白質(zhì)
含量和組成。
圖27.表3-不同細(xì)胞系中的^+/"4了？酶活性。 圖28.肽penetratin (TAT)和antennapedia (AP)的螺旋的序列 [SEQ ID NO 47， 48]。圖29. TAT-P3和AP-P3抑制Src并阻斷DU 145細(xì)胞生長。 圖29A.顯示了TAT或AP標(biāo)記的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3) 的序列[SEQ ID NO 49， 50〗。
圖29B顯示了新肽在體外抑制Src。
圖29C顯示FITC-綴合的TAT-P3乾向細(xì)胞膜。
圖29D顯示向DU 145細(xì)胞加入TAT-P3或AP-P3抑制了細(xì)胞生長。
圖30A-B顯示了具有SEQ ID NO 1-55的表。
優(yōu)選實施方案詳述
Src和Src家族激酶是非受體酪氨酸激酶，其在涉及控制細(xì)胞生 長、運動和肌肉收縮的多種信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控中起重要作用。此外， 我們最近的研究已經(jīng)表明通過強心類固醇對Na/K-ATP酶-結(jié)合的Src 的激活保護心臟免于缺血/再灌注損失。它還抑制癌細(xì)胞生長和刺激成 纖維細(xì)胞中的膠原合成。因為Src家族激酶在許多類型的癌癥中具有 高活性，所以制藥公司對于開發(fā)特異性Src和Src家族激酶抑制劑感 興趣。多數(shù)開發(fā)的抑制劑是直接與ATP竟?fàn)幍腁TP類似物。
一方面，本發(fā)明涉及肽Src抑制劑，其包括結(jié)合并抑制Src的 Na+/K+-ATP酶。肽抑制劑不僅通過不同于ATP類似物的機理發(fā)揮作用， 而且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。從而，這些肽可以用于開發(fā) 癌癥和其他疾病的有效治療劑，在所述癌癥和其他疾病中Src或 Na+/K+-ATP酶/Src活性是異常的。此外，本發(fā)明涉及包括Src片段的 肽Src激活劑，其結(jié)合并阻止^+/"41 酶對Src的抑制。像強心類 固醇一樣，這些肽激活劑可以激活^+/"41 酶結(jié)合的Src。與強心 類固醇相比，它們不抑制血+/1(+4了？酶的泵功能。從而，這些激活劑
用于開發(fā)充血性心力衰竭、局部缺血/再灌注損失(例如，心肌梗塞) 和其中Src或^+/{[+47 酶/81^活性異常的其他疾病的有效治療劑。 強心類固醇如烏本苷激活Src，導(dǎo)致許多不同類型細(xì)胞中的蛋白 質(zhì)酪氨酸磷酸化。發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Src和Na+/K+-ATP酶通過多個 結(jié)構(gòu)域相互作用以形成功能性受體復(fù)合體。該相互作用有效保持Src處于失活狀態(tài)，表明Na+/K+-ATP酶是有效的Src抑制劑。
因為Na+/K+-ATP酶作為新發(fā)現(xiàn)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，介導(dǎo)若干信號通 路，所述通路涉及癌細(xì)胞生長、心臟纖維質(zhì)生成、缺血/再灌注損失和 尿毒癥心肌病，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶和Src之間此類 相互作用的千擾提供了這些疾病的有用的治療信息。
Src和Na+/K+-ATP酶ct 1亞基中功能結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)作圖揭示 Na+/K+-ATP酶介導(dǎo)的對Src的抑制是由于ot亞基的N結(jié)構(gòu)域，特別是 ND1肽和Src激酶結(jié)構(gòu)域，特別是KD1肽之間的相互作用。
進一步分析揭示來自ND1的20個氨基酸的肽(P-3)足夠結(jié)合并抑 制Src活性以及其他Src家族激酶，如Lyn。此外，當(dāng)細(xì)胞穿透肽(例 如，TAT或AP)附著到Src抑制性肽時，該新的肽完全能夠進入細(xì)胞 并抑制細(xì)胞Src活性。當(dāng)在前列腺癌DU 145細(xì)胞中測試時，這些標(biāo)記 的肽抑制劑有效阻斷DU145細(xì)胞增殖。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)來自Src激酶結(jié) 構(gòu)域的KD1可以結(jié)合Na+/K+-ATP酶并且通過與結(jié)合基序竟?fàn)嶴rc而有 效激活Na+/K+-ATP酶-抑制的Src。
從而，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了可用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特 異性Src或Src家族激酶的肽。此外，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了相互作用位 點(即，ct亞基的ND1和Src的Ol之間)，其可以用作開發(fā)其他肽 和小分子抑制劑或激活劑的靶標(biāo)，所述小分子抑制劑或激活劑是更有 效的、組織特異性的或者具有更高的藥效學(xué)或藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。
另一方面，所述肽代表新類別的Src抑制劑和/或激活劑。因為這 些肽靶向與^+/](+4了？酶特異相互作用而不是一般性竟?fàn)嶢TP結(jié)合的 區(qū)域，所以它們更特異并且具有與受體酪氨酸激酶更小的交叉反應(yīng)性。 此外，這些肽提供了 Src活性的通路特異性調(diào)節(jié)，從而被更狹窄(特 異)地耙向。此外，結(jié)構(gòu)-功能研究將產(chǎn)生各Src家族激酶的更有效 和特異的抑制劑/激活劑，因為每種激酶具有不同的KD1序列。因為
^+/1[+41 酶的其他01亞基也結(jié)合激酶結(jié)構(gòu)域，所以可以開發(fā)同種型
特異性Src抑制劑。最后，使用該結(jié)構(gòu)信息，現(xiàn)在可能開發(fā)具有更好 的藥效學(xué)和藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的小分子。Src抑制劑肽的基于序列的分析或者所鑒定的相互作用結(jié)構(gòu)域的 結(jié)晶可以揭示Src和Na+/K+-ATP酶之間的精確界面，這將允許開發(fā)抑 制或激活Src的新肽或小分子。使用所鑒定的相互作用(Na+/K+-ATP 酶/Src相互作用或ot亞基N結(jié)構(gòu)域/ Src激酶結(jié)構(gòu)域相互作用)，可 以開發(fā)快速篩選測定法用于大規(guī)模和高通量篩選其他的肽和小分子。 可以用遺傳方法或化學(xué)品或激素上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞的Na+/K+-ATP酶，從 而抑制或激活細(xì)胞Src或Src家族激酶。
另一方面，所發(fā)現(xiàn)的Na+/K+-ATP酶/Src受體復(fù)合體作為開發(fā)該 受體的新的激動劑和拮抗劑的乾標(biāo)。
實施例1
Src與Na+/K+-ATP酶的結(jié)合形成功能性信號傳導(dǎo)復(fù)合體 Na+/K+-ATP酶與Src相互作用從而形成功能性信號傳導(dǎo)復(fù)合物 材料和方法
從Calbiochem (San Diego， CA)得到一種Src激酶抑制劑PP2。 從New England Nuclear (Boston, MA)得到[y _32P] ATP。使用的抗 體和它們的來源如下單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(PY")、單克隆抗-Src 抗體(B12)、 山羊抗兔和山羊抗小鼠二級抗體從Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)得到。多克隆的抗-Src pY418抗體 和抗-Src pY529來自Biosource International (Camarillo， CA)。 單克隆抗His抗體來自InvUrogen (Carlsbad, CA)。純化的重組Src 和用于測定Src激酶活性的測定試劑盒、抗磷酸酪氨酸抗體和G蛋白 瓊月旨糖得自 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)。質(zhì)粒 pGFP2-C、 pRluc-N和DeepBlueC購自Biosignal Packard (Montreal, Canada)。質(zhì)粒pEYFP-Cl和pECFP-Nl購自Clontech (Palo Alto， CA)， pGEX-4T-1和pTrc-His來自Invitrogen。所有二級抗體都綴合到辣 根過氧化物酶；因此，使用化學(xué)發(fā)光對免疫反應(yīng)性帶顯色(Pierce, Rockford， IL)。谷胱甘肽珠來自 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden) 。 Optitran硝酸纖維素膜得自Schleicher & Schuel 1 (Keene，NH)。
質(zhì)粒構(gòu)建體
進行缺少SH4結(jié)構(gòu)域的雞c-Src和GST-Src突變體的制備(Ma等 人，2000)。基于豬腎^+/)(+-ATP酶cxl亞基的序列構(gòu)建GST-NT (氨 基酸殘基6-90) [SEQIDN0 51]， GST-CD2 (氨基酸殘基152-288) [SEQ ID NO 52]和GST-CD3 (氨基酸殘基350-785) [SEQ ID NO 53]表達 載體(見圖3A)。
分別基于大鼠^+/""^1 酶cDNA和大鼠心臟SERCA 2a cDNA構(gòu) 建GST-H+ /K+-CD3 [SEQ ID NO 54]和GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]。 通過從GST-Src載體切除對應(yīng)的Src cDM然后將它們插入pTrc-His A 載體產(chǎn)生His標(biāo)記的Src構(gòu)建體。通過將全長c-Src符合讀框地克隆 到pECFP-Nl或pRluc載體中構(gòu)建用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和生 物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)測定法的Src-ECFP和Src-Rluc。從 Pressley博士 (Texas Tech University)提供的表達載體切除大鼠 Na+/K+-ATP酶ocl cDNA并將其符合讀框地插入pEYFP-Cl中，并將 犬Na+/K+-ATP酶oc 1 cDNA克隆到pGFP2載體中。通過DM測序驗證 所有構(gòu)建體。
細(xì)胞制備、培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染
豬腎近端LLC-PK1、人胚腎293T細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞SYF和 SYF + Src細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, VA)并培養(yǎng) 在含有10。/。胎牛血清(FBS )和青霉素(100 U/ml) /鏈霉素(100 gg/ml) 的DMEM培養(yǎng)基中。使LLC-PH和293 T細(xì)胞血清饑餓2化，而SYF和 SYF + Src細(xì)胞培養(yǎng)在含有0. 5% FBS的培養(yǎng)基中24h并用于實驗。使 用Lipofectamine 2000，用多種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Wang等人，2004)。 除非另外指出，在轉(zhuǎn)染后24小時進行實驗。
制備Src、 ^+/1(+41 酶、GST融合的蛋白和His標(biāo)記的蛋白 如所述的(Ma等人，2000)從sf-9細(xì)胞純化沒有前85個氨基酸殘基的Src并用于最初的結(jié)合測定中以確保Src結(jié)合Na+/K+-ATP酶，但 是不結(jié)合純化的Na+/K+-ATP酶制備物中的脂類組分。在隨后的實驗 (例如，磷酸化和活性測定)中，4吏用來自Upstate Biotechnology 的純化的重組全長Src。使用Jorgensen方法(Xie等人，1996)從豬 腎外髓質(zhì)純化^+/"-ATP酶并使用具有1200到1400 ,1 Pi/mg/h 的比活性的制備物。
在我們的實驗條件下，100 juM釩酸鹽或10 juM烏本苷引起純 化的豬腎Na+/K+-ATP酶的ATP酶活性的完全抑制。GST融合蛋白或His 標(biāo)記的蛋白在大腸桿菌BL21中表達并在谷胱甘肽珠或鎳柱上純化。
免疫沉淀和GST pulldown
將細(xì)胞在含有1 %Nonidet P40、 0. 25%脫氧膽酸鈉、150mMNaCl、 1 mM EDTA、 1 mM苯甲基碌酰氟、1 mM原釩酸鈉、1 mM NaF、 10 ja g/ml抑酶肽、10 jag/ml抑酶醛肽和50mMTris-HCl (pH 7. 4)的RIPA 緩沖液中裂解。細(xì)胞裂解物通過在16,000 x g下離心U分鐘澄清， 并將上清液(l mg)用抗-al抗體免疫沉淀或者與不同的GST融合蛋 白溫育。然后通過G蛋白瓊脂糖或谷胱甘肽柱(Ma等人，2000; Haas 等人，2002)拉下(pull down)復(fù)合體并通過蛋白質(zhì)印跡分析。
Src激酶活性
使用商業(yè)試劑盒測定Src激酶活性(Haas等人，2000)。為了確定 Na+/K+-ATP酶怎樣影響Src激酶活性，將純化的Src (4. 5 U)與5 n g純化的Na+/K+-ATP酶在Src測定緩沖液中于室溫下溫育30分鐘。 之后，將對照Src或Na+/K+-ATP酶結(jié)合的Src都暴露于10 juM烏本 苷并測定Src激酶活性。在其他實驗中，通過抗-pY"8抗體測量Src pY418以指示Src激活(Ma等人，2000)。為此，將純化的Src (4. 5 U) 與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶或GST-Na+/K+ATP酶構(gòu)建體在磷酸緩 沖鹽水(PBS)中于37匸下溫育30分鐘。之后，加入2 mM ATP/Mg2+。 反應(yīng)在37T持續(xù)5分鐘并通過加入SDS樣品緩沖液終止。體外結(jié)合測定
將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1 % Triton X- 100 PBS中并以 lOO，OOOxg離心30分鐘。收集上清液用于結(jié)合測定。將GST-融合蛋 白(5 |i g)綴合在谷胱甘肽珠上并與500 nl PBS中溶解的 1^+/"4??？酶在0.5% Triton X-100存在下于室溫溫育30分鐘。用 相同緩沖液洗滌所述珠四次。結(jié)合的Na+/K+-ATP酶在10% SDS-PAGE 上分離并通過蛋白質(zhì)印跡檢測。類似地進行互換結(jié)合測定 (reciprocall binding assag),其中使用GST-Na十/K+-ATP酶構(gòu)建 體(5 iag)和缺少前85個氨基酸的純化的Src(200 ng)或者His標(biāo)記 的Src構(gòu)建體(100 ng)。為了測試天然Na+/K+-ATP酶是否結(jié)合Src， 在不存在Triton X-100的情況下下重復(fù)上面的實驗。為了制備 Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體，在不存在Triton X-100的情況下下將2-5 純化的Na+/K+-ATP酶與PBS中的4. 5 U Src (~10 ng)在室溫溫 育30分鐘。復(fù)合體直接用于所指出的實驗或者通過以100， 000 x g 離心30分鐘收集。對照實驗表明Na+ZK+ATP酶-結(jié)合的而不是游離的 Src可以通過離心共沉淀。
通過接納體光漂白進行FRET分析
使用上述pECFP-Nl和pE YFP-C1載體，將增強的青色熒光蛋白 (ECFP)融合到Src的C-末端，并且將增強的黃色熒光蛋白(EYFP)融合 到大鼠Na+/K+-ATP酶a 1亞基的N-末端。然后將Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到LLC-PK1細(xì)胞中。用ECFP/ EYFP或ECFP/EYFP-大鼠al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照。24小時后，生長在蓋玻片上的細(xì)胞用 冰冷的甲醇在-20匸下固定15分鐘并用PBS溶液洗滌兩次。然后將蓋 玻片用于用Leica DMIRE2共焦顯微鏡(Wetzlar， Germany)進行FRET 測量。456 nm處和515 nm的激光線用于激發(fā)熒光，并對于Src-ECFP 在465-509 nm和對于EYFP-大鼠ocl在530-570 nm處記錄發(fā)射強度。 選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠oc 1兩者的細(xì)胞進行FRET分析。選擇 目的膜區(qū)域(R0I1)并通過應(yīng)用100°/。強度的515-nm激光光漂白。所選的R0I1區(qū)域中在光漂白過程前后Src-ECFP和EYFP-大鼠ccl的發(fā)射 強度用于計算FRET效率。也計算非光漂白區(qū)(R0I2)的FRET效率并用 作對照。
活細(xì)胞中的FRET分析
將LLC-PK1細(xì)胞用Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1共轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)在蓋 玻片上24小時。然后將蓋玻片封固在金屬腔中并用Leica DMIRE2共 焦顯微鏡分析。用456 nm和515訓(xùn)的激光線激發(fā)焚光，并對于 Src-ECFP在465-509 nm處和對于EYFP-大鼠a 1在530-570 nm處記 錄發(fā)射強度。選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠cc 1兩者的細(xì)胞并僅僅 通過456-nm激光照射。僅僅表達Src-ECFP或EYFP-大鼠a 1的細(xì)胞用 于校正和測定激光強度以及增益和補償設(shè)置。分別在465-509 nm (FBCPP) 和530-570 nm (FEYFP)下記錄所選膜區(qū)域中Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1 的發(fā)射強度。F磨/F,的比率反映FRET效率。通過50 s記錄后，將 相同的細(xì)胞暴露于烏本普并繼續(xù)記錄所指示的時間。
BRET分析
如Lowry等人(2002)所述的進行BRET測定。簡言之，用 GFP-Na+/K+-ATP酶和Src-Rluc或如所述的其他構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后24小 時，將細(xì)胞以一式三份接種在96孔微量培養(yǎng)板中。用所示濃度的烏本 苷處理后，將細(xì)胞暴露于相等體積的含有10 jaM DeepBlue C(Rluc 的底物)的BRET分析緩沖液中。使用具有微量培養(yǎng)板發(fā)光計檢測的 Fluoroskan Ascent FL (Ubsystems， Franklin, MA)立即獲得410 nm (對于Rluc)和515 nm (對于GFP)處的發(fā)射。如下計算BRET比率 (515 nm處的發(fā)射-515 nm處的背景)/( 410 nm處的發(fā)射-410 nm處 的背景)，其中在每個實驗中通過測量非轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品的信號評估背景 信號。
共定位分析將LLC-PK1細(xì)胞在蓋玻片上培養(yǎng)24小時，用PBS快速洗滌兩次， 然后用冰冷的曱醇固定15分鐘。細(xì)胞再次用PBS洗滌并用 SignalEnhancer (Molecular Probes)封閉。兔多克隆抗-Src抗體和 單克隆抗Na+/K+ATP酶抗體在3% BSA中混合并與蓋玻片在4t:過夜溫 育。用PBS洗滌后，加入Alexa fluor 546-綴合的抗小鼠抗體和Alexa fluor 488-綴合的抗兔抗體并在室溫溫育1小時。用PBS再次洗滌蓋 玻片三次。通過546 nm處的激發(fā)和566-620 nm處的發(fā)射顯示 Na+/K+-ATP酶。通過488 nm處的激發(fā)和505-535 nm處的發(fā)射顯示 Src。為了避免兩種熒光染料之間的干擾，發(fā)明人使用了順序方法，其 特征是通過Leica共焦顯微鏡測量兩種蛋白質(zhì)的共定位，其中交替地 對細(xì)胞應(yīng)用兩種、激光光線488 nm和546 nm。用Leica Confocal Software (版本2. 5 build 1347 )進行共定位分析。
數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)以平均值± SE給出。使用學(xué)生t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，并 在p < 0. 05時認(rèn)可顯著性。
結(jié)果
Na+/K+ -ATP酶與Src的相互作用
烏本苷結(jié)合Na+/K+-ATP酶激活了幾種不同細(xì)胞系中的Src激酶。 此外，Src可以與Na+/K+-ATP酶ct 1亞基共同免疫沉淀并且烏本苷以 時間和劑量依賴性方式調(diào)控該相互作用(Haas等人，2002)。
發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為信號傳導(dǎo)的^+/"-ATP酶可以與Src相互作用形 成信號傳導(dǎo)復(fù)合體。為了證實，將LLC-PK1細(xì)胞固定并通過單克隆抗 -ocl和多克隆抗-Src抗體雙染色。Na+/K+ ATP酶ot 1和Src在 LLC-PK1細(xì)胞中的質(zhì)膜中共定位(圖IA)。
像素分析表明質(zhì)膜中25.2 ± 1. 3%的Na+A+-ATP酶與Src共定 位。在過表達Src-ECFP的293T細(xì)胞中也觀察到這兩種蛋白質(zhì)之間相 似的共定位。為了測試LLC-PK1細(xì)胞中Na+/K+-ATP酶和Src是否相互作用，發(fā)明人用Src-ECFP和EYFP-大鼠ctl轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用接納體光 漂白方案在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析。選擇大 鼠ocl用于最初的FRET實驗是因為發(fā)明人有大鼠ctl特異性抗體，因 此發(fā)明人除了檢測YFP熒光外還可以使用蛋白質(zhì)印跡證實轉(zhuǎn)染的ocl 的表達。數(shù)據(jù)表明能量從Src-ECFP轉(zhuǎn)移到EYFP-大鼠oc 1。
如圖1B中所示，EYFP-大鼠otl的光漂白導(dǎo)致Src-ECFP信號的增 強。從六次單獨實驗的共16個細(xì)胞測量的FRET效率為8. 1到18. 8 (13.2 ± 1.7)。相反，在用一對ECFP/EYFP或ECFP/EYFP-大鼠ot 1 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有檢測到FRET。這些數(shù)據(jù)表明Na+/K+-ATP酶和Src 很接近，表明LLC-PK1細(xì)胞中這兩種蛋白質(zhì)的直接相互作用。
為了得到直接結(jié)合證據(jù)，發(fā)明人首先用純化的豬腎化+/^^1 酶 (PKE)和GST-Src進行在體外結(jié)合測定。重要的是注意到純化的 Na+/K+-ATP酶是膜附著的制備物，其中ot 1和01亞基以1: 1摩爾比結(jié) 合并且占制備物中90%以上的蛋白質(zhì)含量(圖M和Jorgensen， 1974， 1988)。
如圖2C中所示，1 °/。 Triton X-100-增溶的Na+/K+-ATP酶以濃 度依賴性方式結(jié)合到GST-Src。當(dāng)在結(jié)合測定中使用0.5 jag Na+/K+-ATP酶時，檢測到顯著量的al亞基。為了定量結(jié)合，進行如 圖2D中所示的實驗。數(shù)據(jù)表明當(dāng)使用2 pg純化的化+/"41 酶時， GST-Src拉下(pull down)輸入的12 ± 2.4% (n = 3)。這些數(shù)據(jù) 提示Src和^+/1^^7 酶之間直接結(jié)合的可能性。為了控制該結(jié)合不 被Na+/K+-ATP酶的增溶誘導(dǎo)，發(fā)明人用純化的Na+/K+ATP酶不存在去 污劑的情況下進行了上述實驗，表明Na+/K+-ATP酶和GST-Src之間相 似的相互作用。為了分析Src的哪些結(jié)構(gòu)域與^+/"41 酶(關(guān)于結(jié) 構(gòu)域結(jié)構(gòu)見圖3A)相互作用，發(fā)明人表達并純化了 GST-SH2、 GST-SH3、 GST-SH3SH2和GST-激酶結(jié)構(gòu)域融合蛋白(Ma等人，2000)。使用相同 的體外結(jié)合測定，發(fā)明人觀察到純化的Na+/K+-ATP酶結(jié)合到激酶結(jié)構(gòu) 域、SH3SH2和SH2結(jié)構(gòu)域，但是不結(jié)合SH3結(jié)構(gòu)域(圖3C)。因為 GST-SH3SH2比GST-SH2拉下了更多的Na+/K+-ATP酶，所以該構(gòu)建體用于隨后的實驗中。
盡管Src或其結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體不可能通過它們與純化的酶制備物的 中間蛋白質(zhì)組分的結(jié)合拉下Na+/K+-ATP酶，但是為了排除該可能性和 鑒定Na+/K+-ATP酶的哪些結(jié)構(gòu)域涉及其與Src的相互作用，發(fā)明人制 備了 GST融合蛋白，其含有N-末端(GST-NT)、第二個胞質(zhì)環(huán)(GST-CD2)、 和連接Na+/K+-ATP酶的a 1亞基的穿膜螺旋M4和M5的大的中央環(huán) (GST-CD3;圖4A )，因為已知這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白質(zhì)相互作用。
如圖4B中所示，Src與GST-CD3和GST-CD2，但不與GST-NT相互 作用。為了進一步測試該結(jié)合是^+/""^7 酶特異的，發(fā)明人制備了 來自大鼠胃NA+/K+-ATP酶的CD3和大鼠心臟肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a (SERCA)的GST融合蛋白。數(shù)據(jù)顯示來自NA+/K+-ATP酶的GSFCD3而不 是SERCA從LLC-PK1細(xì)胞裂解物拉下Src (圖4C)。
為了對Na+/K+-ATP酶和Src之間的特異性結(jié)構(gòu)域相互作用作圖， 發(fā)明人制備了 His標(biāo)記的激酶結(jié)構(gòu)域和SH3SH2結(jié)構(gòu)域融合蛋白。使用 相同的結(jié)合測定，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GST-CD3與激酶結(jié)構(gòu)域，但不與Src的 SH3SH2結(jié)構(gòu)域相互作用。相反，CD2與SH3SH2，但不與激酶結(jié)構(gòu)域相 互作用(圖4D)?？傊厦娴慕Y(jié)果表明化+/1^^1 酶可以通過011亞 基的CD2和CD3結(jié)構(gòu)域直接與Src相互作用。
Na+/K+ATP酶對Src的調(diào)控
因為SH3SH2與調(diào)控蛋白的結(jié)合足夠激活Src，所以發(fā)明人測試了 Src與Na+/K+-ATP酶的結(jié)合是否導(dǎo)致Src激活。當(dāng)將純化的重組Src 與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶在ATP/Mg2+存在下在無去污劑的PBS 溶液中溫育時，Src在Tyr418 (pY418)處的自磷酸化(表明Src激活) 以濃度依賴性方式降低(圖5A)。因為在IOO jaM釩酸鹽(其完全抑 制Na+/K+-ATP酶對ATP的水解)存在下重復(fù)實驗時發(fā)明人觀察到相同 結(jié)果，所以Na+/K+-ATP酶對Src的影響可能是由于這兩種蛋白質(zhì)之間 的相互作用，但不是ATP的減少。為了進一步檢驗該假設(shè)，發(fā)明人測 定了 CD3對Src的作用。因為據(jù)報導(dǎo)維-奧二氏綜合征蛋白質(zhì)通過激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合抑制Src，所以發(fā)明人推斷CD3和激酶結(jié)構(gòu)域之間的相 互作用可以足夠保持Src處于無活性狀態(tài)。實際上，如圖5B中所示， GST-CD3而不是GST作為純化的Na+/K+-ATP酶發(fā)揮作用，引起了 Src pY418的劑量依賴性抑制。
因為上面的數(shù)據(jù)提示^+/1(+47 酶可以結(jié)合31"(;并保持其處于無 活性狀態(tài)，所以發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體可以構(gòu)成 烏本苷的功能復(fù)合體并且以與G蛋白偶聯(lián)的受體/G蛋白復(fù)合體相似的 方式起作用；即，烏本苷與該復(fù)合體的結(jié)合釋放捕獲的Src激酶結(jié)構(gòu) 域，導(dǎo)致Src激活和隨后下游效應(yīng)物的酪氨酸磷酸化。為了測試，發(fā) 明人將重組Src與純化的Na+/K+-ATP酶在無去污劑的PBS溶液中，在 烏本苷存在或不存在下溫育。蛋白質(zhì)印跡分析表明烏本苷的家族以劑 量依賴型方式顯著增加了 pY418 (圖6A)。
為了證實pY418的改變與Src活性相關(guān)，發(fā)明人現(xiàn)在使用通過商 業(yè)通路可獲得的激酶測定試劑盒測量的Src介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化。如 圖6B中所示，盡管^+/"47 酶保持31:(:處于無活性狀態(tài)，但是烏 本苷的加入恢復(fù)了激酶活性。發(fā)明人還確定了釩酸鹽是否影響該 ^+/"4??？酶/31:(;復(fù)合體的活性。如圖6C中所示，盡管10-100 juM 釩酸鹽完全抑制了 ATP酶活性，但是其對SrcpY418沒有顯示出影響。 更重要的是，烏本苷仍然能夠在釩酸鹽存在下刺激Src的pY418。
為了測試烏本苷是否通過將Src從相互作用的Na+/K+-ATP酶解離 而激活Src，發(fā)明人將Src與純化的化+/"^^ 酶溫育。因為純化的 Na+/K+-ATP酶附著到膜，所以其可以通過以100， 000 X g離心30分 鐘沉淀。當(dāng)Src結(jié)合到^+/〖+-人?。棵笗r，離心足夠沉淀Src。蛋白質(zhì) 印跡分析也表明共同沉淀的Src保持無活性狀態(tài)(圖7A)，其與圖5 中給出的發(fā)現(xiàn)相一致。因為僅僅^+/"41 酶結(jié)合的Src可以沉淀， 所以發(fā)明人推斷如果烏本苷將Src從Na+/K+-ATP酶解離，那么所回收 的Src將在烏本苷處理的樣品中減少。
令人驚奇地，當(dāng)離心前用烏本苷處理樣品后進行樣品分析時，發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)烏本苷對與Na+/K+-ATP酶共同沉淀的總Src沒有影響，而是增加了 Src pY"8的量(圖7B)。因為發(fā)明人已經(jīng)表明多種結(jié)構(gòu)域涉及 Src與Na+/K+-ATP酶的相互作用，所以上面的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致我們檢測烏本 苷是否僅僅從相互作用的^+/"4了？酶解離單個(激酶)結(jié)構(gòu)域。為 此，將1 jug純化的Na+/K+-ATP酶與GST-Src、 GST-SH3SH2或GST 激酶在無去污劑的PBS溶液中溫育，并通過離心收集復(fù)合體。之后， 將復(fù)合體暴露于IO juM烏本苷。
如圖7C中所描繪的，烏本苷對全長Src或SH3SH2結(jié)構(gòu)域與 Na+/K+-ATP酶的結(jié)合沒有影響，而是將激酶結(jié)構(gòu)域從Na+/K+-ATP酶 解離出來，其符合圖5中給出的發(fā)現(xiàn)。烏本普對SH3SH2結(jié)構(gòu)域與 Na+/K+-ATP酶的結(jié)合沒有影響這一事實顯然解釋了為什么烏本苷沒 有改變Src與該酶的總體結(jié)合。為了進一步測試激酶結(jié)構(gòu)域的釋放是 否足夠激活Src，發(fā)明人將GST —激酶融合蛋白與Na+/K+-ATP酶預(yù)溫 育，然后加入全長Src以竟?fàn)幖っ附Y(jié)構(gòu)域結(jié)合位點。蛋白質(zhì)印跡分析 表明GST激酶，而不是GST或GST-SH3SH2顯著增加了 Src pY418 (圖 7D)?？傊@些發(fā)現(xiàn)為如下觀點提供了強烈支持烏本苷通過釋放 Src的被捕獲的激酶結(jié)構(gòu)域而激活Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體。
烏本苷激活活細(xì)胞中Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體并刺激酪氨酸激 酶磷酸化
如果烏本苷通過在活細(xì)胞中釋放激酶結(jié)構(gòu)域而激活Na+/K+-ATP 酶/Src復(fù)合體，發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為烏本苷將增加激酶結(jié)構(gòu)域和相互作用 的Na+/K+-ATP酶之間的距離，因為被釋放的激酶結(jié)構(gòu)域?qū)⒔Y(jié)合并磷酸 化其效應(yīng)物。這將導(dǎo)致共表達的Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1之間FRET 信號的減弱。為了測試，發(fā)明人進行了活細(xì)胞FRET以及BRET分析。
如圖8A中所示，456 nm處ECFP的激發(fā)引起對照細(xì)胞中ECFP譜 (在465和509 nm之間檢測為FECFP )和EYFP i瞽(在530和570 nm 之間檢測為FEYFP)的發(fā)射，表明Src-ECFP和EYFP-大鼠al之間潛 在的FRET。為了測試烏本苷是否刺激激酶結(jié)構(gòu)域的釋放，將相同的細(xì) 胞暴露于烏本苷并測量ECFP和EYFP強度。如圖8A中所示， 一旦細(xì)胞 暴露于IOO mM烏本苷，那么存在F,的依賴時間的減弱和F,的同時增加，表明烏本苷引起了 Src-ECFP和EYFP-大鼠otl之間FRET的減 弱。作為對照，在用ECFP和EYFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中重復(fù)了相同的實驗， 并且沒有觀察到可檢測到的FRBT。
因為必須激發(fā)ECFP以進行FRET分析，所以在實驗期間發(fā)生光漂 白和光譜透膠，使得數(shù)據(jù)分析，特別是活細(xì)胞中的數(shù)據(jù)分析復(fù)雜化。 此外，因為烏本苷不敏感的大鼠ocl用于FRET分析，所以發(fā)明人想要 測試烏本苷敏感的otl是否類似于大鼠ocl發(fā)揮功能。因此，發(fā)明人使 用GFP犬cc 1和Src-Reni 1 la螢光素酶(Src-Rluc)進行BRET分析以確 證上面的發(fā)現(xiàn)。將兩種構(gòu)建體都瞬時轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中并將GFP-融 合Rluc的構(gòu)建體用作陽性對照。選擇人293T細(xì)胞用于BRET分析，因 為這些細(xì)胞在我們的實驗條件下更容易被瞬時轉(zhuǎn)染。
如圖8B中所示，共表達GFP-犬ocl和Src-Rluc產(chǎn)生了與陽性對 照相當(dāng)?shù)腂RET比率，表明Src與活細(xì)胞中的Na+/K+-ATP酶相互作用。 重要的是，當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞暴露于不同濃度的烏本苷時，烏本苷引起了 BRET比率的依賴劑量的降低。當(dāng)使用10nM烏本苷時檢測到顯著降低 (圖8C)。這些數(shù)據(jù)與犬otl的已知烏本苷敏感性一致并且支持圖8A 中FRET分析的結(jié)果。
蛋白質(zhì)酪氛酸磷酸化的增加對于烏本苷誘導(dǎo)的細(xì)胞功能改變是必 需的。盡管烏本苷對Src的激活導(dǎo)致Na+/K+-ATP酶結(jié)合的EGF受體和 ^-,7的反式激活，但是發(fā)明人沒有測試所鑒定的^+/1(+-ATP酶/Src
復(fù)合體的激活是否造成與所述信號傳導(dǎo)復(fù)合體結(jié)合的其他蛋白質(zhì)的烏 本苷誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化。
為了測試，將LLC-PK1細(xì)胞暴露于1 "M烏本苷5分鐘。然后將 來自對照和處理的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物用抗-al抗體免疫沉淀。當(dāng)將 免疫沉淀物在SDS-PAGE上分離并用抗磷酸酪氨酸抗體探測磷酸酪氨 酸時，發(fā)明人觀察到烏本苷實際上刺激了多種Na+/K+-ATP酶結(jié)合的蛋 白質(zhì)的酪氨酸磷酸化(圖9A)。為了證實Src是應(yīng)答烏本苷而啟動蛋白 質(zhì)酪氨酸磷酸化所需的，發(fā)明人在Src家族激酶敲除SYF細(xì)胞中重復(fù) 了相同的實驗。如圖9B中所示，烏本苷對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的作用在SYF細(xì)胞 中完全消失。另一方面，當(dāng)將Src敲回到SYF細(xì)胞(SYF + Src)中時， 烏本苷對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的作用恢復(fù)，表明Src在啟動烏本苷激 活的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化中的基本作用。這進一步受到如下事實的支 持Src抑制劑PP2能夠阻斷SYF + Src細(xì)胞中烏本苷誘導(dǎo)的蛋白質(zhì) 酪氨酸磷酸化。
因為發(fā)明人已經(jīng)表明烏本苷刺激31^向肘+"+41 酶信號傳導(dǎo)復(fù) 合體的募集，所以發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為烏本苷首先激活Na+/K+-ATP酶結(jié)合 的Src并隨后導(dǎo)致EGFR、窖蛋白-1和其他效應(yīng)物的酪氨酸磷酸化。這 些效應(yīng)物又為募集額外Src和其他信號傳導(dǎo)蛋白至該信號復(fù)合體上提 供了結(jié)合位點。
為了測試，發(fā)明人在1 |iM PP2存在或不存在下，用l jiM烏本 苷處理LLC-PK1細(xì)胞5分鐘。然后通過抗-a 1抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解 物。免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡分析表明烏本苷增加了對照細(xì)胞而不是 用PP2預(yù)處理的細(xì)胞中共沉淀的Src(圖9C)，支持了如下觀點Src 的最初激活是將額外的Src募集到復(fù)合體所必須的。對照實驗也表明 用PP3(Src抑制劑PP2的無活性類似物)預(yù)處理LLC-PK1細(xì)胞不能阻斷 烏本苷誘導(dǎo)的Src向Na+/K+-ATP酶的募集(圖9C)。
為了確證上面的發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人還用來自LLC-PK1細(xì)胞的分離的胞 膜窖制備物進行了免疫沉淀實驗。發(fā)明人以前表明烏本苷以依賴Src
的方式增加了分離的胞膜窖制備物中蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。它也刺 激了 Na+ZK+-ATP酶/窖蛋白-l /Src復(fù)合體的形成(Wang等人，2004)。 然而，因為ATP的加入是烏本苷激活分離的胞膜窖中Src所需的，發(fā) 明人認(rèn)為如果Src激活和窖蛋白-1的酪氨酸磷酸化是Src的額外募集 所需的，那么不存在ATP時，烏本苷不能刺激Src向窖蛋白-1復(fù)合體 的募集。實際上，這是當(dāng)發(fā)明人在不存在ATP時重復(fù)上述實驗時所觀 察到的(圖9D)?？傊?，這些數(shù)據(jù)清楚地表明烏本苷通過首先激活Src 然后將包括31:(;在內(nèi)的更多效應(yīng)蛋白募集到信號^+/"41 酶而通過 Na+/K+-ATP酶傳遞信號。討論
發(fā)明人現(xiàn)在顯示了涉及Na+/K+-ATP酶/Src相互作用的已作圖的 結(jié)構(gòu)域。發(fā)明人還闡明Na+/K+-ATP酶和Src可以通過所鑒定的蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)域裝配成功能信號傳導(dǎo)復(fù)合體并且烏本苷與Na+/K+-ATP酶的結(jié) 合激活Src并引起下游蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。該結(jié)論和其他結(jié)論在圖 IO和中總結(jié)并在下文討論。
作為強心類固醇受體的Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體
因為Na+/K+-ATP酶的a 1亞基在其N-末端含有保守的富含脯氨酸 的基序(Yudowski等人，2000)，所以發(fā)明人最初認(rèn)為烏本苷可能促進 Src的3113和^+/"4??？酶之間的相互作用，導(dǎo)致Src的激活。另發(fā) 明人驚奇的是，GST pull down測定法表明SH3結(jié)構(gòu)域不參與和 Na+/K+-ATP酶的直接相互作用。相反，SH2和Src的激酵結(jié)構(gòu)域分別 與Na+/K+-ATP酶oc 1亞基的CD2和CD3結(jié)構(gòu)域相互作用。此外，發(fā) 明人的結(jié)果表明Na+/K+-ATP酶和GST-CD3都抑制Src活性(圖5)。盡 管發(fā)明人不能排除與^+/1[+41 酶共同純化的其他31^調(diào)節(jié)劑涉及其 中的可能性，但是純化的CD3結(jié)構(gòu)域單獨可以模擬Na+/K+-ATP酶的作 用這一事實強烈提示Na+/K+-ATP酶足夠失活Src。
Na+/K+-ATP酶和Src形成無活性Src復(fù)合體這一事實導(dǎo)致發(fā)明人 現(xiàn)在認(rèn)為該受體復(fù)合體可以以類似于細(xì)胞因子受體的方式傳遞烏本苷 信號。盡管這些受體沒有內(nèi)在的激酶活性，但是與Src的偶聯(lián)允許它 們激活下游的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。本文描述的一些實例支持該觀點。
首先，烏本苷誘導(dǎo)的Na+/K+-ATP酶的構(gòu)象改變足夠釋放Src的激 酶結(jié)構(gòu)域(圖7)。有趣的是，SERCA的一種抑制劑，毒胡蘿卜內(nèi)酯能夠 將CD3帶到膜附近。如果烏本苷可以對CD3發(fā)揮類似效果，那么這可 以解釋烏本苷怎樣從血+/1[+41 酶釋放激酶結(jié)構(gòu)域。另一方面，因為 烏本苷對SH3SH2結(jié)構(gòu)域與CD2的結(jié)合沒有影響，所以該結(jié)構(gòu)域可以作 為鉸鏈發(fā)揮功能，保持激活的Src結(jié)合到信號Na+/K+-ATP酶用于特異性和穩(wěn)健的信號傳遞。
其次，通過加入GST-激酶結(jié)構(gòu)域融合蛋白拮抗Src激酶結(jié)構(gòu)域與 ^+/"41 酶的結(jié)合如烏本苷那樣發(fā)揮作用并且刺激了 Src pY418。
第三，所觀察到的烏本苷對Src的作用(圖6)不是由于對ATP酶 活性的抑制，因為在完全抑制ATP酶活性的濃度下，釩酸鹽沒有顯示 出對Src的作用。
此外，不水解ATP的GSTCD3也可以抑制Src激活。類似地，所述 發(fā)現(xiàn)也反對離子強度改變涉及烏本苷誘導(dǎo)的對Src的激活，因為這些 實驗在試管中在相同的離子條件下進行。
最后，F(xiàn)RET和BRET分析都表明烏本苷在活細(xì)胞中確實釋放激酶 結(jié)構(gòu)域(圖8)。重要的是注意到烏本苷對Na+/K+-ATP酶/Src-激酶 結(jié)構(gòu)域相互作用的影響是劑量依賴式的并且與烏本苷與Na+/K+-ATP 酶結(jié)合的已知的劑量反應(yīng)曲線良好相關(guān)(Haas等人，2002)。
簡言之，發(fā)明人已經(jīng)闡明烏本苷引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的機理。因 為Src家族激酶是高度保守的，所以發(fā)明人認(rèn)為信號傳導(dǎo)Na+/K+ ATP 酶可以與Src家族的其他成員相互作用。此外，哺乳動物細(xì)胞以組織 特異性方式表達至少四種不同類型的亞基，并且現(xiàn)在認(rèn)為不同的同種 型也可以以組織特異性方式與Src相互作用。至此，有趣的是注意到 Src也與NA+/K+ ATP酶的CD3結(jié)構(gòu)域相互作用(圖4C)，提示NA+/K+ ATP 酶在Src活性調(diào)節(jié)中的潛在功能。
發(fā)明人還認(rèn)為這些P-ATP酶也可以作為Src效應(yīng)物，因為最近的 研究已經(jīng)提出了這些P-ATP酶的Src介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化(Kanagawa 等人，2000; Masaki等人，2000; Ferrandi等人，2004)。
發(fā)現(xiàn)的重要性
Na+/K+-ATP酶在保持哺乳動物細(xì)胞中跨細(xì)胞膜的Na+和K+離子濃 度中的基本功能是公知的。強心類固醇的結(jié)合位點在整個真核生物種 系發(fā)生中如此保守這一事實表明這些類固醇在Na+/K+-ATP酶功能的 調(diào)控中必定起重要作用。因為直到幾年前，離子泵是^+/"41 酶的唯一已知的功能，所以本領(lǐng)域充分接受強心類固醇必定通過抑制ATP 酶活性傳遞信號，盡管沒有此類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激素先例。該作用模式已 經(jīng)導(dǎo)致本領(lǐng)域許多人質(zhì)疑內(nèi)源性強心類固醇的重要性，因為它們在正 常生理條件下以亞納摩爾濃度循環(huán)，并且僅僅可以結(jié)合到1-2%的細(xì)胞 表面Na+/K+-ATP酶。因為多數(shù)哺乳動物細(xì)胞每個細(xì)胞含有1百萬 Na+/K+-ATP酶分子，所以強心類固醇僅僅作為Na+/K+-ATP酶的泵功 能抑制劑是非常無效的，因為它們必須針對細(xì)胞的大泵能力起作用。 另 一方面，如果結(jié)合位點對于調(diào)控Na+/K+-ATP酶的信號傳導(dǎo)功能是保 守的，那么強心類固醇將作為真正的激動劑發(fā)揮功能。如通過我們的 共定位分析估計的，-25%的^+/1(+47 酶具有與Src相互作用的能力。 烏本苷對1-2%的這些受體的激活將產(chǎn)生每個細(xì)胞幾千活性分子。基于 HeLa細(xì)胞中EGF信號傳導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)和信號放大原理，這將足夠通過激酶 級聯(lián)產(chǎn)生強烈信號，特別是如杲信號傳導(dǎo)事件在膜微結(jié)構(gòu)域如胞膜窖 中發(fā)生。與這相一致的是，最近的研究已經(jīng)表明在培養(yǎng)的細(xì)胞和動物 模型中，生理學(xué)濃度(例如0.1-1 nM)的烏本苷能夠激活Src和ERK (Aydemir-Koksoy等人，2001; Ferrandi等人，2004)。
在藥理學(xué)上，發(fā)明人已經(jīng)闡明在分離的心臟制備物以及在培養(yǎng)的 肌細(xì)胞中通過激活Src和ERK完成烏本苷誘導(dǎo)的收縮力(Mohammadi等 人，2003)。此外，Src和ERK的抑制阻斷了心肌細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的烏本苷誘導(dǎo)的增加(Tian等人，2001)。
從而，本文的實施例揭示了心臟中洋地黃誘導(dǎo)的收縮力的可能的 分子機理。本文的實施例也表明這可以用于開發(fā)可以刺激Na+/K+-ATP
酶的信號傳導(dǎo)功能而不影響離子泵功能的化學(xué)品或肽。此外，本文的 發(fā)明人還提供了對所述分子機理的認(rèn)識，其中膜轉(zhuǎn)運蛋白通過所述分 子機理使用Src形成功能信號復(fù)合體。因為許多膜轉(zhuǎn)運蛋白和離子通 道與Na+/K+-ATP酶一樣經(jīng)歷底物或者配體依賴性構(gòu)象改變，所以這些 發(fā)現(xiàn)提出了關(guān)于其他膜轉(zhuǎn)運蛋白是否也涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而構(gòu)成另一組 重要的受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物的重要生物學(xué)問題。至此，發(fā)明人指出 ^+/1[+41 酶的CD3在許多不同的P型ATP酶中是高度保守的并且現(xiàn)在認(rèn)為其他P類型的ATP酶(例如，圖4C中所示的NA+/K+-ATP酶)也 涉及Src的調(diào)控。發(fā)明人也指出一些最近的報導(dǎo)表明Src與許多其他 膜離子通道相互作用并調(diào)控這些通道(Yu等人，1997; Sobko等人， 1998; Tiran等人，2003)。
實施例II
使用11酞干擾測定法對31^相互作用的^+/1[+41 酶的功能表征
^+/"47 酶和3"形成信號傳導(dǎo)受體復(fù)合體。這里，發(fā)明人現(xiàn) 在展示了 Na+/K+-ATP酶的量和性質(zhì)的改變怎樣影響基礎(chǔ)Src活性和烏 本苷誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過用表達al特異性小干擾RNA的載體轉(zhuǎn)染 LLC-PK1細(xì)胞產(chǎn)生了一些al亞基敲減細(xì)胞系。盡管otl敲減導(dǎo)致 ^+/1(+、1 酶活性的顯著降低，但是它提高了基礎(chǔ)3]^活性和一種51^ 效應(yīng)物縣著斑激酶的酪氨酸磷酸化。同時，它還消除了 Src和ERK1/2 的烏本苷誘導(dǎo)的激活。當(dāng)通過大鼠al挽救敲減的細(xì)胞時，恢復(fù)了 1^+/1^+4了？酶活性和基礎(chǔ)Src活性。此外，烏本苷能夠以高得多的濃 度刺激挽救細(xì)胞中的Src和ERK1/2,與豬和大鼠a 1之間烏本苷敏感 性的所確立的差異相一致。最后熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析和免疫共沉淀 測定表明泵缺失的大鼠al (D371E)突變體也可以結(jié)合Src。該突變體 的表達恢復(fù)了基礎(chǔ)Src活性和黏著斑激酶酪氨酸磷酸化。總之，發(fā)明 人現(xiàn)在認(rèn)為LLC-PK1細(xì)胞含有Src相互作用的Na+/K+-ATP酶庫，其不 僅調(diào)控Src活性而且作為烏本苷激活蛋白激酶的受體。
Src的激活對于許多細(xì)胞活性(包括細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)控、基因表達 和細(xì)胞生長)的烏本苷誘導(dǎo)的改變是必需的，并且發(fā)明人已經(jīng)檢查了 Na+/K+-ATP酶是否直接與Src相互作用以形成功能性信號傳導(dǎo)受體。
使用體外谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶pull down測定法，發(fā)明人現(xiàn)在鑒定 了 ^+/1[+47 酶ctl亞基的第二個和第三個細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域分別與Src SH2和激酶結(jié)構(gòu)域相互作用。在功能上，這些相互作用保持Src處于 無活性狀態(tài)，并且烏本苷與該無活性的Na+/K+-ATP酶 Src復(fù)合體的 結(jié)合釋放并隨后激活所結(jié)合的Src。這些新的實例表明細(xì)胞內(nèi)Src相互作用的化+/1[+-ATP酶現(xiàn)在被認(rèn)為在基礎(chǔ)Src活性的調(diào)控中起重要作
為了測試，發(fā)明人開發(fā)了基于siRNA的測定法，其允許我們確定 ^+/&+41 酶的量和性質(zhì)的改變對基礎(chǔ)的和烏本苷刺激的Src活性的 影響。
材料和方法
最高純度的化學(xué)品購自Sigma。 GeneSuppressor載體購自 BioCarta (San Diego， CA)。細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、 Lipofectamine 2000和P艮制酶購自Invitrogen。 EYFP表達載體 (pEYFP)和ECFP表達栽體(pECFP)來自Clontech。 QuikChange誘變試 劑盒購自Stratagene (La Jolla， CA) 。 0ptUran硝化纖維素膜來自 Schleicher & Schuell。增強的化學(xué)發(fā)光SuperSignal試劑盒購自 Pierce。 Image-iT FX信號增強劑、Ant if ade試劑盒、Alexa Fluor 488-綴合的抗小鼠/兔IgG和Alexa Fluor 546-綴合的抗小鼠/兔IgG來自 Molecular Probes (Eugene, OR)。抗-Src (克隆GDll)單克隆抗體、 抗-^+/"47 酶oc 1多克隆和單克隆(克隆"64. 6)抗體、抗磷酸酪 氨酸(克隆4G10)抗體，和G蛋白-瓊脂糖來自Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY)。 單克隆抗-Tyr (P) 418-Src 和抗 -Tyr(P) 529-Src抗體來自BIOSOURCE (Camarillo， CA)。多克隆抗-FAK 和抗-Tyr(P) 925FAK抗體來自Cell Signaling (Danvers， MA)。單克 隆抗-cxl抗體 (a6F)來自 University of Iowa的Developmental Studies Hybridoma Bank?？?c-Src (B-12)單克隆抗體、抗c-Src (SRC2)多克隆抗體、抗-ERK (C-16)多克隆抗體、抗-pERK (E-4)單 克隆抗體和所有二級辣根過氧化物酶綴合的抗體都來自Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)。多克隆大鼠al特異性抗體 (抗MSE)由Thomas Press ley博士 (Texas Tech University, Lubbock, TX)提供。細(xì)胞培養(yǎng)
LLC-PK1細(xì)胞和人胚腎293 T細(xì)胞來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 并保持在5。/flC02-濕潤培養(yǎng)箱中含有10%胎牛血清、100單位/ml青霉 素和100 )ag/ml鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中。
siRNA表達載體的構(gòu)建
使用GeneSuppressor構(gòu)建試劑盒構(gòu)建siRNA。簡言之，使用人ct 1 cDNA (GenBankTM檢索號NM-000701)作為才莫板合成四對寡核普酸 (A1-A4)(細(xì)節(jié)見表l)，并通過將兩個互補的寡核苷酸退火制備插入 片段。然后將退火的插入片段克隆入用Sail和Xbal消化的 pSuppressorTM-U6載體中。通過核苷酸測序證實陽性克隆。
位點定向誘變
Pressley博士提供了大鼠al表達載體pRc/ CMV-ocl AAC(12)。 為了使得大鼠cxl的表達對A4 siRNA不敏感，使用QuikChange誘變 試劑盒將al siRM靼向的序列從2530ggtcgtctgatcttt (GenBankTM 檢索號NM-012504)沉默突變?yōu)?530ggcaggctaatattc。產(chǎn)生Sspl (aat/att)限制酶位點以方便克隆篩選。通過DNA測序證實陽性突變體 (pRc/CMV-al AACml或縮寫為AAC)然后用于該研究中。通過用 pRc/CMV a lAACml作為模板將1126gacaag突變?yōu)?126gagaag產(chǎn)生泵 缺失的突變體(D371E) (13)。
產(chǎn)生穩(wěn)定的a1亞基敲減和敲入細(xì)胞系
<吏用Lipofectamine 2000，用不同的siRNA表達栽體以及pEYFP 瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞。48小時后，首先檢查細(xì)胞的EYFP表達用 于評估轉(zhuǎn)染效率然后收集細(xì)胞用于通過蛋白質(zhì)印跡分析內(nèi)源ocl含 量。為了產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系，用A4 siRNA表達載體(pSuppressor-A4 siRNA)(見圖25-表l)和噪呤霉素選擇標(biāo)記物(pBade-puro)轉(zhuǎn)染一批 LLC-PK1細(xì)胞。
圖25顯示了表1,人Na/KATP酶-ccl亞基特異性siRNA的靶標(biāo)和 寡核苷酸序列，其中靶序列用粗體字母標(biāo)記[SEQ ID NO. 35-46]。另一批細(xì)胞用pEYFP以及pSuppressor-A4 siRNA和pBade-puro 共轉(zhuǎn)染使得共表達的EYFP可以用作標(biāo)記物來挑選克隆。共同選擇空載 體(pSuppressor)或Al siRM-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并用作對照。轉(zhuǎn)染后24小 時用嘌呤霉素(l jug/ml)選擇細(xì)胞。克隆并擴增嘌呤霉素抗性菌落。 為了挽救^+/"41 酶敲減細(xì)胞，細(xì)胞用pRc/CMV-cxl AACml轉(zhuǎn)染。 用3 juM烏本苷啟動選擇，因為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對烏本苷非常敏感。大 約1周后，分離烏本苷抗性菌落并且在烏本苷不存在下擴增成穩(wěn)定細(xì) 胞系。不使用G418是因為這些細(xì)胞抗G418,從而需要3 mg/ml才能 殺死未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。敲減的細(xì)胞對殺稻瘟素(15 ng/ml)也是敏感 的，發(fā)明人也使用該試劑進行其他選擇。
免疫沉淀和免疫印跡分析
將細(xì)胞用PBS洗滌，溶解在修改的冰冷的放射免疫沉淀測定緩沖 液中，并進行免疫沉淀或蛋白質(zhì)印跡分析。使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑 盒檢測蛋白質(zhì)信號并使用Bio-Rad GS-670成像密度計進行定量。
Na+/K+-ATP酶活性測定
測定^+/1[+47 酶酶促活性。簡言之，用Tris-EGTA緩沖液(pH 7. 2)從培養(yǎng)物收集細(xì)胞并簡短超聲處理。然后室溫下用0.1 mg /mg 蛋白質(zhì)濃度的阿拉霹素處理細(xì)胞裂解物30分鐘。通過測定32P從 [，y-32P]ATP的最初釋放測量ATP酶活性，并在含有100 mM NaCl、 25 mMKCl、 3mMMgCl2、 lmMEGTA、 2mMATP、 5 mM Na&和50 mM Tris-HCl (pH 7. 4)的反應(yīng)混合物(1 ml)中進行反應(yīng)。Na+/K+-ATP酶活性計算為 不存在烏本苷和存在1 mM烏本苷時測量的活性之間的差異。為了測 定烏本苷濃度曲線，將阿拉霉素處理的細(xì)胞裂解物與不同濃度的烏本 苷預(yù)溫育15分鐘，然后加入ATP以開始反應(yīng)。
共焦焚光顯微術(shù)
培養(yǎng)在蓋玻片上的細(xì)胞用PBS洗滌兩次并用在-20匸預(yù)冷的甲醇 固定15分鐘。然后將固定的細(xì)胞用PBS洗滌三次并在室溫下用200 u1 Inmge-iT FX信號增強劑封閉30分鐘。再次洗滌細(xì)胞并用含有1% 牛血清白蛋白的PBS中的一級抗體在室溫下溫育1小時。用PBS洗滌 三次后，細(xì)胞用相應(yīng)的Alexa Fluor綴合的二級抗體溫育。使用Leica DMIRE2共焦顯孩i鏡(Leica， Mannheim, Germany)進行圖《象顯示。Leica 共焦軟件用于數(shù)據(jù)分析。
通過接納體光漂白進行FRET分析
將ECFP融合到Src的C末端，并將EYFP融合到大鼠Na+/K+-ATP 酶ctl或其突變體的N-末端。使用接納體光漂白方案，在用Src-ECFP 和EYFP -大鼠ctl表達載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進行FRBT分析。簡言之， 24小時培養(yǎng)后，將蓋玻片上的細(xì)胞用-20X:下預(yù)冷的甲醇固定15分鐘， 并用PBS溶液洗滌兩次。通過應(yīng)用高強度的515 nM激光將EYFP-大鼠 (xl光漂白，并在EYFP光漂白之前(Dpre)和之后(Dpost)記錄456 nM 激光激發(fā)的ECFP發(fā)射。然后通過(Dpost-Dpre) /Dpre的比率計算FRET 效率。用Src-ECFP和EYFP或EYFP-ocl和ECFP表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 用作對照，在這些對照細(xì)胞中沒有觀察到可檢測到的FRET。
數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)以平均值土 S. E給出。用學(xué)生t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，并 且在p < 0. 05時認(rèn)可顯著性。
結(jié)果
通過基于siRNA的測定法操作細(xì)胞Na+/K+-ATP酶含量 如圖25中的表1所示，選擇了共四對otl特異性siRNA。人胚腎 293T細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染測定法表明A4 siRNA的表達導(dǎo)致人al亞基表 達的超過40%的降低，而其他的導(dǎo)致0 (Al siRM)到209/。 (A2和A3 siRNA)的減弱。因為如通過共表達的EYFP所指示的，轉(zhuǎn)染效率為約 50%，所以發(fā)明人推斷A4 siRM在沉默內(nèi)源Na+ZK+-ATP酶的表達中 是有效的。因此，將LLC-PK1細(xì)胞用 A4 siRNA表達載體(pSuppres sor-A4 s iRNA)與噪呤霉素選擇標(biāo)記(pBade-puro)與或不與 pEYFP進行轉(zhuǎn)染，如"實驗步驟"中所述。兩輪選擇后，發(fā)明人收集 了 20個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。使用單克隆(a6F)抗體的蛋白質(zhì)印跡分析表明 這些克隆中al亞基的表達與用空載體(pSuppressor)轉(zhuǎn)染并選擇的 對照P-ll細(xì)胞相比顯著降低。相反，從用Al siRM轉(zhuǎn)染的LLC-PK1 細(xì)胞中得到的細(xì)胞克隆(例如Al)以與P-ll細(xì)胞中相當(dāng)?shù)乃奖磉_ otl (見圖26，表2)。
圖26顯示了表2，相對ocl亞基蛋白質(zhì)含量和用于不同細(xì)胞系中 的DNA構(gòu)建體的組成。
本文的發(fā)明人已經(jīng)擴增并進一步表征了 3種表達A4 siRNA-的克 隆。如圖11A中所示，al亞基的表達在A4-ll、 TCN23-19和PY-17 細(xì)胞中顯著降低。在這些細(xì)胞系中，通過使用共表達的EYFP作為標(biāo)記 物克隆的PY-17細(xì)胞表達最低水平的^+/"—1 酶。
圖26中的表2顯示了發(fā)明人產(chǎn)生的這些和其他細(xì)胞系中ocl相 對量的定量數(shù)據(jù)。因為使用從豬腎制備的純化的Na+/K+-ATP酶進行的 對照蛋白質(zhì)印跡表明僅僅可能進行合理的定量測定，其比較ocl的量 中小于6倍差異的兩個樣品(數(shù)據(jù)未顯示)，所以發(fā)明人通過比較A4-11 與對照P-ll，然后比較TCN23-19和PY-17與A4-11測量了這些細(xì)胞 中al的相對量。為了證實上面的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)，發(fā)明人還用不同 的抗Na+/K+-ATP酶a 1單克隆抗體(克隆C464. 6)和抗-Na十/K+-ATP 酶otl多克隆抗體探測了印跡，顯示與圖1U中基本相同的結(jié)果。此 外，當(dāng)用抗Na+/K+-ATP酶al抗體(克隆(M64. O免疫染色共培養(yǎng) 的P-ll和PY-17細(xì)胞時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)綠色PY-17細(xì)胞沒有顯示出a 1 的可檢測的表達，而對照P-ll細(xì)胞的質(zhì)膜被該抗體清楚地標(biāo)記(圖 IIB)。為了確保ocl亞基的敲減不誘導(dǎo)其他同種型的表達，發(fā)明人就 a2和ct3分析了細(xì)胞裂解物并且在上面的細(xì)胞系中沒有發(fā)現(xiàn)可檢測 到的信號。
此外，當(dāng)測量細(xì)胞裂解物中的烏本苷敏感的ATP酶活性時，與對 照P-ll細(xì)胞相比在PY-17細(xì)胞中注意到顯著(80% )降低(見圖2"7，表3)。
圖27顯示了表3，在細(xì)胞系P-11， PY-17和AAC-19中的 Na+/K+-ATP酶活性。
PY-17細(xì)胞具有非常低的內(nèi)源Na+/K+-ATP酶并且當(dāng)細(xì)胞通過敲入 內(nèi)源a 1進行挽救時，可用于研究Na+/K+-ATP酶的結(jié)構(gòu) 一 功能性質(zhì)。 為了證實，發(fā)明人首先進行了大鼠ocl cDNA的沉默突變以改變siRNA 靶向的序列。發(fā)明人然后用突變的大鼠otl表達載體(pRc/CMV al AACml)轉(zhuǎn)染PY-17細(xì)胞并產(chǎn)生了 一些穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染物?？寺AC-19的進 一步分析表明與P-ll和PY-17，不同這些細(xì)胞不像表達大鼠ctl (圖 12A)。
當(dāng)使用單克隆抗體(a6F)分析相同印跡的總ccl時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn) AAC-19細(xì)胞表達與對照P-ll細(xì)胞中相當(dāng)?shù)牧康腶l(圖12A)。通過用 抗-ctl (克隆C464. 6)抗體免疫染色共同培養(yǎng)的P-ll和AAC-19細(xì)胞 進一步證實了該結(jié)杲。如圖12B中所述，綠色AAC-19和對照P-ll細(xì) 胞顯示出質(zhì)膜中相似水平的Na+/K+-ATP酶。對照實驗也表明不存在烏 本苷時，大鼠al在該細(xì)胞系中穩(wěn)定表達至少20代。大鼠al向PY-17 細(xì)胞的功能性敲入能夠恢復(fù)^+/"41 酶活性(見圖27-表3)。而 且，它偏移了烏本苷對ATP酶活性的劑量反應(yīng)曲線，并使得挽救的細(xì) 胞對烏本苷的敏感性降低。實際上，挽救的細(xì)胞與僅僅表達ctl同種 型的大鼠細(xì)胞系的行為一樣(圖13)。重要的是注意到PY-17與對照 P-ll細(xì)胞一樣對烏本苷敏感，并且10 juM烏本苷引起Na+/K+-ATP 酶的完全抑制。
Na+/K+-ATP酶對基礎(chǔ)Src活性的調(diào)控
體外研究表明^+/1[+41 酶直接結(jié)合3]:0并保持其處于無活性狀 態(tài)。本文的發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為該調(diào)控模式在活細(xì)胞中起作用并且細(xì)胞內(nèi) 血+/1[+47 酶的降低將減小該相互作用，導(dǎo)致基礎(chǔ)Src活性升高。為 了測試，發(fā)明人測量了來自上面細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物中Src的磷酸化 (Tyr(P)418-Src)，其指示Src的激活。如圖14A中所述，內(nèi)源化+/"41 酶的敲減沒有改變總Src的表 達。然而，活性Src的水平在A4-11、 TCN23-19和PY-17細(xì)胞中顯著 降低。有趣的是，Src活性的升高似乎與這些細(xì)胞中表達的Na+/K+-ATP 酶的量反相關(guān)(圖14B)。
通過用抗-Tyr (P) 418-Src抗體免疫染色細(xì)胞進一步證實了這些 發(fā)現(xiàn)，表明TCN23-19細(xì)胞含有比P-ll細(xì)胞更多的活性Src(圖14C)。 重要的是注意到兩個對照細(xì)胞系P-ll和Al細(xì)胞之間活性Src的量沒 有差異。
為了測試當(dāng)補充Na+/K+-ATP酶時，由于Na+/K+-ATP酶的表達降 低引起的Src活性的升高是可逆轉(zhuǎn)的，發(fā)明人測定了 AAC-19細(xì)胞中總 的Src和活性Src。如圖12A-B中所示，AAC-19細(xì)胞來自大鼠oc 1-轉(zhuǎn) 染的PY-17細(xì)胞并且表達與對照P-ll細(xì)胞中相當(dāng)?shù)牧康腘a+/K+-ATP 酶。盡管大鼠a 1的敲入不改變AAC-19細(xì)胞中總的Src，但是它降低 活性Src水平至對照P-ll細(xì)胞中所看到的水平(圖15 A和15B)。
如圖27中表3所示，PY-17細(xì)胞中Na+/K+-ATP酶活性降低80% 。 當(dāng)在22^+ (0.5 juCi/ml)培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞60分鐘以完全平衡可交 換的細(xì)胞內(nèi)Na+與"Na+(15)后測量細(xì)胞內(nèi)Na+時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PY-17細(xì) 胞中穩(wěn)態(tài)細(xì)胞內(nèi)Na+約為P-11細(xì)胞中的兩倍。為了確保AAC-19細(xì)胞中 觀察到的Src活性的改變不是由于功能性Na+/K+-ATP酶的恢復(fù)和隨后 細(xì)胞內(nèi)Na+的減少，發(fā)明人測試了大鼠otl的泵缺失突變體的敲入對于 所觀察到的Na+/K+-ATP酶和Src之間的相互作用是否足夠，PY-17細(xì) 胞用沉默突變的野生型大鼠ctl (pRc/CMV ocl AACffll)或大鼠al泵 缺失突變體(D371E)瞬時轉(zhuǎn)染。
如圖15C中所示，大鼠al或突變體的表達減少了 PY-17細(xì)胞中 的活性Src。為了進一步證實，發(fā)明人還用EYFP融合的大鼠al突變 表達載體(pEYFP-D371E)瞬時轉(zhuǎn)染TCN23-19細(xì)胞并免疫染色活性Src。 如圖15D中所示，表達大鼠ocl突變體的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的TCN23-19細(xì) 胞相比具有低得多的活性Src。這些數(shù)據(jù)表明泵缺失的Na+/K+-ATP酶 突變體仍然能夠與Src相互作用并調(diào)控Src。為了進一步證實，發(fā)明人在用EYFP-大鼠a 1突變體(D371E)和Src-ECFP表達載體瞬時轉(zhuǎn)染 的TCN23-19細(xì)胞中進行了 FRET分析。
如圖16A中所示，泵缺失突變體被靶向至質(zhì)膜。當(dāng)通過接納體光 漂白方案測量這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的FRET時，清楚了證明了能量從 SrcECFP向EYFP-D371E的轉(zhuǎn)移(圖16B)。從三個獨立實驗中的共20 個細(xì)胞測量的FRET效率為10. 4到15. 6 (13. 2 ± 1.4)。這些數(shù)據(jù)表 明泵缺失Na+/K+-ATP酶像野生型ocl (10)—樣作用并且可以與Src 相互作用而形成信號傳導(dǎo)復(fù)合體。該結(jié)論進一步得到免疫共沉淀測定 法的支持，其表明大鼠ocl突變體可以被抗-Src抗體共沉淀(圖16C)。
FAK是已知的Src效應(yīng)物，其在細(xì)胞遷移和增殖的調(diào)控中起重要 作用。Src的激活刺激FAK Tyr"s的磷酸化，其隨后也導(dǎo)致RDK1/2的 激活。為了檢查基礎(chǔ)Src活性的升高是否可以導(dǎo)致Src效應(yīng)物的激活， 發(fā)明人測量了 otl敲減細(xì)胞中FaK的酪氨酸磷酸化。如圖17 A中所示， 細(xì)胞裂解物被抗磷酸酪氨酸抗體免疫沉淀，并且使用抗FAK抗體探測 免疫沉淀物。數(shù)據(jù)清楚地表明al敲減能夠增加酪氨酸磷酸化的FAK 的量。特別地，當(dāng)探測細(xì)胞裂解物的Tyr(P) 925-FAK時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn) A4-11和PY-17細(xì)胞中Tyr(P) 925-FAK的顯著升高(圖17B)。有趣的 是，當(dāng)測量總的ERK1/2和pERK1/2時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PY-17細(xì)胞中活性 ERK 1/2的量的適度增加(圖170。這符合Tyr(P)"5-FAK的已知的功 能(19， 20)。該Tyr(P)9"的增加對Src抑制劑PP2敏感(圖17D)。重 要的是注意到FAK磷酸化與PP2處理的敲減細(xì)胞中活性Src水平良好 相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明由于al敲減引起升高的Src活性可以刺 激Src效應(yīng)物的酪氨酸磷酸化。這得到如下觀察的進一步支持泵缺 失突變體(D371E)的表達不僅恢復(fù)了基礎(chǔ)Src活性，而且降低了 PY-17 細(xì)胞中FAK Tyr化磷酸化(圖17E)。
Na+/K+-ATP酶的敲減消除了 Src和ERK1/2的烏本苷誘導(dǎo)的激活
因為^+/"—7 酶.Src復(fù)合體作為烏本苷的功能性受體以誘導(dǎo) Src激活和ERK1/2的隨后刺激，所以上面的實施例導(dǎo)致發(fā)明人測試 Na+/K+-ATP酶的敲減是否影響烏本苷激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如圖18A中所示，盡管烏本苷激活了 P-11細(xì)胞中的Src，但是烏 本苷的該效應(yīng)在PY-17細(xì)胞中基本上被消除，而在A4-11細(xì)胞中觀察 到顯著降低。為了確定該抑制不是由于受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的非特異性缺陷， 發(fā)明人也測量了 EGF對Src的作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)表皮生長因子能夠刺 激P-ll和PY-17細(xì)胞中的SrcTyr(P)"8 (P-ll中2. 5 士 0. 3倍增加 對比PY-17中1. 7 ± 0. 2倍增加，n = 3)。與對于Src的發(fā)現(xiàn)相一 致，發(fā)明人也不能檢測PY-17細(xì)胞中ERKl/2磷酸化的任何烏本苷誘導(dǎo) 的改變(圖18B)。
相反，表皮生長因子能夠刺激PY-17細(xì)胞中的ERK1/2。這些數(shù)據(jù) 支持如下觀點Na+/K+-ATP酶實際上是烏本苷誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受 體。該觀點進一步得到圖18C和18D中給出的發(fā)現(xiàn)的支持，表明大鼠 a 1的敲入不僅恢復(fù)了烏本苷應(yīng)答而且使AAC-19細(xì)胞中的劑量反應(yīng)曲 線偏向右邊。
討論
在該實施例中，發(fā)明人不僅介紹了有效的且al特異性RNA千擾 測定法，而且提供了挽救^+/"41 酶耗盡的細(xì)胞的方案。這些方法 使得我們可能闡明細(xì)胞Na+/K+-ATP酶調(diào)控Src和其效應(yīng)物FAK并且 Na+/K+-ATP酶.Src復(fù)合體作為烏本苷的唯一受體而激活活細(xì)胞中的 Src和隨后激活ERK1/2。
通過RNA干擾測定法操作細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATP酶含量 RNA干擾是最初在1998年在秀麗隱桿線蟲(Cse/7or力sM/〃s e/ega/2s)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞機理，并且指通過雙鏈RNA觸發(fā)的內(nèi)源mRNA 的降解進行的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。其現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)為人工沉默多種生 物系統(tǒng)(包括培養(yǎng)的細(xì)胞和完整生物)中特定基因的有力工具。使用 Paul等人(2002)開發(fā)的策略和瞬時轉(zhuǎn)染測定法，發(fā)明人鑒定A4 siRNA 對于沉默ccl表達是有效的。從而，發(fā)明人用A4 siRNA表達載體轉(zhuǎn)染 豬LLC-PK1細(xì)胞并克隆了幾個穩(wěn)定的細(xì)胞系。蛋白質(zhì)印跡分析和免疫 染色測定表明克隆的細(xì)胞系中ocl的表達被顯著降低(圖11和l2和圖26-表2)。例如，PY-17細(xì)胞中otl為對照P-ll細(xì)胞中的僅僅約 8%。功能分析揭示al的耗盡導(dǎo)致PY-17細(xì)胞中烏本苷-敏感性ATP 酶活性降低80% (圖27-表3)。發(fā)明人現(xiàn)在開發(fā)了沉默培養(yǎng)的細(xì)胞 中內(nèi)源ct 1的表達的有效方案。
為了測試al耗盡的細(xì)胞是否可以用于研究內(nèi)源/突變al的信號 傳導(dǎo)功能，發(fā)明人用大鼠al表達載體轉(zhuǎn)染了 PY-17細(xì)胞，所述表達 載體中，A4 siRNA靶向的序列被沉默突變。通過利用與大鼠ocl特異 反應(yīng)的抗體的可用性優(yōu)點，發(fā)明人在本文中闡明內(nèi)源大鼠al可以被 敲入并且大鼠otl的表達不僅恢復(fù)了總的細(xì)胞^+/1(+4了？酶蛋白質(zhì)而 且恢復(fù)了 ^+/"41 酶活性。而且，大鼠ocl挽救的細(xì)胞(AAC-19)顯 示出與僅僅表達Na+/K+-ATP酶ocl亞基的大鼠細(xì)胞系相同的烏本苷 敏感性(圖13)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了操作細(xì)胞 Na+/K+-ATP酶的有效方案。
該方案與廣泛使用的烏本苷選擇方案相比，為在烏本苷敏感細(xì)胞 系中表達突變Na+/K+-ATP酶方面提供了額外的優(yōu)點(23-26)。
首先，本方案使得可能耗盡內(nèi)源化+/""^7 酶，允許發(fā)明人研究 Na+/K+-ATP酶表達的降低對細(xì)胞功能的影響。
其次，本方案不需要使用烏本苷以強迫表達轉(zhuǎn)染的Na+/K+-ATP 酶。在考慮最近的研究中這是重要的，所述研究表明烏本苷刺激 Na+/K+-ATP酶的信號傳導(dǎo)功能并且誘導(dǎo)該酶的胞吞作用。
第三，本方案可用于測定具有極低(小于10% )的內(nèi)源Na+/K+-ATP 酶的細(xì)胞中的內(nèi)源/突變Na+/K+-ATP酶。
第四，所鑒定的A4 siRNA可用于沉默來自不同于人和豬的物種的 細(xì)胞中的ocl表達，因為A4 siRNA靶向的人al cDNA序列(核苷酸 2293到核普酸2312) [SEQ ID N0: 38]在從魚類到人的所有鑒定的a 1
亞基(但不是其他同種型)中是保守的。
第五，用不同同種型的Lp挽救PY-17細(xì)胞，Na+/K+-ATP酶提供
了揭露同種型特異性信號傳導(dǎo)功能的通路。Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶庫
Na+/K+-ATP酶存在于具有Src的胞膜窖中。FRET分析表明信號傳 導(dǎo)Na+/K+-ATP酶和Src可能相互作用并形成功能性受體復(fù)合體。體外 結(jié)合測定法表明otl亞基和Src可以通過多個結(jié)構(gòu)域直接相互作用并 且該相互作用保持Src處于無活性狀態(tài)。發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為存在 Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫，其不僅調(diào)控基礎(chǔ)Src活性，而且作 為烏本苷的受體以刺激多種效應(yīng)物的依賴Src的酪氨酸磷酸化。
首先，因為信號傳導(dǎo)Na+/K+-ATP酶結(jié)合Src并保持其處于無活性 狀態(tài)，所以發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為內(nèi)源Na+/K+-ATP酶的減少將耗盡 Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫，從而導(dǎo)致Src激活。實際上，如圖 14中所示，oil敲減細(xì)胞含有比對照P-ll細(xì)胞更高活性Src。重要的 是提到ctl敲減確實引起PY-17細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的顯著升高。然 而，當(dāng)通過fura-2測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+時，PY-17細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)Ca"與P-ll 細(xì)胞中的相當(dāng)。從而，Src活性的增加不可能是由于細(xì)胞內(nèi)Na+或Ca2+ 的改變。
其次，當(dāng)通過大鼠ocl挽救ocl敲減的PY-17細(xì)胞時，發(fā)明人觀察 到大鼠al的敲入足夠耗盡Src相互作用的血+/1[+^1 酶庫，導(dǎo)致基 礎(chǔ)Src活性的恢復(fù)。
第三，因為當(dāng)前所述的體外結(jié)合測定法表明al的第三個細(xì)胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域與Src相互作用并抑制Src活性，發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為大鼠ocl的 泵缺失突變體應(yīng)該能夠結(jié)合并抑制活細(xì)胞中的Src。實際上，發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)將大鼠a 1突變體D371E敲入PY-17細(xì)胞也能夠耗盡Na+/K+-ATP 酶的該Src相互作用庫并減少活性Src的量(圖15)。
另外，F(xiàn)RET分析和免疫共沉淀測定法表明泵缺失突變體可以與活 細(xì)胞中的Src相互作用(圖16)。因為泵缺失突變體的表達不降低PY-17 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)Na+濃度，所以這些數(shù)據(jù)也表明Na+ZK+-ATP酶可以獨 立于細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的改變與Src相互作用并調(diào)控Src。
FAK涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。它也是Src的 效應(yīng)物之一?；钚許rc與FAK的結(jié)合導(dǎo)致FAK的完全激活和FAK Tyr925的酪氨酸磷酸化，其導(dǎo)致一些下游信號傳導(dǎo)分子的裝配，其中包括
￡110/2的激活。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞^+/1[+41 酶的耗盡不僅激活了 Src， 而且刺激了 FAK的酪氨酸磷酸化。PP2對Src的抑制或者泵缺失ocl 突變體的敲入減少了 PY-17細(xì)胞中的Tyr(P) 925-FAK (圖17)。相一致 的是，發(fā)明人也觀察到烏本苷刺激了對照LLC-PK1細(xì)胞中的Src和隨 后刺激了 FAK。這些發(fā)現(xiàn)是重要的。首先，它們支持如下觀點 化+/1(+41 酶是蛋白激酶的重要調(diào)控物。其次，Na+/K+-ATP酶對Src 和3^效應(yīng)物？人1(的調(diào)控作用依賴于^+/1[+41 酶與蛋白質(zhì)相互作用 而不依賴泵送離子的能力。第三，al耗盡誘導(dǎo)的Src激活能夠產(chǎn)生 下游通路。發(fā)明人也注意到FAK在細(xì)胞運動性的調(diào)控中起關(guān)鍵作用并 且上皮細(xì)胞中ctl的耗盡影響緊密連接的形成和細(xì)胞運動性。從而， 發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為al耗盡和隨后FAK的激活在細(xì)胞遷移的調(diào)控中的作 用是重要的。
烏本苷誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎通過Src的激活啟動。因為烏本苷使 用Na+/K+-ATP酶.Src復(fù)合體作為功能性受體，所以發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為 Src的烏本苷誘導(dǎo)的激活應(yīng)該與Src -相互作用的Na+/K+-ATP酶庫的 大小相關(guān)。實際上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)烏本苷對Src激活的作用與Na+/K+-ATP 酶的細(xì)胞水平反相關(guān)。盡管烏本苷誘導(dǎo)A4-11細(xì)胞中Src的適度激活， 但是它不能激活PY-17細(xì)胞中的Src。因為需要Src將烏本苷信號傳 遞到許多下游效應(yīng)物，所以本文的實施例進一步表明a/K-ATP酶'Src 復(fù)合體是烏本苷引起蛋白質(zhì)信號級聯(lián)的唯一受體。這得到下面觀察的 進一步支持。首先，用大鼠al挽救PY-17細(xì)胞恢復(fù)了烏本苷對Src 和ERKl/2的作用。其次，因為所挽救的細(xì)胞表達烏本苷不敏感的大鼠 ocl，所以需要高得多的烏本苷濃度來刺激AAC-19細(xì)胞中的Src和隨 后刺激ERK 1/2 (圖18)。第三，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了用于操作細(xì)胞 Na+/K+-ATP酶的有用的方案，其允許進一步表征Na+/K+-ATP酶的信 號傳導(dǎo)性質(zhì)。第四，這些新的發(fā)現(xiàn)表明舷+/"41 酶是重要的受體， 其能夠通過蛋白激酶傳遞烏本苷信號。第五，因為Src活躍地參與細(xì) 胞生長的控制，本文的發(fā)明人現(xiàn)在表明需要再次檢查Na+/K+-ATP酶介導(dǎo)的對Src的抑制和烏本苷引發(fā)的對Src激活是否在癌癥生物學(xué)中起 重要作用的問題。
實施例III
在圖19A-D中顯示了與Src相互作用并抑制Src的Na+/K+-ATP 酶中特定結(jié)構(gòu)域的進一步作圖。結(jié)果顯示含有57個氨基酸的ND1結(jié)合 Src。圖19A顯示了 ^+/1(+4??？酶al和CD3結(jié)構(gòu)域的方案。圖19B 顯示 了 ND1的氨基酸序列[SEQIDNO. 1]
VFQANQ1,
圖19C顯示了使用GST標(biāo)記的ctl截短物和His-Src的體外結(jié)合 測定法。
圖19D顯示了該肽在不同物種和不同同種型的Na/K-ATP酶中是保 守的[SEQ ID NO. 2-33]。
實施例IV
圖20A-C中顯示了與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中的特定結(jié)構(gòu) 域的進一步作圖。結(jié)果表明含有54個氨基酸的KDl結(jié)合Na+/K+-ATP 酶。圖20A顯示了 Src和其激酶結(jié)構(gòu)域的示意性結(jié)構(gòu)。圖20B顯示了 來自Src的KDl肽與Na+/K+-ATP酶結(jié)合。[SEQ ID NO: 34]
KLRHE1.
圖20C顯示了使用GST標(biāo)記的Src截短物和純化的Na+/K+-ATP 酶的體外結(jié)合測定法。
實施例V
活性測定法證實ND1和KDl參與Src的Na+/K+-ATP酶介導(dǎo)的調(diào)控。 圖21顯示Na+/K+-ATP酶的GST-ND1抑制Src活性并且該抑制效果可 以被Src的GST-KD1竟?fàn)帯?br> 圖22A-B顯示ND1有效阻斷活細(xì)胞中的Src活性。ND1、 ND和CD3降低LLC-PK1細(xì)胞中的Src磷酸化。圖22A顯示LLC-PK1細(xì)胞用YFP-標(biāo)記的ND1、 ND和CD3瞬時轉(zhuǎn)染2卩小時。細(xì)胞然后在RIPA緩沖液中 裂解并探測pY418。也將YFP瞬時轉(zhuǎn)染到LLC-PK1細(xì)胞中作為對照。 圖22B顯示了來自三個實驗的定量數(shù)據(jù)。* p<0. 05。
實施例VI
ND1也抑制前列腺癌細(xì)胞(DU145)生長。圖23顯示YFP-ND1終止 人前列腺癌細(xì)胞(DU145)生長。用Lipofectamine 2000將2. 0 ju g pYFP-Cl或pYFP-Cl-NDl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到LLC-PK1細(xì)胞中。48小時后，用 臺盼藍染色來計數(shù)細(xì)胞數(shù)。
實施例VII
鑒定P3作為有效的Src抑制劑ND1的作圖已經(jīng)鑒定了來自ND1 的20個氨基酸的肽(P-3)抑制Src。圖24A-B表明來自ND1的肽3顯 著抑制Src活性。圖24A顯示了 P3肽序列[SEQ ID NO: 2]. (SATWLALSRIAGLCNRAVFQ)
圖24B顯示了當(dāng)純化的Src與P-3肽在37C溫育20分鐘并加入2 mMATP額外溫育5分鐘時的結(jié)果。通過加入5X上樣緩沖液終止反應(yīng)。 探測pY418來測量Src激活。
圖28顯示了增強大分子的細(xì)胞膜滲透性的肽(TAT和AP )的序列。
TAT或AP與P3的綴合使得細(xì)胞膜可滲透圖29A顯示了 TAT或 AP綴合的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3)的序列。圖29B顯示了新肽 在體外抑制Src。圖29C顯示FITC綴合的TAT-P3被靶向至細(xì)胞膜。 圖29D顯示向DU145細(xì)胞加入TAT-P3或AP-P3抑制細(xì)胞生長。
盡管本發(fā)明已經(jīng)參考多種和優(yōu)選的實施方案進行了描述，但是本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以進行多種改變并且等同方案可以替代其要 素而不背離本發(fā)明的基本范圍。另外，可產(chǎn)生許多修改使具體的條件
或材料適應(yīng)本發(fā)明的教導(dǎo)而不脫離其基本范圍。因此，本發(fā)明旨在不 限于預(yù)期用于實施本發(fā)明的本文公開的具體實施方案，而是本發(fā)明將包括落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有實施方案。 參考文獻
將上面討論的參考文獻和下面的參考文獻(在它們提供的補充本 文給出方案的示例性程序或者其他細(xì)節(jié)的程度上)特別引入本文作為 參考。本文參考文獻的引用將不被理解為承認(rèn)其是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。Abram， C. L., and Courtneidge， S. A. (2000). Src family tyrosine kinases,and growth factor signaling. Exp. Cell Res. 254, 1—13.
Aizman, O.， Uhlen, P., Lai, M., Brismar, H., and Aperia, A. (2001). Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calciium oscillations. Proc. NatL Acad. Sci. USA 98， 1342CM3424.
Aydemir-Koksoy, A.， Abramowitz，丄,and Alien,丄C. (2001). Ouabain-induced signaling and vascular smooth muscle cell proliferation. J. Biol. Chem. 276， 4660546611.
Baker, P. F.， and Willis, J. S. (1969). On the number of sodium pumping sites in cell membranes. Biochim. Biophys. Acta 183， 646-649.
Baker, P. F.， and Willis, J. S. (1970). Potassium ions and the binding of cardiac glycosides to mammalian cells. Nature 226， 521—523.
Barwe, S. P., Anilkumar, G., Moon, S. Y., Zheng, Y., Whitelegge, J. P., Rajasekaran, S. A.， and Rajasekaran, A. K. (2005). Novel role for Na，K-ATPase in phosphatidylinositol 3-kinase signaling and suppression of cell motility. Mol. Biol. Cell 16, 1082—1094.
Berkers， J. A., van Bergen en Henegouwen, P. M.， and Boonstra， J. (1991). Three classes of epidermal growth factor receptors on HeLa cells. J. Biol. Chem. 266， 922-927.
Boggon, T. J.， and Eck， M. J. (2004). Structure and regulation of Src family kinases. Oncogene 23， 7918-7927.
Brown, M. T".and Cooper, J. A. (1996). Regulation, substrates and functions of Src. Biochim. Biophys. Acta 1287, 121—149.
Devarajan, P.， Scaramuzzino, D. A.， and Morrow, J. S. (1994). Ankyrin binds to two distinct cytoplasmic domains of Na,K-ATPase alpha subunit. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 91,2965-2969.
Dolgova^ N., Mast， N.， Akimova, O.， Rubtsov, A., and Lopina, O. (2003). Proteins binding to alphalbetal isozyme of Na，K-ATPase. Ann. NY Acad. Sci. 986, 527—529.
Emanuel, J. R., Schulz, J., Zhou, X. M., Kent, R. B.， Housman, D.， Cantley， L.， and Levenson, R. (1988) J. Biol. Chem. 263， 7726-7733.
Fedorova， O. V.， Talan， M. I.， Agalakova, N. I.， Lakatta, E. G., and Bagrov， A. Y. (2002). Endogenous ligand of alpha(l) sodium pump， marinobufagenin， is a novel mediator of sodium chloride-dependent hypertension. Circulation 105, 1122—1127.Ferrandi, M.， MoUnari, I., Barassi, P., Minotti, E., Bianchi, G., and Ferrari, P, (2004). Organ hypertrophic signaling within eaveolae membrane, subdomains triggered .by ouabain and antagonized by PST 2238. J. Biol. Chem. 279, 33306"33314.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (簡)Nature 391, 806-811.
Haas， M.， Askari, A., and Xie， Z. (2000). Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal-transducing function of Na+/K+-ATPase. J. Biol. Chem. 275, 27832-27837.
Haas, M, Wang, H., Tian,丄，and Xie, Z. (2002). Src-mediated inter-receptor crosstalk between the Na+/K+-ATPase and the epidermal growth factor receptor relays the signafrom ouabain to mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 277， 18694~ 18702.
Hamlyn, J. M.， Blaustein, M. P., Bova， S., DuCharme, D. W., Harris, D. W., Mandel, F., Mathews, W. R., and Ludens, J. H. (1991). Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 6259~6263.
Haskell, M. D.， Slack, J. K., Parsons, J. T., and Parsons, S. J. (2001) Chem. Rev. 101， 2425-2440.
Huang, L.， Li， H., and Xie， Z. (1997). Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes. 丄Mol. Cell Cardiol. 29,429437.
Ihle， J. N. (1994). The Janus kinase family and signaling through members of the cytokine receptor superfamiy. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 206， 268—272.
Jewell, E. A., and Lingrel, J. B. (1991) J. Biol. Chem. 266,16925-16930.
Jorgensen, P. L. (1974). Purification and characterization of (Na+ plus K+)ATPase. 3. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium dodecylsulphate. Biochim. Biophys. Acta 356， 36~52.
Jorgensen, P. L. (1988). Purification of Na+，K+-ATPase: enzyme sources, preparative problems, and preparation from mammalian kidney. Methods Enzymol. 156, 29~43.
Kanagawa, M., Watanabe, S., Kaya, S., Togawa， K.， Imagawa, T., Shimada, A., Kikuchi, K.， and Taniguchi, K. (2000). Membrane enzyme systems responsible for the Ca(2+)-dependent phosphorylation of Ser(27)， the independent phosphorylation of Tyr(lO) and Tyr(7), and the dephosphorylation of these phosphorylated residues in the alpha-chainof H/K-ATPase. J. Biochem. (Tokyo) 127, 821—828.
Kent, R. B., Emanuel,丄R.， Ben Neriah, Y.， 'Levenson, R.， and Housman， D. E.' (1987) Science 237, 901-903. '
Kaplan, J. H. (2002). Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu. Rev. Biochem. 71,511-535.
Kim， D.， Barry, W. H., and Smith, T. W. (1984) J. Pharmacol. Exp. Ther. 231, 326~ 333.
Kometiani, P., Li,丄，Gnudi， L.， Kahn, B. B., Askari, A., and Xie, Z. (1998). Multiple signal transduction pathways link Na+/K+-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes. The roles of Ras and mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 273, 15249-15256.
Lingrel, J. B.， and Kuntzweiler, T. (1994). Na+，K(+)-ATPase. J. Biol. Chem. 269， 19659-19662.
Liu， L., Abramowitz，丄，Askari, A., and Alen，丄C. (2004) Am. J. Physiol. 287, H2173-H2182.
Liu, J., Kesiry, R.， Periyas呵，S. M.， Malhotra^ D.， Xie, Z., and Shapiro, J. I. (2004) Kidney Int. 66, 227—241.
Liu, L.， Mohammadi, K.， Aynafshar, B., Wang, H., Li, D., Liu,丄，Ivanov, V., Xie， Z.， and Askari, A. (2003) Am. J. Physiol. 284, C1550~C1560.
Liu,丄，Tian， J.， Haas， M., Shapiro,丄I.， Askari, A.， and Xie， Z. (2000). Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J. Biol. Chem. 275, 27838—27844.
LowTy， W. E.， Huang, J" Ma， Y. C., Ali， S., Wang, D., Williams, D. M., Oka&, M., Cole， P. A., and Huang, X. Y. (2002). Csk, a critical link of g protein signals to actin cytoskeletal reorganization. Dev. Cell 2, 733-744.
Ma， Y. C., Huang， J.， Ali, S., Lowry， W., and Huang, X. Y. (2000). Src tyrosine kinase is a novel direct effector of G proteins. Cell 102,635-646.
Masaki, T.， Shiratori， Y., Okada， H., Nishioka, M., Taniguchi, K.， Hatanaka, Y., and Omata, M. (2000). pp60c-src activation in gastric carcinoma: a preliminary study. Am. J. Gastroenterol. 95， 837—838.
McCall， D. (1979). Cation exchange and glycoside binding in cultured rat heart cells.Am. J. Physiol. 236, C87~C95.
Miyakawa-Naho, A" Uhi'en, P., Lal， M.， Aizman, O.， Mikoshiba, K.， Brismar， H.， Zelenin, S., and Aperi^ A. (2003) J. Biol. Chem. 278, 50355—50361.
Mohammadi， K., Liu， L.， Tian, J,， Kometiani， P.， Xie， Z.， and Askari, A. (2003), Positive inotropic effect of ouabain on isolated heart is accompanied by activation of signal pathways that link Na+/K+-ATPase to ERKl/2. J. Cardiovasc. Pharmacol. 41, 609-614.
Mohammadi, K., Kometiani, P., Xie, Z.， and Askari, A. (2001) J. Biol. Chem. 276, 42050~42056.
Ohtsubo, M., Noguchi, S., Takeda, K.， Morohashi， M., and Kawamura, M. (1990) Biochim. Biophys. Acta 102!, 157-160.
Paul, C. P.， Good, P. D.， Winer, I.， and Engelke, D. R. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 505-508.
Petrosian, S. A., Carr, D. L.， Guerrero, G.， and Pressley, T. A. (1998) Arch. Bioehem. Biophys. 357, 249-258.
Pierdomenico, S. D., Bucci, A., Manunta, P., Rivera, R., Ferrandi, M., Hamlyn, J. M., Lapenna, D., Cuccurullo, F.， and Mezzetti, A. (2001). Endogenous ouabain and hemodynamic and left ventricular geometric patterns in essential hypertension. Am. J. Hypertens. 14， 44-50.
Price, E. M.， and Lingrel， J. B. (1988) Biochemistry 27, 8400~8408.
Rajasekaran, S. A.， Palmer, L. G.， Quan, K., Harper,丄F.， Ball, "W. J.， Jr., Bander, N. H., Peralta Soler， A,， and Rajasekaran, A. K. (2001) Mol. Biol, Ce!l 12, 279—295.
Schaller, M. D. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1540, 1-21.
Scheiner-Bobis, G., and Schoner, W. (2001). A fresh facet for ouabain action. Nat. Med. 7， 1288-1289.
Schlaepfer, D. D., Hauck, C. R.， and Sieg， D.丄(1999) Prog. Biophys. Mol. Biol. 71, 435~478.
Schlaepfer, D. D., Broome， M. A,， and Hunter, T. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 1702-1713.
SchJa印fer， D. D.， Hanks， S. K., Hunter, T.， and van der Geer， P. (1994) Nature 372，786-791.
Schulte, R. J.， and Sefton, B. M. (2003). Inhibition of the activity of SRC and Abl tyrosine protein kinases by the binding of the Wiskott-Aldrich syndrome protein. Biochemistry 42, 9424~9430.
Skou， J. C. (1957) Biochim. Biophys. Acta 23, 394-401.
Sobko， A.， Peretz, A., and Attaj, B.(998). Constitutive activation of delayed rectifier potassium channels by a Src family tyrosine kinase in Schwann cells. EMBO J. 17,4723— 4734.
Tatosyan， A. G., and Mizenina， O. A. (2000》Kinases of the Src family: structure and functions. Biochemistry (Mosc.) 65， 49—58.
Tian，丄,Cai， T.， Yuan, Z" Wang， H" Liu， L.， Haas， M., Maksimova， E.， Huang, X. Y" and Xie, Z. 1 (2006) Mol. Biol. Cell7， 317—326.
Tian, J., Gong， X.， and Xie, Z. (2001). Signal-transducing function of Na+-K-ATPase is essential for ouabain's effect on [Ca2+]i in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol, Heart Circ. Physiol. 281, HI899-H1907.
Tiran, Z., Peretz, A., Attali， B.， and Elson, A. (2003). Phosphorylation-dependent regulation of Kv2.1 Channel activity at tyrosine 124 by Src and by protein-tyrosine phosphatase epsilon.丄Biol. Chem. 278, 17509—17514.
Thomas, S. M., and Brugge, J. S, (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13， 513409.
Toyoshima, C., and Nomura, H. (2002). Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. Nature 418, 605~611.
Wan, Y. S., Wang, Z. Q.， Voorhees, J" and Fisher, G. (2001). EGF receptor crosstalks with cytokine receptors leading to the activation of c-Jun kinase in response to UV irradiation in human keratinocytes. Cell Signal 13， 139-144.
Wang, H., Haas, M., Liang, M.， Cai, T., Tian， J.， Li， S., and Xie, Z, (2004). Ouabain assembles signaling cascades through the caveolar Na+/K+-ATPase.丄Biol. Chem. 279, 17250-17259.
Xie, Z. (2001). Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase reveals that the enzyme can act as a pump and as a signal transducer. Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 47, 383-390.
Xie， Z., Kometiani, P.， Liu，丄,Li, J.， Shapiro, J. I.， and Askari, A. (1999). IntraceHuiar reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and itsmarker genes in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 274, 19323—19328.
Xie, Z., Wang, Y., Liu, G., Zolotaijova, N., Periyasamy, S. M., and Askari, A. (1996). Similarities and differences between the properties of native and recombinant Na+/K+-ATPases. Arch. Biochem. Biophys. 330,153-162.
Xie， Z. J.， Wang, Y. H., Ganjeizadeh， M., McGee， R.， Jr., and Askari, A. (1989) Anal. Biochem.83,215-219.
Young, M. A., Gonfloni， S., Superti-Furga， G., Roux, B., and Kuriyan， J. (2001). Dynamic coupling between the SH2 and SH3 domains of i:-Src and Hck underlies their inactivation by C-terminal tyrosine phosphorylation. Cell 105, 115—126.
Yu, X. M., Askalan, R.， Keil， G. J.， 2nd, and Salter, M. W. (1997). NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase Src. Science 275, 674~678.
Yuan, Z., Cai， T.， Tian， J., Ivanov, A. V., Giovannucci, D. R., and Xie, Z. (2005). Na+/K+-ATPase tethers phospholipase C and IP3 receptor into a calcium regulatory complex. Mol. Biol. Cell 16， 403"045.
Yudowski， G. A.， Efendiev, R., Pedemonte, C. H., Katz, A. l.， Berggren， P. O., and Bertorello, A. M. (2000). Phosphoinositide-3 kinase binds to a proline-rich motif in the Na+, K+誦ATPase alpha subunit and regulates its trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,6556~6561.
權(quán)利要求
1.調(diào)控Src和其下游信號傳導(dǎo)通路的方法，其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結(jié)合。
2. 誘導(dǎo)烏本普引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，其包含化+/1(+47 酶/3^ 或Src家族激酶的復(fù)合體。
3. 靶標(biāo)，其包含^+/"41 酶和Src或Src家族激酶之間的相互 作用位點。
4. 藥物組合物，其用于調(diào)控涉及控制細(xì)胞生長、運動性、活性氧 (ROS)的產(chǎn)生、por-膠原合成和肌肉收縮的多種信號傳導(dǎo)通路，所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶抑制劑或激活劑。
5. 權(quán)利要求4的組合物，其包含一種或多種肽或肽片段，其抑制 或刺激Na+/K+- ATP酶的信號傳導(dǎo)功能并且不抑制Na+/K+- ATP酶的離 子泵功能。
6. 權(quán)利要求4的組合物，其中所述抑制劑不直接與ATP竟?fàn)帯?br> 7. 包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制劑或激活劑，其干擾 Src和Na+/K+- ATP酶之間的相互作用，通過與ATP類似物不同的機理 發(fā)揮作用，并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。
8. 治療組合物，其包含至少一種權(quán)利要求7的肽Src抑制劑或激 活劑。
9. 開發(fā)小分子的方法，所述小分子模擬權(quán)利要求7的肽抑制劑或 激活劑，通過與ATP類似物不同的機理發(fā)揮作用，并且是通路 (Na+/K+-ATP酶)特異性的。
10. 包含Na+/K+-ATP酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，其介導(dǎo)與癌細(xì)胞生長、心 臟纖維質(zhì)生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒癥心肌病有關(guān)的一 種或多種信號傳導(dǎo)通路。
11. 包含在Src或Na+/K+-ATP酶cx 1亞基中發(fā)現(xiàn)的功能結(jié)構(gòu)域的 組合物，其中Na+/K+-ATP酶介導(dǎo)的對Src的抑制是由于所述oc亞基或 其他P型ATP酶的ot亞基的N結(jié)構(gòu)域和Src激酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
12. 權(quán)利要求ll的組合物，其包含ND1肽，或其片段。
13. 來自ND1的肽，其足夠結(jié)合Src以及其他Src家族激酶，包括 但不限于Lyn，和抑制它們的活性。
14. 來自Src激酶結(jié)構(gòu)域(KD1)或其他Src家族激酶的類似結(jié)構(gòu)域 的肽，其能夠與Na+/K+-ATP酶結(jié)合并通過竟?fàn)嶴rc的結(jié)合基序而有效 激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。
15. 肽，其用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性Src或Src 家族激酶。
16. 包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活劑，所述肽或其片段 靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用而不是竟?fàn)嶢TP結(jié)合， 和ii)提供Src活性的通路特異性調(diào)節(jié)的區(qū)域。
17. 各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑，所 述激酶包括具有序列或其片段的激酶，其中使用也結(jié)合該激酶結(jié)構(gòu)域的 Na+/K+-ATP酶的一個或多個a亞基開發(fā)所述序列或其片段。
18. 小分子，其包含權(quán)利要求16的同種型特異性Src抑制劑和/ 或激活劑。
19. 用于大規(guī)模和高通量篩選的快速篩選測定法，其包括 Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互作用。
20. 治療蛋白激酶相關(guān)的疾病狀態(tài)的方法，該方法包括對需要其的 受試者施用治療有效量的至少一種權(quán)利要求3或4的組合物。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述疾病狀態(tài)涉及^f吏用Src或Src 家族激酶作為效應(yīng)物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中所述疾病狀態(tài)涉及包含Src的細(xì)胞 酪氨酸激酶。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述疾病狀態(tài)包括癌癥或者腎臟或 心血管相關(guān)的疾病。
24. 物質(zhì)的組合物，其包含a)具有5到50個氨基酸長度的肽， 該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序和b)第一種可檢測的 部分，其中所述第一種可檢測的部分與該肽結(jié)合。
25.組合物，其包含圖19B中所示的序列[SEQ ID NO l]或者基于 該序列開發(fā)。
26，組合物，其包含圖20B中所示的序列[SEQ ID NO 34]或者基 于該序列開發(fā)。
27. 組合物，其包含圖24A中所示的肽序列[SEQ ID NO 2]或者基 于該肽序列開發(fā)。
28. 組合物，其包含^+/"-ATP酶和Src或Src家族激酶之間相 互作用的結(jié)構(gòu)信息或者基于該信息開發(fā)。
29. 小分子Src抑制劑或激活劑，其被開發(fā)以靶向Na+/K+-ATP酶 和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基于該相互作用開發(fā)。
30. Src抑制劑或激活劑，其基于NA+/K+-ATP酶或其他P-ATP酶 和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發(fā)。
31. 開發(fā)鑒定的Na+/K+-ATP酶/Src受體復(fù)合體的激動劑或拮抗劑 的方法。
32. 組合物，其包含基于^+/"41 酶/31:(;復(fù)合體開發(fā)的激動劑 或拮抗劑。
33. 治療組合物，其包含至少一種權(quán)利要求32的激動劑或拮抗劑。
34. 對培養(yǎng)的細(xì)胞中操作細(xì)胞^+/"4??？酶的方法，其包括用A4 siRNA表達載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而降低克隆的細(xì)胞中Na/K-ATP酶的表達。
35. 至少部分沉默培養(yǎng)的細(xì)胞中內(nèi)源otl的表達的方法，其包括用 A4 siRNA表達載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而降低克隆的細(xì)胞中ocl的表達。
36，耗盡內(nèi)源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本苷以迫使表達轉(zhuǎn)染 的Na+/K+-ATP酶的方法，其包括使用A4 siRNA以沉默來自希望的物種， 包括人和豬的細(xì)胞中的ocl表達。
37. 包含GST-NT (氨基酸殘基6-90) [SEQ ID N0 51]的表達載體。
38. 包含GST- CD2 (氨基酸殘基152-288 ) [SEQ ID NO 52]的表達 載體。
39. 包含GST- CD3 (氨基酸殘基350-785 ) [SEQ ID NO 53]的表達 載體。
40. 包含GST-H+/K+-CD3 [SEQ ID NO 54]的構(gòu)建體。
41. 包含GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]的構(gòu)建體。
42. 基于siRNA的測定法，其經(jīng)配置以測定Na+/K+-ATP酶的量和 性質(zhì)的改變對基礎(chǔ)的和烏本苷刺激的Src活性的影響。
43. 用于測定外源的/突變的a l的信號傳導(dǎo)功能的ot l耗盡細(xì)胞， 該細(xì)胞通過用al表達載體轉(zhuǎn)染敲減的細(xì)胞來制備，所述載體中A4 siRNA 靶向的序列被沉默突變，其中外源al被敲入并且al的表達被恢復(fù)，不 僅總的細(xì)胞^+/"-ATP酶蛋白，而且^+/"-ATP酶活性都被恢復(fù)。
全文摘要
公開了調(diào)控Src和其下游信號傳導(dǎo)通路的方法，其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結(jié)合。Na+/K+-ATP酶/Src復(fù)合體是強心類固醇如烏本苷的功能性受體。還公開了Src抑制劑或激活劑，其包括干擾Na/K-ATP酶和Src之間相互作用的Na+/K+-ATP酶或Src，通過不同于ATP類似物的機理發(fā)揮作用，并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。
文檔編號A61K31/17GK101541319SQ200780043725
公開日2009年9月23日 申請日期2007年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者J·I·沙皮羅, J·田, Z·謝 申請人:托萊多大學(xué)