專利名稱：：大部分為二天線、二唾液酸和非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因因子Ⅶ合成物的制作方法大部分為二天線、二唾液酸和非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物
背景技術(shù)：
：因子VII(FVn)是一種維他命K依賴糖蛋白，在其活化形態(tài)(FVIIa)下參與凝血過(guò)程，在存在鈣和組織因子的情況下活化因子x和因子ix。fvii以具有406個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈形態(tài)分泌，其分子量約為50kDa。FVII包含四個(gè)特別的結(jié)構(gòu)域N端Y-羧基域(Gla)、兩個(gè)"類表皮生長(zhǎng)因子(EGF)"域、以及絲氨酸蛋白酶域。將FVII活化為FVIIa是以精氨酸,52-異亮氨酸153域(精氨酸152-異亮氨酸153)連接的裂解為特征的。因此，F(xiàn)VIIa由具有分子量約為20kDa的具有152個(gè)氨基酸的輕鏈、和分子量約為30kDa的具有254個(gè)氨基酸的重鏈組成，兩條鏈通過(guò)單二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。血漿FVila(FVIIa，p)包含幾種翻譯后修飾前十個(gè)谷氨酸被，羧基化，Asp63(天冬氨酸)被部分羥化，Ser52(絲氨酸52)和Ser6o(絲氨酸60)被氧-糖基化，并攜帶葡萄糖(木糖)。-2和巖藻糖成分，分別地，Asn,45(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通過(guò)二天線的二唾'液酸化(bisialylated)的復(fù)合聚糖結(jié)構(gòu)而N-糖基化。FVII用于治療表現(xiàn)為因子Vin(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失的血友病病人，以及對(duì)于表現(xiàn)出凝血因子的其他缺失的病人，例如，F(xiàn)VII的先天性缺失。FVII還用于腦血管意外的治療。因此有必要獲得注射用FVIIa濃縮物。獲取FVIIa濃縮物的最古老的方法為從通過(guò)分餾所獲得的血漿蛋白質(zhì)中提純FVIIa。為這一目的，EP0346241描述了富含F(xiàn)VIIa的餾分的制備，其在吸附后獲得，接著洗提包含F(xiàn)VII、FVIIa以及其他蛋白質(zhì)的血漿蛋白質(zhì)的分餾副產(chǎn)物，即PPSB的預(yù)洗提液(P:凝血素或FII，P-轉(zhuǎn)變加速因子前體或FVII,S-斯圖亞特因子或FX,以及B-抗血友病因子B或FIX),其他蛋白質(zhì)例如為因子4IX(FIX)、X(FX)和II(FII)。這種方法的缺點(diǎn)是獲取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。同樣的，EP0547932描述了基本上不含維他命K依賴因子和FVIII的高純度FVIIa濃縮物的制備過(guò)程。通過(guò)這一過(guò)程獲得的FVII盡管其純度高，但仍表現(xiàn)出殘留的形成血栓活性。這些方法的主要缺點(diǎn)是它們只能獲得低產(chǎn)量的產(chǎn)品。而且，從獻(xiàn)血者采集的血漿的量仍然受到限制。因此，自從二十世紀(jì)八十年代，編碼人體因子VII的DNA被分離出來(lái)(Hagend"/.(1986);Proc.Natl.Acad.Sci.USA;Apr83(8):2412-6),并在哺乳動(dòng)物BHK細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎)中進(jìn)行表達(dá)(EP0200421)。申請(qǐng)人提交的專利申請(qǐng)F(tuán)R0604872也描述了FVIIa在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的生產(chǎn)。通過(guò)這些生產(chǎn)方法獲得的蛋白在病毒或其他致病劑污染方面更為安全。而且，這些方法獲得蛋白具有基本序列，即在不同氨基酸之間的等同于基本人類序列的鏈。然而，人類血漿FVII包含復(fù)雜的翻譯后修飾前十個(gè)谷氨酸被Y-羧基化，Asp63(天冬氨酸63)被部分羥化，Ser52(絲氨酸52)和Ser6o(絲氨酸60)被氧-糖基化，并攜帶葡萄并i(木糖)。-2和巖藻糖成分，分別地，Asn^(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通過(guò)二天線的二唾液酸化(bisialylated)的復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。特別的，N-聚糖的加入(連接到天冬酰胺的聚糖)對(duì)于外源蛋白的蛋白質(zhì)的正確折疊、體內(nèi)體外穩(wěn)定性、生物活性以及藥代動(dòng)力學(xué)(例如，生物處理能力)尤其重要。因此，全部或部分翻if后修飾的變化4吏得蛋白一方面有失活的危險(xiǎn)，另一方面還有致免疫的風(fēng)險(xiǎn)。目前，現(xiàn)有的重組或轉(zhuǎn)基因因子VII由于其在不同于人類系統(tǒng)中的表達(dá)，而表現(xiàn)出與人類血漿FVII不同的糖基化，該糖基化能導(dǎo)致針對(duì)重組蛋白的抗體的增加，從而導(dǎo)致其效率低于提純自人類血漿的人類FVII。因此，需要獲得治療性或預(yù)防性的FVIIa合成物，其功能性質(zhì)接近于提出自人類血漿的人類FVII,而且其生產(chǎn)方法能滿足該蛋白的大量需求。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明涉及一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物，該合成物的每個(gè)因子VII分子含有結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中，與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子VII合成物相比，大部分為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。申請(qǐng)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，大部分為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物與具有較低比率的二唾液S吏化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII相比，即與大部分為二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII相比，其生物處理能力(biodisponibility)更強(qiáng)、清除率更低以及穩(wěn)定性更高。因此，與具有較低比率的二唾液酸化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物相比，即與大部分為單唾液酸化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物相比，本發(fā)明的FVII可以以更低頻率以及以更低的用量提供給病人。生物處理能力指的是分散到血液循環(huán)中并尤其是因此易于到達(dá)出血位點(diǎn)的施加的FVII的百分比。清除率指的是完全純化的理論體積的百分率，即每時(shí)間單元不再含有FVII。換句話說(shuō)，它對(duì)應(yīng)于在一時(shí)間單元區(qū)間內(nèi)完全不含物質(zhì)的流體的假定量。穩(wěn)定性指的是FVII在其完全有效的指定期間內(nèi)維持其化學(xué)、物理、微生物活性以及生物藥性的能力《二k線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu);〉指的是下列結(jié)構(gòu)A2結(jié)構(gòu)(二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化):唾液酸:半乳糖:N-乙酰葡糖胺(GlcNAc):甘露糖這些聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到由天冬酰胺145(Asnl45)和天冬酰胺322(Asn322)組成的N-糖基化位點(diǎn)。事實(shí)上，本發(fā)明的FVII象人類FVII—樣包含兩個(gè)位于145和322位置的N-糖基化位點(diǎn)和兩個(gè)位于52和60位置的O-糖基化A-」位點(diǎn)。在一個(gè)n-糖基化位點(diǎn)，寡糖鏈連接到一個(gè)天冬酰胺(n-連接)。在一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，寡糖鏈連接到一個(gè)絲氨酸。因此，本發(fā)明的FVII的每個(gè)分子包含兩個(gè)寡糖N-連接鏈。然而，合成物的FVII分子并不表現(xiàn)出均一的糖基化，即所有的N-連接寡糖鏈不相同。問(wèn)題在于其為不同聚糖結(jié)構(gòu)的混合物。事實(shí)上，無(wú)論是血漿的、重組的還是轉(zhuǎn)基因的，任何FVII都是幾種FVII蛋白的混合物，這些蛋白表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，尤其是糖基化和指定糖形。該糖基化是一翻譯后過(guò)程，該翻譯后過(guò)程是由細(xì)胞單元通過(guò)在不同細(xì)胞分區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)移Fvn蛋白而實(shí)現(xiàn)的。這一生化修飾強(qiáng)烈的修飾了蛋白，最終的蛋白完美的被結(jié)構(gòu)化，并因此具有活性，而且能被有機(jī)體良好的耐受。這一化學(xué)修飾促進(jìn)了蛋白活性的調(diào)節(jié)和定位。因此，對(duì)于所有的FVII合成物以及所有的合成物中的N-連接寡糖鏈而言，fvii合成物中的每個(gè)聚糖結(jié)構(gòu)或者每個(gè)糖的比率能夠被量化。本發(fā)明中，不同聚糖結(jié)構(gòu)的比例并沒(méi)有考慮o-糖基化。《Fvn合成物》指的是一種合成物，該合成物中唯一的分子實(shí)體是Fvn,優(yōu)選是被活化了的。合成物中的每個(gè)FVII分子表現(xiàn)i相同的基本序列，但是不同分子的糖基化不同。因此，《fvii合成物》指的是具有相同基本序列的分子混合物，特征在于其聚糖結(jié)構(gòu)的含量。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)《FVn》和《FVII合成物》是等同的。因此，本發(fā)明的內(nèi)容中，"Fvn"指的是fvii分子本身，或者指的是具有上述提到的特征的FVII分子混合物。本發(fā)明的Fvn合成物是一種主要含有二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的FVII合成物。這意味著在合成物的所有N-連接寡糖中，即在所有的連接到因子FVII的N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)中，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)占大多數(shù)。有利的，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于或等于30%、40%、50%、60。/。、70%、80%、90%、或者95%。特別有利的，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于或等于45%。特別有利的，二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率在45-60%之間，優(yōu)選的在50-60%之間。唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以通過(guò)HPCE-LIF分析(高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法)和/或NP-HPLC(正相高效液相色譜)確定，通過(guò)測(cè)量對(duì)應(yīng)于不同聚糖的峰的面積而進(jìn)行量化。唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率或者還可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法確定。本發(fā)明FVII合成物也能含有少量的二天線、單唾液酸化結(jié)構(gòu)和三天線結(jié)構(gòu)，以及不表現(xiàn)出唾液酸的中性結(jié)構(gòu)?！吨亟M或轉(zhuǎn)基因Fvn》指的是通過(guò)基因工程獲得的任何Fvn,即通過(guò)細(xì)胞生產(chǎn)的FVII,通過(guò)基因重組對(duì)該細(xì)胞的DNA進(jìn)行修飾，以使其表達(dá)FVII分子并表現(xiàn)出所述的糖基化特征。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)錄，接著在細(xì)胞宿主或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)對(duì)編碼FVII的DNA分子進(jìn)行修飾，進(jìn)而獲得本發(fā)明的Fvn。本發(fā)明的重組或轉(zhuǎn)基因Fvn能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的允許在生物系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。更特別的，《重組vn》指的是在人工培養(yǎng)的細(xì)胞系中通過(guò)基因重組和表達(dá)獲得的任何FVII。例如，下列的細(xì)胞系BHK(幼倉(cāng)鼠腎)和即BHKtk-tsl3(CRL10314,WaediterandBaserga,尸rac.7V^/.5W.L/SJ79:1106-1110.1982)、CHO(ATCCCCL61)、COS-1(ATCCCRL1650)、HEK293(ATCCCRL1573;Grahametal.,/Ge".Wro/.36:59-72,1977)、RatHepI(大鼠肝癌；AT(5cCRL1600)、RatHepII(大鼠肝癌；ATtCCRL1548)、TCMK(ATCCCCX139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)以及DUKX細(xì)胞(CHO細(xì)胞系)(UrlaubandChasin,iVoc.A^/.Jcad>SW.77:4216-4220，1980)、3T3纟田胞、Namalwa細(xì)胞、或者適于無(wú)血清培養(yǎng)基的BHK細(xì)胞(US6,卯3,06外而且，更特別的，《轉(zhuǎn)基因FVII》指的是通過(guò)在動(dòng)物或者植物活體組織內(nèi)的基因重組和表達(dá)獲得的任何FVII。本發(fā)明的二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率能通過(guò)不同方法獲得。特別的，例如，本發(fā)明的FVII在能夠傳授所述的糖基化特征的微生物、細(xì)胞、植物或者動(dòng)物內(nèi)表達(dá)，所述的糖基化特征即為大部分為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)。更特別的，例如，本發(fā)明的FVII在不能獲得主要為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的FVII合成物的微生物、植物或動(dòng)物內(nèi)表達(dá)，接著在體外使用一個(gè)或多個(gè)酶進(jìn)行唾液酸化，以獲得所需的唾液酸化，即二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)成為占大部分，三天線結(jié)構(gòu)成為三唾液酸化結(jié)構(gòu)。例如，由于其良好的性質(zhì)，在合適的條件下，唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以用來(lái)在體外作用FVII合成物，以獲得需要的唾液酸化。因此，本發(fā)明的FVII合成物易于通過(guò)唾液酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)部分唾液酸化的FVII合成物(起始Fvn合成物)進(jìn)行作用獲得。有利的，起始Fvn合成物大部分為二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)。有利的，起始FVII合成物大部分為二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用允許在單唾液酸化結(jié)構(gòu)上^l妄枝一個(gè)另外的唾液酸，以將其轉(zhuǎn)換成二唾液酸化結(jié)構(gòu)。有利的，這些二天線、單唾液酸結(jié)構(gòu)在起始Fvn合成物中的比率高于40%,特別有利的，比率高于50%或者60°/。。有利的，起始FVII合成物中二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于20%,或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50。/。。有利的，起始FVII合成物中至少部分唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。優(yōu)選的，起始FVII合成物的所有唾液酸含有a2-6連接。在一特別的實(shí)施例中，如果起始FVII合成物包含太多比率的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，例如高于50%、或者高于60%,就有可能通過(guò)使用一個(gè)或多個(gè)允許對(duì)合成物去巖藻糖基化的酶而獲得二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)。例如，k用巖藻糖基酶經(jīng)過(guò)一段必須的時(shí)間，用+獲得大部分為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。特別有利的，根據(jù)其低的免疫原性而選擇起始FVII合成物。有利的，起始合成物為專利FR0604872中所描述的FVII合成物，該專利也被視為包含在本申請(qǐng)文件中。有利的，本發(fā)明的FVII是一種多肽，其肽序列可以是天然人類FVII的肽序列，即存在于人類中的與FVII相關(guān)的沒(méi)有問(wèn)題的序列。這樣的序列能夠被編碼，例如通過(guò)EP0200421所描述的序列l(wèi)b進(jìn)^"編碼。有利的，本發(fā)明的FVII序列為SEQIDNO:l序列.在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII可以是天然人類FVII的變異體，只要該變異體不比天然FVII更免疫原性。因此，該變異體的肽序列能表現(xiàn)出與天然人類FVII至少70。/。、有利的為至少80%或90%、更有利的為至少99%的同一性，該變異體具有與人類fvii基本相同的生物活性。而且，本發(fā)明的Fvn還指的是經(jīng)過(guò)修飾的任何Fvn序列，與天然人類FVii相比，該蛋白的生物活性降低。例如，用于治療或預(yù)防血栓形成的重組失活人類FVII,FFR隱FVIIa(Holst&a/"Eur丄Vasc.Endovasc.Surg"1998Jun,15(6):515-520)。這些FVII為多肽，其氨基酸序列不同于人類FVII的序列，該區(qū)別為一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、刪除或替代。本發(fā)明的FVII的生物活性能夠通過(guò)使用FVII-缺陷血漿和凝血活酶測(cè)量FVII合成物引起血凝的能力而量化，例如US5997864所描述的。生物活性通過(guò)與對(duì)照樣品相比的凝血時(shí)間的減少來(lái)表達(dá)，轉(zhuǎn)化為與含有l(wèi)單元(1UFVII活性)/ml血清的標(biāo)準(zhǔn)人類血清對(duì)比的《FVn單元》。本發(fā)明的FVII合成物具有接近于血漿FVII的糖基化特征。事實(shí)上，血漿FVII(或者血漿FVII合成物)的主要N-聚糖結(jié)構(gòu)也是二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)。有利的，本發(fā)明的FVII合成物中二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)(巖藻糖基化的和非巖藻糖基化的)的比率高于30%、或者高于40%、或者高于50%。特別有利的，二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率高于60%、或者高于70%、或者高于80%、或者高于90%。特別有利的，二唾液酸化結(jié)構(gòu)(巖藻糖基化的和非巖藻糖基化的)的比率在50%-80%之間，或者在60%-90%之間，優(yōu)選的在70%-85%之間。有利的，本發(fā)明的FVI'I合成物的巖藻糖比率高于20。/。，有利的在26%-50%之間。這一比率相當(dāng)于測(cè)得的FVII合成物的所有聚糖結(jié)構(gòu)的巖藻糖比率。這一特征是本發(fā)明的FVII的優(yōu)勢(shì)之一。事實(shí)上，商購(gòu)的重組FVII表現(xiàn)出100%的巖藻糖基化，而血漿FVII的巖藻糖基化比率大約為16。/。。因此，本發(fā)明的Fvn的巖藻糖基化接近于血漿Fvn的巖藻糖基化，這給本發(fā)明的Fvn帶來(lái)了無(wú)毒的優(yōu)勢(shì)。有利的，本發(fā)明的因子VII合成物中至少部分唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。因此，本發(fā)明的FVII合成物的含有a2-6連接的唾液酸的比率不為0。而這在血漿FVII中也含有，相對(duì)于商購(gòu)的重組FVII僅包含含有a2-3連接的唾液酸，這為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物中所有的唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，所有的唾液酸含有a2，6連接，即為所有的唾液酸都通過(guò)a2,6連接結(jié)合到半乳糖，而且，特別的至少90。/。的FVn的唾液酸含有a2,6連接。而且，本發(fā)明的FVII合成物包含含有a2-3連接的唾液酸。10事實(shí)上，合成物的FVII的唾液酸中含有a2，6分支是本發(fā)明FVII的優(yōu)勢(shì)之一。實(shí)際上，商購(gòu)的重組FVII的唾液酸僅含有a2,3連接。血漿FVII是這兩種異構(gòu)體的混合物。這樣，血漿FVII含有例如為40%的a2,3異構(gòu)體和60。/。的a2，6異構(gòu)體。然而，由于本發(fā)明的FVII含有更多的a2,6連接，這使得本發(fā)明的FVII更接近于血漿FVII。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物的一些唾液酸含有a2-3連接。因此，本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且含有a2-6連接的唾液酸的比率高于90%。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子VII相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且含有a2-6連接的唾液酸的比率為100%。本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且FVII合成物的巖藻糖比率在20。/。-50%之間。本發(fā)曰月的一個(gè)特別的實(shí)施例中，合成物的重組或fe基因Fvn與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，所有的唾液酸含有a2-6連接，且FVII合成物的巖藻糖比率在20%-50%之間。有利的，本發(fā)明的Fvn合成物易于通過(guò)非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生產(chǎn)。因此，在這一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物被認(rèn)為為《轉(zhuǎn)基因》。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物指的是任何非人類哺乳動(dòng)物，基因改變后用于表達(dá)一外源蛋白，例如兔、山羊、小白鼠、大鼠、牛、馬、豬、昆蟲、綿羊，該列舉為非限制性的。外源蛋白為Fvn,優(yōu)選為人類Fvn。非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物除了表達(dá)Fvn外，還能表達(dá)一外源酶，以對(duì)轉(zhuǎn)基因FVII進(jìn)行需要的唾液酸化。由于這個(gè)原因，非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能共同表達(dá)編碼Fvn的基因和編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明的一特別的實(shí)施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因FVII在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)，并在其奶中生產(chǎn)。由于這個(gè)原因，轉(zhuǎn)基因表達(dá)以組織依賴的方式，通過(guò)能保證在動(dòng)物的乳腺中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。例如為WAP啟動(dòng)子(乳清酸蛋白)、酪蛋白啟動(dòng)子、尤其是(3-酪蛋白或a-酪蛋白啟動(dòng)子、(3-乳球蛋白啟動(dòng)子、a-乳if求蛋白啟動(dòng)子，該列舉是非限制性的。'有利的，本發(fā)明的FVII合成物易于通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)，所述合成物還經(jīng)受體外唾液酸化，以使其大部分為二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)。由于兔對(duì)朊病毒不敏感，尤其是對(duì)可轉(zhuǎn)移的海綿狀亞急性腦病這一主要7>共健康問(wèn)題不敏感，因而兔是用于生產(chǎn)藥用蛋白的特別有利的物種。而且，兔和人之間的種間屏障也是重要的。相反，人和倉(cāng)鼠之間的種間屏障的重要性要低，其中倉(cāng)鼠是生產(chǎn)商購(gòu)重組FVII的生物系統(tǒng)。括非傳統(tǒng)朊病毒致病劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII為在轉(zhuǎn)基因雌兔的乳腺中生產(chǎn)。通過(guò)乳腺分泌感興趣的蛋白，允許分泌物進(jìn)入轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，其包含以組織依賴方式對(duì)重組蛋白表達(dá)的控制。表達(dá)的組織控制是由于允許蛋白表達(dá)到動(dòng)物的特定組織的序列而實(shí)現(xiàn)的。這些序列即為啟動(dòng)子序列以及信號(hào)肽序列。驅(qū)動(dòng)感興趣蛋白在乳腺中表ii的啟動(dòng)子例如為WAP啟動(dòng)子(乳清酸蛋白)、酪蛋白啟動(dòng)子、尤其是p-酪蛋白或a-酪蛋白啟動(dòng)子、(3-乳球蛋白啟動(dòng)子、a-乳球蛋白啟動(dòng)子，該列舉是非限制性的。一個(gè)特別有利的方式，在雌兔乳腺中的表達(dá)是在(3-酪蛋白啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行的。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奶中生產(chǎn)重組蛋白的方法包括下列步驟包含編碼人類FVII的基因的DNA分子的合成，該基因在天然分泌蛋白到奶中的啟動(dòng)子的控制下，集成到非人類哺乳動(dòng)物的胚胎中。該胚胎接著被植入到相同種類的雌性哺乳動(dòng)物中。一旦從胚胎獲得的哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)足夠了，其會(huì)分泌乳汁，接著收集奶。奶中包含感興趣的轉(zhuǎn)基因FVII。EP0264166描述了在非人類雌性哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白的例子，其給出的教導(dǎo)可用于本發(fā)明FVII的生產(chǎn)。EP0527063描述了在非人類雌性哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白的另一個(gè)例子，其給出的教導(dǎo)可用于本發(fā)明FVII的生產(chǎn)。含有a2-6連接。一個(gè)特別優(yōu)選的方式，所有的唾液酸含有ot2,6連接，尤其是，至少90%的FVII的唾液酸含有oc2,6連接。而且，本發(fā)明的FVII合成物可以包含含有a2-3連才妄的唾液酸。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。在雌兔中表達(dá)的Fvn合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大部分是非巖藻糖基化的。有利的，這些二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚^"結(jié)構(gòu)在FVII合成物中的比率高于20。/。。有利的，這一比率高于25%、或者高于40%。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的合成物中FVII的巖藻糖基化比率在20-50%之間。本發(fā)明的另一實(shí)施例中，這一比率低于15%。從雌兔種獲得的轉(zhuǎn)基因FVII包含數(shù)個(gè)翻譯后修飾前九個(gè)或十個(gè)N-端谷氨酸被Y-羧基化，Asp63(天冬酰胺63)被部分羥化，Sers2(絲氨酸52)和Ser6。(絲氨酸60)被氧-糖基化，并分別攜帶葡萄糖(木糖)?！?和巖藻糖成分，Asm45和Asn322主要通過(guò)二天線、單唾液酸化的聚糖復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。FR0604872描述了在雌兔乳腺中生產(chǎn)這樣的FVII合成物，'其內(nèi)容并入本教導(dǎo)中。通過(guò)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在奶中生產(chǎn)FVII可以使用本領(lǐng)域公知技術(shù)來(lái)從奶中純化。例如，US6，268，487中描述了從奶中純化感興趣蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)將奶通過(guò)具有足夠孔隙度的膜進(jìn)行切向過(guò)濾，以形成滯留物和透過(guò)物，透過(guò)物含有外源蛋白，b)對(duì)透過(guò)物用利用色鐠的采集裝置進(jìn)行處理，以轉(zhuǎn)移出外源蛋白并獲得一流出物，c)合并流出物和滯留物，d)重復(fù)步驟a)到c)直到分離脂中的FVII、酪蛋白膠粒，并直到FVII應(yīng)被回收至少75%。申請(qǐng)人提交的FR0604864中描迷了另一個(gè)從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)的Fvn的純化技術(shù)，并引入其內(nèi)容以供參考。對(duì)含在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奶中的Fvn的提取和純化方法(方法A),包含下列步驟a)從奶中提取Fvn,因子vn與所述奶中4丐的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽和/或復(fù)合物相結(jié)合，通過(guò)向奶中加入可溶性鹽來(lái)獲得釣化合物沉淀，其陰離子具有能形成所述不溶鈣化合物以用這種方式從所述鹽和/或復(fù)合物中釋放因子vn,因子VII存在于液相中；b)把富含蛋白的液相從鈣化合物沉淀中分離，所述液相再被分離成脂相和含有蛋白的水性非脂相；C)對(duì)水性非脂相進(jìn)行親和層析步驟，該步驟使用預(yù)定濃度的基于磷酸鹽的洗脫緩沖液；d)對(duì)根據(jù)步驟c)獲得的因子vn洗提液進(jìn)行兩次或三次弱堿性陰離子交換柱的層析步驟，使用適合于對(duì)保留在所述柱上的因子vn進(jìn)行連續(xù)洗提的緩沖液。事實(shí)上，申請(qǐng)人驚奇的注意到，即使置于在抗乳血清中天然生產(chǎn)的蛋白啟動(dòng)子的控制下，例如，在WAP啟動(dòng)子或(3-酪蛋白啟動(dòng)子的控制下，F(xiàn)VII仍然易于與奶中的釣離子結(jié)合，并因此易于與酪蛋白膠束結(jié)合。申請(qǐng)人提交的FR0611536中描述了另一個(gè)對(duì)從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)Fvn的純化技術(shù)，并引入其內(nèi)容以供參考。對(duì)含在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奶中的Fvn的提取和純化方法(方法B)，包含下列步驟a)撇清并脫脂所述奶；,b)在能允許所述蛋白保留在所述載體上的pH條件下，將含有所述蛋白的撇清脫脂部分進(jìn)行通過(guò)層析載體，該層析載^具有表現(xiàn)出疏水和離子特性的接枝配體；c)蛋白的洗提；d)通過(guò)從所述洗提部分中移除奶蛋白，對(duì)洗提部分進(jìn)行純化；并且e)回收所述蛋白。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)FVII合成物時(shí)，對(duì)其進(jìn)行體外唾液酸化，以使二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)占多數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施例中，唾液酸化是通過(guò)1"吏用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的，例如a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(或者(3-D-半乳糖-pi,4-N-乙酰基-P-D-氨基葡萄糖-a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)、或者半乳糖(31,3乙酰氨基半乳糖a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者半乳糖-(31,3(4)-乙酰氨基半乳糖-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者乙酰氨基半乳糖a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I，這些酶都是商購(gòu)的。優(yōu)選的，使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種能允許通過(guò)a2,6連接轉(zhuǎn)移唾液酸的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。事實(shí)上，有利的，本發(fā)明的FVII合成物具有包含a2-6連接的唾液酸，因?yàn)樵摦悩?gòu)體在血漿FVII中更多。唾液酸化可以4吏用唾液S吏供體底物進(jìn)行，例如，唾液酸或者任何含有一個(gè)或多個(gè)唾液酸基團(tuán)并易于釋放唾液酸基團(tuán)的分子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，如果酶為a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，底物為胞苷—5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，該底物在一適合于唾液酸,人唾液酸供體基團(tuán)轉(zhuǎn)移到FVII的反應(yīng)介質(zhì)中，二天線、二唾液酸結(jié)構(gòu)成為主要。該反應(yīng)介質(zhì)可以為基于例如由嗎啉-3-丙磺酸組成的緩沖液，以及基于例如為吐溫的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，底物可以在反應(yīng)介質(zhì)中合成，該介質(zhì)中包括胞苷單磷酸(CMP)-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及能使得反應(yīng)發(fā)生的足夠量的二《介金屬陽(yáng)離子。例如，二價(jià)金屬陽(yáng)離子為鈣離子、鋅離子、鎂離子、鉻離子、銅離子、鐵離子或者鈷離子。無(wú)論什么方法應(yīng)用來(lái)實(shí)現(xiàn)FVII合成物的唾液酸化，反應(yīng)總是在足夠的時(shí)間和合適的條件下進(jìn)行，以使得二唾液酸化結(jié)構(gòu)增加到足夠以占大多數(shù)。只供參考的是，反應(yīng)可以至少進(jìn)行0.5小時(shí)，且尤其是至少5小時(shí)，特別有利的是7小時(shí)、或者8小時(shí)、9小時(shí)、甚至10小時(shí)。優(yōu)選的，培育在夜間進(jìn)行。特別的，該反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間在5小時(shí)到12小時(shí)之間。有利的，本發(fā)明的合成物的FVII是活化的(FVIIa)。由于這個(gè)原因，跟據(jù)FVII(未活化的)代表FVIIa與組織因子的相互作用，F(xiàn)VIIa能表現(xiàn)出凝固能'力高于FVII(未活化的)25-100倍。FVII體'夕卜的活化是通過(guò)用二硫鍵連接的兩個(gè)鏈中的不同的蛋白酶(FIXa,FXa,FVIIa)對(duì)酶原的分裂得到的。FVIIa單獨(dú)表現(xiàn)出非常弱的酶活性，但是和輔因子復(fù)合時(shí)，組織因子(TF)通過(guò)活化FX和FIX而觸發(fā)凝固過(guò)程。FVIIa是負(fù)責(zé)止血的凝固因子，例如在帶有循環(huán)抗體的血友病中。在一特別有利的方式中，本發(fā)明的FVII完全被活化。有利的，本發(fā)明的FVIIa包含數(shù)個(gè)翻譯后修飾前九個(gè)或十個(gè)N-端谷氨酸被Y-羧基化，AspM被部分羥化，Ser52和Ser6()被氧-糖基化，并分別攜帶葡萄糖(木糖)。-2和巖藻糖成分，Asn!45和Asri322主要與二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖復(fù)合結(jié)構(gòu)而被N-糖基化。FVII的活化也能由一體外的方法獲得，例如，通過(guò)本發(fā)明的FVII的純化(參見(jiàn)實(shí)施例2)。因此，F(xiàn)VIIa由具有分子量約為20kDa的具有152個(gè)氨基酸的輕鏈、和分子量約為30kDa的具有254個(gè)氨基酸的重鏈組成，兩條鏈通過(guò)單二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。因此，本發(fā)明的FVII是一種活化的FVII,其活性和結(jié)構(gòu)接近于血漿FVII。通過(guò)與組織因子(TF)的相互作用，F(xiàn)Vna表現(xiàn)出的凝血凝力高于FVII25-IOO倍。15本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)VII能被因子X(jué)a、VIIa、IIa、IXa和XIIa體外活化。本發(fā)明的FVII也能被其自身的純化過(guò)程活化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用本發(fā)明的FVII合成物作為藥物。本發(fā)明的另一目的是將根據(jù)本發(fā)明的因子VII合成物用于制備用于治療血友病病人的藥物。出血性創(chuàng)傷的藥物。本發(fā)明的另一目的是將根據(jù)本發(fā)明的因子VII合成物用于制備用于治療由于抗凝藥過(guò)量而出血的藥物。本發(fā)明的另一目的是一種含有根據(jù)本發(fā)明的因子VII和賦形劑和/或藥物可接受載體的藥物合成物。本發(fā)明的另一目的是用于制備重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物的方法，該合成物的每個(gè)因子VII分子包含連接到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，所述合成物的所有因子VII分子中，二天線、二唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)，包括一唾液酸化步驟，通'過(guò)將如上所述的部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或t組因子VII合成物與唾液酸供體底物和唾液酸轉(zhuǎn)移酶在合適的保留唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間和在合適的允許從唾液酸供體底物向FVII轉(zhuǎn)移唾液酸的條件下，所述二唾液酸化結(jié)構(gòu)增長(zhǎng)到足夠占大多數(shù)。進(jìn)行反應(yīng)的條件如上和實(shí)施例中所述?！恫糠滞僖核峄分傅氖荈VII合成物的連接到N的聚糖結(jié)構(gòu)未全被二唾液酸化，即有些結(jié)構(gòu)為單唾液酸化。有利的，這些二天線、單唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率高于40%，特別有利的高于50%,或者高于60%。有利的，二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于20%，或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50%。有利的，唾液酸轉(zhuǎn)移酶為a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(或者(3"0-半乳糖-(31，4-N-乙酰基-(3-D-氨基葡萄糖-ct2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)、或者半乳糖(31,3乙酰氨基半乳糖a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者半乳糖-(31,3(4)-乙酰氨基半乳糖-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者乙酰氨基半乳糖a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I。優(yōu)選的，使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種能允許通過(guò)a2，6連接轉(zhuǎn)移唾液酸的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。事實(shí)上，本發(fā)明的FVII合成物具有包含a2-6連接的唾液酸是一種優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵摦悩?gòu)體在血漿FVII中更多。唾液酸化能用任何唾液酸供體底物進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，如果酶為a2，6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，底物為刀包苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，該底物在一適合于唾液酸,人唾液酸供體基團(tuán)轉(zhuǎn)移到FVII的反應(yīng)介質(zhì)中，二天線、二唾液酸結(jié)構(gòu)成為主要。反應(yīng)介質(zhì)可以是基于生物兼容的表面活性劑混合物，例如濃度為0.01%到0.2。/。的Tween⑧80或Triton⑧X-100或者上述的混合物，或者濃度為5mM-10mM之間的二4介金屬陽(yáng)離子，優(yōu)選的例如為Ca"、Mn2+、Mg2+、或Co2+、Ca2+。該反應(yīng)介質(zhì)還能進(jìn)一步包括離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑和/或保持介質(zhì)pH的試劑，例如從40mM到60mM之間不同濃度的二鉀砷酸鈉、嗎啉-3-丙磺酸、Tris和NaCl。pH值典型的為6-7.5之間。反應(yīng)介質(zhì)能進(jìn)一步包含濃度范圍在0.05-0.15mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)。根據(jù)另一實(shí)施例，底物可以在反應(yīng)介質(zhì)中通過(guò)向該介質(zhì)中可I入CMP-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及足夠量的二價(jià)金屬陽(yáng)離子而合成，例子如上所述。無(wú)論應(yīng)用什么方法來(lái)實(shí)現(xiàn)Fvn合成物的唾液酸化，反應(yīng)總是在足夠的時(shí)間和合適的條件下進(jìn)行，以使得二唾i酸化結(jié)構(gòu)增加到足夠以占大多數(shù)，如前所定義。當(dāng)方法使用一固定化酶，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選在0.5-3小時(shí)之間，有利的，溫度在4-37。C之間，優(yōu)選的在4-20。C之間。當(dāng)方法在一間歇反應(yīng)中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選在l-9小時(shí)之間，優(yōu)選的在l-6小時(shí)之間，反應(yīng)溫度有利的在4-37。C之間，優(yōu)選的在4-20。C之間。優(yōu)選的，本發(fā)明的方法的目的是提高部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或重組因子VII合成物的生物處理能力。該生物處理能力的提高是通過(guò)將所述合成物與唾液酸供體底物、唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸而獲得的，如前所闡述。《提高生物處理能力》指的是與唾液酸化沒(méi)有被修飾的相同的FVII合成物相比，F(xiàn)VII合成物的生物處理能力提高了至少5。/。、或者至少10%、或者有利的至少30%或50%、優(yōu)選的至少80%或90%。在另一特別的實(shí)施例中，在唾液酸化步驟之前，進(jìn)行半乳糖基化步驟。該步驟的目的是在半乳糖-缺陷的結(jié)構(gòu)上接枝半乳糖，半乳糖-缺陷的結(jié)構(gòu)即為FVII的無(wú)半乳糖(agalactosylated)和單半乳糖結(jié)構(gòu)，半乳糖被固定到GlcNAc上，并且易于在接下來(lái)的唾液酸化步驟中易于固定唾液酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人17員公知的是，該半乳糖基化步驟可以通過(guò)使用半乳糖基-轉(zhuǎn)移酶在包含UDP-gal尿苦(5'-二磷酸半乳糖)的反應(yīng)介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)，有利的，部分唾液酸化的FVII合成物的大部分聚糖結(jié)構(gòu)是一復(fù)合的二天線、單唾液酸化型。這些聚糖結(jié)構(gòu)如下圖所示唾液酸半乳牆N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)甘露糖巖藻糖本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施例中，部分唾液酸化的FVII合成物中還包括二天線非唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)、三天線非唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)、以及二唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)的復(fù)合結(jié)構(gòu)。有利的，在部分唾液酸化的FVII的合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大部分聚糖結(jié)構(gòu)是非巖藻糖基化的。有利的，部分唾液酸化的FVII合成物表現(xiàn)出至少部分唾液酸包含a2-6連接，如前所述。優(yōu)選的，方法還包括在唾液酸化步驟之前的，通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因FVII合成物的步驟。該步驟也如前所述。該步驟還可以在半乳糖基化步驟之前進(jìn)行。有利的，部分唾液酸化FVII合成物的FVII是活化的?；Y(jié)構(gòu)占大多數(shù)。有利的，唾液酸供體基團(tuán)是胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，唾液酸轉(zhuǎn)移酶是oi2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。這樣的部分唾液酸化FVII合成物可以是在轉(zhuǎn)基因雌兔的乳腺中生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因FVII合成物。特別有利的，部分唾液酸化的FVII合成物為專利FR0604872中所描述的合成物，該專利的內(nèi)容也被視為包含在本申請(qǐng)文件中。本發(fā)明優(yōu)勢(shì)的更多方面將在下列實(shí)施例中描述，這些實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。縮略語(yǔ)FVII-Tg=FVIIa-Tg:根據(jù)本發(fā)明的活化的轉(zhuǎn)基因FVIIFVII-r=FVIIa-r:商購(gòu)的重組活化FVIIFVII-p=FVIIa-p:血漿來(lái)源的活化的FVII,即/人人類血漿中純化得到的MALDI-TOF:基質(zhì)輔助i敫光解片斤電離-飛4亍時(shí)間iffCE-LIF:高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光'ESI-MS:質(zhì)譜-電離《電噴霧》LC-ESIMS:液相色語(yǔ)-質(zhì)譜-電離《電噴霧》NP-HPLC:正相高效液相色譜PNGaseF:肽N-糖普酶FLC-MS:液相色譜-質(zhì)譜圖1:對(duì)實(shí)施例1中獲得的FVII合成物的提取與純化圖2'.攜帶N-糖基化位點(diǎn)的肽的去巻積(deconvoltuted)質(zhì)譜ESI圖3:通過(guò)PNGaseF對(duì)FVII去糖基化之后的HPCE-LIF的電泳圖譜圖例頂端電泳圖FVIIa,p;兩條中央電泳圖語(yǔ)FVII-Tg;底端電泳圖FVIIa，r圖4:用NP-HPLC得到的FVII特征；圖例最上面色鐠圖FVIIa,p;中間色譜圖FVII-Tg;底端色譜圖FVIIa,r圖5:使用MALDI-TOFMS對(duì)FVII-Tg的主要聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定圖6:使用MALDI-TOFMS對(duì)FVIIa,r的主要聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定圖7:體外再次唾液酸化的HPCE-LIF分析天然FVII-Tg的寡糖圖(底端)；再次唾液酸化后的FVII-Tg的寡糖圖(頂端)圖8:根據(jù)二天線二唾液酸化非巖藻糖基化(A2)的和巖藻糖基化的(A2F)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的百分比的FVII-Tg唾液酸化動(dòng)力學(xué)圖9:在兔中初步PK(藥代動(dòng)力學(xué))比較研究的結(jié)果轉(zhuǎn)基因非唾液酸化FVII(FVIITgNRs)與轉(zhuǎn)基因唾液酸化FVII(FVIITgRS)比較消除的半對(duì)數(shù)曲線具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:在轉(zhuǎn)基因雌兔的奶中生產(chǎn)人類FVII蛋白首先，通過(guò)將WAP基因序列引入(在文件Devinoyda/,NucleicAcidsResearch,vol.16,no.16,25August1988,p.8180中描述)到p-polyIII-I載體的多連接子中(在文件Lathe&Gene(1987)57,193-201中描述)而制備質(zhì)粒pl。從質(zhì)粒pl獲得的質(zhì)粒p2，包含兔的WAP基因啟動(dòng)子和人類FVII的基因。轉(zhuǎn)基因雌兔通過(guò)傳統(tǒng)的顯孩t注射技術(shù)(Brinster&a/，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，4438-4442)獲得。包含500份基因拷貝的l-2pl被注入鼠胚胎的雄原核中。包含重組基因的該質(zhì)粒的Not1-Notl片段被顯微注射。之后，胚胎被轉(zhuǎn)移到激素制備的繼承性雌性的輸卵管中。約10%的被操作的胚胎產(chǎn)生幼兔，而2%到5%的被操作的胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的幼兔。轉(zhuǎn)基因的存在通過(guò)對(duì)提取自兔尾的DNA進(jìn)行Southem轉(zhuǎn)換技術(shù)來(lái)顯示。動(dòng)物血液中以及奶中FVII的濃度通過(guò)特異性放射免疫檢測(cè)得到計(jì)算。FVII的生物學(xué)活性通過(guò)將奶加入到細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)或者兔哺乳動(dòng)物外植體培養(yǎng)介質(zhì)中而進(jìn)行評(píng)估。實(shí)施例2:對(duì)獲得的FVII的提取和純化a)FVII的提取取500ml全原奶，用9倍體積的0.25M、pH8.2的磷酸鈉稀釋。室溫下攪拌30分鐘后,對(duì)富含F(xiàn)VII的水相在15。C下10000g離心l小時(shí)(離心機(jī)SorvallEvolutionRC-6700rev/min-轉(zhuǎn)子SLC-6000)。約835ml的6罐是必需的。離心后，存在三個(gè)相在表層的脂相(乳脂)，清澈富含F(xiàn)VII的水性非脂相(主要相)以及剩余的白色固相(不溶性酪蛋白和鈣化合物沉淀)。20通過(guò)蠕動(dòng)泵收集富含F(xiàn)VII的水性非脂相，直至脂相。脂相單獨(dú)回收。固相(沉淀)；波去除。然而，水性非脂相仍然含有非常少量的脂，對(duì)其通過(guò)一系列過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾(PallSLK7002U010ZP-孔徑為1pm的玻璃纖維預(yù)濾器-之后PallSLK7002NXP-孔徑為0.45fmi的尼龍66)。在過(guò)濾的最后，脂相通過(guò)該過(guò)濾系列，奶中的脂肪球被完全截留，且濾出液是清澈的。過(guò)濾過(guò)的非脂水相接著在超濾膜上進(jìn)行透析(MilliporeBiomax50kDa-0.1m2)以使其與層析相相容。分子量約為50kDa的FVII不濾過(guò)該膜，這與奶中的鹽、糖以及肽不同。第一時(shí)間內(nèi)，溶液(約5000ml)被濃縮到500ml,接著維持這個(gè)恒定體積，通過(guò)超濾膜透析以去除電解質(zhì)，并制備用于層析步驟的生物材料。透析緩沖液是0.025M的磷酸鈉緩沖液，pH8.2。含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含F(xiàn)VII-tg的抗乳血清中。該制備物在后繼處理前被保存于-30°C。這步的FVII的總回收率非常令人滿意90%(用磷酸鹽提取91%+透析/濃縮99%)。這一^得到的包含F(xiàn)VII的非脂水相完全清澈，并i于后續(xù)層析步驟。在這一步中，提取了大約93000IU的FVII-Tg。制備的FVII的純度在0.2。/。的級(jí)別。b)FVII的純化1.羥磷灰石膠上的層析(親和層析)用BioRad陶資羥磷灰石I型膠(CHT-I)填充Amicon90柱(直徑9cm-橫截面64cm2)。該膠用水性緩沖液A平衡，A由0.025M磷酸鈉和0.04氯化鈉的混合物組成，pH8.0。存于-30。C的所有制備物用水浴在37。C解凍，直到冰塊完全溶解，接著注入到膠上(直線流動(dòng)速率100cm/h,即105ml/min)。未保留的部分利用緩沖液的通過(guò)而去除，直到回到基線(RBL),該緩沖液由0.025M磷酸鈉和0.04M氯化鈉組成，pH8.2。含有FVII-Tg部分用緩沖液B實(shí)施洗提，該緩沖液由0.25M磷酸鈉和0.4M氯化鈉組成，pH8.0。收集洗提部分，直到回到基線。通過(guò)波長(zhǎng)(X)為280nm處的吸收測(cè)量檢測(cè)該化合物。該層析可以回收超過(guò)90y。的FVI1-Tg,同時(shí)去除超過(guò)95%的乳蛋白。該特異活性(S.A.)增加了25倍。在這一步，可獲得約85000IU的FVII-Tg,純度為4%。2.1OOkDa切向過(guò)濾以及50kDa濃縮/透析前一步驟得到的所有的洗提液在切向才莫式下通過(guò)1OOkDa超濾膜(PallOMEGASC100K-0.1m2)過(guò)濾。FVII濾過(guò)100kDa的膜，同時(shí)分子量超過(guò)100kDa的蛋白不能濾過(guò)。之后，濾過(guò)的部分一皮進(jìn)一步濃縮到約500ml體積，接著如前所述，在50kDa的超濾器上透析。透析緩沖液使用0.15M的氯化鈉。在這階段的處理中，產(chǎn)品在進(jìn)行離子交換層析前被保存于-30。C。這一階段可以減少分子量超過(guò)100kDa蛋白的量，并且尤其是酶前體。在100kDa膜上的處理可以截留留約50。/。的蛋白，其中為高分子量蛋白，同時(shí)濾過(guò)95%的FVn-Tg,即濾過(guò)82000IU的FVII-Tg。該處理可以減少后續(xù)步驟中的蛋白酶水解的風(fēng)險(xiǎn)。3.在Q-S印harose⑧FF上的層析(步驟d)-方法A這在離子交換膠Q-SepharoseFastFlow(QSEF)上進(jìn)行的連續(xù)三步層析是為了對(duì)活性成分進(jìn)行純化，以允許將FVn活化為活化FVII(FVIIa),以及最終濃縮并制備為FVII合成物。通過(guò)波長(zhǎng)(人)為280nm處的吸收測(cè)量檢測(cè)該化合物。3.1O-SepharoseFF1步-洗提<〈高鉤》用100mlQ-Sepharose⑧FF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.6cm(橫截面5.3cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。保存于-30。C的所有部分在37。C水浴中解凍，直到所有冰塊都溶解。該部分先用平衡緩沖液稀釋到1/2[v/v]，再注入到膠(流速13ml/min,即直線速度150cm/h),未保留部分隨后隨緩沖液的通過(guò)去除，直到RBL。對(duì)具有低FVn含量的第一蛋白部分用0.05M的Tris和0.15M氯化鈉、pH7.5的緩沖液以9ml/min(即100cm/h)洗提，并隨后被去除。用0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.05M氯化鈣、pH7.5的緩沖液對(duì)富含F(xiàn)VII的第二蛋白部分以9ml/min(即100cm/h)洗提。如前所述，對(duì)該第二部分在50kDa的超濾器上進(jìn)行透析。透析緩沖液為0.15M的氯化鈉。該部分在第二次通過(guò)陰離子交換層析前在夜間被存儲(chǔ)于十4。C。這一步可以回收73%的FVII(即60000IU的FVII-Tg),同時(shí)消除80%的結(jié)合蛋白。這一步還使得將FVII活化成FVIIa。3.2O-SepharoseFF2步-洗4是W氐釣》用30mlQ-SepharoseFF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。先對(duì)存儲(chǔ)于+4。C的先前的洗提部分(第二部分)進(jìn)行稀釋，再將其注入到膠上(9ml/min,即直線流速100cm/h)。在注入第二部分后，對(duì)該膠用平衡緩沖液沖洗以去除不保留的部分，直到RBL。對(duì)含有非常高純度FVH的部分用0.05M的Tris、0.05M氯化鈉和0.005M氯化鉤、pH7.5的緩;中液以4.5ml/min(即50cm/h)洗提。約23000IU的FVII-Tg凈皮純化，即12mg的FVII-Tg。這一步可以消除超過(guò)95%的結(jié)合蛋白(雌兔奶蛋白)。該純度高于90%的洗提液表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)與功能特征接近天然人類FVII分子。該洗提液在第三次離子交換層析時(shí)被濃縮和制備。3.3QSepharoseFF3歩—洗4是《鈉》用10miQ-SepharoseFF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。在注入所述部分后，對(duì)該膠用平衡緩沖液沖洗以去除不保留的部分，直到RBL。前一步驟中洗提、純化的部分用注射用純水(PWI)稀釋五倍，然后注入到膠中(流速4.5ml/min,即直線速度50cm/h)。之后，用0.02M的Tris和0.28M氯化鈉、pH7.0的緩沖液以3ml/min(即36cm/h)對(duì)FVn-Tg進(jìn)行洗提。純度高于95%的FVII-Tg合成物被制備出來(lái)。該產(chǎn)品適于靜脈注射。該方法累積產(chǎn)率為22%,因此每升被處理的奶可以純化出至少20mg的FVn。表A再現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例用于生產(chǎn)純化FVII合成物的方法步驟，并提供了每步獲得的不同產(chǎn)率、純度和特異活性。然后，對(duì)FVII-Tg合成物進(jìn)行不同的結(jié)構(gòu)分析，例如下列實(shí)施例所示。實(shí)施例3:通過(guò)MS-ESI對(duì)糖基化位點(diǎn)和糖肽進(jìn)行表征通過(guò)LC-ESIMS(/MS)鑒別FVII-Tg、FVIIa,p(血漿FVII)以及FVIIa,r的N-糖基化位點(diǎn)，通過(guò)MALDI-TOFMS進(jìn)行證實(shí)，通過(guò)LC-ESIMS對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的不同聚糖的相對(duì)比例進(jìn)行確定。圖2描述了包含兩個(gè)糖基化天冬酰胺殘基的糖肽的去巻積ESI光譜。通過(guò)MALDI-TOF(/TOF)和Edman測(cè)序?qū)μ腔稽c(diǎn)的位置進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)分別表現(xiàn)出N-糖基化位點(diǎn)Asn!45和Asn322的FVna,p的糖肽1]0123-11152]和的質(zhì)譜分析顯示存在二天線的、二唾液酸的、未巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2)(觀察到的含有Asn^的糖肽質(zhì)量5563.8Da)以及巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的帶有Asnl45的糖肽質(zhì)量5709.8Da)。同樣注意到，Asn145存在三天線的、三唾液酸的、未巖藻糖基化(A3)(觀察到的質(zhì)量'6220.0Da)和巖藻糖基化(A3F)(觀察到的質(zhì)量6366.1Da)。對(duì)于轉(zhuǎn)基因FVIIa，p，Asnw被A2F、A1F型聚糖所修飾，"A1F"對(duì)應(yīng)于其他天線帶有GalNAc端位置的單唾液酸化結(jié)構(gòu)。注意到有聚糖A3F(三天線、三唾液酸化、巖藻糖基化結(jié)構(gòu))的存在。對(duì)于FVII-Tg，對(duì)分別帶有N-糖基化位點(diǎn)Asnw5和Asn322的FVII-Tg的糖肽和[K3L6-R353]的質(zhì)譜分析顯示存在著二天線的、二唾液酸的、未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(A2)(觀察到的含有Asn!45的糖肽質(zhì)量5563.8Da)和巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的質(zhì)量5709.7Da)。位于Asnw5的大部分寡糖為二天線、單唾液酸、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1)(觀察到的質(zhì)量5272.3Da)和巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的質(zhì)量5418.7Da)。三天線結(jié)構(gòu)幾乎不存在。需要注意的是在其他天線的端位置沒(méi)有帶有GalNAc的單唾液酸化結(jié)構(gòu)存在。關(guān)于ASI1322的主要糖型，可以觀察到不同比例的相同聚糖結(jié)構(gòu)。圖l顯示與Asnw5相比，成熟結(jié)構(gòu)較少(較少天線和唾液酸的)。例如，對(duì)于血漿產(chǎn)物，在Asn322上三天線的結(jié)構(gòu)比在Asnw5上出現(xiàn)的少，而對(duì)于FVIIa,r和FVII-Tg，則沒(méi)有。應(yīng)當(dāng)注意的是，Asnl45和322被100。/。糖基化。雖然是半定量的，這些結(jié)果與通過(guò)HPCE-LIF和NP-HPLC獲得的定量數(shù)值是一致的。實(shí)施例4:利用HPCE-LIF對(duì)N-聚糖定量在用PNGaseF去糖基化后，通過(guò)HPCE-LIF對(duì)N-連接寡糖進(jìn)行識(shí)別和量化。FVII樣品用外切糖苦酶(唾液酸酶(酶/底物比例為lmIU/10嗎)、半乳糖苷酶、乙酰氨基己糖苦酶(Prozyme試劑盒)、巖藻糖苷酶(酶/底物比例1mU1/10jig)以一定方式處理，以保證對(duì)每個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別和量化。所獲得的聚糖用熒光染料標(biāo)記，并根據(jù)其質(zhì)量和電荷進(jìn)行分離。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(葡萄糖均聚物和寡糖)可以用來(lái)識(shí)別結(jié)構(gòu)。通過(guò)累計(jì)每個(gè)峰對(duì)所有量化的寡糖的比例而進(jìn)行量化。使用了毛細(xì)管電泳設(shè)備ProteoLabPA800(Beckman-Coulter),其毛細(xì)管為50cmx50jam內(nèi)徑的N-CHO《涂層》(Beckman-Coulter)。還使用了《膠緩沖液-N》(Beckman-Coulter)分離緩沖液。在20。C、電壓為25kV下進(jìn)行遷移20分鐘。通過(guò)使用人激發(fā)488nm和入發(fā)射520nm的激光進(jìn)4亍才全測(cè)。在同時(shí)用唾液酸酶、半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶去糖基化后，根據(jù)"核，，和巖藻糖基化"核，，的峰區(qū)域之間的關(guān)系來(lái)計(jì)算巖藻糖基化的比率。FVIIa,p中大部分聚糖為二天線的、二唾液酸化、非巖藻糖基^類型(A2)以及二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化類型(A2F)。FVII-Tg的聚糖結(jié)構(gòu)顯示存在著二天線、單唾液酸、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)類型(A1F，Al)，以及存在著二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的類型(A2F,A2)。在這些不同結(jié)構(gòu)之間，分布不同。FVIIa,r表現(xiàn)出大部分為A2F結(jié)構(gòu)的二天線、唾液酸化的、巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)和二天線、單唾液酸化的、巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1F)對(duì)于A2F和A1F結(jié)構(gòu)，可以觀察到與這些結(jié)構(gòu)的通常遷移時(shí)間相比的非典型的遷移時(shí)間。兩批(A和B)FVII-Tg的聚糖結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖3-在中間的兩個(gè)電泳圖譜)顯示存在著二天線、單唾液酸、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)類型(A1F,Al),以及存在著二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的類型(A2F,A2)。表1.FVII的不同批次的從天然樣品獲得的唾液酸化結(jié)構(gòu)的百分比的匯總百分比兩Ia，pFVII-TgA批FVII國(guó)TgB批FVIIa，r天然的A241.919.313.9-25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>不同聚糖結(jié)構(gòu)(表l)的量化分析顯示，對(duì)于FVIIa,p,其唾液酸化的結(jié)構(gòu)的主要形態(tài)為約51%的二唾液酸化聚糖(A2和A2F)以及30%三天線的、唾液酸化的、未巖藻糖基化的和巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(G3和G3F)(結(jié)果未顯示)。FVII-Tg(A批和B批)與FVIIa,p相比，較少的被唾液酸化，35%為二天線的、二唾液酸化的結(jié)構(gòu)而只有6%為三天線的，唾液酸化結(jié)構(gòu)(結(jié)果未顯示)。主要結(jié)構(gòu)是單唾液酸化的，其中50。/。具有Al和AlF結(jié)構(gòu)。同樣，F(xiàn)VIIa,r與FVIIa,p相比較少的被唾液酸化，其45%為A2F結(jié)構(gòu)，而僅6%為三天線的、唾液酸化的聚糖(結(jié)果未示出)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FVIIa，r的非巖藻糖基化結(jié)乾，，表2.不同F(xiàn)VII的巖藻糖基化比率<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結(jié)果顯示FVIIa,p巖藻糖基化比例低(16%),對(duì)于FVII-Tg,巖藻糖基化的比例從24到42%,而對(duì)于FVIIa,r則是100。/。的巖藻糖基化了。實(shí)施例5:利用NP-HPLC對(duì)N-聚糖定量通過(guò)NP-HPLC對(duì)FVIIa,p、FVIIa,r以及FVI1-Tg的N-糖基化進(jìn)行了定性和定量分析(參見(jiàn)圖4)。對(duì)蛋白進(jìn)行脫鹽和干燥后，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法對(duì)該蛋白進(jìn)行變性和簡(jiǎn)化。然后，在酶促反應(yīng)中釋放聚糖，并通過(guò)乙醇的沉淀進(jìn)行純化。獲得的聚糖用熒光2-氨基苯曱酰胺(2-AB)標(biāo)記。所標(biāo)記的聚糖根據(jù)其親水性通過(guò)正相HPLC用4.6x250mm氨基-80柱(Tosohaas)在30。C恒溫下分離。在注入樣品前，對(duì)柱用80%乙腈緩沖液平衡。對(duì)寡糖用逐漸增加的50mM、pH4.5甲酸銨在等于或大于140分鐘的時(shí)間內(nèi)洗提。通過(guò)X激發(fā)為330腿和人發(fā)射為420nm熒光測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。FVIIa，p的色譜圖顯示主要的聚糖是二天線的、二唾液酸化的類型(A2),其比率為39%。同時(shí)觀察到了較低的量的二天線的二唾液酸化的巖藻糖基化形式(A2F)、單唾液酸化形式(Al)、以及三唾液酸化的巖藻糖基化的和未巖藻糖基化的(A3F和A3)形式。對(duì)FVII-Tg用NP-HPLC進(jìn)行的分析證實(shí)了存在的主要寡糖是A1類型的，比例高達(dá)27%。A1F、A2和A2F的結(jié)構(gòu)較少，而三天線的結(jié)構(gòu)僅以痕量存在。這顯示FVIIa，p和較少唾液酸化的因子FVII-Tg(B批)之間唾液酸化上的差異。對(duì)因子FVIIa,r的同樣的分析表明，主要形式A2F的量為30。/。。存在的A1F的結(jié)構(gòu)較少，而三天線的結(jié)構(gòu)僅以痕量存在。對(duì)FVIIa,r的分析同樣表明AlF和A2F結(jié)構(gòu)的保留時(shí)間的重要時(shí)間延遲，這表明該結(jié)構(gòu)不同于FVIIa,p和FVII-Tg中的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果與那些通過(guò)HPCE-LIF'獲得的結(jié)果一致。實(shí)施例6:用MALDI-TOFMS鑒定質(zhì)譜MALDI-TOFMS(基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)是一種可以精確測(cè)量肽、蛋白、聚糖、寡糖以及大部分可電離的聚合物的分子量的技術(shù)。將要分析的肽、蛋白和聚糖與基質(zhì)相混合，基質(zhì)吸收所使用激光的波長(zhǎng)。對(duì)于肽分析，主要的基質(zhì)是a-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA),對(duì)于蛋白分析，是芥子酸(SA),對(duì)于寡糖分析，是2,5-二羥基笨曱酸(DHB)。該方法包含用脈沖激光照射基質(zhì)/被分析物的共晶，導(dǎo)致基質(zhì)和被分析物分子的解吸附。在氣相電離后，被分析物分子在飛行時(shí)間內(nèi)穿過(guò)檢測(cè)器。由于質(zhì)量和飛行時(shí)間是直接相關(guān)的，檢測(cè)后者可以確定目標(biāo)被分析物的質(zhì)量。通過(guò)將觀測(cè)到的質(zhì)量測(cè)量與理論質(zhì)量相比而實(shí)施鑒定?；谒@得的離子碎片在MS/MS模式下進(jìn)行排序。所使用的裝置是BrukerAutoflex2,在TOF和TOF/TOF模式下工作。為了鑒定存在于FVII-Tg和FVIIa,r的聚糖結(jié)構(gòu)，對(duì)通過(guò)制備型NP-HPLC所獲得的洗提部分進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。27對(duì)FVII-Tg進(jìn)行MALDI-TOF分析可以證實(shí)對(duì)用NP-HPLC分離的聚糖的鑒定，即大部分單唾液酸化的A1結(jié)構(gòu)和少量的A1F、A2F以及A2類型結(jié)構(gòu)。本研究還可以確定三天線二唾液酸化的和三唾液S吏化的少凄t結(jié)構(gòu)、雜交結(jié)構(gòu)和Man5和Man6-P-HexNAc類型的寡糖(參見(jiàn)圖5)。對(duì)FVIIa，r進(jìn)行的MALDI-TOFMS分析表明存在著如圖6所示的聚糖結(jié)構(gòu)。因子FVIIa,r近乎完全巖藻糖基化，而FVII-Tg僅部分巖藻糖基化。大部分聚糖結(jié)構(gòu)是A2F，通過(guò)NP-HPLC量化的比率為30。/。。鑒別出二天線單唾液酸化巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1F)以及在端位置含有GalNAc的其他天線結(jié)構(gòu)，中性二天線巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，在一個(gè)和/或兩個(gè)天線帶有Hex-NAc-HexNAc部分。還注意到有三天線、三唾液酸化、巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的存在。非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)以痕量存在。實(shí)施例7:對(duì)唾液酸-半乳糖連接的HPCE-LIF分析關(guān)于唾液酸-半乳糖連接("分枝")研究，實(shí)驗(yàn)步驟與在實(shí)施例4中描述的相似。在用PNGaseF去糖基化后，對(duì)寡糖用特異性外切唾液酸酶處理，來(lái)保證對(duì)連接進(jìn)行鑒定和對(duì)每個(gè)單獨(dú)結(jié)構(gòu)的量化。所使用的唾液酸酶是來(lái)自51;朋ww朋/"e(對(duì)于a2-3連接有特異性，0.02IU,E/S=0.4m/m)，C/^/hVgera(對(duì)a2-3和a2-6連接有特異性，0.04IU,E/S=0.1m/m)以及Awe/ac/e似(可以水解a2-3、a2-6、a2-8和a2-9連接，0.01IU,E/S=0.05m/m)的重組酶。通過(guò)分析顯示，F(xiàn)VIIa,r具有二天線、唾液酸化的、巖藻糖基化的聚糖結(jié)構(gòu)，主要是A2F以及二天線的、單唾液酸化的、巖藻糖基化的(A1F)結(jié)構(gòu)。對(duì)于這些A2F和A1F結(jié)構(gòu)，可以觀察到與這些結(jié)構(gòu)的通常遷移時(shí)間相比的非典型的遷移時(shí)間。尤其是，這些唾液酸化的寡糖結(jié)構(gòu)在HPCE-LIF和NP-HPLC中表現(xiàn)出與FVII-Tg相比具有非典型性遷移時(shí)間。另一方面，對(duì)單糖合成物的分析沒(méi)有顯示任何特別的與Neu5Ac不同的唾液酸，而質(zhì)譜工具分析顯示聚糖具有與二唾液酸化類型一致的質(zhì)量。最后，F(xiàn)VIIa，r聚糖的去唾液酸化可以發(fā)現(xiàn)其層析與電泳行為與FVII-Tg的寡糖的相同。因此這些在電泳和層析行為上的差異可用唾液酸的不同分技來(lái)解釋。用HPCE-LIF和MS對(duì)該假設(shè)通過(guò)不同途徑進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果如表3所示。表3:不同批次的FVII上唾液酸的分枝<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>該結(jié)果顯示在兩種FVII水平上顯著的唾液酸異構(gòu)。事實(shí)上，F(xiàn)VIIa,r的唾液酸包含a2-3連接，而FVII-Tg表現(xiàn)出a2-6分枝。FVIIa,r的聚糖與FVII-Tg相比，在HPCE-LIF和NP-HPLC中行為的差異，與在唾液酸水平上的異構(gòu)差異相關(guān)。實(shí)施例8:FVII-Tg的體外再唾液酸化文獻(xiàn)(ZhangX.&a/,Biochim.Biophys.Acta1998,1425;441-52)提到了糖蛋白更完全的唾液酸化有助于提高體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性。該研究的目的是為了闡述體外唾液酸化的可行性。通過(guò)使用(x2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(rat,Spofifofera/ragiperab,S.A之l單位/mg(S.A.:特異活性)，41kDa,Calbiochem)以及底物胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸(Calbiochem)來(lái)進(jìn)行再唾液酸化。這兩種試劑由于其不穩(wěn)定性而儲(chǔ)存于-0。C。唾液酸化底物(胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸)和酶a2，6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在夜間37。C下在反應(yīng)緩沖液中混合:所用的反應(yīng)緩沖液是50mM的嗎啉_3-丙磺酸、0.P/。的Tween⑧80、0.1mg/mlBSA(牛血清白蛋白)，pH調(diào)整到7.4(Sigma試劑)。實(shí)驗(yàn)條件如下表4所示。表4:實(shí)驗(yàn)條件匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>天然FVII-Tg的電泳圖i普表明大部分結(jié)構(gòu)為二天線、單唾液酸化A1結(jié)構(gòu)(42%),少量的A2、A2F和A1F結(jié)構(gòu)。天然FVII-Tg例如為實(shí)施例的純化后獲得的(圖7,最下面的圖)。再唾液酸化后(圖7,上面的圖)，存在著的單唾液酸化結(jié)構(gòu)僅6。/。，二唾液酸化結(jié)構(gòu)，尤其是非巖藻糖基化的變得占大多數(shù)(52%)。再唾液酸化前后的聚糖的量化結(jié)果如下表5所示。表5:唾液酸化前后的寡糖結(jié)構(gòu)的量化^^^^天然FVII-Tg再唾液酸化的FVII-TgA219.852.4A2F15.525.1Al42.16.4A1F13.611.6中性的9.04.5唾液酸化(％)91.195.5二唾液酸化比率'35.377.5'轉(zhuǎn)基因FVII的唾液酸化動(dòng)力學(xué)如圖8所示。該研究表明再唾液酸化的效率為二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率增長(zhǎng)了超過(guò)100%。實(shí)施例9:對(duì)從實(shí)施例8中獲得的轉(zhuǎn)基因非再唾液酸化FVII(FVIITgNRS)與轉(zhuǎn)基因再唾液酸化FVII(FVIITgRS)在兔中的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究。本研究的目的是在新西蘭雄兔中對(duì)FVII-TgRS和FVII-TgNRS進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)曲線比較研究。試驗(yàn)劑量是每動(dòng)物200jig/kg，是重組FVII施加到人類的藥物劑量雙倍。在J-4(注射前4天)和J1(注射當(dāng)天)的T0.17h(注射當(dāng)天，注射后10分鐘)、T0.33h(注射當(dāng)天，注射后20分鐘)、Tlh(注射當(dāng)天，注射后l小時(shí))、T3h(注射當(dāng)天，注射后3小時(shí))、T6h(注射當(dāng)天，注射后6小時(shí))、T8h(注射當(dāng)天，注射后8小時(shí))進(jìn)行采血。FVII:Ag的劑量用ELISA方法(Asserachrom試劑盒)測(cè)量。兔血液中FVII:Ag的劑量結(jié)果一方面可以用來(lái)確定去除曲線，另一方面可以確定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。藥量學(xué)組和實(shí)驗(yàn)組如表6所示。30表6:藥量學(xué)和實(shí)驗(yàn)組<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>NA:沒(méi)有應(yīng)用去除曲線如圖9所示。結(jié)果如表7所示。表7:結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>兩組實(shí)驗(yàn)的施加劑量、去除半衰期、平均停留時(shí)間(MRT)、最大濃度(Cmax)以及回收率(《回收》)都是可比的。FVII-TgRS表現(xiàn)出的動(dòng)力學(xué)曲線不同于FVII-TgNRS。對(duì)FVII-Tg的再唾液酸化非顯著的提高了半衰期、平均停留時(shí)間(MRT)、Cmax以及《回收》。AUC參數(shù)水平(峰面積)、Cl(清除)以及分布體積(Vd)(用血漿濃度除以施加或吸收劑量而獲得)的差異表明從血液循環(huán)中清除FVII-TgRS不重要。FVII-Tg的再唾液酸化提高了產(chǎn)品的生物處理能力大約300/0。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權(quán)利要求1.一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物(FVII)，該合成物的每個(gè)因子VII分子含有結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子，與因子VII合成物的結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的所有聚糖結(jié)構(gòu)相比，大多數(shù)為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。2.根據(jù)權(quán)利要求i所述的合成物，其特征在于二天線、二唾液酸化、巖藻糖基化和非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的比率高于50%。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的合成物，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中，巖藻糖比率在20°/。-50%之間。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的合成物，其特征在于所述合成物的因子VII中至少部分唾液酸含有(x2-6連接。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成物，其特征在于所述合成物的因子VII的所有唾液酸包含a2-6連接。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成物，，其特征在于所述合成物的因子VII同時(shí)包含a2-3連接的唾液酸。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一所述的合成物，其特征在于所述FVII是活化的。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的合成物用作藥物的用途。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療血友病病人的藥物的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療多出血性創(chuàng)傷的藥物的用途。11.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療由于抗凝劑過(guò)量而出血的藥物的用途。12.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所定義的FVn、和賦形劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。13.—種用于制備重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物的方法，該合成物的每個(gè)因子vn分子包含連接到n-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，所述合成物的所有因子vii分子中，二天線、二唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)，該方法包括一唾液酸化步驟，通過(guò)將部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或重組因子vn合成物與唾液酸供體底物和唾液酸轉(zhuǎn)移酶在合適的能保留唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間和在合適的條件下，以使得唾液酸從唾液酸供體底物向FVII轉(zhuǎn)移，并使得所述的二唾液酸化結(jié)構(gòu)足夠增長(zhǎng)到占大多數(shù)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在唾液酸化步驟之前，先進(jìn)行半乳糖基化步驟，用于在半乳糖-缺陷結(jié)構(gòu)上接枝一半乳糖，該半乳糖-缺陷結(jié)構(gòu)表示FVII的無(wú)半乳糖和單半乳糖結(jié)構(gòu)。15.根據(jù)權(quán)利要求13和14任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化的FVII的合成物表現(xiàn)出大多數(shù)為二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述的部分唾液酸化的FVII的合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)聚糖結(jié)構(gòu)是非巖藻糖基化的。17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化FVII的合成物中至少部分唾液S菱含有a2-6連接。18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任一所述的方法，其特征在于在唾液化步驟之前，還包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因FVII的合成物的步驟。19.根據(jù)權(quán)利要求13-18中任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化的FVII的合成物中的FVII是活化的。20.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一所述的方法，其特征在于所述"唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，唾液酸供體底物是胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物，該合成物的每個(gè)因子VII分子具有連接到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述合成物的所有因子VII分子中，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)。本發(fā)明還涉及所述合成物用作藥物的用途，以及用于制備所述合成物的方法。文檔編號(hào)A61K38/36GK101495133SQ200780027968公開(kāi)日2009年7月29日申請(qǐng)日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日發(fā)明者埃馬紐埃爾·諾尼,尼古拉·比奧羅,阿卜杜勒薩塔爾·薩米·什圖魯申請(qǐng)人:Lfb生物科技公司