專利名稱：：新的h5蛋白、其編碼核酸、載體及它們的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明系關(guān)于醫(yī)藥領(lǐng)域，優(yōu)選系關(guān)于傳染病領(lǐng)域。尤其，本發(fā)明系關(guān)于流感蛋白；編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子及載體；及疫苗。更尤其，本發(fā)明系關(guān)于所述蛋白質(zhì)、核酸分子、載體或疫苗中之任一者用于治療及預(yù)防流感感染，進(jìn)一步用于預(yù)防流感病毒之種內(nèi)及種間傳播的用途。
背景技術(shù)：
：流感感染仍然為動(dòng)物及人類之重要感染。流感系由經(jīng)歷連續(xù)抗原性變異/修飾且占據(jù)動(dòng)物宿主的病毒引起。因此，未來(lái)可能發(fā)生新的流行病及大流行，且難以實(shí)現(xiàn)該疾病之根除。流感病毒是本領(lǐng)域熟知的且詳述于(例如)可供進(jìn)一步參考之P.Palese，NatureMedicine第10巻，第12期，第S82至S86頁(yè)(2004年12月)中。簡(jiǎn)而言之，流感A病毒之基因組系由/^個(gè)單鏈節(jié)段組成，且病毒顆粒在其表面上具有兩種主要糖蛋白血凝素(H)及神經(jīng)氨酸酶(N)。在流感病毒之間因存在至少16種不同的血凝素(H1至H16)及9種不同的神經(jīng)氨酸酶(N1至N9)亞型而存在相當(dāng)多的抗原變異。已證明流感病毒中的H5N1型禽流感病毒可感染禽類、豬及人類。所述病毒亦可自禽類物種直接傳染給人類(Claas等人，Lancet1998，351:472;Suarez等人，J.Virol.1998,72:6678;Subbarao等人，Science1998，279:393;Shortridge，Vaccine1999，17(增刊1):S26-S29)。已知人類臨床病例之死亡率接近約50%。上一個(gè)世紀(jì)，豬一直為流感大流行之重要媒介。豬、駱駝及海豹(以豬為優(yōu)選)可充當(dāng)禽流感病毒之'混合室'，且因此代表一種越過(guò)禽類(流感病毒之天然宿主)至哺乳動(dòng)物之物種障礙之潛在風(fēng)險(xiǎn)因素。這種跨物種傳播常通過(guò)易感動(dòng)物(例如豬)被已知的哺乳動(dòng)物(豬)流感病毒與禽流感病毒雙重感染而發(fā)生。此雙重感染有可能形成能引起人或豬大流行的新重組病毒。然而，最近有跡象表明，當(dāng)前禽類H5病毒抹與哺乳動(dòng)物流感病毒之重組不會(huì)形成強(qiáng)毒性重組體。另一方面，禽流感病毒可感染豬且藉由自發(fā)突變而變得順應(yīng)于豬。一旦病毒在豬(或其它哺乳動(dòng)物)群體內(nèi)引起橫向感染，則將越過(guò)關(guān)鍵障礙。目前大多數(shù)東南亞豬已被鄰近的家禽飼養(yǎng)場(chǎng)的禽(H5)流感病毒林感染。由于這些感染迄今為止都是亞臨床的，因此其僅可藉由實(shí)驗(yàn)室方法診斷并因此常常被忽視。這帶來(lái)以下高風(fēng)險(xiǎn)這些亞臨床感染豬為病毒適應(yīng)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)、在豬群內(nèi)傳播以及感染人類提供了機(jī)會(huì)。當(dāng)前流感疫苗包括亞單位疫苗(Babai等人，Vaccine1999,17(9-10):1223國(guó)1238;Crawford等人，Vaccine1999，17(18):2265-2274;Johansson等人，Vaccine1999,17(15-16):2073-2080)、減毒疫苗(Horimoto等人，Vaccine2004,22(17-18):2244-2247)、DNA疫苗(Watabe等人，Vaccine2001,19(31):4434-4444)及滅活流感疫苗(Cao等人，Vaccine1992，10(4):238-242)，其中滅活流感疫苗以商業(yè)規(guī)模最廣泛使用(Lipatov等人，JVirol2004，78(17):8951-8959)。亞單位疫苗、重組血凝素及神經(jīng)氨酸酶(Babai等人，Vaccine1999，17(9-10):1223-1238;Crawford等人，Vaccine1999,17(18):2265-2274;Johansson等人，Vaccine1999，17(15-16):2073-2080)有可能成為滅活疫苗的頗受關(guān)注的替代物，單目前尚未作為商用疫苗投入使用。這些疫苗制劑顯然比滅活疫苗安全。此外，亞單位疫苗并不對(duì)流感病毒內(nèi)部蛋白產(chǎn)生抗體反應(yīng)，因此使得能夠區(qū)分接種動(dòng)物和感染動(dòng)物(Crawford等人，Vaccine1999，17(18):2265-2274)。血凝素蛋白是流感病毒表面與受體結(jié)合并與膜融合的糖蛋白，是中和感染力的抗體的攻擊標(biāo)靶。H5N1的完整血凝素蛋白(HA)系由568個(gè)氨基酸組成，分子量為56kDa。HA分子系由HA1及HA2亞單位組成，HA1亞單位介導(dǎo)最初與細(xì)胞膜的接觸而HA2負(fù)責(zé)膜融合(Chizmadzhev,Bioelectrochemistry2004,63(1-2):129-136)。桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)已用于表達(dá)從禽流感亞型分離的血凝素基因(Babai等人，Vaccine1999，17(9-10):1223-1238;Crawford等人，Vaccine1999,17(18):2265-2274;Johansson等人，Vaccine1999,17(15-16):2073-2080);New等人，BMCMircobiology2006，6(16):doi:10.1186/1471-2180-6匿16)。然而，這些重組蛋白似乎任何時(shí)候都不具有保護(hù)性，或者至少對(duì)一些物種僅具有較低效力(Treanor等人，Vaccine2001，19:1732-1737)。因此,需要提供更多的改良疫苗及疫苗接種新方法，以便為控制流感感染及對(duì)疾病負(fù)荷(diseaseload)產(chǎn)生正面影響而提供更好的方法。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明之實(shí)施例之前，應(yīng)了解，如本文中及隨附申請(qǐng)專利范圍中所使用，單數(shù)形式"一"及"該"包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，舉例而言，提及"一種制劑"包括復(fù)數(shù)種所述制劑；提及該"載劑"系指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知之一或多種載劑及其均等物，諸如此類。除非另外定義，屬技術(shù)者通常所了解之含義相同。除非另外指明或本領(lǐng)域技術(shù)人員另外得知，否則所有給定范圍及值可變化1至5%，因此術(shù)語(yǔ)"約"在本說(shuō)明書(shū)中省去。盡管可在本發(fā)明之實(shí)施或測(cè)試中使用與本文所述所述方法及物質(zhì)相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒拔镔|(zhì)，但優(yōu)選的方法、裝置及物質(zhì)現(xiàn)加以描述。為描述并揭示可配合本發(fā)明使用之如出版物中所報(bào)導(dǎo)之物質(zhì)、賦形劑、載劑及認(rèn)為本文中認(rèn)可本發(fā)明無(wú)權(quán)優(yōu)先于先前發(fā)明之此類4皮露內(nèi)容。藉由本說(shuō)明及申請(qǐng)專利范圍中之特征性實(shí)施例獲得上述技術(shù)問(wèn)題之解決方法。流感蛋白及編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子本發(fā)明涉及流感病毒的H5蛋白，該蛋白具有氨基酸223N及修飾328K+，其中氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。優(yōu)選地，本發(fā)明之該H5蛋白及其它任何H5蛋白為經(jīng)分離的H5蛋白。已驚人地發(fā)現(xiàn)，與在位置223及328/329上不具有相應(yīng)氨基酸的H5蛋白相比，具有上述修飾的H5蛋白具有更高的抗原性。本文術(shù)語(yǔ)"血凝素5(H5)"或"禽流感病毒之H5"或"H5蛋白"是指(但不限于)任何天然存在的H5蛋白及H5蛋白之任何經(jīng)修飾形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突變體)，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修飾328K+。本文所用H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置。SEQIDNO:l代表病毒抹鴨/China/E319-2/03的血凝素的氨基酸序列(但缺少氨基末端信號(hào)肽)。換而言之，若提及位置223的氨基酸(氨基酸223)，則是指與SEQIDNO:l中之氨基酸223對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。然而，此并非是指本發(fā)明的H5蛋白具有與SEQIDNO:l—致的氨基酸序列。其僅是指本發(fā)明H5蛋白的對(duì)應(yīng)氨基酸編碼這里明確提及的氨基酸殘基。在此情況下，氨基酸223為絲氨酸(S)。例如，術(shù)語(yǔ)"223N"或"155N"分別指，位置223及155(根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸位置編號(hào))的氨基酸編碼天冬酰胺(N)。換而言之，若提及"具有氨基酸223N的H5蛋白"，則表明，在氨基酸位置223(根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸位置編號(hào))，正常情況下編碼絲氨酸的H5氨基酸分子應(yīng)被天冬酰胺(N)取代。術(shù)語(yǔ)"328K+"或"修飾328K+"是指，在H5蛋白之氨基酸位置328(根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸位置編號(hào))插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。天然情況下，位置328及329的氨基酸序列編碼賴氨酸-賴氨酸，未插入其它賴氨酸(K)。然而，大多數(shù)已知H5序列在氨基酸位置328及329編碼賴氨酸-精氨酸。在上述任一種情況下，術(shù)語(yǔ)328K+修飾是指，應(yīng)將第二個(gè)賴氨酸(K)插入位置328的賴氨酸與位置329的精氨酸之間。于是，修飾后的序列應(yīng)讀成賴氨酸-賴氨酸-精氨酸(KKR)。因此，本發(fā)明系關(guān)于H5蛋白及H5蛋白之任何經(jīng)修飾形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突變體)，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修飾328K+,其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。不言而喻，如本文中所提供之任一種H5蛋白具有抗原性，此是指其在對(duì)流感病毒之標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示抗原特性。根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于H5蛋白之任何部分，此部分是指在標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示抗原特性、且至少具有氨基酸223N及修飾328K+的任何肽片段，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。若H5蛋白在標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)(例如，如實(shí)例2中所述)中抑制凝血，則其展示抗原特性。H5蛋白的該抗原部分通常包含編碼H5蛋白的氨基酸序列中的200、180、160、150、140、130、120、110或最優(yōu)選105個(gè)毗鄰氨基酸，所述H5蛋白是指上述經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)修飾、在實(shí)例2所述標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示抗原特性的蛋白。標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試^^例如亦描述于可供進(jìn)一步參考之Stephenson等人，VirusResearch,第103巻，第91-95頁(yè)(2004)中。然而，實(shí)施例2所述HI試,瞼應(yīng)被理解為與本文所述本發(fā)明所有方面有關(guān)的參考試驗(yàn)簡(jiǎn)而言之，進(jìn)行HI試驗(yàn)以沖全測(cè)HA特異性抗體之存在。異源H5N2病毒(A/雞/Mexico/232/94)以四個(gè)血凝單位[4HA單位]之濃度用于HI試驗(yàn)中。隨后在U形底微量滴定板中，將PBS中之連續(xù)兩倍稀釋血清液與等體積("jxL)(含有4HA單位)之病毒混合，且在室溫(約25°。)培育30分鐘。將PBS中之濃度為0.5%之雞紅細(xì)胞添加至含有血清-病毒之孔中且在室溫下培育,40分鐘。以觀測(cè)到血凝抑制的最高血清稀釋度之倒數(shù)確定HI效價(jià)。值得注意的是，Haesebrouck及Pensaert(1986)發(fā)現(xiàn)"針對(duì)攻擊病毒之HI效價(jià)與防御攻擊之保護(hù)之間可能存在關(guān)聯(lián)"。Haesebrouck及Pensaert(1986)亦測(cè)定，HI效價(jià)〉40的豬"完全抵抗攻擊且在受攻擊下呼吸道中不發(fā)生病毒復(fù)制"。因此，在經(jīng)疫苗接種之豬中形成〉40之HI效價(jià)將與保護(hù)作用有關(guān)。(F.Haesebrouck及M.B.Pensaert,1986)。預(yù)先用滅活流感H1N1疫苗免疫之肥育豬之氣管內(nèi)攻擊的效應(yīng)(VeterinaryMicrobiology,11(1986)239-249)。須假設(shè)等值或至少差不多等值的H5HI效價(jià)亦將對(duì)豬產(chǎn)生防御禽流感病毒的完全免疫保護(hù)。較低效價(jià)至少引起經(jīng)接種之動(dòng)物之血清轉(zhuǎn)化且產(chǎn)生對(duì)所述動(dòng)物之部分免疫保護(hù)，此亦可大大降低大流行之風(fēng)險(xiǎn)。此外，本發(fā)明的H5蛋白的抗原部分包括(但不限于)H5蛋白之缺失突變體，其包含i.圍繞且包括氨基酸223N之氨基酸序列中之至少35、30、25、20、18、15、13、10、9個(gè)或最優(yōu)選8個(gè)毗鄰氨基酸；及ii.圍繞且包括氨基酸修飾328K+之氨基酸序列中之至少35、30、25、20、18、15、13、10、9個(gè)或最優(yōu)選8個(gè)毗鄰氨基酸；且iii.其中H5蛋白之該抗原部分中之任一者可在實(shí)施例2所述標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示血凝素抑制。優(yōu)選地，圍繞氨基酸223N及/或328K+之所述氨基酸系由SEQIDNO:l或SEQIDNO:4編碼。此外，本發(fā)明之優(yōu)選H5蛋白為i.上述任一種具有氨基酸223N及修飾328K+的所述H5蛋白；ii.上述任一種具有氨基酸94N/223N及修飾328K+的所述H5蛋白；iii.具有氨基酸223N及修飾328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離林，該分離林最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或iv.具有氨基酸94N/223N及修飾328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離抹，該分離抹最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或v.具有氨基酸155N/223N及修飾328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離抹，該分離林最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或vi.具有氨基酸120N/155N/223N及修飾328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離林，該分離抹最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或vii.具有修飾94N/223N及修飾328K+的任何H5蛋白；或viii.具有修飾94N/155N/223N及修飾328K+的任何H5蛋白；或；ix.具有修飾94N/120N/155N/223N及修飾328K+的任何H5蛋白；或x.具有修飾223N、修飾328K+及選自以下氨基酸簇(aminoacidclusters)中之一或多者的任何H5蛋白a.aa93-95:GNFb.aa123-125:SDHc.aa128-130:SSGd.aa138-140:GSSe.aa226-228:MDFf.aa270-272:EVEg.aa309-311:NKL;或xi.具有氨基酸223N及修飾328K+及選自以下氨基酸簇中之一或多者的任何H5蛋白a.aa93-95:GNFb.aa128-130:SSGc.aa138-140:GSS;或xii.具有SEQIDNO:4之氨基酸序列的任何H5蛋白。此外，如本文中所提供之優(yōu)選H5蛋白包括以下文獻(xiàn)所述的H5蛋白Hoffmann等人，PNAS，第106巻，第36期，第12915-12920頁(yè)(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括如上所述之修飾中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修飾328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。該參考文獻(xiàn)之揭示內(nèi)容將以引用方式全文并入本文中。此外，如本文中所提供之優(yōu)選H5蛋白包括包含含有氨基酸223N及修飾328K+之肽的H5蛋白，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)，及i.SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6之氨基酸序列；或ii.具有與i)之多肽至少85%序列同源性、更優(yōu)選至少約90%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約95%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約97%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約98%序列同源性且甚至更優(yōu)選至少約99%序列同源性并在如上所述之標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示血凝素抑制的任何肽；或iii.i)或ii)之多肽之任何抗原部分，其包含i)或ii)之肽中之任一者的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9或最優(yōu)選8個(gè)毗鄰氨基酸。iv.i)、ii)或iii)之任何肽，其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、223N、223N或120N/155N。v.i)、ii)、iii)或iv)之任何肽，其具有選自以下氨基酸簇中之一或多者a.aa93-95:b.aa123-125:c.aa128-130:d.aa138-140:e.aa226-228:f.aa270-272:g.aa309-311:GNFSDHSSGGSS函FEVENKL;或vi.i)、ii)、iii)或iv)之任何肽，a.aa93-95:GNF其具有選自以下氨基酸簇中之一或多者:b.aa128-130:SSGc.aa138-140:GSS。本文所用之"序列同源性"系指測(cè)定兩個(gè)序列之相關(guān)性的方法。為測(cè)定序列同源性，將兩個(gè)或兩個(gè)以上的序列優(yōu)化對(duì)齊，且必要時(shí)引入空位(gap)。與序列一致性形成對(duì)比，在測(cè)定序列同源性時(shí)，保守性氨基酸取代視為匹配。換而言之，為獲得具有與參考序列之95%序列同源性的多肽或多核苷酸，參考序列中85%、優(yōu)選90%、甚至更優(yōu)選95%之氨基酸殘基或核苷酸必須與其它氨基酸或核苷酸匹配或包含其它氨基酸或核苷酸之保守性取代，或者可將參考序列中全部氨基酸殘基或核苷酸(不包括保守性取代)之至多15%、優(yōu)選至多10%、甚至更優(yōu)選至多5%量的氨基酸或核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?。?yōu)選地，同源序列包含至少一段50個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選100個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選250個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選500個(gè)核苷酸。此對(duì)齊后，逐位確定序列同源性，例如，若核苷酸或氨基酸殘基在特定位置處一致，則序列在彼位置上"同源"。接著將所述位置一致之總數(shù)除以參考序列中核苷酸或氨基酸殘基之總數(shù)以得到序列同源性％。序列同源性可容易地藉由已知方法計(jì)算，所述方法包括(但不限于)以下文獻(xiàn)中所述之所述方法ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.N.編，OxfordUniversityPress,NewYork(1988),Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.編，AcademicPress,NewYork(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分，Griffin,A.M.,及Griffin，H.G.編，HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinge，G.，AcademicPress(1987);SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.及Devereux，J.編，M.StocktonPress,NewYork(1991);及Carillo,H.及Lipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)，所述文獻(xiàn)之教示內(nèi)容以引用方式并入本文中。設(shè)計(jì)序列同源性之優(yōu)選測(cè)定方法以使所測(cè)試之序列之間達(dá)成最大匹配。序列同源性測(cè)定方法可編程為可公開(kāi)獲得之測(cè)定指定序列之間的序列一致性的計(jì)算機(jī)程序。所述程序之實(shí)例包括(但不限于)GCG程序套件(Devereux,J.等人，NucleicAcidsResearch,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec,Biol"215:403-410(1990))。BLASTX程序可乂>開(kāi)獲自NCBI及其它來(lái)源(BLASTManual,Altschul,S.等人，NCVINLMNIHBethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.，215:403-410(1990)，所述文獻(xiàn)之教示內(nèi)容以引用方式并入本文中)。所述程序利用預(yù)設(shè)空位;K重使序列最優(yōu)選對(duì)齊，以使指定序列與參考序列之間達(dá)成最高水平的序列同源性。此外，優(yōu)選的H5蛋白包括包含如上所述之328K+修飾及表1中所提供之氨基酸序列的H5蛋白或其任何免疫原部分表1:H5抗原<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>BAE48694、BAE48692、BAE48691、BAE48690、BAE48689、BAE48688、BAE48687、BAE48686、BAE48685、BAE楊84、BAE48683、AAC58999、ABC72082、AAV91149、AAP71993、AAP71992、AAP71991、AAP71990、AAP71989、AAP72011、AAP72010、AAP72009、AAP72008、AAP72007、AAP72006、AAP72005、AAP72004、AAP72003、AAP72002、AAP72001、AAP72000、AAP71999、AAP71998、AAP71997、AAP71996、AAP71995、AAP71994、AAF99718、ABF58847、AAG38534、AAC32102、AAC32099、AAL75847、AAC32101、AAC32098、AAC32088、AAC32078、AAR99628、AAC32亂AAM49555、AAL75843、AAL75839、AAD13573、AAD13568、AAF04720、AAF04719、AAC34263、AAR16155、AAD13574、AAD13570、AAD13575、AAD13572、AAD13569、AAD13567、AAD13566、AAK57506、AAG01225、AAG01215、AAG01205、AAG01195或ABD83813，它們?nèi)缟鲜鲂揎?，此是指這些序列包括上述223N及328K+修飾，這些修飾并不是野生型序列的組成部分；或ii.具有與i)之多肽之至少85%序列同源性、更優(yōu)選至少約90%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約95%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約97%序列同源性、甚至更優(yōu)選至少約98%序列同源性且甚至更優(yōu)選至少約99%序列同源性且在如上所述之標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示血凝素抑制的任何肽；iii.i)或ii)之肽中之任一者，其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A、263T或120N/155N;或iv.i)、ii)或iii)之所述肽中之任一者，其具有選自以下氨基酸簇中之一或多者a.aa93-95:GNFb.aa123-125:SDHc.aa128-130:SSGd.aa138-140:GSSe.aa226-228:MDFf.aa270-272:EVEg.aa309-311:NKL;或v.i)、ii)、iii)或iv)之任何肽，其具有選自以下氨基酸簇中之一或多者a.aa93-95:GNFb.aa128-130:SSGc.aa138-140:GSS。根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于編碼上述H5蛋白中之任一者的核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸分子為RNA、DNA或拷貝(c)DNA分子。因此，本發(fā)明系關(guān)于核酸分子，優(yōu)選編碼H5蛋白及H5蛋白之任何修飾形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突變體)的cDNA分子，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修飾328K+,其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于核酸分子，優(yōu)選編碼H5蛋白之任何部分的cDNA分子，其是指編碼在上述標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示抗原特性且至少具有氨基酸223N及修飾328K+之任何肽片段的cDNA分子，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:1所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。通常，編碼H5蛋白的抗原部分的所述核酸分子包含編碼上述經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾且在如本文所述之標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示抗原特性的H5蛋白的核苷酸序列中之600、540、480、450、420、390、360、330或最優(yōu)選315個(gè)毗鄰核香酸。H5蛋白的抗原部分之其它實(shí)施例在上文中加以描述。構(gòu)建任何所述核酸分子(優(yōu)選編碼上述H5蛋白的抗原部分的cDNA分子)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知。此亦包括(但不限于)構(gòu)建編碼上述H5蛋白的抗原部分(包括H5蛋白之缺失突變體)的核酸分子(優(yōu)選cDNA分子)，其包含i.圍繞且包括編碼氨基酸223N之編碼序列的核苷酸序列中之至少105、90、75、60、48、45、39、30、27或最優(yōu)選24個(gè)毗鄰核苷酸；及ii.圍繞且包括編碼修飾328K+之編碼序列的核苷酸序列中之至少105、卯、75、60、48、45、39、30、27或最優(yōu)選24個(gè)毗鄰核苷酸；且iii.其中H5蛋白之該抗原部分中之任一者在實(shí)施例2所述標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中展示血凝素抑制。優(yōu)選地，圍繞編碼氨基酸223N及/或328K+之核香酸的所述核苷酸編碼SEQIDNO:l或SEQIDNO:4。此外，本發(fā)明之編碼H5蛋白之優(yōu)選核酸分子為i.上述編碼氨基酸223N及修飾328K+的所述核酸分子中之任一者；ii.上述編碼氨基酸94N/223N及》務(wù)飾328K+的所述核酸分子中之任一者；iii.編碼氨基酸223N及修飾328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離抹，所述分離林最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或iv.編碼氨基酸94N/223N及修飾328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離林，所述分離林最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或v.編碼氨基酸155N/223N及修飾328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離抹，所述分離抹最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或vi.編碼具有氨基酸120N/155N/223N及修飾328K+之禽源H5蛋白的任何核酸分子，其中禽源是指H5序列來(lái)源于一種病毒分離林，所述分離抹最初是從感染5型禽流感病毒的禽類分離的；或vii.編碼具有修飾94N/223N及修飾328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或viii.編碼具有修飾94N/155N/223N及修飾328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或ix.編碼具有修飾94N/120N/155N/223N及修飾328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或x.編碼具有修飾223N、修飾328K+及選自以下氨基酸簇中之一或多者的H5蛋白的任何核酸分子a.aa93-95:GNFb.aa123-125:SDHc.aa128-130:SSGd.aa138-140:GSSe.aa226-228:MDFf.aa270-272:EVEg.aa309-311:NKL;或xi.編碼具有氨基酸223N、修飾328K+及選自以下氨基酸簇中之一或多者的H5蛋白的任何核酸分子a.aa93-95:GNFb.aa128-130:SSGc.aa138-140:GSS;或xii.編碼具有SEQIDNO:4之氨基酸序列的H5蛋白的任何核酸分子。此外，如本文中所提供之優(yōu)選H5蛋白包括以下文獻(xiàn)所述的H5蛋白Hoffmann等人，PNAS，第106巻，第36期，第12915-12920頁(yè)(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括如上所述之修飾中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修飾328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。此參考文獻(xiàn)之揭示內(nèi)容將以引用方式全文并入本文中。因此，根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于任何核酸分子，優(yōu)選編碼以下文獻(xiàn)所述之所述蛋白質(zhì)中之任一者的cDNA分子Hoffmann等人，PNAS,第106巻，第36期，第12915-12920頁(yè)(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括上述修飾中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修飾328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。將上述任何修飾引入核苷酸序列(包括流感病毒的H5蛋白之編碼序列)內(nèi)的方法是本領(lǐng)域熟知的。完整流感病毒之基因組序列可根據(jù)本發(fā)明加以修飾，例如根據(jù)可供進(jìn)一步參考之US6，951，754中所述的方法加以修飾。此外，可利用此項(xiàng)技術(shù)技能范圍內(nèi)之傳統(tǒng)分子生物學(xué)、微生物學(xué)及重組DNA技術(shù)修飾編碼本文中所述的抗原的核酸序列。所述技術(shù)已詳釋于文獻(xiàn)中。參見(jiàn)例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;DNACloning:APracticalApproach,第I及II巻(D.N.Glover編，1985);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編，1984);NucleicAcidHybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1985)];TranscriptionAndTranslation[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1984)];AnimalCellCulture[R.I.Freshney編(1986)];ImmobilizedCellsAndEnzymes[IRLPress,(1986)];B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);F.M.Ausubel等人編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.1994)。根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于包含上述核酸分子中之任一者的載體。換而言之，本發(fā)明系關(guān)于包括上述任何該H5蛋白或其部分之編碼序列的載體。優(yōu)選地，該載體為使上述任何該H5蛋白或其部分得到表達(dá)的表達(dá)載體。本發(fā)明的載體為適于在活體外或活體內(nèi)轉(zhuǎn)染或感染細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞的所述載體。載體及用于制備及/或使用表達(dá)載體(或重組體)的方法可依據(jù)或類似于以下文獻(xiàn)中所揭示之與DNA表達(dá)載體相關(guān)的方法美國(guó)專利第4,603,112號(hào)、第4，769，330號(hào)、第5,174,993號(hào)、第5,505,941號(hào)、第5,338,683號(hào)、第5,494,807號(hào)、第4，722，848號(hào)、第5,942,235號(hào)、第5,364,773號(hào)、第5,762,938號(hào)、第5,770,212號(hào)、第5,942,235號(hào)、第382,425號(hào)；PCT出版物WO94/16716、WO96/39491、WO95/30018;Paoletti,"Applicationsofpoxvirusvectorstovaccination:Anupdate,"PNASUSA93:11349-11353,1996年10月；Moss,"Geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression,vaccination,andsafety,"PNASUSA93:11341-11348,1996年10月；Smith等人，美國(guó)專利第4，745，051號(hào)(重組桿狀病毒)；Richardson,C.D.(編者)，MethodsinMolecularBiology39,"BaculovirusExpressionProtocols"(1995HumanaPressInc.);Smith等人，"ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCellsInfectedwithaBaculovirusExpressionVector",MolecularandCellularBiology,1983年12月，第3巻，第12期，第2156-2165頁(yè)；Pennock等人，"StrongandRegulatedExpressionofEscherichiacoliB-GalactosidaseinInfectCellswithaBaculovirusvector,"MolecularandCellularBiology,1984年3月，第4巻，第3期，第399-406頁(yè)；EPA0370573;美國(guó)申請(qǐng)案第920,197號(hào)(1986年10月16日申請(qǐng))；EP專利出版物第265785號(hào)；美國(guó)專利第4,769,331號(hào)(重組皰滲病毒)；Roizman，"Thefunctionofherpessimplexvirusgenes:Aprimerforgeneticengineeringofnovelvectors,"PNASUSA93:11307-11312,1996年10月；Andreansky等人，"Theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplexvirusestothetreatmentofexperimentalbraintumors,"PNASUSA93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，"Epstein-BarrvirusvectorsforgenedeliverytoBlymphocytes",PNASUSA93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，"Alphavirus-basedexpressionvectors:Strategiesandapplications,"PNASUSA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991;美國(guó)專利第5,591，439號(hào)、第5,552,143號(hào)、WO98/00166;已受理之美國(guó)申請(qǐng)案第08/675,556號(hào)、第08/675,566號(hào)(兩者均于1996年7月3日申請(qǐng))(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992，"Adenovirusascloningvectors,"SeminarsinVirology(第3巻)，第237-52頁(yè)，1993;Ballay等人，EMBOJournal,第4巻，第3861-65頁(yè)；Graham,Tibtech8,85-87,1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434;PCTWO91/11525;Feigner等人，(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993及McClements等人，"ImmunizationwithDNAvaccinesencodingglycoproteinDorglycoproteinB,aloneorincombination,inducesprotectiveimmunityinanimalmodelsofherpessimplexvirus-2disease",PNASUSA93:11414-11420,1996年10月；及美國(guó)專利第5,591,639號(hào)、第5,589,466號(hào)及第5,580,859號(hào);以及WO90/11092、W093/19183、W094/21797、WO95/11307、WO95/20660;Tang等人，Nature;及Furth等人，AnalyticalBiochemistry等。亦可參見(jiàn)WO98/33510;Ju等人，Diabetologia，41:736-739，1998(豆?fàn)畈《颈磉_(dá)系統(tǒng))；Sanford等人，美國(guó)專利第4,945,050號(hào)；Fischbach等人(Intracel)，WO90/01543;Robinson等人，seminarsinImmunology第9巻，第271-283頁(yè)(1997)(DNA載體系統(tǒng))；Szoka等人，美國(guó)專利第號(hào)(將DNA插入活細(xì)胞內(nèi)的方法)；McCormick等人，美國(guó)專利第5，677，178號(hào)(細(xì)胞病病毒之使用)；及美國(guó)專利第5,928,913號(hào)(用于基因傳遞的載體)以及本文中所引用之其它文件。病毒載體例》。選自豬皰滲病毒(i者i。Aujeszky氏疾病病毒)、豬&泉病毒、和痘病毒(尤其牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒及豬痘病毒)。本發(fā)明H5蛋白的制備方法根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供制備及/或回收高產(chǎn)量重組H5蛋白的方法i)用含有H5DNA編碼序列的重組病毒載體感染培養(yǎng)中的易感細(xì)胞，其中所述重組病毒載體表達(dá)H5蛋白；及ii)爾后自細(xì)胞培養(yǎng)物中回收H5蛋白。H5蛋白之高產(chǎn)量是指(但不限于)約20嗎/ml細(xì)胞培養(yǎng)物以上、優(yōu)選約25i!g/ml以上、甚至更優(yōu)選約30昭/ml以上、甚至更優(yōu)選約40|ig/ml以上、甚至更優(yōu)選約50|ig/ml以上、甚至更優(yōu)選約60|ig/ml以上、甚至更優(yōu)選約80}ig/ml以上、甚至更優(yōu)選約100(xg/ml以上、甚至更優(yōu)選約150ng/ml以上、最優(yōu)選約190ng/ml以上。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例，藉由收獲表達(dá)H5蛋白之全(亦即完整)SF+細(xì)胞來(lái)回收H5蛋白。優(yōu)選細(xì)胞為所述易受含有H5DNA并表達(dá)H5蛋白的適當(dāng)重組病毒載體感染之細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞，且更優(yōu)選地，其包括以商標(biāo)SF+昆蟲(chóng)細(xì)月包(ProteinSciencesCorporation,Meriden,CT)出售的昆蟲(chóng)細(xì)月包。優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)約0.3-2.0xl(^個(gè)細(xì)胞/ml，更優(yōu)選約0.3-1.9xl()S個(gè)細(xì)胞/ml、甚至更優(yōu)選約0.4-1.8xl(^個(gè)細(xì)胞/ml、甚至更優(yōu)選約0.45-1.7xl06個(gè)細(xì)胞/ml,最優(yōu)選約0.5-1.5xl(^個(gè)細(xì)胞/ml。優(yōu)選病毒載體包括桿狀病毒，諸如BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，CA)，尤其是在制備細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞的情況下。盡管桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為優(yōu)選的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，其它表達(dá)系統(tǒng)可用于本發(fā)明之目的，亦即用于使H5表達(dá)至細(xì)胞培養(yǎng)物之上清液中。所述其它表達(dá)系統(tǒng)可能需要使用信號(hào)序列以使H5表達(dá)至培養(yǎng)基中。適當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基亦可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，優(yōu)選生長(zhǎng)培養(yǎng)基為無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基，諸如Excell420(JRHBiosciences,Inc.，Lenexa，KS)及類似培養(yǎng)基。當(dāng)用于感染易感細(xì)胞時(shí)，含有H5DNA序列的重組病毒載體優(yōu)選感染復(fù)數(shù)(MOI)約0.03-1.5、更優(yōu)選約0.05-1.3、甚至更優(yōu)選約0.09-1.1，最優(yōu)選約0.1-1.0。優(yōu)選地，上述MOI是針對(duì)lmL細(xì)胞培養(yǎng)液而言。優(yōu)選地，本文中所述方法包含用MOI(感染復(fù)數(shù))約0.03-1.5、更優(yōu)選約0.05-1.3、甚至更優(yōu)選約0.09-1.1、最優(yōu)選約0.1-1.0的含H5DNA并表達(dá)H5蛋白的重組病毒載體感染0.35-1.9xl(^個(gè)細(xì)胞/ml、甚至更優(yōu)選約0.4-1.8xl(^個(gè)細(xì)胞/ml、甚至更優(yōu)選約0.45-1.7xl()G個(gè)細(xì)胞/ml且最優(yōu)選約0.5-1.5xl06個(gè)細(xì)胞/ml。接著將受感染細(xì)胞培育至多10天、更優(yōu)選約2-10天、甚至更優(yōu)選約4-9天，最優(yōu)選約5-8天。優(yōu)選的培育條件包括溫度約22-32°C、更優(yōu)選約24-30°C、甚至更優(yōu)選約25-29°C、甚至更優(yōu)選約26-28°C,最優(yōu)選約27。C。優(yōu)選地，接種之后觀測(cè)到SF+細(xì)胞具有被桿狀病毒誘導(dǎo)的特征性變異。此種觀測(cè)包括感染后監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度變化及存活力降低。已發(fā)現(xiàn)，感染后3-5天觀測(cè)到峰值病毒效價(jià)，且細(xì)胞中的H5蛋白表達(dá)在第5天與第8天之間且/或在細(xì)胞存活力降至小于10%時(shí)達(dá)到峰值。因此，本發(fā)明一方面提供制備及/或回收重組H5蛋白(優(yōu)選為上述量)的方法i)用具有上述MOI的重組病毒載體感染培養(yǎng)中的大量易感細(xì)胞(見(jiàn)上文)；ii)由重組病毒載體表達(dá)H5蛋白；及iii)爾后收集感染后5-8天的細(xì)胞，且/或收集細(xì)胞存活力降至小于10%之時(shí)的細(xì)胞，A/v中回收H5蛋白。優(yōu)選地，重組病毒載體為含有H5DNA編碼序列的重組桿狀病毒且所述細(xì)胞為SF+細(xì)胞。此外，優(yōu)選定期檢查培養(yǎng)物受污染之宏觀及微觀跡象或感染后細(xì)胞形態(tài)之異常變化。任何呈現(xiàn)任何污染的培養(yǎng)物應(yīng)棄去。為回收在免疫原性或免疫組合物(諸如疫苗)中使用的H5蛋白，優(yōu)選包括滅活步驟以便將病毒載體滅活。"免疫原性或免疫組合物"系指包含至少一種抗原的物質(zhì)組合物，該抗原可在宿主體內(nèi)引發(fā)對(duì)目標(biāo)組合物或疫苗的免疫反應(yīng)，是細(xì)胞性免疫反應(yīng)及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)。通常，"免疫反應(yīng)"包括(但不限于)以下效應(yīng)中之一B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞及/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞及/或y-ST細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主可呈現(xiàn)治療性或保護(hù)性免疫反應(yīng)，以便增強(qiáng)對(duì)新感染之抵抗力及/或降低疾病之臨床嚴(yán)重程度。此保護(hù)作用表現(xiàn)為受感染宿主通常所呈現(xiàn)之癥狀減少或消失、恢復(fù)時(shí)間加快及/或受感染宿主之病毒效價(jià)降低。因此，本發(fā)明亦系關(guān)于制備及/或回收重組H5蛋白(優(yōu)選為上述量)的方法i)用具有上述MOI的重組病毒載體感染培養(yǎng)中的大量易感細(xì)胞(見(jiàn)上文)；ii)由重組病毒載體表達(dá)H5蛋白；及iii)爾后收集感染后5-8天的細(xì)胞，且/或收集細(xì)胞存活力降至小于10%之時(shí)的細(xì)胞，從中回收H5蛋白；及iv)將重組病毒載體滅活。優(yōu)選地，此滅活系在即將進(jìn)行過(guò)濾步驟之前進(jìn)行或在過(guò)濾步驟剛結(jié)束之后進(jìn)行，過(guò)濾步驟之后為優(yōu)選滅活時(shí)間。任何傳統(tǒng)滅活方法可用于本發(fā)明之目的。因此，滅活可藉由化學(xué)及/或物理處理來(lái)進(jìn)行。在優(yōu)選形式中，測(cè)定所收獲流體之體積且使溫度介于約32-42。c之間、更優(yōu)選介于約34-40°c之間且最優(yōu)選介于約35-39。c之間。優(yōu)選滅活方法包括添加環(huán)化二乙烯亞胺(binaryethylenimine，BEI)，此物質(zhì)濃度優(yōu)選為約lmM至約20mM、優(yōu)選為約2mM至約10mM、甚至更優(yōu)選為約2mM至約8mM、甚至更優(yōu)選為約3mM至約7mM、最優(yōu)選為約5mM。舉例而言，滅活包括將優(yōu)選為約0.4M之2-溴伸乙基胺氫溴化物溶液(其已在0.3NNaOH中環(huán)化為0.2M二乙烯亞胺BEI)添加至流體中以得到最終濃度約5mM之BEI。優(yōu)選地，接著將流體連續(xù)攪拌72-96小時(shí)，且可將經(jīng)滅活之收獲流體在-40。C或-4(TC以下冷凍儲(chǔ)存或在約l-7。C之間儲(chǔ)存。滅活完成后，添加硫代硫酸鈉溶液(優(yōu)選為1.0M)以中和任何殘余BEI。優(yōu)選地，碌u代碌u酸鈉的添加量與滅活之前所添加之BEI的量相當(dāng)。舉例而言，在添加BEI至最終濃度為5mM之情況下，添加1.0M硫代硫酸鈉溶液以得到最終最小濃度5mM以中和任何殘余BEI。因此，本發(fā)明之另一方面系關(guān)于一種如下制備重組H5蛋白(優(yōu)選為上述量)的方法i)用具有上述MOI的重組病毒載體感染培養(yǎng)中的大量易感細(xì)胞(見(jiàn)上文)；ii)由重組病毒載體表達(dá)H5蛋白；及iii)爾后收集感染后5-8天的細(xì)胞，且/或收集細(xì)胞存活力降至小于10%之時(shí)的細(xì)胞，從中回收H5蛋白；及iv)將重組病毒載體滅活。優(yōu)選地，重組病毒載體為含有H5DNA編碼序列的桿狀病毒且所述細(xì)胞為SF+細(xì)胞。優(yōu)選滅活步驟為上述步驟。優(yōu)選地，滅活系在約35-39。C且在2mM至8mMBEI存在下、甚至更優(yōu)選在約5mMBEI存在下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明之另一方面，上述方法亦包括步驟iv)之后的中和步驟。此步驟v)包含添加中和溶液中之滅活劑的等量試劑。優(yōu)選地，若滅活劑為BEI,則優(yōu)選添加等量之硫代硫酸鈉。因此，根據(jù)另一方面，當(dāng)滅活劑為BEI時(shí)，步驟v)包含添加硫代硫酸鈉溶液直至最終濃度為約1mM至約20mM、優(yōu)選約2mM至約10mM、甚至更優(yōu)選約2mM至約8mM、甚至更優(yōu)選約3mM至約7mM、最優(yōu)選約5mM。在優(yōu)選形式中且尤其在以免疫原性組合物(諸如疫苗)使用重組H5蛋白之形式中，每一批所收獲的H5蛋白通過(guò)在具有貼壁依賴性、且易被桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞(諸如Sf9細(xì)胞)中傳代來(lái)測(cè)試滅活。在此測(cè)試之一優(yōu)選形式中，將150cn^之適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)單層用1.0mL經(jīng)滅活之H5流體接種且在25-29。C下維持14天，期間至少傳代兩次。在維持期結(jié)束時(shí)，對(duì)細(xì)胞單層檢查H5桿狀病毒所特有之致細(xì)胞病變作用(CPE)。優(yōu)選地，亦使用陽(yáng)性病毒對(duì)照。此等對(duì)照可由以下各物組成一份經(jīng)未滅活之參考H5桿狀病毒接種之Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物及一瓶尚未接種之Sf9細(xì)胞。培育及傳代之后，經(jīng)BEI處理之病毒流體中不存在受病毒感染之細(xì)胞說(shuō)明滅活測(cè)試令人滿意。經(jīng)參考病毒接種之對(duì)照細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)H5桿狀病毒所特有之CPE而未接種燒瓶應(yīng)不呈現(xiàn)任何H5桿狀病毒CPE跡象?；蛘撸诰S持期結(jié)束時(shí)，可收集上清液樣本且將其接種于Sf996孔板上，該孔板已裝載Sf9細(xì)胞，接著在25-29°C下維持5-6天。接著將孔固定，用偶聯(lián)FITC的抗-H5抗體或抗桿狀病毒特異性蛋白(亦即gp64)的任何標(biāo)記抗體染色。經(jīng)BEI處理之病毒流體中不存在CPE、H5表達(dá)或桿狀病毒特異性蛋白(亦即gp64)之表達(dá)說(shuō)明滅活測(cè)試令人滿意。經(jīng)參考病毒接種之對(duì)照細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)CPE及IFA活性，而未接種燒瓶應(yīng)不呈現(xiàn)任何H5桿狀病毒CPE跡象且不含IFA活性。因此，本文所述另一方面系關(guān)于用于測(cè)定表達(dá)H5蛋白之重組病毒載體之滅活有效性的滅活測(cè)試，其包含以下步驟i)使含有重組病毒載體之培養(yǎng)流體之至少一部分與優(yōu)選如上所述之滅活劑接觸；ii)添加優(yōu)選如上所述之中和劑以中和滅活劑；及iii)藉由如上所述之試驗(yàn)測(cè)定殘余感染性。滅活之后，可以多種方式測(cè)定樣本中重組H5蛋白之相對(duì)量。優(yōu)選量化方法包括SDS-PAGE密度測(cè)定法、ELISA及動(dòng)物接種研究，其使已知疫苗量與臨床結(jié)果(血清學(xué)等)相關(guān)。當(dāng)利用SDS-PAGE量化時(shí)，將含有未知量之重組H5蛋白的樣本物質(zhì)連同含有各種已知量之重組H5蛋白的樣本一起在凝膠上展開(kāi)。接著可基于已知樣本形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，且可藉由與此標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)測(cè)定未知樣本中重組H5之量。由于ELISA通常公認(rèn)為抗原量化之行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，因此優(yōu)選利用ELISA進(jìn)行量化。包含H5蛋白或編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子或載體的疫苗根據(jù)另一方面，本發(fā)明系關(guān)于通常包含以下物質(zhì)的疫苗或藥物組合物i.一或多種本文所述H5蛋白；ii.一或多種如本文所述之編碼任何所述H5蛋白的核酸分子；及/或iii.一或多種本文所述載體，其包含如本文所述之任一種所述核酸分子且編碼如本文所述之任何所述H5蛋白；及iv.可藥用載劑及/或賦形劑。如本文所述之術(shù)語(yǔ)"藥物組合物"、"藥物/疫苗組合物"包括(但不限于)用于減少或預(yù)防感染的疫苗或用于治療及減輕感染的物質(zhì)組合物。編碼流感血凝素的基于核酸的疫苗(優(yōu)選cDNA疫苗)的制備例如描述于以下參考文獻(xiàn)中Deck等人,Vaccine1997;15(1):71-78;Ulmer等人，Science1993;259:1745-1749;Ulmer等人，Vaccine1994;12(16):1541隱1544。任何所述方法可用于制備編碼如本文所述之流感H5蛋白的基于核酸的疫苗，優(yōu)選CDNA疫苗。此外，包含本文所述H5蛋白或其部分的疫苗可藉由傳統(tǒng)方法制備，例如藉由重組表達(dá)技術(shù)或藉由生物化學(xué)純化及分離技術(shù)制備。重組表達(dá)技術(shù)(包括在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá))是本領(lǐng)域熟知的且例如描述于以下參考文獻(xiàn)中Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(l989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;DNACloning:APracticalApproach,第I及II巻(D.N.Glover編，1985);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編，1984);NucleicAcidHybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1985)];TranscriptionAndTranslation[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1984)];AnimalCellCulture[R.I.Freshney編(1986)];ImmobilizedCellsAndEnzymes[IRLPress,(1986)];B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);RM.Ausubel等人(編)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.1994)。成熟的重組表達(dá)系統(tǒng)的其它實(shí)例有，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtilis);基于酵母之表達(dá)系統(tǒng)如釀酒酵母(S.cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(S.pombe);或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如基于BHK、CHO及/或NS0的表達(dá)系統(tǒng)。所述系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的且一般可(例如)經(jīng)由ClontechLaboratories,Inc.4030FabianWay,PaloAlto，California94303-4607,USA購(gòu)得。其它表達(dá)策略例如描述于Liischow等人，Vaccine第19期(2001)，第4249-4259頁(yè)或Veit等人，PNAS第103巻(2006)，第8197-8202頁(yè)中。此外，重組腺伴隨病毒系統(tǒng)為成熟系統(tǒng)且描述于例如可供進(jìn)一步參考之US5,436,146或WO200203872中。此外，基于牛痘(痘)病毒之表達(dá)系統(tǒng)(例如，如可供進(jìn)一步參考之US6,265,183中所述)亦為成熟系統(tǒng)且適于制備本發(fā)明用的重組抗原、抗原組合物。其它適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)利用重組的乳多空病毒(如SV40)、禽痘病毒、假型3王犬病病毒及逆4t錄病毒。本文所述相關(guān)藥物/疫苗組合物亦可包含含有本文所述H5蛋白的滅活病毒，含有本文所述H5蛋白的活病毒的非致病形式、含有本文所述H5蛋白的病毒制劑及/或病毒片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以與抗原一起包含于所述組合物/疫苗中的其它組分(參見(jiàn)例如Remington'sPharmaceuticalSciences.(1990),第18版，MackPubl.,Easton)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用已知的生理學(xué)上可接受之無(wú)菌可注射溶液。需要制備即用溶液(aready-to-usesolution)時(shí)，可以很容易地獲得鹽水或相應(yīng)血漿蛋白溶液之類的等滲水溶液。藥物組合物/疫苗可以是凍干制劑或干燥制劑，如組配試劑盒的形式，它們可在無(wú)菌條件下于臨用前用已知的注射液重建。此外，本發(fā)明之藥物/疫苗組合物可包括一或多種獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑。本文中，"獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑"包括(但不限于)任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑及類似載劑。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及類似物。等滲劑尤其可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的石咸金屬鹽。本文所用之防腐劑系指抗;敞生物活性劑，諸如慶大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)及類似物。具體地，制備一種多劑量組合物最優(yōu)選添加防腐劑。所述抗微生物活性劑的濃度足以有效防止目標(biāo)組合物受任何微生物污染或抑制目標(biāo)組合物內(nèi)任何微生物生長(zhǎng)。本文所用之"佐劑"可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂苷(例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals:Inc.,Birmingham,AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。乳液尤其可基于輕質(zhì)液狀石蠟油(歐洲藥典類型)；類異戊二烯油，諸如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；烯烴(尤其異丁烯或癸烯)之寡聚反應(yīng)所產(chǎn)生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。油可與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選為非離子型表面活性劑，尤其脫水山梨糖醇酯、二縮甘露糖醇酯(例如脫水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、異硬脂酸酯、荒麻酸酯或羥基硬脂酸酯(其視情況經(jīng)乙氧基化)；及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產(chǎn)品，尤其L121。參見(jiàn)Hunter等人，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull編，D.E.S.).JohnWileyandSons,NY，第51-94頁(yè)(1995)及Todd等人，Vaccine15:564-570(1997)。適當(dāng)水包油型乳液之實(shí)例為基于Emulsigen的佐劑，諸如EMULSIGEN、EMULSIGEN-D、EMULSIGEN-P、EMULSIGEN-75(MVPLaboratories,Inc.Omaha,NE,USA)。意外發(fā)現(xiàn)，包含H5蛋白、優(yōu)選本文所述重組H5蛋白的藥物/疫苗組合物可以被水包油型乳液，優(yōu)選為所述基于Emulsigen的佐劑，更優(yōu)選EMULSIGEN⑧及EMULSIGEN-D⑧有效輔佐。此夕卜，可使用M.Powell及M.Newman所編之"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"第147頁(yè)所述之SPT乳液及該書(shū)第183頁(yè)所述之乳液MF59。佐劑之另一實(shí)例為選自丙蹄酸或曱基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與鏈烯基衍生物之共聚物的化合物。有益的佐劑化合物為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，尤其與糖或多元醇的聚乙烯基醚形成的交聯(lián)物。所述化合物稱為卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8巻，第2期，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可參考美國(guó)專利第2,909,462號(hào)，其描述與具有至少3個(gè)羥基、優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)羥基之多羥基化合物交聯(lián)的所述丙烯酸聚合物，至少三個(gè)羥基中之氫原子可置換為具有至少2個(gè)碳原子的不飽合脂族基。優(yōu)選基團(tuán)為含有2至4個(gè)碳原子的所述基團(tuán)，例如乙烯基、烯丙基及其它烯鍵式不飽合基團(tuán)。不飽合基團(tuán)本身可含有其它取代基，諸如曱基。以商品名Carbopol(BFGoodrich,Ohio,USA)銷售的產(chǎn)品尤其適用。其與烯丙基蔗糖或烯丙基異戊四醇交聯(lián)。其中可提及Carbopol9MP、9MP及9"P。最優(yōu)選為使用Carbopol971P。在順丁晞二酸酐與烯基衍生物之共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。所述聚合物溶解于水中可產(chǎn)生酸溶液，使該酸溶液中和，優(yōu)選中和至生理pH值，以便得到佐劑溶液，再向其中加入免疫原性、免疫性或疫苗性組合物。其它適當(dāng)佐劑尤其包括(但不限于)RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、單磷酰脂質(zhì)A、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì)胺佐劑、大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組體或其它形式)、霍亂毒素或胞壁酰二肽。優(yōu)選地，佐劑以每劑量約IOO嗎至約10mg之量添加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑量約100昭至約10mg之量添加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑量約500嗎至約5mg之量添加。甚至更優(yōu)選地，佐劑以每劑量約750昭至約2.5mg之量添加。最優(yōu)選地，佐劑以每劑量約1mg之量添加。藥物/疫苗組合物可進(jìn)一步包括一或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，諸如白介素、干擾素或其它細(xì)胞因子。藥物/疫苗組合物亦可包括慶大霉素及>5克柳汞。盡管適用于本發(fā)明之上下文中的佐劑及添加劑之量及濃度可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，但本發(fā)明的組合物可以是，在1ml劑量的疫苗組合物中包含約50[xg至約2000嗎佐劑且優(yōu)選約250(xg佐劑。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋包含約l嗎/ml至約60|xg/ml抗生素且更優(yōu)選小于約30嗎/ml抗生素的疫苗組合物。因此，根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明亦系關(guān)于藥物/疫苗組合物,其包含i.治療有效量之如本文所述之任一種流感病毒H5蛋白，其中該H5蛋白具有氨基酸223N及修飾328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)是指SEQIDNO:l所例示的氨基酸位置且其中修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+);及ii.如上所述之可藥用佐劑。優(yōu)選地，佐劑系選自由以下各物組成之群a)EMULSIGEN⑧一種水包油型乳液(o/w);b)EMULSIGEN-D:—種具有溴化二曱基二-十八烷基銨(DDA)之水包油(o/w)孝L'液；c)Polygen:—種共聚物；d)EMULSIGEN-P,—種具有專有免疫刺激劑的水包油型(o/w)乳液；e)Carbigen為一種交4關(guān)聚合物；f)EMULSIGEN-75:—種包含具有交聯(lián)聚合物之水包油型(oAv)乳液的雙重佐劑；g)ISA70為一種油包水型(w/o)乳液。最優(yōu)選地，所述佐劑為水包油型乳液，諸如選自以下的基于emulsigen的佐齊寸EMULSIGEN、EMULSIGEN-D、EMULSIGEN-P、EMULSIGEN-75、EMULSIGEN及EMULSIGEN-P。最優(yōu)選EMULSIGEN⑧及EMULSIGEN-P⑧用于本發(fā)明之配制劑中。根據(jù)另一方面，如本文中所提供之藥物/疫苗組合物包含一或多種抗原。優(yōu)選地，所述抗原為禽類或哺乳動(dòng)物病原體的抗原。根據(jù)另一實(shí)施例，所述抗原為其它流感抗原，諸如流感病毒之血凝素H3、H7、H9或其它任何血凝素。該(等)其它抗原可以是純化形式、作為抗原制劑之一部分添加，以經(jīng)滅殺微生物之形式或以經(jīng)修飾之活微生物之形式添加。本文術(shù)語(yǔ)"抗原"是指(但不限于)肽、多肽、糖肽或多糖，其能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子(諸如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體)特異性交互作用以便在該抗原所施用之宿主中引發(fā)、活化或刺激針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"抗原"亦指核酸分子，優(yōu)選為DNA分子或RNA分子，其各自編碼且表達(dá)能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子(諸如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體)特異性交互作用的肽、多肽或糖肽，以便引發(fā)、活化或刺激針對(duì)由該核酸分子所編碼的抗原的免疫反應(yīng)。用于制備根據(jù)本發(fā)明使用之藥物組合物的抗原為^f效生物或該;微生物的抗原部分及/或制劑。就此而言，本文術(shù)語(yǔ)"免疫"是指(但不限于)任何《1起或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的情況。術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"已于上文中加以描述。流感疫苗之投藥策略是本領(lǐng)域熟知的。滅活病毒疫苗及減毒病毒疫苗之粘膜接種策略也包括在本發(fā)明內(nèi)。盡管粘膜可通過(guò)局部傳遞疫苗而被鎖定目標(biāo)，但多種策略皆已用于將免疫原性蛋白傳遞至粘膜。在具體實(shí)施例中，可將疫苗與霍亂毒素(諸如霍亂毒素B或霍亂毒素A/B嵌合體)混合或作為結(jié)合型或嵌合型融合蛋白投藥(Hajishengallis,JImmunol,,154:4322-32，1995;Jobling及Holmes,InfectImmun.,60:4915-24,1992)?；谑褂没魜y毒素B亞單位之粘膜疫苗已加以描述(Lebens及Holmgren,DevBiolStand82:215-27，1994)。在另一實(shí)施例中，可制備與熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)之混合物用于粘膜接種。其它粘膜免疫策略包括將病毒嚢封于微嚢中(US5,075,109、US5,820,883及US5,853,763)及使用免疫增強(qiáng)性膜質(zhì)載劑(WO98/0558)。經(jīng)口投藥之免疫原之免疫原性可藉由使用紅細(xì)胞(rbc)或rbc碎片(US5,643,577)或藉由使用藍(lán)舌病抗原(US5，690,938)而得以增強(qiáng)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明系關(guān)于一種制備如上所述之藥物/疫苗組合物的方法，優(yōu)選為一種制備包含如上所述之經(jīng)桿狀病毒表達(dá)之重組H5蛋白的疫苗的方法。通常，此方法包括以下步驟i)將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至病毒內(nèi)，其中該構(gòu)建體包含如本文所述之重組H5cDNA;ii)用經(jīng)轉(zhuǎn)染之病毒感染生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之細(xì)胞；iii)使病毒表達(dá)如本文所述之重組H5蛋白；iv)自培養(yǎng)物回收經(jīng)表達(dá)的H5蛋白；及v)藉由將經(jīng)表達(dá)的H5蛋白與適當(dāng)佐劑及/或其它可藥用載劑摻混而制備組合物。優(yōu)選佐劑為上述佐劑。因此，根據(jù)另一方面，用于激發(fā)抗流感感染之免疫反應(yīng)的抗原組合物(諸如疫苗)的制備方法包含i)制備及回收H5蛋白，及ii)將此蛋白與適當(dāng)佐劑混合。此外，本發(fā)明的疫苗組合物亦可包括稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑及/或防腐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及類似物。等滲劑尤其可包括無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽(例如氯化鈉)、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖、糖類、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之堿金屬鹽。適當(dāng)佐劑為上述佐劑。所述H5蛋白、核酸分子、載體及疫苗中之任一者之醫(yī)藥用途如本文中所提供的H5蛋白、編碼任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(編碼本文所述任何H5蛋白)的載體以及包含該H5蛋白、核酸分子或載體中之任一者的任何藥物/疫苗組合物可用作藥物，優(yōu)選用于治療及預(yù)防由流感病毒、最優(yōu)選由流感A病毒引起的感染。如本文中所提供的H5蛋白、編碼任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(編碼如本文所述之任何所述H5蛋白)的載體以及包含如本文所述之該H5蛋白、核酸分子或載體中之任一者之任何藥物/疫苗組合物可用于人類之治療或預(yù)防且可用于獸醫(yī)藥物中。當(dāng)用于獸醫(yī)藥物中時(shí)，優(yōu)選為治療禽類，優(yōu)選鳥(niǎo)、雞、鴨、火雞及類似動(dòng)物；以及哺乳動(dòng)物，優(yōu)選豬、牛、馬、海豹、駱駝、狗、貓、倉(cāng)鼠、小鼠及類似動(dòng)物。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明系關(guān)于如本文中所提供的H5蛋白、編碼任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(編碼如本文所述之任何所述H5蛋白)的載體以及包含如本文所述之該H5蛋白、核酸分子或載體中之任一者之任何藥物/疫苗組合物的用途，其可用作藥物、優(yōu)選用作人類藥物及/或獸醫(yī)藥物。此外，如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述之編碼任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(編碼任何該H5蛋白)的載體可用于制備如本文所述之藥物組合物，以便預(yù)防或治療由流感病毒引起的感染。如上所述，所述藥物組合物/疫苗組合物可用于人類之治療及/或預(yù)防以及動(dòng)物之治療及/或預(yù)防，所述動(dòng)物諸如禽類，優(yōu)選鳥(niǎo)、雞、鴨、火雞及類似動(dòng)物，以及哺乳動(dòng)物，優(yōu)選豬、牛、馬、海豹、駱駝、狗、貓、倉(cāng)鼠、小鼠及類似動(dòng)物。如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述之編碼任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(編碼任何所述H5蛋白)的載體可用于制備如本文所述之藥物組合物，該藥物組合物適于治療及預(yù)防優(yōu)選由禽、豬或人類流感病毒或其任何組合或混合之流感病毒感染。根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦系關(guān)于一種治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其中該方法包含將治療有效量之本文所述H5蛋白投與需要該治療之受檢者。此外，本發(fā)明亦系關(guān)于一種治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其中該方法包含將治療有效量的如本文所述之編碼如本文所述之任何H5蛋白的任何H5核酸分子或載體投與需要該治療之受檢者。此外，本發(fā)明亦系關(guān)于一種治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其中該方法包含將治療有效量之包含如本文所述之任何該H5蛋白、核酸分子或載體的疫苗投與需要該治療之受檢者。有需要之受檢者可為人類以及動(dòng)物，優(yōu)選為禽類，甚至更優(yōu)選為鳥(niǎo)、雞、鴨、火雞；或哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為豬、牛、馬、海豹、駱駝、狗、貓、倉(cāng)鼠、小鼠及類似動(dòng)物。優(yōu)選地，當(dāng)對(duì)雞進(jìn)行接種時(shí)，可在1日齡時(shí)或1日齡之后(例如在10曰齡時(shí)，或在1日齡至10日齡時(shí)，或在10日齡時(shí)或10日齡之后)使用本文所述H5蛋白接種?？山逵赏杜c任何H5蛋白、編碼該任何H5蛋白的核酸分子或載體或如本文所述之任何藥物/疫苗組合物治療的流感感染優(yōu)選系由禽、豬或人類流感病毒或其任何組合或混合引起。根據(jù)另一方面，本發(fā)明系關(guān)于組配試劑盒，其包含i)如本文所述之該H5蛋白、編碼任何該H5蛋白的核酸分子或載體或包含如本文所述之該H5蛋白、核酸分子或載體中任一者之任何藥物/疫苗組合物中的任一者；及ii)指示該H5蛋白、核酸分子、載體或疫苗用于治療或預(yù)防由流感病毒引起的感染之用途的包裝插頁(yè)。當(dāng)對(duì)雞進(jìn)行接種時(shí)，可在1日齡時(shí)或1日齡之后使用本文所述H5蛋白接種。根據(jù)另一實(shí)施例，彼組配試劑盒包含禽類或哺乳動(dòng)物病原體之至少另一種抗原及指示彼另外抗原之醫(yī)藥、人類或獸醫(yī)學(xué)用途的信息。實(shí)施例以下實(shí)施例闡述本發(fā)明之優(yōu)選物質(zhì)及方法。然而應(yīng)了解，所述實(shí)施例僅為說(shuō)明而提供，且不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明之整體范圍之限制。實(shí)施例1構(gòu)建編碼及表達(dá)HAH5抗原的重組桿狀病毒如下生成含有H5HA抗原的重組桿狀病毒化學(xué)合成H5HA(SEQIDNO:2)之編碼序列且將其再克隆入轉(zhuǎn)移載體pVL1392(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，CA)內(nèi)。藉由使用寡核苦酸引物及QuikChange⑧定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，LaJolla,CA)生成H5HAMutK+(SEQIDNO:4)且將其再克隆入轉(zhuǎn)移載體pVL1392(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego,CA)內(nèi)。接著用DiamondBac(Sigma)桿狀病毒DNA將含有編碼H5HA抗原共轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(BDBiosciencesPharmingen)內(nèi)以生成含有編碼SEQIDNO:2之基因H5HA及編碼SEQIDNO:4之基因H5HAmutK+的重組桿狀病毒。將含有編碼H5HA(SEQIDNO:2)及H5HAMutK+(SEQIDNO:4)之基因的重組桿狀病毒進(jìn)行空斑純化，且將主種子病毒(MasterSeedVirus;MSV)于SF+細(xì)胞林上繁殖，制成等分試樣且在-7(TC儲(chǔ)存。昆蟲(chóng)細(xì)胞為生成MSV或工作種子病毒(WorkingSeedVirus)的目的而感染了上述H5HA桿狀病毒，結(jié)果所述細(xì)胞表達(dá)H5HA抗原(SEQIDNO:2)及H5HAMutK+抗原(SEQIDNO:4)，這通過(guò)用多克隆血清或單克隆抗體經(jīng)間接焚光抗體試驗(yàn)或Western印跡法一企測(cè)。用適量重組桿狀病毒(分別為H5HA及H5HAMutK+)接種后，接著將含有SF+細(xì)胞(ProteinSciences,Inc.,Meriden,CT)的旋轉(zhuǎn)瓶在27±2。C培育7天，期間以100rpm攪拌。所述旋轉(zhuǎn)瓶使用通氣蓋以使空氣流動(dòng)。收獲含有經(jīng)桿狀病毒感染之SF+細(xì)胞的粗制全細(xì)胞培養(yǎng)物及各培養(yǎng)物之細(xì)胞培養(yǎng)上清液。實(shí)施例2制備包含HAH5抗原之藥物組合物(疫苗)收獲由基于桿狀病毒之表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的粗制全細(xì)胞H5HA蛋白及H5HAMutk+蛋白。將桿狀病毒在5mM環(huán)化二乙烯亞胺(BEI)(最終濃度)之存在下、在約32。C-39。C滅活72至96小時(shí)。滅活完成后，添加0.3M硫代硫酸鈉溶液直至最終濃度為5mM，以中和任何殘余BEI。中和后，添加各種佐劑且生成以下疫苗/藥物組合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>上清液。該疫苗輔以Emulsigen-75佐劑。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>l.引論實(shí)施例3對(duì)豬進(jìn)行接種以防御禽流感此研究之目的系測(cè)定含有重組H5血凝素(HA)抗原之粗提取物之實(shí)驗(yàn)性疫苗在豬體內(nèi)誘導(dǎo)血凝抑制(HI)效價(jià)的能力。用H5HA抗原評(píng)價(jià)各種佐劑。此研究中評(píng)價(jià)的HAH5原型(prototype)含有來(lái)自傳統(tǒng)H5HA或H5HAMutK+的抗原。傳統(tǒng)H5HA系源自A/鴨/China/E319-2/03,而H5HAMutK十是傳統(tǒng)H5HA經(jīng)改造后在S120N、D150N、S223N及328mutK+含有三個(gè)特定氨基酸變異。其亦含有氨基酸94N。H5HAMutK+中之特定氨基酸變異產(chǎn)生更類似于A/HK/213/03之HA的H5HA。目前認(rèn)為A/HK/213/03之H5HA之氨基酸組成有助于H5HA之抗體識(shí)別。2.研究設(shè)計(jì)表1:研究概述<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>研究開(kāi)始時(shí)，仔豬為3周±5日齡。研究開(kāi)始時(shí)，仔豬在臨床上為健康的。在研究第0日、第21日及第35日獲得血樣。在研究第1日至第35日每日觀測(cè)全部研究動(dòng)物之一般健康狀況。在每次接種后七天，每天查看注射部位且記錄可見(jiàn)到的反應(yīng)。在研究日第35曰動(dòng)物研究期結(jié)束時(shí)，對(duì)全部動(dòng)物施以人道安樂(lè)死。3.疫苗用實(shí)施例2所述的疫苗501至514進(jìn)行豬4^種研究。4.血凝素抑制試-瞼在第0日及第21日用含有H5HA之原型對(duì)豬進(jìn)行接種。在第0曰、第21日、第35日收集豬血清以便藉由血凝抑制(HI)試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)行HI試驗(yàn)以檢測(cè)HA特異性抗體之存在。異源H5N2病毒(A/雞/Mexico/232/94)系以四個(gè)血凝單位[4HA單位]之濃度用于HI試驗(yàn)中。隨后在U形底微量滴定板中，將在PBS中連續(xù)兩倍稀釋之血清液與等體積(25pL)(含有4HA單位)之病毒混合，且在室溫(約25。C)培育30分鐘。將PBS中之濃度為0.5%之雞紅細(xì)胞添加至含有血清-病毒之孔中，室溫培育40分鐘。以觀測(cè)到血凝抑制的最高血清稀釋度之倒數(shù)確定HI效價(jià)。5.結(jié)果HI測(cè)試使用Mexican政府法定(o伍cial)之H5N1抗原(A/雞/Mexico/232/94)[4HA單位]，接種方案為第0日及第21日1x1mL。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>BIVH5(來(lái)源于流感A病毒(A/鴨/China/E319-2/03(H5N1))BIVH5K+(突變之BIVH5,有S120N、D155N、S223N，且增添328K+)結(jié)果證明，大多數(shù)疫苗組合物在被接種的豬中引發(fā)免疫反應(yīng)。尤其，大多數(shù)疫苗組合物引起血清轉(zhuǎn)化，這意味著，大多數(shù)被接種的豬針對(duì)HI試驗(yàn)所用禽流感病毒產(chǎn)生特異性抗體?？傊?，這些結(jié)果清楚且無(wú)疑地證明，本發(fā)明極其奏效。藉由用禽流感病毒之相關(guān)抗原對(duì)豬進(jìn)行接種，可大大降低豬(即第二物種的動(dòng)物)被禽流感病毒(即第一物種的病原體)廣泛流行性感染之風(fēng)險(xiǎn)。這已得到清楚證明。此外，依據(jù)此接種概念，禽流感病毒向哺乳動(dòng)物(包括人類)傳播并適應(yīng)的情況大大減少。豬是禽病原體(包括禽流感病毒)最重要的貯主(reservoir)之一。若病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制以及由此而及的禽流感對(duì)豬適應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)大大降低且得以控制，則禽流感病毒對(duì)人類適應(yīng)之風(fēng)險(xiǎn)亦大大降低。在施用抗原產(chǎn)生較低HI效價(jià)(是指效價(jià)低于30)之情況下，需要用抗原進(jìn)一步加強(qiáng)免疫，以進(jìn)一步提高HI效價(jià)且增強(qiáng)被接種的豬體內(nèi)的免疫保護(hù)。因此，效價(jià)低并不是指無(wú)法獲得保護(hù)，其僅表明可能需要進(jìn)一步加強(qiáng)免疫以促進(jìn)免疫反應(yīng)。被接種的豬體內(nèi)可測(cè)量到免疫反應(yīng)，這一事實(shí)證明，本發(fā)明是極其有效的。換而言之，本文所提供之實(shí)驗(yàn)清楚且無(wú)疑地證明，本發(fā)明奏效。實(shí)施例4對(duì)鳥(niǎo)進(jìn)行接種以防御禽流感1.引論此研究之目的系測(cè)定含有重組H5mutk+血凝素(H5HAmutk+)抗原之粗提取物之實(shí)驗(yàn)性疫苗在雞體內(nèi)誘導(dǎo)血凝抑制(HI)之能力。用傳統(tǒng)重組H5抗原(H5HA)以及滅;舌疫苗VolvacAI(BoehringerIngelheimVetmedica,Mexico)作為對(duì)照。此外，用H5HA抗原評(píng)價(jià)多種佐劑。2.研究設(shè)計(jì)1日齡或IO日齡的SPF鳥(niǎo)(15-25只)各自獨(dú)立地用0.5ml不同實(shí)驗(yàn)性疫苗在頸背部藉由皮下途徑接種；實(shí)驗(yàn)期間所有鳥(niǎo)隔離祠養(yǎng)。不限量提供食物及水。接種后第31日或第32日，用H5N2高致病性禽流感病毒抹進(jìn)行攻擊。接種后第15日、第30日，自鳥(niǎo)頸靜脈放血獲得血清樣本。所得血清在4。C儲(chǔ)存，直至進(jìn)行實(shí)施例3所述血凝抑制(HI)測(cè)試以獲得抗體效價(jià)。3.疫苗及攻擊病毒獨(dú)立評(píng)價(jià)四種不同配制劑1Z專纟克油乳液H5HAMutk+:4安照BoehringerIngelheimVetmedica的方法，將H5HAmutk+抗原配制在油乳液(弗氏不完全佐劑(Freundincompleteadjuvant))中。2.S印picH5HAMutk+:根據(jù)供貨商的建議，將H5HAmutk+抗原與非傳統(tǒng)的佐劑(ISA206，W/0/W，獲自Seppic)—起配制。3.H5HA傳統(tǒng)油乳液:4安照BoehringerIngelheimVetmedica的方法，將H5HA抗原配制在油乳液(弗氏不完全佐劑)中。4.SeppicH5HA:根據(jù)供貨商的建議，將H5HA抗原與非傳統(tǒng)的佐劑(ISA206，W/O/W,獲自Seppic)—起配制。用禽流感BoehringerIngelheimVetmedica油乳液疫苗作為對(duì)照VolvacAI(BoehringerIngelheimVetmedica,Mexico)。對(duì)于經(jīng)過(guò)接種及未經(jīng)接種的雞，每只經(jīng)鼻內(nèi)途徑接種0.2ml1067CEID的H5N2攻擊病毒進(jìn)行攻擊。攻擊后，記錄病征及死亡率。接種后第10日，將所有幸存的雞按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序施以人道安樂(lè)死。4.結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>陽(yáng)性血清效價(jià)根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)而考慮log24?；诖藰?biāo)準(zhǔn)，血清學(xué)結(jié)果為陰性，但與基線相比時(shí)，觀測(cè)到某些陽(yáng)性值。在l日齡或10日齡接種的鳥(niǎo)體內(nèi)觀測(cè)到，與油佐劑及與H5HAMutk+抗原一起配制的疫苗具有最好的血清學(xué)效價(jià)。在與Seppic及與H5HA抗原一起配制的原型中觀測(cè)到最低的血清學(xué)效價(jià)。在攻擊研究中觀測(cè)到，疫苗原型提供保護(hù)作用，用傳統(tǒng)油乳液疫苗與H5HAMutk+抗原一起配制時(shí)尤其如此。攻擊研究中觀測(cè)到SeppicH5HA具有最低的保護(hù)作用，死亡率為68%。相比之下，10日接種的鳥(niǎo)相比于1日齡接種的鳥(niǎo)，觀測(cè)到最高的血清學(xué)效價(jià)。權(quán)利要求1.流感病毒H5蛋白，其具有氨基酸223N及修飾328K+，其中該H5蛋白的氨基酸位置編號(hào)指SEQIDNO1中所例示之氨基酸位置，且其中該修飾328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二個(gè)賴氨酸(K+)。2.權(quán)利要求1的H5蛋白，其中該H5蛋白具有氨基酸94N。3.權(quán)利要求1或2的H5蛋白，其中該H5蛋白具有氨基酸120N。4.權(quán)利要求1-3之一的H5蛋白，其中該H5蛋白具有氨基酸155N。5.權(quán)利要求1-4之一的H5蛋白，其中該H5蛋白具有一或多個(gè)選自下組的氨基酸簇a.aa93-95:GNFb.aa123-125:SDHc.aa128-130:SSGd.aa138-140:GSSe.aa226-228:MDFf.aa270-272:EVEg.aa309-311:NKL。6.權(quán)利要求l-5之一的H5蛋白，其中該H5蛋白包含肽，該肽包含i.SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6之氨基酸序列；或ii.任何與多肽i)有至少85%序列同源性、且在標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中有血凝素抑制活性的肽；或iii.多肽i)或ii)中包含至少8個(gè)毗鄰氨基酸的任何部分，其在標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制試驗(yàn)中有血凝素抑制活性；或iv.肽i)、ii)或iii)之任一，其具有以下氨基酸中之一者36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120S、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A或263T;或v.肽i)、ii)、iii)或iv)之任一，其具有一或多個(gè)選自以下的氨基酸簇a.aa93-95:GNFb.aa123-125:SDHc.aa128-130:SSGd.aa138-140:GSSe.aa226-228:MDFf.aa270-272:EVEg.aa309-311:NKL。7.權(quán)利要求l-6之一的H5蛋白，其中該H5蛋白來(lái)源于禽流感病毒。8.權(quán)利要求1-7之一的H5蛋白，其中該H5蛋白包含SEQIDNO:4之氨基酸序列。9.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白。10.載體，其包含權(quán)利要求9的核酸分子。11.疫苗，其包含a.權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白、權(quán)利要求9的核酸分子或權(quán)利要求10的載體；及b.可藥用載劑及/或賦形劑。12.權(quán)利要求11的疫苗，其中該賦形劑為一或多種佐劑。13.權(quán)利要求12的疫苗，其中所述佐劑為基于Emulsigen的佐劑。14.權(quán)利要求11至13之一的疫苗，其中該疫苗包含一或多種抗原。15.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述抗原為禽類病原體或哺乳動(dòng)物病原體的抗原。16.權(quán)利要求15的疫苗，其中所述抗原為流感病毒的H3、H7或H9。17.制備權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白的方法，包括以下步驟a.分離或擴(kuò)增編碼該H5蛋白的核酸；b.將該H5編碼核酸克隆至表達(dá)載體內(nèi)；c.表達(dá)該H5蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中該表達(dá)載體為重組桿狀病毒。19.權(quán)利要求17或18的方法，其中該H5蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。20.制備包含權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白的疫苗的方法，包括a.獲得權(quán)利要求1至9之一的H5蛋白；b.將步驟a)的H5蛋白與可藥用載劑及/或賦形劑混合。21.制備包含權(quán)利要求9之H5核酸或權(quán)利要求10之載體的疫苗的方法，其中該方法包含以下步驟a.獲得權(quán)利要求9的H5核酸分子或權(quán)利要求10的載體；b.將步驟a)的H5核酸分子或載體與可藥用載劑及/或賦形劑混合。22.將權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白用作藥物的用途。23.將權(quán)利要求9的核酸分子用作藥物的用途。24.將權(quán)利要求10的載體用作藥物的用途。25.將權(quán)利要求11至16之一的疫苗用作藥物的用途。26.權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防或治療由病毒性流感引起的感染。27.權(quán)利要求9的核酸分子用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防或治療由病毒性流感引起的感染。28.權(quán)利要求10的載體用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防或治療由病毒性流感引起的感染。29.權(quán)利要求26至28之一的用途，其中該病毒性流感感染由禽流感病毒、豬流感病毒、或人流感病毒、或它們的任何組合或雜種引起。30.治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其包括對(duì)需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1-8之一所述H5蛋白。31.治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其包括對(duì)需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求9所述H5核酸或權(quán)利要求10所述載體。32.治療或預(yù)防流感病毒感染的方法，其包括對(duì)需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求11-16之一所述包含H5蛋白的疫苗。33.權(quán)利要求30-32之一的方法，其中該流感病毒感染由禽流感病毒、豬流感病毒、或人流感病毒、或它們的任何組合或雜種引起。34.組配試劑盒，其包含a.權(quán)利要求1至8之一的H5蛋白、權(quán)利要求9的核酸分子、權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求11至16之一的疫苗；及b.包裝插頁(yè)，其說(shuō)明用a)的H5蛋白、核酸分子、載體或疫苗治療或預(yù)防由流感病毒引起的感染的用途。35.權(quán)利要求34的組配試劑盒，其包含至少一種其它的禽類病原體抗原或哺乳動(dòng)物病原體抗原。全文摘要本發(fā)明系關(guān)于新穎的血凝素H5蛋白、編碼所述H5蛋白的核酸及載體，以及包含所述H5蛋白、編碼所述H5蛋白的核酸或載體中之任一者的疫苗。此外，本發(fā)明亦系關(guān)于所述組合物中之任一者用于人類及動(dòng)物之醫(yī)藥用途。文檔編號(hào)A61K39/00GK101553248SQ200780040131公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日發(fā)明者于爾根·德姆根,保利諾·C·岡薩雷斯-赫爾南德茲,埃里克·M·沃恩申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司