專利名稱：肌肉再生促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有IL-6抑制劑作為有效成分的肌肉再生促進(jìn)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已知在微重力環(huán)境的宇宙環(huán)境中駐留后、長期臥床狀態(tài)后、或者在繃帶固定狀態(tài)后，推旁肌和下肢比目魚肌等會(huì)發(fā)生肌肉萎縮。骨骼肌的損傷、壞死可通過再生補(bǔ)償，肌肉萎縮中，肌纖維的壞死無法通過再生補(bǔ)償。已知骨骼肌肉損傷后的再生過程有衛(wèi)星細(xì)胞被動(dòng)員。衛(wèi)星細(xì)胞是在骨骼肌內(nèi)通常以休止?fàn)顟B(tài)存在的組織特異性干細(xì)胞，在骨骼肌纖維上增殖、分化，與肌纖維融合，促進(jìn)肌肉再生。但是，生物體內(nèi)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的動(dòng)員、增殖、分化的因子目前尚未得知。
IL-6是被稱為B細(xì)胞刺激因子2 (BSF2)或干擾素P 2的細(xì)胞因子。IL-6作為與B淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的活化有關(guān)的分化因子而被發(fā)現(xiàn)(非專利文獻(xiàn)1),之后又了解到它是對(duì)各種細(xì)胞功能有影響的多功能細(xì)胞因子(非專利文獻(xiàn)2)。有報(bào)道稱IL-6誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的成熟(非專利文獻(xiàn)3)。
IL-6經(jīng)由兩種蛋白質(zhì)介導(dǎo)，在細(xì)胞上轉(zhuǎn)導(dǎo)其生物學(xué)活性。 一種是IL-6受體，其是IL-6所結(jié)合的、分子量約80kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)4、 5)。 IL-6受體除在細(xì)胞膜上表達(dá)的、跨細(xì)胞膜的、膜結(jié)合型之外，主要以含有其胞外區(qū)域的可溶性IL-6受體的形式存在。
另一種是與非配體結(jié)合性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的、分子量約130 kD的膜蛋白gpl30。 IL-6和IL-6受體形成IL-6/ IL-6受體復(fù)合體，接著與gpl30結(jié)合，由此，IL-6的生物學(xué)活性轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)(非專利文獻(xiàn)6)。
IL-6抑制劑是抑制IL-6的生物學(xué)活性轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。目前已知有IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、gpl30的抗體(抗gpl30抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體的部分肽等。
抗IL-6受體抗體已經(jīng)有多個(gè)報(bào)道(非專利文獻(xiàn)7、 8，專利文獻(xiàn)1-3)。已知有將其中之一的小鼠抗體PM-1 (非專利文獻(xiàn)9)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體中得到的人源化PM-1抗體(專利文獻(xiàn)4)。
目前，已知胰島素樣生長因子-I (非專利文獻(xiàn)IO)或抗肌肉生長抑制素抗體(非專利文獻(xiàn)ll)顯示肌肉萎縮的抑制效果和肌肉再生的促進(jìn)
效果。但是，對(duì)于肌肉再生，IL-6等細(xì)胞因子是否有影響則目前完全未進(jìn)行過研究。
本申請(qǐng)的發(fā)明相關(guān)先行技術(shù)文獻(xiàn)信息如下所示。
專利文獻(xiàn)l: WO 95-09873專利文獻(xiàn)2: FR 2694767專利文獻(xiàn)3: US 5216128專利文獻(xiàn)4: WO 92-19759
非專利文獻(xiàn)l: Hirano， T等人.，Nature (1986) 324, 73-76非專利文獻(xiàn)2: Akira, S等人.，Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78非專利文獻(xiàn)3: Lotz, M.等人.,J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258非專利文獻(xiàn)4: Taga, T等人.,J. Exp. Med. (1987) 166， 967-981非專利文獻(xiàn)5: Yamasaki, K.等人.，Science (1988) 241， 825-828非專利文獻(xiàn)6: Taga, T.等人.，Cell (1989) 58， 573-581非專利文獻(xiàn)7: Novick， D.等人.，Hybridoma (1991) 10, 137-146非專利文獻(xiàn)8: Huang, Y. W.等人.，Hybridoma (1993) 12, 621-630非專利文獻(xiàn)9: Hirata， Y.等人，，J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906非專利文獻(xiàn)IO: Barton-Davis, E. R壽人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95, 15603-15607
非專利文獻(xiàn)ll: Bogdanovich, S,等人.，Nature (2002) 420, 418-421非專利文獻(xiàn)12:非專利文獻(xiàn)13:非專利文獻(xiàn)14:非專利文獻(xiàn)15:非專利文獻(xiàn)16:非專利文獻(xiàn)17:非專利文獻(xiàn)18:
非專利文獻(xiàn)19:非專利文獻(xiàn)20:非專利文獻(xiàn)21:非專利文獻(xiàn)22:非專利文獻(xiàn)23:
8, 136-40非專利文獻(xiàn)24:非專利文獻(xiàn)25:非專利文獻(xiàn)26:非專利文獻(xiàn)27:非專利文獻(xiàn)28:非專利文獻(xiàn)29:
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述狀況，其目的在于提供含有IL-6抑制劑作為有效成分的肌肉再生促進(jìn)劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供促進(jìn)對(duì)象的肌肉再生的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予發(fā)生肌肉萎縮的對(duì)象的步驟。
本發(fā)明人為解決上述課題，對(duì)于IL-6信號(hào)途徑的抑制對(duì)肌肉細(xì)胞生長的效果進(jìn)行了研究。
首先，在含有各種濃度MR16-1 (抗小鼠IL-6受體單克隆抗體)的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)C 2 C12細(xì)胞，免疫組織化學(xué)法檢測與肌肉再生相關(guān)的蛋白質(zhì)MyoD、肌細(xì)胞生成蛋白、生肌調(diào)節(jié)因子蛋白、以及肌球蛋白重鏈。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)肌肉分化標(biāo)志M-鈣黏著
6蛋白、熒光體-p38和MyoD的表達(dá)。
結(jié)果表明，添加MR16-1使C2C12細(xì)胞的增殖受到抑制，表達(dá)MyoD、肌細(xì)胞生成蛋白、生肌調(diào)節(jié)因子蛋白、以及肌球蛋白重鏈的C2C12細(xì)^^的百分比分布增加。并且，在進(jìn)^f亍了 MR16-1處理的細(xì)胞^中M-4丐翁著蛋白和熒光體-p38以及MyoD的表達(dá)水平增加。由該結(jié)果可知，免疫系統(tǒng)經(jīng)由IL-6信號(hào)途徑介導(dǎo)，對(duì)于肌肉纖維的發(fā)育和/或生長發(fā)揮了重要作用。
接著，在雄性小鼠(C57BL/6KJ Jcl)中,通過添加MR16-1,研究負(fù)載(負(fù)荷)或非負(fù)載(非負(fù)荷)的比目魚肌完整單肌纖維中衛(wèi)星細(xì)胞的反應(yīng)發(fā)生了怎樣的變化。
結(jié)果表明，進(jìn)行MR16-1處理，對(duì)于非負(fù)載中的纖維萎縮和衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目的減少并未表現(xiàn)特異性效果。但是對(duì)再負(fù)載(再負(fù)荷)的反應(yīng)，增殖活化的衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目因進(jìn)行MR16-1處理而增加。衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)于肌纖維量的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，由此顯示抑制IL-6是促進(jìn)肌肉再生的一個(gè)方法。
即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過給予IL-6抑制劑，可以促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的粘附、增殖、分化，繼而可以促進(jìn)肌肉再生或肌纖維的肥大，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明更具體地提供以下[1]-[23]。肌肉再生促進(jìn)劑，該肌肉再生促進(jìn)劑含有IL-6抑制劑作為有效成分。 [l]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6的抗體。 [l]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6受體的抗體。 [2]或[3]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體是單克隆抗體。 [2]或[3]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體是識(shí)別人IL-6或人IL-6受體的抗體。 [2]或[3]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體是重組型抗體》 [6]所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。 [1]-[7]中任一項(xiàng)所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于肌肉再生是源于肌肉萎縮的肌肉再生。促進(jìn)對(duì)象中肌肉再生的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予對(duì)象的步驟。 [9]所述的方法，其特征在于對(duì)象發(fā)生肌肉萎縮。 [9]或[10]所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6
的抗體。 [9]或[10]所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6
受體的抗體。 [11]或[12]所述的方法，其特征在于抗體是單克隆抗體。[14] [11]或[12]所述的方法，其特征在于抗體是識(shí)別人IL-6或
人IL-6受體的抗體。 [11]或[12]所述的方法，其特征在于抗體是重組型抗體。[16] [15]所述的方法，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗
體或人抗體。 IL-6抑制劑在制備肌肉再生促進(jìn)劑中的應(yīng)用。 [17]中所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6的抗體。 [17]中所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別IL-6受體的抗體。 [18]或[19]所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是單克隆抗體。[21] [18]或[19]所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是識(shí)別人IL-6或
人IL-6受體的抗體。 [18]或[19]所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是重組型抗體。[23] [22]所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗
體或人抗體。
附圖簡述


圖1是表示通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)C2C12細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果的照片。研究添加MR16-1對(duì)于在含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的C2C12細(xì)胞生長的效果。圖2A是表示添加MR16-1對(duì)于負(fù)載或非負(fù)載的雄性小鼠(C57BL/6J Jcl)的比目魚肌的完整單肌纖維中的衛(wèi)星細(xì)胞特性的效果圖。圖2A是各組的由肌腱到肌腱的肌纖維中全部BrdU陽性(分裂活化)衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目的圖。以下圖2的整個(gè)圖中，各符號(hào)表示以下狀態(tài)的組。Pre:后肢懸垂前的組，C:不同年齡對(duì)照組，CMR:對(duì)不同年齡對(duì)照組進(jìn)行MR16-1處理的組，S:后月支懸垂組，SMR:對(duì)后月支懸垂進(jìn)4亍MR16-1處理的組。以下圖2的整個(gè)圖中，以R+0表示的四個(gè)組中為7天非負(fù)載或在剛完成籠內(nèi)飼養(yǎng)的組，R+7表示的四個(gè)組是再負(fù)載7天后的組。以下圖2的整個(gè)圖中，數(shù)據(jù)均為平均士SEM。 *和卞表示P0.05,是Pre和C、 R+0中的S和SMR的比較。
圖2B是表示各組由肌腱到肌腱的肌纖維中全部M-鈣黏著蛋白陽性(休止)衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)的圖。
圖2C是表示各組由肌腱到肌腱的肌纖維中總衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)的圖。
圖2D是表示BrdU陽性(分裂活化)衛(wèi)星細(xì)胞/衛(wèi)星細(xì)胞的值(％)的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過給予抗IL-6受體抗體，可以促進(jìn)肌肉的再生。本發(fā)明根據(jù)該認(rèn)識(shí)完成。
本發(fā)明涉及肌肉再生促進(jìn)劑，該肌肉再生促進(jìn)劑含有IL-6抑制劑作為有效成分。
本發(fā)明中，"IL-6抑制劑"是指阻斷IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。IL-6抑制劑優(yōu)選對(duì)與IL-6、 IL-6受體和gp130其中任意結(jié)合具有抑制作用的物質(zhì)。
本發(fā)明的IL-6抑制劑例如有抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gpl30抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或IL-6或IL-6受體的部分肽、以及顯示與它們同樣的活性的低分子物質(zhì)，但并不限于此。本發(fā)明的IL-6抑制劑優(yōu)選，如識(shí)別IL-6受體的抗體。
本發(fā)明的抗體的由來沒有特別限定，優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選來自人的抗體。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體可以采用公知方法，以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。本發(fā)明使用的抗IL-6抗體特別優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體有在雜交瘤中生成的；以及在通過基因工程的方法，用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主中生成的。該抗體通過與IL-6結(jié)合，可以抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合，阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
上述抗體有MH166 (Matsuda， T.等人.，Eur. J.Immunol. (1988) 18,951-956)或SK2抗體(Sato， K.等人.，第21回日本免疫學(xué)會(huì)總會(huì)，學(xué)術(shù)記錄(1991)21, 166)等。
生成抗IL-6抗體的雜交瘤基本可采用公知技術(shù)，如下制備。即，使用IL-6作為致敏抗原，將其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，通過通常的細(xì)胞融合法使所得免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，通過通常的篩選法篩選單克隆的抗體生成細(xì)胞。
具體來說，制備抗IL-6抗體可如下進(jìn)行。例如，作為獲得抗體的致敏抗原使用的人IL-6通過使用Eur. J. Biochem (1987) 168， 543-550;J.Immunol. (1988) 140， 1534-1541;或Agr. Biol, Chem. (1990) 54,2685-2688所示的IL-6基因/氨基酸序列獲得。
將IL-6的基因序列插入到公知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，然后從該宿主細(xì)胞中或者由培養(yǎng)上清中按照公知方法純化目標(biāo)IL-6蛋白質(zhì)，使用該純化IL-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原。還可以使用IL-6蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體可使用公知方法、以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。本發(fā)明使用的抗IL-6受體抗體特別優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體可以是在雜交瘤中生成的；以及在通過基因工程的方法、用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中生成的。該抗體與IL-6受體結(jié)合，由此可以抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合，阻斷IL-6的生物學(xué)活性在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
上述抗體有MR16-1抗體(Tamura,T等人.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1993) 90, 11924-11928)、 PM-1抗體(Hirata, Y.等人.，J.Immunol.(1989) 143, 2900-2906)、 AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(W092/19759)。其中，人IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗體有PM-1抗體，小鼠IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗體有MR16-1抗體。
生成抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤可使用公知的技術(shù)如下制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原，將其按照通常的免疫方法免疫，通過常規(guī)細(xì)胞融合法將所得免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，通過通常的篩選法篩選生成單克隆抗體的細(xì)胞。
具體來說，制備抗IL-6受體抗體可如下進(jìn)行。例如，作為獲得抗體的致敏抗原使用的人IL-6受體通過使用歐洲專利申請(qǐng)EP 325474中、小鼠IL-6受體通過使用日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平3-155795中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列獲得。
IL-6受體蛋白有在細(xì)胞膜上表達(dá)的和脫離細(xì)胞膜的(可溶性IL-6受體)(Yasukawa, K.等人.，J. Biochem, (1990) 108， 673-676)兩種?？扇苄訧L-6受體由與細(xì)胞膜結(jié)合的IL-6受體的實(shí)質(zhì)上的胞外區(qū)構(gòu)成，跨細(xì)胞膜區(qū)、或者跨細(xì)胞膜區(qū)域與胞內(nèi)區(qū)缺失，因此與膜結(jié)合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白只要是可用作制備本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的致敏抗原即可，可以使用任何IL-6受體。
將IL-6受體的基因序列插入到公知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，然后按照公知方法，從該宿主細(xì)胞中、或培養(yǎng)上清中純化目標(biāo)IL-6受體蛋白，可以使用該純化IL-6受體蛋白作為致敏抗原。也可以使用表達(dá)IL-6受體的細(xì)胞、或IL-6受體蛋白與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗gp 130抗體可以使用公知的方法，以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。本發(fā)明中使用的抗gpl30抗體特別優(yōu)選來自動(dòng)物的單克隆抗體。來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體可以是在雜交瘤中生成的；以及在通過基因工程的方法、用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中生成的。該抗體與gpl30結(jié)合，由此可以抑制IL-6/IL-6受體復(fù)合體與gp 13 0的結(jié)合，阻斷IL - 6的生物學(xué)活性在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
上述抗體有AM64抗體(日本特開平3-219894)、 4B11抗體和2H4抗體(US5571513)、 B-S12抗體和B-P8抗體(日本特開平8-291199)等。
生成抗gpl30單克隆抗體的雜交瘤基本上可使用公知技術(shù)如下制備。即，使用gpl30作為致敏抗原，將其按照通常的免疫方法免疫，通過常規(guī)細(xì)胞融合法將所得免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，通過通常的篩選法篩選生成單克隆抗體的細(xì)胞。
具體來說，制備單克隆抗體可如下進(jìn)行。例如，作為獲得抗體的致敏抗原使用的gpl30通過使用歐洲專利申請(qǐng)EP 411946中公開的gpl30基因/氨基酸序列獲得。
ii將gpl30的基因序列插入到公知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)?宿主細(xì)胞，然后按照公知方法，從該宿主細(xì)胞中、或培養(yǎng)上清中純化 目標(biāo)gpl30蛋白，可以使用該純化gpl30蛋白作為致敏抗原。也可以 使用表達(dá)gpl30的細(xì)胞或gpl30蛋白與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致 敏抗原。
用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物沒有特別限定，考慮到與細(xì)胞融合中 使用的親本細(xì)胞的相容性，通?？墒褂脟X類動(dòng)物例如小鼠、大鼠、 倉鼠等。
將致敏抗原免疫動(dòng)物時(shí)，可按照爿^知的方法進(jìn)行。例如常規(guī)方法 是將致敏抗原進(jìn)行哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下注射。具體來說，優(yōu)選將 致敏抗原用PBS(磷酸鹽緩沖液)或生理鹽水等稀釋為適當(dāng)量，根據(jù)需 要，將懸浮物與通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑適量混合，乳化后每 隔4-21天多次給予哺乳動(dòng)物。致敏抗原免疫時(shí)可使用適當(dāng)?shù)妮d體。
進(jìn)行上述免疫并確認(rèn)血清中所需抗體水平升高，然后從哺乳動(dòng)物 中取出免疫細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。優(yōu)選用免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，特 別優(yōu)選脾細(xì)胞。
作為與上述免疫細(xì)胞融合的另一方親本細(xì)胞的哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞可
適當(dāng)使用已經(jīng)公知的各種細(xì)月&朱，例如P3X63Ag8.653(Keamey, J. F. et al. J. Imm unol. (1979) 123, 1548—1550) 、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and
Immunology (1978) 81， 1_7) 、 NS-l(Kohler. G. and Kdilstein, C. Eur. J. hnmuno1.(19
76) 6， 511-519 ) 、 MPC-11 (M，lies. D. H. et a.,Cell (1976) 8, 405-415 ) 、 SP2/
0 (Shulman, M. et al.， Nature (1978) 276, 269-270)、 FO(de St. Groth， S, F. et al.,
j. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge, 1. S. J. Exp. Med. (1978)
148, 313-323)、 R210(Galfre, G. et al.， Nature (1979) 277， 131-133 )等。
上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本上可按照公知的方 法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein， C.， Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46)等進(jìn)行。
更具體地說，上述細(xì)胞融合，例如在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下、 在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)液中實(shí)施。融合促進(jìn)劑，例如可使用聚乙二醇(PEG)、 仙臺(tái)病毒(HVJ)等，根據(jù)需要，為了進(jìn)一步提高融合效率可以添加二 甲基亞砜等助劑使用。
免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的^f吏用比例，例如優(yōu)選免疫細(xì)胞相對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞為1-10倍。上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如可使用適合
上述骨髓瘤細(xì)胞抹增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、除此之外還可以使用該種細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的常規(guī)培養(yǎng)液，還可以結(jié)合使用胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液。
細(xì)胞融合可以將規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，通常以30-60。/。(w/v)的濃度添加預(yù)先加溫至37。C左右的PEG溶液、例如平均分子量1000-6000左右的PEG溶液，通過混合形成目標(biāo)融合細(xì)胞(雜交瘤)。接著，依次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，將離心除去上清的操作反復(fù)進(jìn)行，由此可以除去雜交瘤生長所不優(yōu)選的細(xì)胞融合劑等。
該雜交瘤通常在選擇培養(yǎng)液，例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃噪呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，由此進(jìn)行選擇。該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)可以持續(xù)至目標(biāo)雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡所需的足夠的時(shí)間、通常為數(shù)天-數(shù)周進(jìn)行。接著，實(shí)施通常的有限稀釋法，進(jìn)行生產(chǎn)目標(biāo)抗體的雜交瘤的篩選和克隆。
用抗原免疫人以外的動(dòng)物，獲得上述雜交瘤，除此之外可以將人淋巴細(xì)胞在體外用所需抗原蛋白質(zhì)或抗原表達(dá)細(xì)胞致敏，將致敏B淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞，例如U266融合，可以獲得與所需抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞具有結(jié)合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878)。并
表達(dá)細(xì)、胞，可按t照、上述方,法獲得所需x抗^4參照國、ii'專矛;
W093/12227、 WO92/03918、 WO94/02602、 W094/25585、 WO96/34096、W096/33735)。
上述制備的生成單克隆抗體的雜交瘤可在通常的培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)，也可以在液氮中長期保存。
由該雜交瘤獲得單克隆抗體時(shí)，可采用以下方法按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，獲得其培養(yǎng)上清的方法；或者將該雜交瘤給予與其具有相容性的哺乳動(dòng)物，使其增殖，以其腹水的形式獲得的方法等。前者的方法適合獲得高純度的抗體，而后者的方法適合于抗體的大量生產(chǎn)。
例如，生成抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備可按照日本特開平3-139293中公開的方法進(jìn)行?？砂凑找韵路椒ㄟM(jìn)行將生成PM-1抗
13體的雜交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)，獲得腹水，由該腹水純化PM-1抗體的方法；或者將該雜交瘤在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、例如含有10%胎牛血清、5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim制備)的RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制備)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制備)等中培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤中克隆抗體基因，整合到適當(dāng)?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入宿主，采用基因重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)的重組型抗體(例如參照 Borrebaeck C.A.K和 Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD， 1990)。
具體來說，從生成目標(biāo)抗體的細(xì)胞、例如雜交瘤中分離編碼抗體可變(V)區(qū)的mRNA。 mRNA的分離可按照7>知的方法，例如胍超離心法(Vhirgwin， J.M.等人.，Biochemistry (1979) 18， 5294-5299)、 AGPC法(Chomczynski， P.等人.,Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等制備總RNA,使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制備)等制備mRNA。還可以使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制備)，直接制備mRNA。
使用反轉(zhuǎn)錄酶，由所得mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。 cDNA的合成可使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進(jìn)行。進(jìn)行cDNA的合成和擴(kuò)增時(shí)，可采用5'-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制備)和使用PCR的5'-RACE法(Froman,M.A.等人.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998-9002 ; Belyavsky， A.等人.,Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932)。由所得PCR產(chǎn)物純化目標(biāo)DNA片段，與載體DNA連接。并且，由此制備重組載體，導(dǎo)入到大腸桿菌等中，選擇集落，制備所需重組載體?？砂凑展姆椒ɡ缑撗醴ù_認(rèn)目標(biāo)DNA的堿基序列。
如果要可獲得編碼目標(biāo)抗體V區(qū)的DNA，則可以將其與編碼所需抗體恒定區(qū)(C)區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá)載體中?；蛘邔⒕幋a抗體V區(qū)的DNA整合到含有抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體中。
為了制備本發(fā)明中使用的抗體，可以如后所述將抗體基因整合到表達(dá)載體，使其在表達(dá)控制區(qū)、例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。接著，通過該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可使抗體表達(dá)。
本發(fā)明中，還可以使用為了降低對(duì)人的異種抗原性等而進(jìn)行人工變異的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。這些變異抗體可采用已知的方法制備。
嵌合抗體可如下獲得如上所述，將得到的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá)載體中，導(dǎo)入到宿主中進(jìn)行生產(chǎn)(參照歐洲專利申請(qǐng)EP 125023、國際專利申請(qǐng)W092-19759)。采用該已知方法可以獲得對(duì)本發(fā)明有用的嵌合抗體。
人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體或人化抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物，例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)所得，其通常的基因重組方法也是已知的(參照歐洲專利申請(qǐng)EP 125023,國際專利申請(qǐng)W092-19759)。
具體如下獲得通過PCR法，由制備成末端具有重疊部分的多個(gè)寡核苷酸合成設(shè)計(jì)為小鼠抗體的CDR與人抗體的框架區(qū)(FR)連接而成的DNA序列。將所得DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，接著整合到表達(dá)載體中，將其導(dǎo)入宿主(參照歐洲專利申請(qǐng)EP 239400、國際專利申請(qǐng)W092-19759)。
選用經(jīng)由CDR連接的人抗體的FR,由此可形成良好的抗原結(jié)合部位?？梢愿鶕?jù)需要置換抗體可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位。
嵌合抗體、人源化抗體可以使用人抗體C區(qū)。人抗體C區(qū)有C Y ，例如可使用Cyl、 Cy2、 Cy3或Cy4。另外，為了改善抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性，可以修飾人抗體C區(qū)。
區(qū)和來自人抗:的框架區(qū)以及c區(qū)，兩者均使得其在人體內(nèi)的抗原性降低，因此可用作本發(fā)明中使用的抗體。
體(參照國際專利申請(qǐng)W092-19759)。
人抗體的獲得方法除之前所述的方法之外，還已知有使用人抗體文庫、通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如可以以人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv),通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達(dá)，選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。如果分析所選擇的噬菌體的基因，則可以確定編碼
與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。如果了解了與抗原結(jié)合的 scFv的DNA序列，則可以制備含有該序列的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可以 獲得人抗體。這些方法是周知的，可以參考WO92/01047、 WO92/20791 、 WO93/06213、 W093/11236、 W093/19172、 WO95/01438、 W095/15388。
上述構(gòu)建的抗體基因可通過公知的方法表達(dá)。使用哺乳類細(xì)胞 時(shí)，可以通過常用的有用的啟動(dòng)子、要表達(dá)的抗體基因、在其3'—側(cè) 下游功能性結(jié)合polyA信號(hào)的DNA、或者含有該DNA的載體來表達(dá)。 例如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
除此之外，可在本發(fā)明中使用的、用于抗體表達(dá)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子 可使用反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)等病毒 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，或者人延伸因子la(HEFla)等來自哺乳類細(xì)胞的啟動(dòng) 子/增強(qiáng)子。
例如使用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，可按照Mulligan等人的方法 (Mulligan, R.C.等人.，Nature (1979) 277， 108-114)容易地實(shí)施，而使用 HEFla啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima, S. 和Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)容易地實(shí)施。
為大腸桿菌時(shí)，可以功能性結(jié)合常用的有用啟動(dòng)子、用于抗體分 泌的信號(hào)序列、要表達(dá)的抗體基因進(jìn)行表達(dá)。例如啟動(dòng)子有l(wèi)acZ啟 動(dòng)子、araB啟動(dòng)子。使用lacZ啟動(dòng)子時(shí)，可按照Ward等人的方法(Ward, E.S.等人.，Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S.等人.，F(xiàn)ASEB J. (1992) 6,2422-2427);使用araB啟動(dòng)子時(shí)可以按照Better等人的方法(Better, M.等人.Science (1988) 240， 1041-1043)進(jìn)行。
作為用于抗體分泌的信號(hào)序列，在大腸桿菌的周質(zhì)中生成時(shí)，可 使用pel B信號(hào)序列(Lei, S.P.等人 J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)。將在周質(zhì)中生成的抗體進(jìn)行分離后，可以使抗體的結(jié)構(gòu) 適當(dāng)再折疊使用(例如參照WO96/30394)。
作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳 頭瘤病毒(BPV)等的起點(diǎn)，并且，為了在宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴(kuò)增基因拷 貝數(shù)，表達(dá)載體可以含有氨基糖香磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶 (TK)基因、大腸桿菌黃噪呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)志。
為了制備在本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產(chǎn)體系。用于抗體制備的生產(chǎn)體系有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)體系。體外的生產(chǎn)體系有使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)體系和使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)體系。
使用真核細(xì)胞時(shí)，有使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。動(dòng)物細(xì)胞已知有來自(l)哺乳類細(xì)胞例如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK (幼倉鼠腎細(xì)胞)、HeLa、 Vero等，(2)兩棲類細(xì)胞、例如非洲爪蟾卯細(xì)胞，或(3)昆蟲細(xì)胞例如sf9、 sf21、 Tn5等。植物細(xì)胞已知有來自煙草(iV/co"^a M6acMm)的細(xì)胞，可將其進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。真菌細(xì)胞已知有酵母，例如糖酵母屬(Sacc/^raw少ce力，例如釀酒糖酵母(Sacc/wromyces cereWw'ae); 絲狀菌例如曲霉屬045perg〃/w51), 例如黑曲霉(j，rg〃/ws "扭r)等。
使用原核細(xì)胞時(shí)，有使用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。細(xì)菌細(xì)胞已知有大腸桿菌、枯草桿菌。
通過轉(zhuǎn)化，將目標(biāo)抗體基因?qū)氲竭@些細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞在體外培養(yǎng)，可以得到抗體。培養(yǎng)可按照公知的方法進(jìn)行。例如培養(yǎng)
液可使用DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM，也可以結(jié)合胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液使用。導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞移入動(dòng)物的腹腔等，由此可在體內(nèi)生產(chǎn)抗體。
體內(nèi)生產(chǎn)體系有使用動(dòng)物的生產(chǎn)體系或使用植物的生產(chǎn)體系。使用動(dòng)物時(shí)，有使用哺乳類動(dòng)物、昆蟲的生產(chǎn)體系等。
哺乳類動(dòng)物可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。昆蟲可以使用蠶。使用植物時(shí)，可以使用煙草。
向這些動(dòng)物或植物中導(dǎo)入抗體基因，在動(dòng)物或植物的體內(nèi)生產(chǎn)抗體，回收。例如將抗體基因插入到編碼如山羊p酪蛋白等生產(chǎn)乳汁中特有的蛋白質(zhì)的基因中間，制成融合基因。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，將該胚胎移植到雌山羊體內(nèi)。從接受了胚胎的山羊所生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因山羊、或其子代所生產(chǎn)的乳汁中可以獲得所需抗體。為了使含有由轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的抗體的乳汁量增加，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊使用激素(Ebert，K.M.等人.,Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。使用蠶時(shí)，將插入了目標(biāo)抗體基因的桿狀病毒感染蠶，從蠶的體
液中獲得所需抗體(Maeda,S等人.，Nature (1985) 315:592-594)。使用煙 草時(shí)，將目標(biāo)抗體基因插入到植物表達(dá)用的載體例如pMON 530中， 將該栽體導(dǎo)入到才艮癌土》裏桿菌(Jgro6fl"en'wm m附e/ac/ew力等的細(xì)菌 中。將該細(xì)菌感染煙草、例如煙草(iWco"aw" M^ct/m),可由該煙葉獲 得所需抗體(Julian，K,C.Ma等人，，Eur. J. Immunol. (1994) 24:
131- 138)。
如上所述，通過體外或體內(nèi)生產(chǎn)體系生產(chǎn)抗體時(shí)，可以將編碼抗 體重鏈(H)鏈或輕鏈(L)鏈的DNA分別整合到表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化宿 主，或者將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到同一的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化 宿主(參照國際專利申請(qǐng)W094/11523)。
本發(fā)明中使用的抗體只要適合本發(fā)明即可，可以是抗體片段或其 修飾體。例如抗體的片段有Fab、 F(ab，)2、 Fv或者將H鏈和L鏈的 Fv用適當(dāng)?shù)慕宇^連接而成的單鏈Fv (scFv)。
具體來說，將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶處理，生成抗 體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入到表達(dá)載體中， 然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(例如參照Co， M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M. & Horwitz， A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Plueckthun, A. & Skerra， A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux， J. et al" Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66; Bird, R. E. et al" TIBTECH (1991) 9,
132- 137)。
scFv可通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連接獲得。該scFv中， H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)經(jīng)由接頭、優(yōu)選肽接頭連接(Huston, J.S.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5879-5883)。 scFv中的H鏈V區(qū)和L 鏈V區(qū)可以來自上述抗體中所記載的任意一種。連接V區(qū)的肽接頭 例如可使用含有12-19個(gè)氨基酸殘基的任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA可如下獲得以編碼上述抗體的H鏈或H鏈V 區(qū)的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA為模板，用定義其兩端 的引物對(duì)，通過PCR法擴(kuò)增這些序列中編碼所需氨基酸序列的DNA 部分，然后進(jìn)一步將編碼肽接頭部分的DNA及其兩端定義為與各H
18鏈、L鏈連接的引物對(duì)組合，進(jìn)行擴(kuò)增。
如果制備編碼scFv的DNA,則可以按照常規(guī)方法獲得含有它們的表達(dá)載體、以及由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，還可以使用該宿主，按照常規(guī)方法獲得scFv。
這些抗體的片段可以與上述同樣地獲得基因、使其表達(dá)，通過宿主生成。本發(fā)明中所述的"抗體"也包含這些抗體的片段。
抗體的修飾物可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合得到的抗體。本發(fā)明中所述的"抗體"中也包含這些抗體修飾物。為了獲得上述抗體修飾物，可通過對(duì)所得抗體實(shí)施化學(xué)修飾獲得。這些方法在該領(lǐng)域中已經(jīng)建立。
如上所述，生產(chǎn)并表達(dá)的抗體可以從細(xì)月包內(nèi)外、宿主中分離并可純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可通過親和層析進(jìn)行。親和層析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的載體例如有HyperD、 POROS、 Sepharose F.F.等。除此之外，也可以采用通常對(duì)蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒有任何限定。
例如，通過將上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等適當(dāng)選擇并組合，可以分離并純化本發(fā)明中使用的抗體。層析例如有離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。這些層析可適用于HPLC(高效液相色譜)。也可使用反相HPLC。
上述得到的抗體的濃度測定可通過吸光度的測定或ELISA等進(jìn)行。即，通過吸光度測定時(shí)，用PBS(-)適當(dāng)稀釋，然后測定280 nm的吸光度，以lmg/mL為1.35 0D進(jìn)行計(jì)算。通過ELISA測定時(shí)，可如下測定。即，將用0.1 M碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋為ljig/mL的lOO(iL山羊抗人IgG (TAG制備)加入到96孔板(Nunc制備)中，在4。C下溫育過夜，固定抗體。封閉后，添加100pL適當(dāng)稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或者作為標(biāo)準(zhǔn)品的人IgG (CAPPEL制備)，在室溫下溫育1小時(shí)。
清洗后，加入100 (xL稀釋為5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG(BIO SOURCE制備)，在室溫下溫育l小時(shí)。洗滌后加入底物溶液，溫育，使用微量板讀板儀Model 3550 (Bio-Rad制造)測定405 nm的吸光度，計(jì)算目標(biāo)抗體濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體具有與IL-6受體具有結(jié)合活性、且不轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，IL-6變異體和IL-6受體與IL-6 竟?fàn)幮越Y(jié)合，不轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6的生物學(xué)活性，因此可以阻斷IL-6的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-6變異體通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基來導(dǎo)入突變 制備。作為IL-6變異體的基礎(chǔ)的IL-6無論其來由均可，如果考慮抗 原性等，則優(yōu)選人IL-6。
具體來說，使用公知的分子建模程序例如WHATIF (Vriend等人., J.Mol. Graphics (1990) 8， 52-56),預(yù)測IL-6的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu), 再評(píng)價(jià)對(duì)要置換的氨基酸殘基總體的影響。確定了適當(dāng)?shù)闹脫Q氨基酸 殘基之后，以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，通過 通常進(jìn)行的PCR法導(dǎo)入突變，使氨基酸置換，由此可得到編碼IL-6 變異體的基因。將其根據(jù)需要整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，按照上述重 組抗體的表達(dá)、生產(chǎn)和純化方法，可以得到IL-6變異體。
IL-6變異體的具體例子在Brakenhoff等人.，J. Biol. Chem. (1994)269， 86-93;以及Savino等人.，EMBO J. (1994) 13, 1357-1367; WO 96-17869中有公開。
本發(fā)明中使用的IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽是與各IL-6 受體或IL-6具有結(jié)合活性、且不轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。即， IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽與IL-6受體或IL-6結(jié)合，捕捉它 們，由此可以特異性抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。結(jié)果，由于不轉(zhuǎn) 導(dǎo)IL-6的生物學(xué)活性，因此可以阻斷IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽是含有在IL-6或IL-6受體的 氨基酸序列中，包含與IL-6和IL-6受體之間的結(jié)合的相關(guān)區(qū)域的一 部分或全部氨基酸序列的肽。上述肽通常含有10-80、優(yōu)選20-50、更 優(yōu)選20-40個(gè)的氨基酸殘基。
IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽可如下制備在IL-6或IL-6 受體的氨基酸序列中，確定與IL-6和IL-6受體之間的結(jié)合相關(guān)的區(qū) 域，根據(jù)該確定的區(qū)域的一部分或全部氨基酸序列，按照通常已知的 方法例如基因工程的方法或肽合成法制備。
將IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽通過基因工程方法制備時(shí)， 可以將編碼所需肽的DNA序列整合到表達(dá)載體中，按照上述重組型 抗體的表達(dá)、生產(chǎn)和純化方法獲得。
20將IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽通過肽合成法制備時(shí)，可 以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體來說，可按照続醫(yī)薬品(D開発第14巻^7。于K合成監(jiān)修矢島 治明廣川書店1991年所述的方法進(jìn)行。固相合成法可采用以下方法 例如是使要合成的肽的C末端所對(duì)應(yīng)的氨基酸與不溶于有機(jī)溶劑的 支撐體結(jié)合，將a-氨基和支鏈官能基團(tuán)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)，將保
護(hù)后的氨基酸按照由C末端向N末端的方向依次進(jìn)行一個(gè)個(gè)氨基酸縮 合反應(yīng)，再進(jìn)行使在樹脂上結(jié)合的氨基酸或肽的a-氨基的該保護(hù)基團(tuán) 脫離的反應(yīng)，使上述兩種反應(yīng)交互反復(fù)進(jìn)行，由此使肽鏈延伸。固相 肽合成法根據(jù)所使用的保護(hù)基團(tuán)的種類而大致分為Boc法和Fmoc法。
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斷的反應(yīng)。與肽鏈進(jìn)行的切斷反應(yīng)中，在BOC法中，使用氟化氫或三
氟甲磺酸，在Fmoc法中通常使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氬 中、在茴香醚的存在下對(duì)上述保護(hù)肽樹脂進(jìn)行處理。接著進(jìn)行保護(hù)基 團(tuán)的脫離和從支撐體上切斷，回收肽。通過將其冷凍干燥可得到粗制 肽。另一方面，在Fmoc法中，例如可在TFA中通過與上述同樣的操 作進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)和肽鏈從支撐體上切斷的反應(yīng)。
所得粗制肽可采用HPLC進(jìn)行分離、純化。在其洗脫時(shí)，可使用 通常在蛋白質(zhì)純化中使用的水-乙腈系溶劑、在最佳條件下進(jìn)行。分取 所得層析的圖譜中相應(yīng)于峰的組分，將其冷凍干燥。對(duì)于這樣純化得 到的肽組分通過質(zhì)譜分析的分子量分析、氨基酸組成分析或氨基酸序 列分析等鑒定。
IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽的具體例子有日本特開平 2-188600、日本特開平7-324097、日本特開平8-311098和美國專利公 報(bào)US5210075。
本發(fā)明中使用的抗體可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質(zhì)、毒 素等各種分子結(jié)合的螫合抗體。上述螯合抗體可通過對(duì)所得抗體進(jìn)行 化學(xué)修飾來獲得?？贵w的修飾方法在該領(lǐng)域中已經(jīng)得到建立。本發(fā)明 中的"抗體"也包含這些螯合抗體。
本發(fā)明的IL-6抑制劑可以在促進(jìn)肌肉再生時(shí)使用。 本發(fā)明中，"肌肉再生"是指受損傷的肌肉或者萎縮的肌肉恢復(fù) 成原來狀態(tài)。肌肉恢復(fù)成原來狀態(tài)是指肌纖維的容積、肌纖維的數(shù)目、或肌肉組織的性質(zhì)(發(fā)揮張力、持久性、代謝特性、伸縮性、柔軟性) 恢復(fù)至受損傷前或者肌肉萎縮前的數(shù)值、狀態(tài)。本發(fā)明中，"肌肉萎
縮"的優(yōu)選例子有在無重力刺激的狀態(tài)下產(chǎn)生的肌肉萎縮、廢用性 肌肉萎縮(不使用肌肉導(dǎo)致的肌肉萎縮)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥 性疾病所伴隨的肌肉萎縮、先天性肌肉疾病中的肌肉萎縮，但并不限 于此。
本發(fā)明中，"肌肉、肌肉組織"對(duì)其種類并沒有特別限定，可以 是骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞的任意一種。
以下對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞參與的肌肉再生的過程進(jìn)行說明?？梢哉J(rèn)為成體 肌肉組織中的衛(wèi)星細(xì)胞通常細(xì)胞分裂停止、或者是緩慢分裂。骨骼肌 等肌肉受損傷，則被激活，開始增殖。增殖后，穿過基底膜的衛(wèi)星細(xì) 胞分化為被稱為成肌細(xì)胞的前體細(xì)胞，活躍地進(jìn)行反復(fù)分裂、增殖， 同時(shí)向損傷部位游走。成肌細(xì)胞沿著受損傷的肌纖維中周圍的基底膜 取向，不久侵入到基底膜的內(nèi)側(cè)，或者與殘留的肌細(xì)胞互相細(xì)胞融合， 形成肌管細(xì)胞。肌管細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟，形成成體肌肉組織。
本發(fā)明中，"肌肉再生"也可以指通過上述步驟生成成體肌肉組織。
本發(fā)明中，"肌肉再生得到促進(jìn)，，是指使上述肌肉再生的進(jìn)行加 快。另外，與肌肉再生相關(guān)的衛(wèi)星細(xì)胞的激活得到促進(jìn)時(shí)，也可以視 作與肌肉再生得到促進(jìn)同等。"促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的活化"是指促進(jìn)衛(wèi)星
細(xì)胞的動(dòng)員、增殖或分化。
本發(fā)明中，對(duì)肌肉再生是否得到促進(jìn)的確認(rèn)可通過測定肌纖維的 容積或數(shù)目來進(jìn)行。通過給予本發(fā)明的藥物，如果肌纖維的容積或數(shù) 目增加得到促進(jìn)，則可以視作肌肉再生得到促進(jìn)。肌纖維的容積或數(shù) 目的測定可通過 ^知的方法進(jìn)行，也可以按照實(shí)施例所述的方法進(jìn) 行。
肌肉再生是否得到促進(jìn)的確認(rèn)可通過測定激活的衛(wèi)星細(xì)胞的量 (肌肉組織中激活的衛(wèi)星細(xì)胞的比例)來進(jìn)行。通過給予本發(fā)明的藥物， 如果激活的衛(wèi)星細(xì)胞的量增加(肌肉組織中激活的衛(wèi)星細(xì)胞的比例增 加)，則可視為肌肉再生得到促進(jìn)。激活的衛(wèi)星細(xì)胞的量的測定可通過 公知方法進(jìn)行，也可按照實(shí)施例所述方法進(jìn)行。
本發(fā)明中使用的IL-6抑制劑對(duì)IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制活性可通過通常所采用的方法評(píng)價(jià)。具體來說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤林 (S6B45、 KPMM2)、人Lennert，s T淋巴瘤細(xì)胞林KT3或IL-6依賴性 細(xì)胞MH60.BSF2,向其中添加IL-6，同時(shí)使IL-6抑制劑共存，可由 此測定IL-6依賴性細(xì)胞對(duì)3H-胸苷的攝取。培養(yǎng)IL-6受體表達(dá)細(xì)胞 U266,添加125I標(biāo)記IL-6，同時(shí)加入IL-6抑制劑，由此測定與IL-6 受體表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的、125I標(biāo)記的IL-6。在上述測定體系中，除存在 IL-6抑制劑的組之外，也設(shè)置不含有IL-6抑制劑的陰性對(duì)照組，將兩 組所得的結(jié)果進(jìn)行比較，則可以評(píng)價(jià)IL-6抑制劑對(duì)IL-6的抑制活性。 如后述實(shí)施例所示，通過給予抗IL-6受體抗體，可見肌肉再生得 到促進(jìn)，因此顯示抗IL-6受體抗體等IL-6抑制劑可用作肌肉再生促 進(jìn)劑。
給予本發(fā)明的肌肉再生促進(jìn)劑的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物優(yōu)選 為人。
本發(fā)明的肌肉再生促進(jìn)劑可以以藥物的形式給予，可以口服或非 口服、全身或局部給予。例如，可以選擇點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注 射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，可根據(jù) 患者的年齡、癥狀選擇適當(dāng)給予方法。給予有效量可在每一次第lkg 體重0.01 mg-100 mg的范圍內(nèi)選擇。或者每位患者選擇1-1000 mg, 優(yōu)選5-50 mg的給予量。作為優(yōu)選的給予量、給予方法，例如為抗IL-6 受體抗體時(shí)，血液中存在游離抗體的程度的量作為有效給予量，具體 例子是1 kg每個(gè)月(4周)分一次-多次給予0.5 mg-40 mg，優(yōu)選1 mg-20 mg，例如可按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等給予日程、 通過點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法給予。給予日程的安排可以 一邊觀察給予后的狀態(tài)和血液檢查值的動(dòng)向， 一邊延長給予間隔如2 次/周或者l次/2周、l次/3周、l次/4周等地調(diào)整。
本發(fā)明中，肌肉再生促進(jìn)劑可以添加防腐劑或穩(wěn)定劑等制劑可接 受的載體。制劑可接受的載體可以是其本身具有上述肌肉再生促進(jìn)效 果的材料，也可以是不具有該肌肉再生促進(jìn)效果的材料，其是指可以 與上述藥物一起給予的材料。即使是不具有肌肉再生促進(jìn)效果的材 料，但通過結(jié)合使用IL-6抑制劑而具有相乘或相加的效果的材料。
制劑可接受的材料例如有無菌水或生理鹽水、穩(wěn)定劑、賦型劑、 緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA等)、粘結(jié)劑等。本發(fā)明中，表面活性劑有非離子表面活性劑，例如典型的化合物
有脫水山梨醇單辛酸酯、脫水山梨醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單棕 櫚酸酯等脫水山梨醇脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、 甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂 酸酯、十甘油單油酸酯等多甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯脫水山梨醇單月 桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂 酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸 酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸 酯；聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙 烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸 酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等 聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、 聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬 基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖 麻油等聚氧乙烯氫化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜜蠟等聚氧乙烯蜜蠟衍 生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰 胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLD6-18的等。
表面活性劑還可以是陰離子表面活性劑，典型的例子例如有鯨 蠟基疏酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳原子數(shù)10-18的烷 基的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等環(huán)氧乙烷的平均加成摩爾 數(shù)為2-4、烷基的碳原子數(shù)為10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂 基磺基琥珀酸酯鈉等烷基的碳原子數(shù)為8-18的烷磺基琥珀酸酯鹽；天 然系表面活性劑例如卯磷脂、甘油基磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子 數(shù)12-18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。
本發(fā)明的藥物中可以將這些表面活性劑的 一種或兩種以上組合 添加。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇20、 40、 60或80等聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨醇20和 80。還優(yōu)選以泊洛沙姆(poloxamer， Pluronic F-68 (注冊(cè)商標(biāo))等)為代 表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
表面活性劑的添加量根據(jù)所使用的表面活性劑的種類而不同，為 聚山梨醇20和聚山梨醇80時(shí)，通常為0.001-100 mg/mL,優(yōu)選0.003-50 mg/mL，進(jìn)一步優(yōu)選0.005-2 mg/mL。本發(fā)明中，緩沖劑有磷酸、檸檬酸緩沖液、乙酸、蘋果酸、酒石 酸、琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡糖酸、辛酸、脫氧膽酸、水楊酸、三
乙醇胺、富馬酸等其它有機(jī)酸等，或者碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組
氨酸緩沖液、咪唑緩沖液等。
可以通過溶解于溶液制劑領(lǐng)域中公知的水性緩沖液中來制備溶
液制劑。緩沖液的濃度通常為l-500mM,優(yōu)選5-100mM，進(jìn)一步優(yōu) 選10-20 mM。
本發(fā)明的藥物還可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明 膠或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖和單糖等糖類，或碳水化合 物、糖醇。
本發(fā)明中，氨基酸有堿性氨基酸例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、 鳥氨酸等，或者這些氨基酸的無機(jī)鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式，即 磷酸氨基酸)。使用游離氨基酸時(shí)，優(yōu)選的pH值可通過添加適當(dāng)?shù)纳?理可接受的緩沖物質(zhì)例如無機(jī)酸、特別是鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、 曱酸或它們的鹽來調(diào)節(jié)。此時(shí)，使用磷酸鹽，特別可以獲得穩(wěn)定的凍 干物，因此特別有利。制備物實(shí)質(zhì)上不含有有機(jī)酸，例如蘋果酸、酒 石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等時(shí)，或者不存在對(duì)應(yīng)的陰離子(例如 蘋果酸離子、酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等) 時(shí)特別有利。優(yōu)選的氨基酸有精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸。也 可以進(jìn)一步使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其鹽的形式 (優(yōu)選鈉鹽)，或者中性氨基酸例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨 酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、或丙氨酸，或者芳族氨 基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物N-乙?；彼?。
本發(fā)明中，多糖和單糖等糖類或碳水化合物，例如有葡聚糖、葡 萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖 等。
本發(fā)明中，糖醇可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。 將本發(fā)明的藥物制成注射用的水溶液時(shí)，例如可以與含有生理鹽 水、葡萄糖或其它輔助試劑(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、 氯化鈉)的等滲液混合。該水溶液還可以結(jié)合使用適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦?例 如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山 梨醇80、 HCO-50)等)。可以根據(jù)需要進(jìn)一步含有稀釋劑、溶解助劑、pH調(diào)節(jié)劑、止痛 劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。
本發(fā)明中，含硫還原劑例如有N-乙?；腚装彼?、N-乙酸基高 半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、巰 基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽以及碳原子數(shù)1-7的硫代鏈烷 酸等具有硫氫基的化合物。
本發(fā)明中，抗氧化劑例如有異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基 羥基茴香醚、a-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血 酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子 酸三戊酯、沒食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏 磷酸鈉等螯合劑。
還可以根據(jù)需要封入到微膠嚢(羥曱基纖維素、明膠、聚[曱基丙 烯酸甲酯]等微膠嚢)中，或者制成膠體型藥物輸送系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋 白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠嚢等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等)。并且還已知將 藥物制成緩釋性藥物的方法，也可用于本發(fā)明(Langer等人.，J.Biomed. Mater. Res. 1981, 15:167-277; Langer, chem. Tech. 1982, 12:98-105;美 國專利第3773919號(hào)；歐洲專利申請(qǐng)公開(EP)第58481號(hào)；Sidman等 人.，Biopolymers 1983, 22:547-556; EP第133988號(hào))。
所使用的制劑可接受的載體可根據(jù)劑型從上述中適當(dāng)或者組合 選擇，但并不限于此。
本發(fā)明還涉及促進(jìn)對(duì)象的肌肉再生的方法，該方法包含將IL-6抑 制劑給予對(duì)象的步驟。
本發(fā)明中，"對(duì)象"有發(fā)生肌肉萎縮的生物體、肌肉受到損傷的 生物體、或者這些生物體的體內(nèi)的一部分。生物體沒有特別限定，包 含動(dòng)物(例如人、家畜動(dòng)物、野生動(dòng)物)。另外，"生物體的體內(nèi)一部 分"沒有特別限定，優(yōu)選肌肉組織，更優(yōu)選骨骼肌或骨骼肌的周邊部 位。
本發(fā)明中，"給予"包含口服或非口服給予?？诜o予有以口 服制劑的形式的給予，口服制劑可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢 劑、溶劑、乳劑或混懸劑等劑型。
非口服給予有以注射劑的形式的給予，注射劑有點(diǎn)滴等靜脈注射、皮下注射劑、肌肉注射劑或腹腔內(nèi)注射劑等。使用基因治療的方 法將含有要給予的寡核苷酸的基因?qū)氲缴矬w內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的
方法的效果。另外，可以將本發(fā)明的藥物局部給予希望處置的區(qū)域。 例如，可以是手術(shù)中的局部注入、通過導(dǎo)管給予或者通過輸送編碼本
發(fā)明的抑制劑的DNA的靼基因來給予。可以與公知的肌肉再生治療 法同時(shí)或者間隔時(shí)間給予本發(fā)明的藥物。
本發(fā)明中所引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照援引到本說明 書中。
實(shí)施例
以下通過實(shí)施例進(jìn)一 步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí) 施例的限定。 [實(shí)施例1]
曝露在宇宙環(huán)境中時(shí)，免疫機(jī)能被調(diào)節(jié)至低水平，這對(duì)于宇航員 來說是一個(gè)很嚴(yán)峻的問題。為了研究IL-6信號(hào)途徑的抑制對(duì)肌肉細(xì)胞 生長的效果，在以含有15、 150 ng/mL、 1.5、 15、 150)ig/mL磷酸鹽 緩沖液(PBS)的濃度的MR16-1 (抗小鼠IL-6受體單克隆抗體)的分化培 養(yǎng)基中培養(yǎng)C2C12細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞是在除去MR16-1的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。
培養(yǎng)3天后，將半數(shù)細(xì)胞用10%曱醛固定，免疫組織化學(xué)檢測肌 肉再生相關(guān)的蛋白質(zhì)MyoD、肌細(xì)胞生成蛋白、生肌調(diào)節(jié)因子蛋白、 以及肌球蛋白重鏈。將其余的細(xì)胞溶解于含有1% Triton的溶解緩沖 液中，通過蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)作為肌肉分化標(biāo)志的M-鈣黏著蛋白、 熒光體-p38和MyoD的表達(dá)。
結(jié)果，添加MR16-1使C2C12細(xì)胞的增殖受到抑制。用150 ng/mL 以上濃度的MR16-1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，與用PBS處理的細(xì)胞相比， 表達(dá)MyoD、肌細(xì)胞生成蛋白、生肌調(diào)節(jié)因子蛋白、以及肌球蛋白重 鏈的C2C12細(xì)胞百分比分布增加。并且，在進(jìn)行了 MR16-1處理的細(xì) 胞中，作為肌肉分化標(biāo)志的M-鈣黏著蛋白和熒光體-p38、以及MyoD 的表達(dá)水平增加(圖1)。由這些結(jié)果表明，免疫系統(tǒng)經(jīng)由IL-6信號(hào)途 徑介導(dǎo)，對(duì)于肌肉纖維的發(fā)育和/或生長發(fā)揮重要作用。[實(shí)施例2]
接著，在雄性小鼠(C57BL/6JJcl)中，研究添加MR16-1對(duì)于負(fù)載 或非負(fù)載下的比目魚肌由肌腱到肌腱的完整單肌纖維中，衛(wèi)星細(xì)胞的 特性出現(xiàn)了怎樣的變化。
在后肢懸垂7天之前、7天的再負(fù)載之前的時(shí)期，以2mg/小鼠的 濃度向小鼠腹腔內(nèi)(i.p.)注射MR16-1或PBS。將采集的肌肉浸泡在 Cellbanker (Nihon Zenyaku制備)中，在-80。C下冷凍，然后在35。C下 解凍。然后在20 (iM 5'-溴畫2'-脫氧尿苷(BrdU)、 0.2% I型膠原酶、1% 抗生素、以及含有10%新生牛血清的Dulbecco，s改性Eagle's培養(yǎng)基 中(35。C)培養(yǎng)4小時(shí)，用膠原酶消化，采集單肌纖維。將該肌纖維用 M-鈣黏著蛋白或BrdU特異性抗體進(jìn)行溫育，分別用熒光素或羅丹明 進(jìn)行熒光染色。使用FV-300共焦點(diǎn)激光顯微鏡(奧林巴斯)，分析M-鈣黏著蛋白陽性[休止期]或BrdU陽性(分裂期)衛(wèi)星細(xì)胞。
結(jié)果，進(jìn)行MR16-1處理，對(duì)于非負(fù)載相關(guān)的肌纖維萎縮和衛(wèi)星 細(xì)胞數(shù)目的減少并未表現(xiàn)特異性的效果(圖2)。但是，對(duì)再負(fù)載的反 應(yīng)，通過進(jìn)行MR16-1處理后分裂活化的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目增加(圖2)。
衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)于肌纖維量的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要效果，由此顯示，抑制IL-6 可以成為促進(jìn)肌肉再生的方法。
將通過給予MR16-1培養(yǎng)而增殖的衛(wèi)星細(xì)胞用GFC標(biāo)記，將該細(xì) 胞注入到損傷的、或具有萎縮肌肉的動(dòng)物的肌肉組織或靜脈中。按照 本領(lǐng)域所公知的方法研究該細(xì)胞的給予對(duì)于對(duì)象動(dòng)物的肌肉組織的 恢復(fù)或再生的效果。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在無重力刺激狀態(tài)下發(fā)生的肌肉萎縮或發(fā)生廢用 性肌肉萎縮的肌肉組織中，通過使用IL-6受體抗體特異性地抑制 IL-6，可以促進(jìn)肌肉再生。即，本發(fā)明的肌肉再生促進(jìn)劑可適用于在 長期臥床狀態(tài)或繃帶固定時(shí)的肌肉萎縮、以及宇宙飛行中發(fā)生的肌肉 萎縮的預(yù)防或再生。另外，也可適用于肌損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢 性炎癥性疾病所伴隨的肌肉萎縮或先天性肌肉疾病的肌肉再生。目前尚未有促進(jìn)肌肉再生的治療藥，但根據(jù)本發(fā)明，可以通過藥 物促進(jìn)肌肉再生。
權(quán)利要求
1.肌肉再生促進(jìn)劑，該肌肉再生促進(jìn)劑含有IL-6抑制劑作為有效成分。
2. 權(quán)利要求1所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于IL-6抑制 劑是識(shí)別IL-6的抗體。
3. 權(quán)利要求1所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于IL-6抑制劑 是識(shí)別IL-6受體的抗體。
4. 權(quán)利要求2或3所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體 是單克隆抗體。
5. 權(quán)利要求2或3所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體 是識(shí)別人IL-6或人IL-6受體的抗體。
6. 權(quán)利要求2或3所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體 是重組型抗體。
7. 權(quán)利要求6所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于抗體是嵌 合抗體、人源化抗體或人抗體。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的肌肉再生促進(jìn)劑，其特征在于 肌肉再生是源于肌肉萎縮的肌肉再生。
9. 促進(jìn)對(duì)象中肌肉再生的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予 對(duì)象的步驟。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于對(duì)象發(fā)生肌肉萎縮。
11. 權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是 識(shí)別IL-6的抗體。
12. 權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是 識(shí)別IL國6受體的抗體。
13. 權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于抗體是單克隆 抗體。
14. 權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于抗體是識(shí)別人 IL-6或人IL-6受體的抗體。
15. 權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于抗體是重組型 抗體。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于抗體是嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。
17. IL-6抑制劑在制備肌肉再生促進(jìn)劑中的應(yīng)用。
18. 權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別 IL-6的抗體。
19. 權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑是識(shí)別 IL-6受體的抗體。
20. 權(quán)利要求18或19所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是單克隆 抗體。
21. 權(quán)利要求18或19所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是識(shí)別人 IL-6或人IL-6受體的抗體。
22. 權(quán)利要求18或19所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是重組型抗體o
23. 權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其特征在于抗體是嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。
全文摘要
本發(fā)明人研究了IL-6信號(hào)途徑的抑制對(duì)肌肉細(xì)胞生長的效果。結(jié)果，通過給予IL-6抑制劑，可以促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的粘著、增殖、分化，以及該結(jié)果可以促進(jìn)肌肉再生。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101495146SQ20078002097
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者大平充宣, 西本憲弘 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué);西本憲弘