專利名稱：改造抗體-應(yīng)激蛋白融合物的制作方法
改造抗體-應(yīng)激蛋白融合物
政府支持
本發(fā)明部分在由Accelerated Drug and Vaccine Development with Former Soviet Union Institutions in Support of the U.S. Department of State Biolndustry Initiative 授 予 的 Department of State Grant S-LMAQM-04-GR-164的政府支持下進(jìn)行。因此，美國(guó)政府在本發(fā)明中 擁有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
經(jīng)典單克隆抗體通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，這種生產(chǎn)方法的缺點(diǎn) 包括生產(chǎn)和選擇合適的克隆的困難，和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的費(fèi)用。"下 一代"單克隆抗體在大腸桿菌中進(jìn)行改造。近來(lái)，由多肽接頭
栓系在一起的Vh和VL結(jié)構(gòu)域的微生物表達(dá)已造成了產(chǎn)生改造的"小型
抗體(mini-antibodies)"的能力。這些小型抗體可以在大腸桿菌中以實(shí) 際上組合的方式來(lái)產(chǎn)生。這些人工生成的Fab或單鏈Fv (scFv)可以連 接在一起以形成多聚體，例如雙抗體、三鏈抗體和四抗體(tetrabodies )。 盡管它們能夠以幾乎抗體樣的效率與抗原結(jié)合，但這些改造的、Fc缺陷 的小型抗體缺乏與抗原呈遞細(xì)胞相互作用的能力并且是弱免疫原性的。
改造抗體的免疫原性缺乏的現(xiàn)有解決方案涉及指導(dǎo)抗原結(jié)合部位 之一與免疫細(xì)胞直接結(jié)合。這使它們對(duì)合(in apposition)，但不導(dǎo)致相 同的MHC I類致敏(priming)，如對(duì)于單克隆抗體觀察到的。
發(fā)明概述
在一個(gè)方面，^是供了改造抗體例如Fab或scFv與應(yīng)激蛋白例如 HSP70的融合物。應(yīng)激蛋白在將抗原呈遞給抗原呈遞細(xì)胞且引起T細(xì)胞 應(yīng)答方面非常有效。它們?cè)谕ㄟ^(guò)這種途徑引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免 疫應(yīng)答方面特別有效。
因此，融合分子以高親和力與抗原結(jié)合，是高免疫原性的，顯示 MHC I類致敏，引起T細(xì)胞應(yīng)答并且能夠在非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)例如大腸桿 菌中生產(chǎn)。融合分子因此適合于用作高免疫原性疫苗用于預(yù)防或治療傳染性、炎性、自身免疫性或惡性病。
因此，提供了包含至少一種改造抗體和至少一種應(yīng)激蛋白的融合多 肽。這些包含改造抗體的融合多肽可以是多價(jià)的，即它們可以是二價(jià)、 三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)的等。此外，它們可以是單特異性或多特異性的。
還提供了編碼改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的核酸和載體、包含核酸 和載體的宿主細(xì)胞以及用于生產(chǎn)改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的方法。抗 原組合位點(diǎn)或改造抗體片段可以快速且以高親和力產(chǎn)生，并且可以廉價(jià) 地與應(yīng)激蛋白融合。
進(jìn)一步提供了包含主題改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的藥物和疫苗 組合物。此種組合物可以進(jìn)一步包含佐劑或其他試劑。還提供了預(yù)防或 治療患者中的傳染性、炎性、自身免疫性或惡性病的方法，其包括給有 此需要的患者施用有效量的任何一種前述組合物。
用于實(shí)踐該方法的試劑盒也在本文中得到描述。
其他特征和優(yōu)點(diǎn)由于下述詳細(xì)描述和權(quán)利要求將是顯而易見(jiàn)的。 附圖簡(jiǎn)述


圖1描述了示例性改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽，其包含四價(jià)Tandab (改造抗體)和HSP70 (應(yīng)激蛋白)。
圖2描述了分別來(lái)自結(jié)核分枝桿菌(A^coM"e〃wm a^ercw/cws ) HSP70和牛分枝桿菌() HSP70的HSP70的全長(zhǎng)多 肽序列。
圖3描述了如實(shí)施例1中描述的12。/。PAAG的結(jié)果，所有蛋白質(zhì)在 變性(DTT)條件下以4jig/道裝載。
圖4。 OD450nm。用于包被的抗原以溶于PBS的濃度l昭/ml獲取。 第一抗體在PBS中與系列稀釋的0.2%BSA和0.05%Tween 20 —起溫 育。使用與HRP綴合的第二抗小鼠抗體。
詳述
為了方便起見(jiàn)，在進(jìn)一步描述本發(fā)明前，在說(shuō)明書、實(shí)施例和附加 權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語(yǔ)在此處進(jìn)行定義。
除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式"一個(gè)(a)"、"一種(an)，， 和"該(the)"包括復(fù)數(shù)參考。術(shù)語(yǔ)"施用"包括本發(fā)明的化合物(包括但不限于藥物組合物或治療 劑)遞送到受試者的系統(tǒng)內(nèi)或者受試者中或其上的特定區(qū)域的任何方 法。如本文所使用的，短語(yǔ)"全身施用"、"全身地施用"、"外周施用"和"外 周地施用，，意指化合物、藥物或其他材料除直接方式外進(jìn)入中樞神經(jīng)系 統(tǒng)內(nèi)的施用，從而使得它進(jìn)入患者的系統(tǒng)且因此進(jìn)行代謝和其他類似過(guò) 程，例如皮下施用。"腸胃外施用"和"腸胃外地施用"意指除腸和局部施 用外的施用模式，通常經(jīng)由注射，且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表 皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
術(shù)語(yǔ)"氨基酸"意欲包含無(wú)論是天然的還是合成的所有分子，這包括 氨基功能性和酸功能性，并且能夠包括在天然存在的氨基酸的聚合物
中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其類似物、衍生物和同源物 (congener);具有不同側(cè)鏈的氨基酸類似物；和任何前述的所有立體 異構(gòu)體。天然氨基酸的名稱在本文中依照IUPAC-IUB的建議進(jìn)行縮寫。 術(shù)語(yǔ)"抗體"指免疫球蛋白、其維持特異性結(jié)合能力的衍生物、和具 有與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或很大程度上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋 白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以衍生自天然來(lái)源、或部分或全部合成產(chǎn)生。抗體 可以是單克隆或多克隆的?？贵w可以是來(lái)自任何物種的任何免疫球蛋白 類別的成員，包括人類別中的任何一種IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。 在示例性實(shí)施方案中，本文描述的方法和組合物使用的抗體是IgG類別 的4汙生物。
術(shù)語(yǔ)"抗體片段"指小于全長(zhǎng)的抗體的任何衍生物。在示例性實(shí)施方 案中，抗體片段保留全長(zhǎng)抗體的特異性結(jié)合能力的至少顯著部分?？贵w 片段的例子包括但不限于，F(xiàn)ab、 Fab'、 F ( ab') 2、 scFv、 Fv、 dsFv雙抗 體和Fd片段。抗體片段可以通過(guò)任何方式進(jìn)行生產(chǎn)。例如，抗體片段 可以通過(guò)完整抗體的斷裂而酶促或化學(xué)生產(chǎn)，它可以由編碼部分抗體序 列的基因重組生產(chǎn)，或它可以是全部或部分合成生產(chǎn)?？贵w片段可以任 選是單鏈抗體片段?？商娲兀慰梢园缤ㄟ^(guò)二硫鍵連接在一 起的多條鏈。片段還可以任選是多分子復(fù)合物。功能抗體片段一般將包 含至少約50個(gè)氨基酸，并且更一般地將包含至少約200個(gè)氨基酸。 術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合部位"指特異性結(jié)合抗原上的表位的抗體區(qū)域。 術(shù)語(yǔ)"包含"以包括在內(nèi)的、開(kāi)放意義使用，意指可能包括另外的要素。
術(shù)語(yǔ)"有效量，，指足以達(dá)到所需結(jié)果的化合物、材料或組合物的量。 化合物的有效量可以在一次或多次施用中進(jìn)行施用。
術(shù)語(yǔ)"改造抗體"指包含至少抗體片段且可能任選包含來(lái)自任何Ig
類別(例如IgA、 IgD、 IgE、 IgG、 IgM和IgY)抗體的可變和/或恒定結(jié) 構(gòu)域的完整或部分的重組分子，所述抗體片段包含衍生自抗體的重鏈和 /或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合部位。
術(shù)語(yǔ)"表位，，指抗體與之優(yōu)先且特異性結(jié)合的抗原的區(qū)域。單克隆抗 體與可以分子限定的分子的單個(gè)特異性表位優(yōu)先結(jié)合。在本發(fā)明中，多 個(gè)表位可以由多特異性抗體識(shí)別。
"融合蛋白"或"融合多肽"指包含來(lái)自至少2種不同多肽的多肽部分 的雜交多肽。部分可以來(lái)自相同生物的蛋白質(zhì)，在這種情況下融合蛋白 被說(shuō)成是"種內(nèi)的"、"基因內(nèi)的"等。在各種實(shí)施方案中，融合多肽可以 包含與第 一種多肽連接的一種或多種氨基酸序列。在其中超過(guò)一種氨基 酸序列與第 一種多肽融合的情況下，融合序列可以是相同序列的多個(gè)拷 貝，或可替代地，可以是不同的氨基酸序列。第一種多肽可以與第二種 多肽的N末端、C末端或N和C末端融合。此外，笫一種多肽可以插 入第二種多肽的序列內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)"Fab片段"指包含通過(guò)用木瓜蛋白酶切割抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合 部位的抗體片段，所述木瓜蛋白酶在H鏈間二疏鍵N末端的鉸鏈區(qū)處切 割且產(chǎn)生來(lái)自l個(gè)抗體分子的2個(gè)Fab片段。
術(shù)語(yǔ)"F (ab') 2片段"指包含通過(guò)用胃蛋白酶切割抗體分子產(chǎn)生的2 個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體片段，所述胃蛋白酶在H鏈間二硫鍵C末端的鉸 鏈區(qū)處切割。
術(shù)語(yǔ)"Fc片段"指包含其重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的抗體片段。 術(shù)語(yǔ)"Fv片段"指包含其重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段。 "基因構(gòu)建體"指核酸，例如載體、質(zhì)粒、病毒基因組等，其包括關(guān) 于多肽的"編碼序列"或可以以其他方式轉(zhuǎn)錄成生物活性RNA (例如反 義、誘斜、核酶等)，可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，例如在某些實(shí)施方案中，哺 乳動(dòng)物細(xì)胞，并且可以引起編碼序列在用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)。基 因構(gòu)建體可以包括與編碼序列可操作地連接的一種或多種調(diào)節(jié)元件，以 及內(nèi)含子序列、聚腺苷酸化位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因等。"宿主細(xì)胞，，指可以用特定轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。細(xì)胞任選地選自體 外細(xì)胞，例如衍生自細(xì)胞培養(yǎng)的那些，先體外后體內(nèi)細(xì)胞，例如衍生自 生物的那些，和體內(nèi)細(xì)^M例如在生物中的那些。應(yīng)當(dāng)理解此種術(shù)"^吾不 僅指特定主題細(xì)胞還指此種細(xì)胞的后代或潛在后代。因?yàn)槟承┬揎椏梢?由于突變或環(huán)境影響而在隨后的代中發(fā)生，所以此種后代事實(shí)上可能不 等同于親代細(xì)胞，但仍包括在如本文所使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"包括"意指"包括但不限于"。"包括"和"包括 但不限于"可互換使用。
術(shù)語(yǔ)"免疫原性"指物質(zhì)引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。"免疫原性組合物"或 "免疫原性物質(zhì)"是引發(fā)免疫應(yīng)答的組合物或物質(zhì)。"免疫應(yīng)答"指受試者
對(duì)抗原的存在的反應(yīng)，這可以包括下述中的至少一種制備抗體、發(fā)展 免疫、發(fā)展對(duì)抗原的過(guò)敏性、和發(fā)展耐受性。
術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"指這樣的多肽，其可以由重組DNA或RNA制備， 或具有合成來(lái)源、其一些組合，或可以是天然存在的多肽，所述多肽(1 ) 不與其在自然界中與之通常結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合，(2)從其中它天然存
在的細(xì)胞中分離，(3)基本上不含來(lái)自相同細(xì)胞來(lái)源的其他蛋白質(zhì)， (4)由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(5)在自然界中不存在。
術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"指基因組、cDNA、合成、或天然來(lái)源或其一些 組合的多核苷酸，所述多核苦酸(l)不與"分離的核酸"在自然界中在 其中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)合，或(2)與其在自然界中不與之連接的多核苷酸 可操作地連接。
術(shù)語(yǔ)"接頭"是領(lǐng)域公認(rèn)的，并且指連接2種化合物例如2種多肽的 分子或分子組。接頭可以包含單個(gè)連接分子或可以包含連接分子和意欲 使連接分子和化合物隔開(kāi)特定距離的間隔區(qū)分子。
術(shù)語(yǔ)"多價(jià)抗體"指包含超過(guò)一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體或改造抗體。 例如，"二價(jià)"抗體具有2個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，而"四價(jià)"抗體具有4個(gè)抗原 識(shí)別位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"單特異性"、"雙特異性"、"三特異性"、"四特異性"等 指多價(jià)抗體中存在的不同抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性的數(shù)目(與抗原識(shí)別位點(diǎn) 的數(shù)目相反)。例如，"單特異性"抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)全都結(jié)合相同表 位。"雙特異性"抗體具有結(jié)合笫一種表位的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，和 結(jié)合與第 一種表位不同的第二種表位的至少 一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)。"多價(jià) 單特異性"抗體具有全都結(jié)合相同表位的多個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)。"多價(jià)雙特異性，，抗體具有多個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，其中 一 些數(shù)目結(jié)合第 一種表位和其 中 一些數(shù)目結(jié)合與第 一種表位不同的第二種表位。
術(shù)語(yǔ)"核酸"指聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核苷酸，或經(jīng) 修飾形式的任一類型的核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)理解為包括，作為等價(jià)物，
由核苷酸類似物制備的RNA或DNA類似物，和如可應(yīng)用于描述的實(shí)施 方案，單鏈(例如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。
"蛋白質(zhì)"(如果是單鏈的)、"多肽"和"肽"在本文中當(dāng)提及例如如 可以由編碼序列編碼的基因產(chǎn)物時(shí)可互換使用。在本文中當(dāng)提及"多肽" 時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到除非上下文另有明確說(shuō)明，可以使用蛋白 質(zhì)代替。"蛋白質(zhì)"還指一種或多種多肽的結(jié)合。"基因產(chǎn)物"意指由于基 因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分子。基因產(chǎn)物包括由基因轉(zhuǎn)錄的RNA分子，以及由此 種轉(zhuǎn)錄物翻譯的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)"多肽片段，，或"片段，，當(dāng)關(guān)于特定多肽使用時(shí)，指與參考多肽自 身相比較，其中氨基酸殘基被缺失但剩余氨基酸序列通常等同于參考多 肽的那種的多肽。此種缺失可以在參考多肽的氨基末端或羧基末端，或 可替代地兩者上發(fā)生。片段一般長(zhǎng)度為至少約5、 6、 8或10個(gè)氨基酸， 長(zhǎng)度為至少約14個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度為至少約20、 30、 40或50個(gè)氨基酸， 長(zhǎng)度為至少約75個(gè)氨基酸，或者長(zhǎng)度為至少約100、 150、 200、 300、 500或更多氨基酸。片段可以保留參考多肽的一種或多種生物活性。在 各種實(shí)施方案中，片段可以包含參考多肽的酶促活性和/或相互作用位 點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段可以具有免疫原性性質(zhì)。
"患者"或"受試者"或"宿主，，指人或非人動(dòng)物。
短語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的，，在本文中用于指那些化合物、材料、組合物 和/或劑型，其在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合于與人類和動(dòng)物的組織接 觸使用，而無(wú)過(guò)量毒性、刺激、變應(yīng)性應(yīng)答、或其他問(wèn)題或并發(fā)癥，與 合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。
如本文所使用的，"藥學(xué)上可接受的載體，，意指藥學(xué)上可接受的材 料、組合物或媒介物，例如液體或固體充填劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑 被嚢化材料，涉及從身體的一個(gè)器官或部分?jǐn)y帶或轉(zhuǎn)運(yùn)主題化合物到身 體的另一個(gè)器官或部分。每種載體在與制劑的其他成分相容的意義上必 須是"可接受的"和對(duì)患者無(wú)害的?？梢猿洚?dāng)藥學(xué)上可接受的載體的材料 的一些例子包括(l)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧曱基纖維 素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6) 明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油，例 如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 甘醇，例如丙二醇；(ll)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和 聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14) 緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；U6)無(wú)致熱原水；(17) 等滲鹽水；(18)林格液；U9)乙醇；(20)pH緩沖溶液；(21) 聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)藥物制劑中使用的其他無(wú)毒的相容 的物質(zhì)。
"藥學(xué)上可接受的鹽"指化合物的相對(duì)無(wú)毒的、無(wú)機(jī)和有機(jī)酸加成鹽。
術(shù)語(yǔ)"單鏈可變片段或scFv"指其中重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈結(jié)構(gòu)域連接 的Fv片段。 一個(gè)或多個(gè)scFv片段可以與其他抗體片段(例如重鏈或輕 鏈的恒定結(jié)構(gòu)域)連接，以形成具有一個(gè)或多個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體構(gòu)建體。
如本文所使用的，"應(yīng)激蛋白"，也稱為"熱激蛋白"或"Hsp",是由應(yīng) 激基因編碼，且因此一般在應(yīng)激物與生物接觸或暴露后以明顯更大的量 生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"應(yīng)激蛋白"意欲包括應(yīng)激蛋白的 此種部分和肽。如本文所使用的，"應(yīng)激基因"，也稱為"熱激基因"，指 由于生物(包含基因)與應(yīng)激物或某些苯醌安沙霉素接觸或暴露而激活 或以其他方式可檢測(cè)地上調(diào)的基因，所述應(yīng)激物例如熱激、低氧、葡萄 糖缺乏、重金屬鹽、能量代謝和電子傳遞抑制劑、和蛋白質(zhì)變性劑。 Nover, L., Heat Shock Response, CRC Press, Inc., Boca Raton， FL( 1991 )。 "應(yīng)激基因"還包括在已知應(yīng)激基因家族內(nèi)的同源基因，例如Hsp70和 Hsp90應(yīng)激基因家族內(nèi)的某些基因，即使此種同源基因自身不由應(yīng)激物 誘導(dǎo)。如本說(shuō)明書中所使用的，術(shù)語(yǔ)應(yīng)激基因和應(yīng)激蛋白各自可以包括 在另一個(gè)內(nèi)，除非上下文另有說(shuō)明。
"治療"受試者中的疾病或"治療"具有疾病的受試者指對(duì)受試者實(shí)施 藥物處理，例如施用藥物，從而使得疾病的程度得到減少或預(yù)防。處理 包括(但不限于)施用組合物，例如藥物組合物，并且可以預(yù)防地，或 在病理事件起始后進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"疫苗"指引發(fā)免疫應(yīng)答且還對(duì)受試者賦予保護(hù)性免疫的物質(zhì)。 "載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)它與之連接的另一種核酸的核酸分子。 一種類型 的優(yōu)選載體是附加體，即能夠染色體外復(fù)制的核酸。優(yōu)選載體是能夠自 主復(fù)制和/或表達(dá)它們與之連接的核酸的那些。能夠指導(dǎo)它們與之可操作 地連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱為"表達(dá)載體"。
一般而言，用于重
組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常為"質(zhì)粒"的形式，所述質(zhì)粒一般指環(huán)狀 雙鏈DNA環(huán)，其以其載體形式不與染色體結(jié)合。在本說(shuō)明書中，"質(zhì)粒" 和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。然而，如本領(lǐng)域
技術(shù)人員將理解的，本發(fā)明意欲包括此種其他形式的表達(dá)載體，所述表 達(dá)載體發(fā)揮等價(jià)功能且隨后變得本領(lǐng)域已知的。
7.攻造拔體-j邀蛋冷凝^^/應(yīng)
提供了包含改造抗體和應(yīng)激蛋白的融合多肽。改造抗體可以包含例 如至少一個(gè)scFv、至少一個(gè)Fab片段、至少一個(gè)Fv片段等。它可以是 單價(jià)的或它可以是多價(jià)的。在其中改造抗體是多價(jià)的實(shí)施方案中，它可 以是二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)的等。多價(jià)抗體可以是單特異性或多特異性的， 例如雙特異性、三特異性、四特異性等。多價(jià)抗體可以是任何形式，例 如雙抗體、三鏈抗體、四抗體等。在某些實(shí)施方案中，改造抗體是Tandab。 應(yīng)激蛋白可以包含任何應(yīng)激蛋白。在某些實(shí)施方案中，應(yīng)激蛋白包含 HSP70,例如結(jié)核分枝桿菌HSP70或牛分枝桿菌HSP70。結(jié)核分枝桿菌 HSP70或牛分枝桿菌HSP70的全長(zhǎng)多肽序列分別在圖2中作為SEQ ID NO: l和2得到描述。
關(guān)于可以摻入主題融合多肽內(nèi)的改造抗體和應(yīng)激蛋白的進(jìn)一步細(xì) 節(jié)在下文提供。
A.改造抗體
天然抗體自身是二聚體，且因此是二價(jià)的。如果生產(chǎn)不同抗體的2 種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行人工融合，那么由雜種雜交瘤生產(chǎn)的一些抗體由具有 不同特異性的2種單體組成。此種雙特異性抗體還可以通過(guò)使2種抗體 化學(xué)綴合來(lái)生產(chǎn)。天然抗體及其雙特異性衍生物相對(duì)較大且對(duì)于生產(chǎn)是 昂貴的。小鼠抗體的恒定結(jié)構(gòu)域也是人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答的主 因，這阻止其廣泛用作治療劑。由于其結(jié)合Fc-受體，它們還可以引起不合需要的效應(yīng)。由于這些原因，分子免疫學(xué)家已集中于在微生物中生
產(chǎn)小得多的Fab和Fv片段。這些較小片段不僅更易于生產(chǎn)，它們的免 疫原性也較小，沒(méi)有效應(yīng)子功能，并且由于其相對(duì)小的尺寸，它們能夠 更好地穿透組織和胂瘤。在Fab片段的情況下，與可變結(jié)構(gòu)域鄰近的恒 定結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定化重鏈和輕鏈二聚體中起主要作用。因此，盡管全長(zhǎng)或 接近全長(zhǎng)的改造抗體可以包含主題融合多肽，但較小的、單結(jié)構(gòu)域改造 抗體(其可以是多價(jià)和多特異性的)優(yōu)選用于融合多肽中。
Fv片段更不穩(wěn)定，且肽接頭因此可以引入重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間 以增加穩(wěn)定性。這種構(gòu)建體稱為單鏈Fv (scFv)片段。為了額外的穩(wěn)定 性，二硫鍵有時(shí)引入2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。迄今，基于四價(jià)scFv的抗體已通 過(guò)與額外的聚合結(jié)構(gòu)域例如形成四聚體的鏈霉抗生物素蛋白單體，和兩 親性a螺旋融合進(jìn)行生產(chǎn)。然而，這些額外的結(jié)構(gòu)域可以增加四〗介分子 的免疫原性。
二價(jià)和雙特異性抗體可以僅使用抗體可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行構(gòu)建。相當(dāng)有 效和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法是制備VH和VL結(jié)構(gòu)域之間如此短的接頭序列，從 而使得它們不能在彼此上折疊和結(jié)合。接頭長(zhǎng)度減少至3 - 12個(gè)殘基阻 止了 scFv分子的單體構(gòu)型，且支持分子間VH-V^配對(duì)，形成60kDa非 共價(jià)scFv二聚體"雙抗體"(Holliger等人，1993,/Voc. Ato/. jcad V&4 90, 6444-6448)。雙抗體形式還可以用于產(chǎn)生重組雙特異性抗體，其通 過(guò)2個(gè)單鏈融合產(chǎn)物的非共價(jià)結(jié)合而獲得，由通過(guò)短接頭與另一種抗體
的VL結(jié)構(gòu)域連接的來(lái)自一種抗體的VH結(jié)構(gòu)域組成。接頭長(zhǎng)度再進(jìn)一步
減少至3個(gè)殘基以下可以導(dǎo)致三聚體("三鏈抗體"，約90kDa)或四聚 體("四抗體"，約120 kDa)的形成(Le Gall等人，1999, /^ASLe能ra 453, 164-168)。關(guān)于改造抗體特別是單結(jié)構(gòu)域片段的綜述，參見(jiàn)Holliger 和Hudson, 2005, M /w,e 5,o/ec/mo/ogy， 23: 1126-1136。所有此種改 造抗體可以在本文提供的融合多肽中使用。
可以包含主題融合多肽的其他多價(jià)改造抗體在Lu等人，2003,丄 /mmw"o/. A/e仇279: 219-232 (雙-雙抗體(di-diabodies )或四價(jià)雙特異 性抗體)；美國(guó)公開(kāi)申請(qǐng)20050079170(多聚體Fv分子或"flexiboches")、 以及WO99/57150和Kipriyanov等人，1999, J. Mol. Biol. 293: 41-56(串 耳關(guān)雙抗體、或"Tandabs")中得到描述。
上述多價(jià)改造抗體中的任何一種可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)重組DNA技術(shù)進(jìn)行開(kāi)發(fā)，例如下述參考文獻(xiàn)中描述的PCT國(guó)際申請(qǐng) 號(hào)PCT/US86/02269;歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?84,187;歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71,496; 歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?73,494; PCT國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 86/01533;美國(guó)專利號(hào) 4,816,567;歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?25,023; Better等人(1988 ) 240: 1041-1043; Liu等人(1987 )爿c"d V&4 84: 3439-3443; Liu等人(1987 )■/ /mww朋/. 139: 3521-3526; Sun等人(1987 )尸亂淑/. 爿c"d V&4 84: 214-218; Nishimura等人(1987) C""cw 47: 999-1005; Wood等人(1985 ) Atowe 314: 446-449; Shaw等人(1988 ) J. 7W^/. C""cer/"w. 80: 1553-1559) ; Morrison ( 1985 ) Sc&"ce 229: 1202-1207; Oi等人(1986 )S,o:Tec—腦4: 214;美國(guó)專利號(hào)5，225,539; Jones等人(1986 )淑,321: 552-525; Verhoeyan等人(1988 ) 239: 1534; Beidler等人(1988 ) J.141: 4053-4060;和Winter 和Milstein, Nature, 349,第293-99頁(yè)(1991))。優(yōu)選地非人抗體通 過(guò)使非人抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人恒定結(jié)構(gòu)域連接進(jìn)行"人源化"(例如 Cabilly等人，美國(guó)專利號(hào)4,816,567; Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81,第6851-55頁(yè)(1984))。
改造抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)或整個(gè)可變區(qū)可以衍生自針對(duì)任何目的 抗原的一種或多種親代抗體。親代抗體可以包括天然存在的抗體或抗體 片段，由天然存在的抗體修改的抗體或抗體片段，使用已知對(duì)于目的抗 原特異的抗體或抗體片段序列從頭構(gòu)建的抗體?？梢匝苌杂H代抗體的 序列包括其重和/或輕鏈可變區(qū)和/或CDRs、構(gòu)架區(qū)或其他部分。
多價(jià)、多特異性抗體可以包含含有2個(gè)或更多可變區(qū)的重鏈和/或含 有一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的輕鏈，其中至少2個(gè)可變區(qū)識(shí)別相同抗原上的不 同表位。
用于包括在融合多肽中的候選改造抗體，或融合多肽自身可以使用 多種已知測(cè)定就活性進(jìn)行篩選。例如，測(cè)定結(jié)合特異性的篩選測(cè)定是本 領(lǐng)域眾所周知的和常規(guī)實(shí)踐的。關(guān)于此種測(cè)定的廣泛討論，參見(jiàn)Harlow 等人(編輯)，ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor N. Y., 1988,笫6章。
進(jìn)一步提供了選擇候選的改造抗體的方法。例如，候選物可以衍生 自人scFv和其他抗體文庫(kù)。因此，提供了抗體細(xì)菌展示文庫(kù)。文庫(kù)優(yōu)選 包含多個(gè)細(xì)菌，其中細(xì)菌展示平均具有至少一個(gè)scFv或Vh或VL拷貝；文庫(kù)包含多個(gè)種類的scFv或Vh或VL。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌展示平 均包含至少3個(gè)、至少4個(gè)、或至少5個(gè)scFv或Vh或VL拷貝/細(xì)菌。 特別優(yōu)選的文庫(kù)平均包含至少約106、優(yōu)選地至少約107、更優(yōu)選地至少 約108個(gè)不同種類的scFv或Vh或VL。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體由 其為質(zhì)粒或噬菌粒載體部分的核酸編碼。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供了編碼如細(xì)菌展示抗體文庫(kù)的核酸文庫(kù)。核酸文庫(kù)包含至少約 106、更優(yōu)選地至少約107、和最優(yōu)選地至少約108個(gè)不同的質(zhì)?；蚴删?粒載體。
月包吞的細(xì)菌可以通過(guò)2種不同方法進(jìn)行選擇。 一種方法是使這些哺 乳動(dòng)物細(xì)胞裂解且在包含合適的抗生素標(biāo)記的細(xì)菌培養(yǎng)基上鋪平板，但 當(dāng)必須篩選〉108個(gè)變體的大型文庫(kù)時(shí)，此種程序是繁瑣和費(fèi)力的。另一 種方法是在大腸桿菌中表達(dá)熒光蛋白質(zhì)例如GFP,并且一旦被胞吞，哺 乳動(dòng)物細(xì)胞就是焚光的，并且可以通過(guò)FACS進(jìn)行分離。GFP是新型熒 光標(biāo)記以由于下述特征選擇胞吞的細(xì)菌a) GFP是具有低毒性的細(xì)胞 質(zhì)蛋白質(zhì)(Chalfie等人,263: 802， 1994);因此，GFP的存 在應(yīng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面動(dòng)力學(xué)具有最低限度的作用；b) GFP可以是連續(xù) 合成的，這使在細(xì)菌復(fù)制期間熒光信號(hào)稀釋的作用降到最低；和c)GFP 是易于成像和定量的(Wang和Hazelrigg, A^we 369: 400, 1994)。 此外，單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和與之結(jié)合的細(xì)菌數(shù)目成正比 (Valdivia等人，173: 47， 1996)。因此，與宿主細(xì)胞結(jié)合的GFP 生產(chǎn)性細(xì)菌的流式細(xì)胞術(shù)分析提供了細(xì)菌粘附和侵染的快速和方便的 測(cè)量。已顯示a)基因她被表達(dá)，且功能性熒光GFP在不同細(xì)菌系統(tǒng) 例如大腸桿菌、假結(jié)核病耶爾森氏菌(ye^/m'a/wewt/t^wZ)en:w/c^& )、鼠 傷寒沙門氏菌(Sa/mo/ e〃a (y/ /z/mwn'wm )禾口海分斗支片干菌(A^co6a"en'wm ww/mwO中進(jìn)行生產(chǎn)，b) GFP的生產(chǎn)不改變3種病原體與其各自的宿 主細(xì)胞的相互作用，c)生產(chǎn)GFP的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌性病原體可以與活細(xì)胞 和組織結(jié)合進(jìn)行成像，和d) GFP生產(chǎn)可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)， 且用于測(cè)量細(xì)菌與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的程度(Valdivm等人，同上)。
可以從大型非免疫或免疫細(xì)菌口展示文庫(kù)中直接選擇內(nèi)在;匕抗體候選物。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇內(nèi)在化到特定靶細(xì)胞內(nèi)的 多肽或抗體結(jié)構(gòu)域的方法。該方法涉及a)使一種或多種靶細(xì)胞與細(xì)菌展示文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)成員接觸；b)在其中展示文庫(kù)的成員可以進(jìn)行 內(nèi)在化的條件下培養(yǎng)耙細(xì)胞；和c)如果細(xì)菌展示文庫(kù)的成員內(nèi)在化到 一個(gè)或多個(gè)耙細(xì)胞內(nèi)，那么鑒定細(xì)菌展示文庫(kù)的內(nèi)在化成員。優(yōu)選地， 該方法另外涉及使細(xì)菌展示文庫(kù)的成員與相減細(xì)胞系的細(xì)胞接觸；和隨 后洗涂耙細(xì)胞以去除相減細(xì)胞系的細(xì)胞；和去除與靶細(xì)胞非特異性結(jié)合 或弱結(jié)合的細(xì)菌展示文庫(kù)的成員。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌展示文庫(kù)是 抗體細(xì)菌展示文庫(kù)，更優(yōu)選地展示單鏈抗體(scFv)的抗體細(xì)菌展示文 庫(kù)，或輕(VL)或重(VH)鏈的可變結(jié)構(gòu)域。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定步驟包括回收內(nèi)在化細(xì)菌和再次重復(fù)該方 法的步驟，以進(jìn)一步選擇內(nèi)在化的結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，回收 步驟涉及使靶細(xì)胞裂解以釋放內(nèi)在化細(xì)菌，和傳代培養(yǎng)細(xì)菌以生產(chǎn)細(xì)菌 用于后續(xù)選擇輪次?；厥詹襟E可以涉及回收傳染性細(xì)菌，和/或回收編碼 細(xì)菌展示抗體的核酸和/或選擇表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)菌。鑒定步驟可以涉及 檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)，檢測(cè)特定核酸的存在或量，或經(jīng)由選擇標(biāo)記選擇 細(xì)菌。鑒定步驟還可以涉及通過(guò)FACS分選具有內(nèi)在化細(xì)菌的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。在優(yōu)選方法中，相減細(xì)胞系的細(xì)胞以超過(guò)靶細(xì)胞至少2倍過(guò)量呈 現(xiàn)。在優(yōu)選方法中，靶細(xì)胞系與組織培養(yǎng)板貼壁生長(zhǎng)且在單個(gè)培養(yǎng)^f瓦中 與相減細(xì)胞系懸浮共溫育。在特別優(yōu)選的方法中，與相減細(xì)胞系的接觸 在低于內(nèi)在化培養(yǎng)條件(例如，37°C)的溫度(例如，4°C)下進(jìn)行。 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌表達(dá)選擇標(biāo)記和/或報(bào)道基因。優(yōu)選的選 擇標(biāo)記包括但不限于，編碼焚光蛋白質(zhì)(例如，GFP )的基因(或cDNAs )、 和生色基因或cDNA (例如，卩內(nèi)酰胺酶、螢光素酶和卩半乳糖普酶)。 在某些實(shí)施方案中，耙細(xì)胞可以包括超表達(dá)特定受體的細(xì)胞、cDNA表 達(dá)文庫(kù)的成員、超表達(dá)趨化因子受體的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的細(xì)胞、用編 碼特定表面靶受體的基因或cDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。合適的相減細(xì)胞系包括 但不限于，正常人成纖維細(xì)胞、正常人乳腺細(xì)胞、胰細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
涉及受體介導(dǎo)的胞吞作用的細(xì)胞表面受體可以從頭進(jìn)行鑒定(Gao 等人，</. /mmw"o/. A/e仇274: 185， 2003 )。在第一個(gè)步驟中，通過(guò)相 減法，肺瘤特異性內(nèi)在化scFvs通過(guò)使scFv文庫(kù)順次暴露于各種人細(xì)胞 和隨后最終暴露于所需細(xì)胞類型進(jìn)行分離。作為下一個(gè)步驟，所選擇的 scFvs用作探針用于通過(guò)免疫沉淀、質(zhì)譜分析法和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索隨后鑒定
14其同源受體?；谶@個(gè)程序，選擇對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞中的運(yùn)鐵蛋白受體，
和胰腺癌細(xì)胞中存在的a3(3i整聯(lián)蛋白特異的scFvs (Gao等人，同上)。 此種相減法已成功地用于選擇在人乳腺和胰癌細(xì)胞系上(Fransson等人， QmcerZ^". 208: 235, 2004 )以及在前列腺癌細(xì)胞上(Liu等人，Omcw 64: 704， 2004)的內(nèi)在化受體。
因此，本發(fā)明的方法還可以用于鑒定內(nèi)在化受體。鑒定僅存在于肝 細(xì)胞(hepatocyte )(肝細(xì)胞(liver cell))中且不存在于任何其他細(xì)胞 類型中的胞吞受體是一個(gè)此種例子。該方法一般涉及用于鑒定內(nèi)在化抗 體的任何方法，或鑒定的多肽用于探測(cè)原始靶細(xì)胞或不同細(xì)胞。因?yàn)閮?nèi) 在化抗體或多肽這樣結(jié)合，所以它們?cè)试S分離具有內(nèi)在化受體的細(xì)胞和 分離受體和/或受體表位自身。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法涉及a) 使一種或多種靶細(xì)胞與細(xì)菌展示文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)成員接觸，b)任選 地，但優(yōu)選地，使細(xì)菌展示文庫(kù)的成員與相減細(xì)胞系的細(xì)胞接觸，c) 任選地，卩旦優(yōu)選地，洗滌耙細(xì)胞以去除相減細(xì)胞系的所述細(xì)胞，和去除
的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，e)如果細(xì)菌展示文庫(kù)的成員內(nèi)在化到一個(gè)或多個(gè) 耙細(xì)胞內(nèi)，那么鑒定細(xì)菌展示文庫(kù)的內(nèi)在化成員，f)使相同或不同靶細(xì) 胞與步驟(e)鑒定的內(nèi)在化成員或由其繁殖的成員接觸，由此成員與 所述耙細(xì)胞的表面結(jié)合。該方法可以進(jìn)一步涉及分離成員與之結(jié)合的相 同或不同草巴細(xì)胞的組分。在一些方法中，"鑒定"步驟涉及回收內(nèi)在化細(xì) 菌和重復(fù)步驟(a-e)以進(jìn)一步選擇內(nèi)在化受體。接觸、洗滌、培養(yǎng)和 鑒定步驟優(yōu)選如本文描述的進(jìn)行，且相減細(xì)胞系包括心肌細(xì)胞、正常和 癌性乳腺細(xì)胞。
其他蛋白質(zhì)展示技術(shù)可以在上述方法中使用。摻入其他展示技術(shù)的 此種方法的修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？梢栽诒痉椒ㄖ惺褂玫?示例性蛋白質(zhì)展示技術(shù)的綜述在下文提供。
f ^^#雇^戎^.-抗體 改造在開(kāi)發(fā)具有優(yōu)良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的 抗體療法中起關(guān)鍵作用(Burks等人，尸rac. TVa". v4cad V&4 94: 412, 1997; US Patent: 6,180,341 )。定向進(jìn)化涉及，首先使用分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生具有隨機(jī)序列的蛋白質(zhì)表達(dá)克隆的重組文庫(kù)，和其次，使用篩選
技術(shù)用于分離顯示最增強(qiáng)的活性的蛋白質(zhì)變體。大型文庫(kù)的篩選要求在 基因、其編碼的蛋白質(zhì)和所需功能中的物理聯(lián)系。此種聯(lián)系可以通過(guò)使
用已證明無(wú)價(jià)的多種體內(nèi)展示技術(shù)來(lái)確定(Wittr叩，Atow" S/Wec/mo/. 18: 1039， 2000; Hayhurst和Georgiou, C鮮.0—. CA置腸/. 5: 683, 2001 )。
蛋白質(zhì)展示技術(shù)共同代表用于蛋白質(zhì)改造的最有力工具之一(Olsen 等人，Cwr. 0/ ,".所Wec/z"o/. 11: 331， 2000)。為了展示目的，蛋白質(zhì) 與多肽序列的C或N末端融合，所述多肽序列使所得到的嵌合體靶向生 物顆粒例如病毒、細(xì)菌和酵母表面上,。文庫(kù)一般通過(guò)稱為"淘選"的方法 經(jīng)由 一 系列吸附-解吸循環(huán)就配體結(jié)合進(jìn)行篩選。淘選已成功地用于篩選 通過(guò)克隆哺乳動(dòng)物抗體鐠和在噬菌體上展示其而制備的高度復(fù)雜的文 庫(kù)(最高達(dá)10"個(gè)克隆)。對(duì)于稍微較不多樣的文庫(kù)(最高達(dá)109個(gè)克 隆)，在與流式細(xì)胞術(shù)偶聯(lián)的細(xì)菌或酵母上展示是用于發(fā)現(xiàn)具有特別高 的配體結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)的有力工具(Chen等人，A^wre Ao化c/wo/. 19: 537, 2001 )。盡管展示技術(shù)的重要性對(duì)于蛋白質(zhì)改造是無(wú)異議的， 但使靶多肽錨定在生物顆粒表面上的需要強(qiáng)加了許多限制，所述限制可 以顯著減少相對(duì)于可以以可溶形式在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)全體的文庫(kù) 多樣性。首先，蛋白質(zhì)展示需要目的蛋白質(zhì)作為C或N末端融合物進(jìn)行 表達(dá)，這個(gè)過(guò)程可以不利地影響蛋白質(zhì)功能和/或穩(wěn)定性。其次，蛋白質(zhì) 展示受與蛋白質(zhì)輸出和呈遞相關(guān)的生物約束的影響，這可以損害病毒或 細(xì)胞的生存力。第三，展示可以引入篩選假象例如在噬菌體中的抗體親 抗原性效應(yīng)(O，Connell等人，丄Mo/. Ao/. 321: 49, 2002)。
候選改造抗體可以通過(guò)蛋白質(zhì)展示技術(shù)的組合進(jìn)行選擇，特別是細(xì) 菌展示技術(shù)-涉及構(gòu)建在細(xì)菌周質(zhì)中錨定的周質(zhì)表達(dá)(APEx)文庫(kù)以及 在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的文庫(kù)，從而使得候逸改造抗體在細(xì)胞溶膠的生理 學(xué)還原環(huán)境下正確折疊且是功能活性的。
已的一種方法是從噬菌體展示文庫(kù)中分離scFvs，隨后為就在大腸 桿菌中表達(dá)或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用篩選大量克隆(Lecerf等人， A^/.爿cad Sc. V&4 98: 4764, 2001; Gennari等人，Mo/. Ao/. 335: 193, 2004; Emadi等人，B,oc/ze脂Wo/43: 2871， 2004)。其他人已使 用雙雜交系統(tǒng)以分離改造抗體(Tes等人，乂 Mo/.317: 85, 2002;Tanaka等人，￡A/S<922: 1025, 2003 ) , ^f旦這不允許樣i調(diào)抗體生物物 理學(xué)性質(zhì)例如親和力和表達(dá)。
丄逸##^^義岸；
在M13噬菌體上展示是最古老和最廣泛使用的蛋白質(zhì)文庫(kù)篩選法 (Marks等人，丄A/o/. 222: 581, 1991; Marks等人，./. S/o/. C/zew. 267: 16007, 1992; Rodi和Makowski， CW. (9—.胸ec/z"o/. 10: 87, 1999 )。噬菌體抗體文庫(kù)已變成用于開(kāi)發(fā)治療抗體的重要資源(Bradbury 和Marks， J./mmw"o/. Me汰290: 29, 2004)。大型非免疫文庫(kù)充當(dāng)單 罐資源用于快速產(chǎn)生針對(duì)廣泛范圍的自身和非自身抗原的人MAbs (HuMAbs),包括腫瘤生長(zhǎng)因子受體(Li等人，77^r 8: 555, 2001; Liu等人，OmcwA饑64: 704, 2004)。從在噬菌體上表 達(dá)的組合文庫(kù)中分離的大多數(shù)MAbs已使用固定化在人工表面上的純化 的抗原或肽進(jìn)行選擇。這種方法可以選擇在生理學(xué)背景中不識(shí)別天然蛋 白質(zhì)，特別是具有大分子量細(xì)胞表面受體的MAbs。已試圖使用細(xì)胞裂 解物(Parren等人，J. F,ra/. 70: 9046, 1996; Sanna等人，尸rac. vV"".爿c^/. Sci. 92: 6439, 1995; Sawyer等人，丄/mmtmo/. Me仇204: 193, 1997)或活細(xì)胞(Andersen等人，A^/.爿c^ . 93: 1820，
1996; Osboum等人，/mmw"Wec/mo/. 3: 293, 1998)選擇天然構(gòu)象的 抗原。由于原材料的異質(zhì)性，此種方法要求精細(xì)規(guī)程，包括相減步驟以 避免選擇無(wú)關(guān)抗體。對(duì)異源材料進(jìn)行的少數(shù)成功選擇一般使用來(lái)自免疫 來(lái)源的小型文庫(kù)來(lái)完成。免疫文庫(kù)的使用限制可以潛在地得自相同文庫(kù) 和一般產(chǎn)生鼠抗體的抗原特異性語(yǔ)。僅存在使用大型非免疫文庫(kù)對(duì)細(xì)胞 成功選擇的3篇報(bào)道(de Kruif等人，/Voc.淑/.爿cad. Sc/.固92: 3938， 1995; Marks等人，S她c/zwo/ogy 11: 1145, 1993; Vaughan等人，淑訓(xùn) 腸&c/mo/. 14: 309， 1996)。
看起來(lái)是非特異性噬菌體相對(duì)高的背景^合和特異性噬菌體相對(duì)低的 纟*合(Becerril等人，6wc/^m. Aes. Comm. 255: 386, 1999;
Pereira等人，J. /附mwwo/. A/eA. 203: 11, 1997; Watters等人， /附mw"o化c/z"o/. 3: 21， 1997)。特異性噬菌體的低結(jié)合與多克隆制劑中 低濃度的給定結(jié)合噬菌體部分相關(guān)(在1 x 10"顆粒/ml的噬菌體制劑中對(duì)于109文庫(kù)的單個(gè)成員約1.6xl(T17M)。低濃度同時(shí)限制普通結(jié)合劑
的相減和特定結(jié)合劑的富集的效率。為了克服這種限制，求助于利用正 常細(xì)胞表面受體生物學(xué)。許多受體在配體結(jié)合后經(jīng)歷胞吞作用。假定在 嚴(yán)格去除來(lái)自細(xì)胞表面的非特異性噬菌體后，通過(guò)從細(xì)胞溶膠中回收胞
吞的噬菌體抗體可以顯著增加特異性結(jié)合劑的富集比(Poul等人,J. A/o/. 腸/. 301: 1149， 2000)。
凡',母4面^^x岸.'
酵母表面展示(YSD; Boder和Wittrup,淑,腸"c/mo/. 15: 553, 1997)是另一種已證明用于蛋白質(zhì)改造的工具。在YSD中，目的蛋白 質(zhì)表達(dá)為與酵母交配蛋白質(zhì)Aga2p的融合物，所述Aga2p靶向酵母細(xì)胞 壁。 一旦在酵母表面上表達(dá)，蛋白質(zhì)性質(zhì)例如穩(wěn)定性和親和力就可以使 用熒光標(biāo)記的試劑和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量測(cè)量。此外，突變體文庫(kù)可以 使用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)就所需性質(zhì)進(jìn)行分選。YSD已成功 地應(yīng)用于抗體改造的幾個(gè)方面從非免疫HuMAb文庫(kù)中分離針對(duì)特定 抗原的新型Abs (Feldhaus等人，Ato^re Ao&c/mo/. 21: 163， 2003 ); 親和力成熟，從而導(dǎo)致迄今為止報(bào)道的最高親和力的抗體(Boder等人， 尸rac. Sc. t/&4 97: 10701, 2000);以及穩(wěn)定性和細(xì)胞外表
達(dá)最優(yōu)化(Shusta等人，Atowre ^Wec/wo/. 18: 754, 2000)。此外， YSD是用于抗體結(jié)合部位(互補(bǔ)位)的結(jié)構(gòu)域水平分析，和功能性抗體 改造的有用工具(Colby等A，丄A/o/. Ao/. 342: 901， 2004 )。在鑒定 具有優(yōu)良表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)功能的最低限度抗體片段的嘗試中，YSD用于通 過(guò)親和力成熟和結(jié)合部位分析將細(xì)胞內(nèi)無(wú)功能的scFv改造成功能性的 單結(jié)構(gòu)域Vl抗體。
盡管所有這些優(yōu)點(diǎn)，但YSD平臺(tái)關(guān)于應(yīng)用于抗體改造的潛在缺點(diǎn) 可能起于與細(xì)胞質(zhì)相比較細(xì)胞表面上氧化還原環(huán)境中的差異，其中二硫 鍵未穩(wěn)定形成。MAbs包含在Vh和VL結(jié)構(gòu)域中高度保守的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二 硫鍵，所述結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵使P折疊形成性構(gòu)架殘基保持剛性構(gòu)象。這 些二硫鍵的破壞擾亂結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，從而減少蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(Ramm等人， 丄Mo/. B/o/. 290: 535, 1999)。這推測(cè)起來(lái)負(fù)責(zé)關(guān)于scFv的細(xì)胞表面 表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)水平之間的差異。此外，融合蛋白(例如，scFv)的 表達(dá)一般是順式顯性的；即，融合蛋白的表達(dá)僅與具有最低穩(wěn)定性的成員的表達(dá)一樣好，因此當(dāng)VH被消除時(shí)在觀察到的表達(dá)中改善的可替代
解釋是2.4.3的VH結(jié)構(gòu)域在還原條件下明顯不如Vl穗定(Colby等人， 同上)。
與任何文庫(kù)篩選技術(shù)(噬菌體和酵母展示技術(shù))有關(guān)的重要問(wèn)題是 以高水平表達(dá)分離的克隆的能力。現(xiàn)有展示形式涉及與大錨定序列融 合，這可以影響展示的蛋白質(zhì)的表達(dá)特征。由于這個(gè)原因，在噬菌體、 酵母或細(xì)菌(特別是在外膜上表達(dá)的蛋白質(zhì)文庫(kù))中作為融合物良好展 示的scFvs不必順應(yīng)作為非融合蛋白可溶形式的高表達(dá)(Hayhurst等人， 丄/mm麗o/. Me仇276: 185, 2003 )。相比之下，在APEx展示中蛋白 質(zhì)N末端栓系到細(xì)胞質(zhì)膜上所需的短(6-aa)序列不太可能影響融合物 的表達(dá)特征。與這個(gè)假設(shè)一致，通過(guò)APEx分離的針對(duì)炭痘PA毒素的 所有3個(gè)親和力增強(qiáng)的克隆顯示出極佳的可溶表達(dá)特征，盡管具有眾多 氨基酸置換，從而暗示可以在細(xì)菌中以可溶形式大規(guī)模容易地生產(chǎn)的克 隆的分離可能是APEx選擇的固有特征(Harvey等人，尸rac. A^/.爿cac/. Sc/. V&4 101: 9193, 2004)。
C.' AP五;c勿絲^義岸,
基于流式細(xì)胞術(shù)的方法已使用細(xì)菌表達(dá)得到開(kāi)發(fā)，用于從組合文庫(kù) 中有效選擇高親和力配體結(jié)合蛋白質(zhì)，和特別地scFvs。 APEx基于蛋白 質(zhì)與內(nèi)膜周質(zhì)側(cè)的錨定，隨后為在與熒光標(biāo)記的抗原溫育前破壞外膜和 FC分選(Harvey等人，ZVoc. Ato/.爿cad S" J7&4 101: 9193, 2004)。 在APEx中，蛋白質(zhì)通過(guò)與大腸桿菌的內(nèi)膜栓系在周質(zhì)中表達(dá)。細(xì)菌外 膜化學(xué)/酶促透化后，表達(dá)錨定的scFv抗體的大腸桿菌細(xì)胞可以用焚光 抗原特異性標(biāo)記，大小范圍最高達(dá)至少240 kDa，和通過(guò)FC進(jìn)行分析。 另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是GFP和抗原之間的融合物可以內(nèi)源表達(dá)且通過(guò)周質(zhì)錨定 的scFv進(jìn)行捕獲。因此，在洗滌步驟后，表達(dá)焚光抗原和APEx錨定的 scFv的細(xì)胞是高度熒光的，且可以與僅表達(dá)單獨(dú)的scFv或GFP抗原融 合物的細(xì)胞容易地分選。
使用〉400百萬(wàn)細(xì)胞/小時(shí)的分選率，商業(yè)FC機(jī)器可以用于篩選大小 在微生物轉(zhuǎn)化效率的約束內(nèi)可接近的文庫(kù)。此外，多參數(shù)FC可以實(shí)時(shí) 提供關(guān)于各個(gè)和每個(gè)文庫(kù)克隆的功能的有價(jià)值信息，因此幫助指導(dǎo)文庫(kù) 構(gòu)建方法和最優(yōu)化分選條件(Daugherty, P.S.等人，尸roc. Ato/. ^c^/. Sc/.V&4 97: 2029， 2000)。特別地，大腸桿菌提供了重組蛋白質(zhì)的容易表 達(dá)和高DNA轉(zhuǎn)化效率，這允許有效的大型文庫(kù)生產(chǎn)和蛋白質(zhì)文庫(kù)序列 空間增加的覆蓋。
APEx展示提供了超過(guò)先前開(kāi)發(fā)的稱為PECS (Chen等人，Mm^e Ao&c/wo/. 19: 537, 2001 )的具有細(xì)胞計(jì)量篩選的細(xì)菌周質(zhì)表達(dá)法， 以及表面展示法例如噬菌體和酵母展示技術(shù)的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)(i) APEX是 基于大腸桿菌的系統(tǒng)，且因此提供了通過(guò)分離的抗體的轉(zhuǎn)化和制備型蛋 白質(zhì)表達(dá)來(lái)制備大型文庫(kù)的容易途徑；(ii)通過(guò)使用脂肪?；^以使 蛋白質(zhì)保留在內(nèi)膜中，短至6個(gè)氨基酸的融合物是展示所需的全部。短 融合物不太可能影響分離的蛋白質(zhì)的親和力或表達(dá)特征；(iii)內(nèi)膜缺 乏可以空間上妨礙與展示的多肽結(jié)合的大抗原的分子，例如LPS或其他 復(fù)合糖；(iv)融合物在其展示前必須僅穿過(guò)一個(gè)膜，且因此可能限制 某些序列輸出至酵母或細(xì)菌表面的生物合成限制可能被回避；(v)展 示通過(guò)使用N或C末端融合來(lái)完成，(vi) APEx可以直接用于由廣泛 使用的噬菌體展示載體表達(dá)的蛋白質(zhì)。最后，(vii) APEx提供了用于 在相同細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)熒光抗原和抗體的手段。這對(duì)于肽抗原是特別重 要的，且避免了關(guān)于制備量探針的合成、純化和綴合的費(fèi)時(shí)過(guò)程，如當(dāng) 熒光抗原與文庫(kù)一起溫育時(shí)所需的。APEx可以用于檢測(cè)從小分子(<1 kDa)到藻紅蛋白綴合物(240 kDa)的抗原，和可能大得多的抗原。
當(dāng)scFv的結(jié)合能主要由2個(gè)結(jié)構(gòu)域之一貢獻(xiàn)時(shí)，APEx展示程序可 以用于從scFv衍生單結(jié)構(gòu)域抗體(DAbs )。
B. HSP70結(jié)構(gòu)域
任何合適的應(yīng)激蛋白(熱激蛋白(Hsp))都可以用于本發(fā)明的融 合多肽中。例如，可以使用Hsp60和/或Hsp70。轉(zhuǎn)向一般的應(yīng)激蛋白， 細(xì)胞通過(guò)增加通常稱為應(yīng)激、或熱激基因的基因群表達(dá)對(duì)應(yīng)激物(一般 為熱激處理)應(yīng)答。熱激處理涉及使細(xì)胞或生物暴露于超過(guò)細(xì)胞適應(yīng)的 溫度l至幾攝氏度的溫度。與此種基因的誘導(dǎo)一致，相應(yīng)的應(yīng)激蛋白水 平在受應(yīng)激細(xì)胞中增加。
在細(xì)菌中，占優(yōu)勢(shì)的應(yīng)激蛋白是分別具有約70和60kDa的分子大 小的蛋白質(zhì)，其通常分別稱為Hsp70和Hsp60。這些和其他特定應(yīng)激蛋 白以及編碼其的基因在下文進(jìn)一步討論。在細(xì)菌中，基于使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和染料考馬斯藍(lán)的染色模式，Hsp70和 Hsp60 —般代表約1 - 3 %的細(xì)胞蛋白質(zhì)，但在應(yīng)激條件下累積至高達(dá)25 %的水平。應(yīng)激蛋白看起來(lái)參與重要的細(xì)胞過(guò)程例如蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞 內(nèi)運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和分解。看起來(lái)在應(yīng)激過(guò)程中增加的合 成的應(yīng)激蛋白量主要用于使誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)解折疊的后果降到最低。事實(shí) 上，細(xì)胞預(yù)暴露于誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白合成的適度應(yīng)激條件給細(xì)胞提供不受后 續(xù)更極端應(yīng)激的有害作用的保護(hù)。
主要的應(yīng)激蛋白看起來(lái)在迄今為止檢查的每種生物和組織類型)中 表達(dá)。同樣，看起來(lái)應(yīng)激蛋白代表迄今為止鑒定的最高度保守的蛋白質(zhì) 群。例如，當(dāng)比較在廣泛多樣的生物中的應(yīng)激蛋白時(shí)，Hsp90和Hsp70 在氨基酸水平上顯示出50%或更高的同一性，且在非等同位置上共享許 多相似性。應(yīng)當(dāng)指出相似或更高的同源性水平存在于物種內(nèi)的特定應(yīng)激 蛋白家族的不同成員之間。
應(yīng)激蛋白，特別地Hsp70、 Hsp60、 Hsp20J0和Hsp 10,在針對(duì)經(jīng) 由結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌(A今co6""enwm /e/ rae )感染的免疫應(yīng) 答中在由宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要決定簇中。Young,R.A.和Elliott. T丄， Stress Proteins, Infection, And Immune Surveillance, Ce〃 50: 5-8( 1989 )。 此外， 一些大鼠致關(guān)節(jié)炎(arthritogenic) T細(xì)胞識(shí)別Hsp60表位。Van Eden, W.等人，Atow^ 331: 171-173 ( 1988 )。然而，個(gè)體包括無(wú)分枝 桿菌感染或自身免疫疾病史的健康個(gè)體，也攜帶識(shí)別細(xì)菌和人Hsp60表 位的T細(xì)胞；在健康個(gè)體中特征在于表達(dá)？ST細(xì)胞受體的相當(dāng)大級(jí)分 的T細(xì)胞識(shí)別自身和外來(lái)應(yīng)激蛋白。O'Brien, R.等人,Ce〃 57: 664-674 (1989)。因此，個(gè)體即使是健康個(gè)體也具有識(shí)別外來(lái)和自身應(yīng)激蛋白 表位的T細(xì)胞群體。
識(shí)別應(yīng)激蛋白表位的這個(gè)系統(tǒng)推測(cè)構(gòu)成針對(duì)侵入生物的"早期防御 系統(tǒng)"。Murray, P丄和Young, R.A., J. te/e"o/ 174: 4193-6 ( 1992 )。 該系統(tǒng)可以通過(guò)經(jīng)由細(xì)菌和病毒的頻繁刺激得到維持。如前文所討論 的，健康個(gè)體具有識(shí)別自身應(yīng)激蛋白的T細(xì)胞群體。因此，自身反應(yīng)性 T細(xì)胞的存在與正常健康相容且不引起自身免疫疾病；這證實(shí)應(yīng)激蛋白 在個(gè)體內(nèi)的安全性。應(yīng)激蛋白的安全性由BCG(卡介苗，牛分枝桿菌菌 抹)接種疫苗的成功和相對(duì)安全性得到另外證實(shí)，所述BCG接種疫苗 誘導(dǎo)針對(duì)應(yīng)激蛋白的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答還是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌保
21護(hù)性的。
應(yīng)激基因家族和用于在融合多肽中使用的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周
知的，并且包括例如Hsp 100-200、 HsplOO、 Hsp90、 Lon、 Hsp70、 Hsp60、 TF55、 Hsp40、 FKBPs、親環(huán)蛋白、Hsp20-30、 ClpP、 GrpE、 HsplO、泛 蛋白、《丐聯(lián)接蛋白和蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶。Macario， A丄L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59-70, 1995; Parsell， D.A.和Lindquist, S. J肌 "ev. 27: 437-496( 1993 );美國(guó)專利號(hào)5,232,833 ( Sanders等人)。
應(yīng)激蛋白的特別組包括Hsp90、 Hsp70、 Hsp60、 Hsp20-30,進(jìn)一步優(yōu)選 地Hsp70和Hsp60。
HsplOO-200例子包括Grpl70 (用于葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白)。Grpl70 位于ER的腔內(nèi)，在前高爾基區(qū)室中，并且可以在免疫球蛋白折疊和裝 配中起作用。
HsplOO例子包括哺乳動(dòng)物HspllO、酵母Hspl04、 ClpA、 ClpB、 ClpC、 ClpX和ClpY。酵母Hspl04和大腸桿菌ClpA形成六聚的和大腸 桿菌ClpB,四聚顆粒，其裝配似乎需要腺噪呤核苷酸結(jié)合。Clp蛋白酶 提供了由ClpP (蛋白水解亞單位)和ClpA組成的750 kDa雜寡聚體。 ClpB-Y在結(jié)構(gòu)上與ClpA相關(guān)，盡管與ClpA不同，它們似乎不與ClpP 復(fù)合。
Hsp90例子包括在大腸桿菌中的HtpG,酵母Hsp83和Hsc83,以及 在人中的Hsp90a、 Hsp90(3和Grp94。 Hsp90結(jié)合蛋白質(zhì)群，所述蛋白質(zhì) 一般是細(xì)胞調(diào)節(jié)分子例如類固醇激素受體(例如，糖皮質(zhì)激素、雌激素、 孕酮和睪酮受體)，轉(zhuǎn)錄因子和在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起作用的蛋白質(zhì)激酶。 Hsp90蛋白質(zhì)還參與包括其他應(yīng)激蛋白的大的、豐富的蛋白質(zhì)復(fù)合物的 形成。
Lon是在大腸桿菌中起降解非天然蛋白質(zhì)的ATP依賴性蛋白酶作用 的四聚蛋白質(zhì)。
Hsp70例子包括來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Hsp72和Hsc73,來(lái)自細(xì)菌的 DnaK,所述細(xì)菌特別是分枝桿菌例如麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和牛 分枝桿菌(例如卡介苗在本文中稱為Hsp71 )，來(lái)自大腸桿菌 (￡^c/zenc/n<2 co//)、酵母和其他原核生物的DnaK,以及BiP和Grp78。 Hsp70能夠特異性結(jié)合ATP以及解折疊的多肽和肽，由此參與蛋白質(zhì)折 疊和解折疊以及蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和分解。Hsp60例子包括來(lái)自分枝桿菌的Hsp65。細(xì)菌Hsp60通常也稱為 GroEL,例如來(lái)自大腸桿菌的GroEL。 Hsp60形成大的同寡聚復(fù)合物， 并且似乎在蛋白質(zhì)折疊中起關(guān)鍵作用。Hsp60同源物存在于真核線粒體 和葉綠體中。
TF55例子包括Tcpl、 TRiC和熱聚體(thermosome )。該蛋白質(zhì)一 般存在于真核生物和一些古細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，且形成多成員環(huán)、從而促 進(jìn)蛋白質(zhì)折疊。它們還與Hsp60弱同源。
Hsp40例子包括來(lái)自原核生物例如大腸桿菌和分枝桿菌的DnaJ以 及HSJ1、 HDJ1和Hsp40。在其他細(xì)胞活性中，Hsp40在蛋白質(zhì)折疊、 耐熱性和DNA復(fù)制中作為分子侶伴起作用。
FKBPs例子包括FKBP12、 FKBP13、 FKBP25,以及FKBP59、 Fprl 和Nepl。該蛋白質(zhì)一般具有肽基脯氨酸異構(gòu)酶活性且與免疫抑制劑例如 FK506和雷帕霉素相互作用。該蛋白質(zhì) 一般在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticululum )中發(fā)現(xiàn)。
親環(huán)蛋白例子包括親環(huán)蛋白A、 B和C。該蛋白質(zhì)具有肽基脯氨酸 異構(gòu)酶活性且與免疫抑制劑環(huán)孢菌素A相互作用。該蛋白質(zhì)環(huán)孢菌素A 結(jié)合《丐依賴磷酸酶(蛋白磷酸酶)。
HspS0^0也稱為小Hsp。 Hsp20-30 —般在大的同寡聚復(fù)合物中，或 可能地，也在其中生物或細(xì)胞類型表達(dá)幾種不同類型的小Hsps的雜寡 聚復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)。Hsp20-30與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相互作用，且可能在肌動(dòng)蛋 白的聚合/解聚中起調(diào)節(jié)作用。Hsp20-30在靜息細(xì)胞應(yīng)激或暴露于生長(zhǎng) 因子后快速磷酸化。Hsp20-30同源物包括a晶體蛋白。
ClpP是牽涉于異常蛋白質(zhì)降解的大腸桿菌蛋白酶。ClpP的同源物 在葉綠體中發(fā)現(xiàn)。ClpP與ClpA形成雜寡聚復(fù)合物。
GrpE是牽涉于應(yīng)激損害的蛋白質(zhì)拯救以及損害蛋白質(zhì)降解的約20 kDa的大腸桿菌蛋白質(zhì)。GrpE在大腸桿菌中的應(yīng)激基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起作 用。
HsplO例子包括GroES和CpnlO。 HsplO —般在大腸桿菌以及真核 細(xì)胞的線粒體和葉綠體中發(fā)現(xiàn)。HsplO與Hsp60寡聚體結(jié)合形成7成員 環(huán)。HsplO也涉及蛋白質(zhì)折疊。
已發(fā)現(xiàn)泛蛋白與通過(guò)ATP依賴性胞質(zhì)蛋白酶蛋白水解去除蛋白質(zhì) 一致結(jié)合蛋白質(zhì)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的應(yīng)激蛋白得自腸道菌，分枝桿菌(特
別地麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、母牛分枝桿菌(A/. wccae)、恥垢 分枝桿菌(M smegma^)和牛分枝桿菌)，大腸桿菌，酵母，果蠅 (Z>ow/7/n7a),脊推動(dòng)物，禽類，雞，哺乳動(dòng)物，大鼠，小鼠，靈長(zhǎng) 類動(dòng)物或人。
在具體實(shí)施方案中，例如在涉及應(yīng)激蛋白和改造抗體之間的化學(xué)綴 合物的情況下，使用的應(yīng)激蛋白是分離的應(yīng)激蛋白，這意指應(yīng)激蛋白已 進(jìn)行選擇且與它們?cè)谄渲猩a(chǎn)的宿主細(xì)胞中分離。此種分離可以如本文 所述且使用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)分離的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。
應(yīng)激蛋白可以是酸性或堿性鹽的形式，或中性形式。此外，個(gè)別氨 基酸殘基可以通過(guò)氧化或還原進(jìn)行修飾。此外，可以對(duì)氨基酸或核酸序 列進(jìn)行各種置換、缺失或添加，其凈效應(yīng)是保留或進(jìn)一步增強(qiáng)應(yīng)激蛋白 的增加的生物活性。由于密碼簡(jiǎn)并，例如，在編碼相同氨基酸序列的核 苷酸序列中可能存在相當(dāng)大的變異。應(yīng)激蛋白的部分或得自應(yīng)激蛋白的 肽可以用于融合多肽中，前提是此種部分或肽包括涉及增強(qiáng)免疫應(yīng)答的 表位。應(yīng)激蛋白的部分可以通過(guò)使用蛋白酶斷裂，或通過(guò)重組方法而獲 得，例如僅表達(dá)應(yīng)激蛋白編碼核苷酸序列(單獨(dú)或與另一種蛋白質(zhì)編碼 核酸序列融合)的部分。肽還可以通過(guò)此種方法或通過(guò)化學(xué)合成進(jìn)行生 產(chǎn)。應(yīng)激蛋白可以包括在特定基因座上通過(guò)多種已知技術(shù)引入的突變。 參見(jiàn)，例長(zhǎng)口, Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ; Drinkwater和 Klinedinst尸rac. A^/. jct^. USA 83: 3402-3406 ( 1986) ; Liao和 Wise, 88: 107-111 ( 1990) : Horwitz等人，3: 112-117
(1989 )。
2教務(wù)攻遵拔謬-^^f冷凝合,庶W才法
還提供了用于制備改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的組合物和方法。包 括改造抗體和應(yīng)激蛋白的融合蛋白可以通過(guò)重組方法進(jìn)行生產(chǎn)。例如， 編碼應(yīng)激蛋白的核酸可以與編碼改造抗體的核酸序列的任一末端進(jìn)行 連接，從而使得2個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列共享共有的翻譯讀框，且可以表達(dá) 為包括改造抗體和應(yīng)激蛋白的融合蛋白。將組合的序列插入基于所需表 達(dá)特征和宿主細(xì)胞的性質(zhì)選擇的合適載體內(nèi)。在下文中提供的例子中，核酸序列在適合于在大腸桿菌中蛋白質(zhì)表達(dá)的載體中進(jìn)行裝配。在所選 擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)后，融合蛋白可以通過(guò)常規(guī)生物化學(xué)分離技術(shù)或通 過(guò)免疫親和法使用針對(duì)融合蛋白的 一個(gè)或另 一部分的抗體進(jìn)行純化?？?替代地，所選擇的載體可以給融合蛋白序列添加標(biāo)記，例如如下文呈現(xiàn) 的實(shí)施例中描述的寡組氨酸標(biāo)記，從而允許表達(dá)可以通過(guò)親和力法進(jìn)行 純化的標(biāo)記的融合蛋白，使用對(duì)于標(biāo)記具有合適的高親和力的抗體或其
他材料。Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ; Deutscher, M. Guide to Protein Purification Methods Enzymology,第182巻.Academic Press, Inc.. San Diego， CA ( 1990)。如果使用適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載 體，例如下文討論的載體之一，那么融合蛋白可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn) 行表達(dá)和純化。可替代地，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(包括融合蛋白編碼序列) 可以施用于受試者，以指導(dǎo)改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽在受試者的細(xì)胞 中的表達(dá)。編碼改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的核酸還可以以化學(xué)方法生 產(chǎn)，且隨后插入合適的載體內(nèi)用于融合蛋白生產(chǎn)和純化或施用于受試 者。最后，融合蛋白還可以以化學(xué)方法制備。
用于制備融合基因的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?；旧希幋a不同 多肽序列的各種DNA片段的連接依照常規(guī)技術(shù)來(lái)進(jìn)行，利用平端或交 錯(cuò)末端用于連接，限制酶消化以提供合適的末端，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)平粘性末端， 堿性磷酸酶處理以避免不合需要的連接，和酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，融合基因可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)化DNA合成儀來(lái)合成?？?替代地，基因片段的PCR擴(kuò)增可以使用錨定引物來(lái)進(jìn)行，這產(chǎn)生在2 個(gè)連續(xù)基因片段之間的互補(bǔ)突出端，所述互補(bǔ)突出端隨后可以進(jìn)行退火 以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)，例如Cwre"/尸r^oco/s A/o/ecw/<ar 編輯Ausubel等人，John Wiley & Sons: 1992)。因此，提供 了包含編碼至少 一種改造抗體的基因和編碼至少 一種應(yīng)激蛋白的基因 的融合基因的分離核酸。
核酸可以在包含核苷酸序列的載體中提供，所述核普酸序列編碼改 造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽，且與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接。應(yīng)當(dāng) 理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以依賴于此種因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇 和/或需要表達(dá)的蛋白質(zhì)類型。應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)，控制拷貝數(shù)的能力， 和由載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)例如抗生素標(biāo)記的表達(dá)。此種載體可以在任何生物學(xué)活性的載體中施用，例如能夠先體外后體內(nèi)或體內(nèi)用編碼 嵌合多肽的遺傳材料有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的任何制劑或組合物。方法包括將核 酸插入病毒載體中，包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、人免 疫缺陷病毒、和單純皰滲病毒-1，或重組細(xì)菌或真核質(zhì)粒。病毒載體可
以用于直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞；質(zhì)粒DNA可以借助于例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體 (lipofectin)或衍生的(例如，抗體綴合的)、聚賴氨酸綴合物、短桿 菌肽S、人工病毒被膜或其他此種細(xì)胞內(nèi)載體單獨(dú)進(jìn)行遞送。核酸還可 以直接進(jìn)行注射。可替代地，可以進(jìn)行磷酸鈣沉淀以促進(jìn)核酸進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi)。
主題核酸可以用于引起改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽在培養(yǎng)中繁殖 的細(xì)胞中的表達(dá)和超表達(dá)，例如以生產(chǎn)融合蛋白或多肽。
還提供了用重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以表達(dá)改造抗體-應(yīng)激蛋白融 合多肽。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，改造抗體-應(yīng)激蛋 白融合多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞(桿狀病毒)、酵 母、昆蟲(chóng)、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在宿主細(xì)胞是人時(shí)的那些情況 下，它可以在或不在活受試者中。其他合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的。此外，宿主細(xì)胞可以補(bǔ)加在宿主中一般未發(fā)現(xiàn)的tRNA分子， 以便最優(yōu)化多肽的表達(dá)。適合于使融合多肽的表達(dá)最大化的其他方法將 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他副產(chǎn)品。用于細(xì)胞培養(yǎng)的 合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的。融合多肽可以由包含多肽的細(xì)胞和培 養(yǎng)基的混合物分泌和分離?？商娲?，融合多肽可以保留在細(xì)胞質(zhì)中， 并且收獲細(xì)胞、裂解和分離蛋白質(zhì)。融合多肽可以使用本領(lǐng)域已知的用 于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中進(jìn)行分離，所述 技術(shù)包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、超濾、電泳和使用對(duì)融合物的 特定表位特異的抗體的免疫親和純化。
因此，編碼所有或部分改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的核苦酸序列可 以用于經(jīng)由微生物或真核細(xì)胞過(guò)程生產(chǎn)重組形式的蛋白質(zhì)。將序列連接 到多核普酸構(gòu)建體例如表達(dá)載體內(nèi)，且轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到真核(酵母、禽類、 昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物)或原核(細(xì)菌細(xì)胞)宿主內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)程序。類似程序或 其修改可以用于依照本發(fā)明通過(guò)微生物方法或組織培養(yǎng)技術(shù)制備重組 融合多肽。用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)媒介物包括質(zhì)粒和其他載體。例如，用
于表達(dá)融合多肽的合適載體包括下述類型的質(zhì)粒用于在原核細(xì)胞例如 大腸桿菌中表達(dá)的pBR322-衍生的質(zhì)粒、pEMBL-衍生的質(zhì)粒、pEX-衍 生的質(zhì)粒、pBTac-衍生的質(zhì)粒和pUC-衍生的質(zhì)粒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是與細(xì)菌啟動(dòng)子可操作地連接的改造抗 體-應(yīng)激蛋白融合多肽，例如在Inouye等人(1985 ) A^c/. Jc,A Z^s. U: 3101中描述的厭氧大腸桿菌A^"B啟動(dòng)子或大腸桿菌脂蛋白//p啟動(dòng)子； 沙門氏菌屬(Sa/wo"e〃a)/ "gC啟動(dòng)子(Miller等人,同上),志賀氏 菌屬(幼/ge〃a)加啟動(dòng)子(Schmitt和Payne, J. ^"enW. 173: 816 (1991))，在TnlO上的fe/啟動(dòng)子(Miller等人，同上)，或霍亂弧 菌(F/^7'o c/zo/era)的c"啟動(dòng)子?？梢允褂萌魏纹渌麊?dòng)子。細(xì)菌啟 動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。示例性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是可通 過(guò)鐵或鐵限制條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。事實(shí)上， 一些細(xì)菌例如細(xì)胞內(nèi)生物被 認(rèn)為在宿主細(xì)胞質(zhì)中遇到鐵限制條件。Fe/^4和7b"S的鐵調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子 的例子是本領(lǐng)域已知的，且在例如下述參考文獻(xiàn)中得到描述Headley， V.等人(1997)/"/ec,/o" &/m/m^,(y 65: 818; Ochsner, U.A.等人(1995 ) Jo固a/0/Sa"er油gy 177: 7194; Hunt, M.D.等人(1994 ) Jow，/o/ Ba"er油gy 176: 3944; Svinarich, D.M.和S. Palchaudhuri.( 1992 )J簡(jiǎn)削/ q/" D/a^r/zoea/ Z)/5"e^wes i^ean:/z 10: 139; Prince, R.W.等人(1991 ) Mo/ecw/(3T McroZ)/o/ogy 5: 2823; Goldberg, M.B.等人(1990 ) c/ow7 a/ Bac,e〃'o/ogy 172: 6863; de Lorenzo, V.等人(1987 X/owma/ o/Sacfm'o/ogy 169: 2624;和Hantke, K. ( 1981 ) M /固/w & G匿ra/G匿to 182: 288。
質(zhì)粒優(yōu)選包含核酸在細(xì)菌中合適轉(zhuǎn)錄所需的序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信 號(hào)。載體可以進(jìn)一步包含編碼允許選擇包含目的核酸的細(xì)菌的因子的序 列，例如編碼提供針對(duì)抗生素抗性的蛋白質(zhì)的基因，核酸擴(kuò)增所需的序 列，例如細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將信號(hào)肽序列加入構(gòu)建體中，從而使得融合 多肽從細(xì)胞中分泌。此種信號(hào)肽是本領(lǐng)域眾所周知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，由大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的有力的噬菌體 T5啟動(dòng)子與lac操縱基因阻遏模塊一起使用，以提供在大腸桿菌中緊密 調(diào)節(jié)的、高水平表達(dá)或重組蛋白質(zhì)。在這個(gè)系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)表達(dá)在高水
27平的lac阻遏物的存在下纟皮阻斷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA與第一種啟動(dòng)子可操作地連接，且細(xì)菌進(jìn) 一步包含編碼第一種聚合酶的第二種DNA,所述第一種聚合酶能夠介導(dǎo) 從第一種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，其中編碼第一種聚合酶的DNA與第二種啟動(dòng) 子可操作地連接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第二種啟動(dòng)子是細(xì)菌啟動(dòng)子，例 如上文描述的那些。在甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶是噬菌體聚 合酶，例如SP6、 T3或T7聚合酶，且第一種啟動(dòng)子是噬菌體啟動(dòng)子， 例如分別為SP6、 T3或T7啟動(dòng)子。包含噬菌體啟動(dòng)子的質(zhì)粒和編碼噬 菌體聚合酶的質(zhì)?？梢岳鐝腜romega Corp. ( Madison ， Wis.)和 InVitrogen (San Diego, Calif.)商業(yè)上獲得，或可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA 技術(shù)直接,人噬菌體獲得(J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Laboratory Press, 1989)。 噬菌體聚合酶和啟動(dòng)子在例如下述參考文獻(xiàn)中得到進(jìn)一步描述 Sagawa, H.等人(1996)Ge"e 168: 37; Cheng, X.等人(1994)尸A^St7&4 91: 4034; Dubendorff, J.W.和F.W. Studier ( 1991 ) Jo廳a/q/"M /簡(jiǎn)/ar S/o/ogy 219: 45; Bujarski， J.J.禾口 P. Kaesberg( 1987 )7W/c/e/c爿c/(is Aesean:/z 15: 1337;和Studier, F.W.等人(1990) A/"/zoA /" ￡"^ymo/ogy 185: 60)。此種質(zhì)粒可以根據(jù)待表達(dá)的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的具體實(shí) 施方案進(jìn)一步修飾。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌進(jìn)一步包含編碼第二種聚合酶的DNA, 所述第二種聚合酶能夠介導(dǎo)從第二種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，其中編碼第二種聚 合酶的DNA與第三種啟動(dòng)子可操作地連接。第三種啟動(dòng)子可以是細(xì)菌 啟動(dòng)子。然而，超過(guò)2種不同的聚合酶和啟動(dòng)子可以引入細(xì)菌中，以獲 得高水平的轉(zhuǎn)錄。用于介導(dǎo)細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄的一種或多種聚合酶的使用可 以提供細(xì)菌中多肽量相對(duì)于其中DNA直接在細(xì)菌啟動(dòng)子的控制下的細(xì) 菌的顯著增加。采用的系統(tǒng)的選擇將依賴于具體用途而變，例如人們希 望生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的量。
一般地，編碼融合多肽的核酸例如通過(guò)轉(zhuǎn)染引入宿主細(xì)胞內(nèi)，且宿 主細(xì)胞在允許表達(dá)融合多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將核酸引入原核和真核 細(xì)胞內(nèi)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于哺乳動(dòng)物和原核宿主細(xì)胞培養(yǎng) 的合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的。 一般地，編碼主題融合多肽的核酸 在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，其在包含核酸的宿主細(xì)胞一旦已分裂一定次數(shù)就被誘導(dǎo)。例如，當(dāng)核酸在P半乳糖操縱基因和阻遏物的控制下時(shí)，
當(dāng)細(xì)菌宿主細(xì)胞已達(dá)到約OD, 0.45-0.60的密度時(shí)，將異丙基P-D-硫代 吡喃型半乳糖苦(IPTG)加入培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物隨后生長(zhǎng)一些更多的時(shí) 間以給予宿主細(xì)胞合成多肽的時(shí)間。在多肽分離和純化前，培養(yǎng)物隨后 一般進(jìn)行冷凍且可以冷凍貯藏一些時(shí)間。
當(dāng)使用原核宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞可以包括表達(dá)內(nèi)部T7溶菌酶的 質(zhì)粒，所述T7溶菌酶例如由質(zhì)粒pLysSL表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例)。此種宿 主細(xì)胞的裂解釋放溶菌酶，所述溶菌酶隨后降解細(xì)菌膜。
可以包括在載體中用于在細(xì)菌或其他原核細(xì)胞中表達(dá)的其他序列 包括合成的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，例如來(lái)自噬菌體X的to, 和來(lái)自大腸桿菌中rrnB操縱子的t4，以阻止連讀轉(zhuǎn)錄且確保表達(dá)的多肽 的穩(wěn)定性；復(fù)制起點(diǎn)，例如ColEl;和賦予氨芐青霉素抗性的卩內(nèi)酰胺 酶基因。
其他宿主細(xì)胞包括原核宿主細(xì)胞。甚至更加優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì) 菌，例如大腸桿菌?？梢允褂玫钠渌?xì)菌包括志賀氏菌屬物種(S&ge〃a 卿.),沙門氏菌屬物種(Sa/m,〃"卿.),利斯特氏菌屬物種(丄她〃.a ),立克次氏體屬物種(化c々"加a ),耶爾森氏菌屬物種(re"/ma W/ .),埃希氏菌屬物種(^c/zehc/na ),克雷伯氏菌屬物種(A7eZwe〃a ),博德特氏菌屬物種(SoWe&〃a ),奈瑟氏球菌屬物種(A^/^^7" ), 氣單胞菌屬物種(Jeramo"os w/7.), 弗朗西斯氏菌屬物種 (Frawcz'"e〃a s/ / .),才奉牙干菌屬物種(Cor>77e6a"e〃'wm s/ / .)，斗寧才彖酸 桿菌屬物種(OTyo6""er 5/7/7.), 衣原體屬物種(C/z/amyc//" w/ .),嗜 血菌屬物種(Z/emo^/n7ws ),布魯氏菌屬物種(Sn^ce〃a 5pp.),分 枝桿菌屬物種，軍團(tuán)菌屬物種(Z^g/we〃" w/7.),紅球菌屬物種 (A/zot/ococcus1 s/7/ . ) , "j〖i單月包菌屬4勿種(尸sewt/omo"as ),蟲(chóng)累4干菌 屬物種(Z/e//co6a"er ) ， f瓜菌屬物種(K/6n'o ^; .)，芽孑包4干菌屬 物種(^if"〃船)和丹毒絲菌屬物種(五o^;pe/(^/2nx w尸.)。大多數(shù) 這些細(xì)菌可以得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 )。
存在用于在酵母中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的許多載體。例如，YEP24、 YIP5、 YEP51、 YEP52、 pYES2和YRP17是用于將遺傳構(gòu)建體引入啤酒 糖酵母(s. ce"v/w'ae)內(nèi)的克隆和表達(dá)媒介物(參見(jiàn)，例如Broach等人, (1983 ) in Ex/ en'膨虛/ Mam一/a〃o" Expre抓'o", 編輯M.
Inouye Academic Press,笫83頁(yè))。由于pBR322 ori的存在這些載體可 以在大腸桿菌中復(fù)制，且由于酵母2|um質(zhì)粒的復(fù)制決定簇可以在啤酒糖 酵母中復(fù)制。此外，可以使用藥物抗性標(biāo)記例如氨千青霉素。
在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含原核序列以促進(jìn)載體在 細(xì)菌中的繁殖，和在真核細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種真核轉(zhuǎn)錄單位。 pcDNAI/amp、 pcDNAI/neo、 pRc/CMV、 pSV2gpt、 pSV2neo、 pSV2誦dhfr、 pTk2、 pRSVneo、 pMSG、 pSVT7、 pko-neo和pHyg衍生的載體是適合 于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子。這些載體中的一些用來(lái)自
細(xì)菌質(zhì)粒例如pBR322的序列進(jìn)行修飾，以促進(jìn)在原核和真核細(xì)胞中的 復(fù)制和藥物抗性選擇?？商娲?，病毒衍生物例如牛乳頭瘤病毒 (BPV-1 )、或EB病毒(pHEBo、 pREP衍生的和p205 )可以用于在真 核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)。用于制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物的各種方法是 本領(lǐng)域眾所周知的。對(duì)于用于原核和真核細(xì)胞的其他合適的表達(dá)系統(tǒng)， 以及一般的重組程序，參見(jiàn)Mo/ecw/ar C/om"g爿丄"60rato/7 A^r肌a/,第 2版由Sambrook, Fritsch和Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 )第16和17章。在一些情況下，可能需要通過(guò)使用桿狀病 毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)重組蛋白質(zhì)。此種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的例子包括pVL-衍生的載體(例如pVL1392、 pVL1393和pVL941 ) ， pAcUW-衍生的載 體(例如pAcUWl ),和pBlueBac-衍生的載體(例如包含B-gal的 pBlueBacIII)。
在另一種變化中，蛋白質(zhì)生產(chǎn)可以使用體外翻譯系統(tǒng)來(lái)完成。體外 翻譯系統(tǒng)一般是作為包含將RNA分子翻譯成蛋白質(zhì)所必需的至少最低 限度元件的無(wú)細(xì)胞提取物的翻譯系統(tǒng)。體外翻譯系統(tǒng)一般包含至少核糖 體，tRNAs,起始子甲硫氨酰-tRNAMet,涉及翻譯的蛋白質(zhì)或復(fù)合物， 例如elF2、 elF3，包含帽結(jié)合蛋白(CBP )和真核起始因子4F ( elF4F ) 的帽結(jié)合(CB)復(fù)合物。多種體外翻譯系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且 包括商購(gòu)可得試劑盒。體外翻譯系統(tǒng)的例子包括真核裂解物，例如兔網(wǎng) 織紅細(xì)胞裂解物、兔卵母細(xì)胞裂解物、人細(xì)胞裂解物、昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解物 和麥胚提取物。裂解物是從廠商例如Promega Corp., Madison, Wis.; Stratagene， La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, 111.; 和 GIBCO/BRL， Grand Island, N.Y.商購(gòu)可得的。體外翻譯系統(tǒng)一般包含大分子，例如酶，翻譯、起始和延伸因子，化學(xué)試劑和核糖體。此外，可
以使用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。此種系統(tǒng)一般包含至少RNA聚合酶全酶，核糖 核苷酸和任何必需轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止因子。用于體外翻譯的RNA 核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)生產(chǎn)。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯可以在單罐 反應(yīng)中偶聯(lián)，以由一種或多種分離的DNAs生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
當(dāng)需要表達(dá)多肽的羧基末端片段，即平截突變體時(shí)，可能必須給包 含待表達(dá)的所需序列的寡核苷酸片段添加起始密碼子(ATG)。本領(lǐng)域 眾所周知的是在N末端位置上的曱硫氨酸可以通過(guò)使用曱硫氨酸氨肽 酶(MAP )進(jìn)行酶促切割。MAP已從大腸桿菌(Ben-Bassat等人，(1987 ) ^"er,W. 169: 751-757 )和鼠傷寒沙門氏菌中得到克隆,并且它的體 外活性已在重組蛋白質(zhì)上得到證實(shí)(Miller等人，(1987 )尸WAS (7&4 S( 2718-1722 )。因此，若需要，N末端甲石克氨酸的去除可以通過(guò)在生產(chǎn) MAP的宿主(例如大腸桿菌或CM89或啤酒糖酵母)中表達(dá)此種重組多 肽在體內(nèi)地，或通過(guò)使用純化的MAP (例如Miller等人的程序)在體外 地完成。
在其中使用植物表達(dá)載體的情況下，改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的 表達(dá)可以由許多啟動(dòng)子中的任何一種來(lái)驅(qū)動(dòng)。例如，可以使用病毒啟動(dòng) 子例如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson等人，1984, Nature, 310: 511-514),或TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu等人， 1987, EMBO丄，6: 307-311 );可替代地，可以-使用植物啟動(dòng)子例如 RUBISCO的小亞基(Coruzzi等人，1994, EMBOJ., 3: 1671-1680; Broglie等人，1984, Science, 224: 838-843 );或熱激啟動(dòng)子，例如大 豆Hsp 17.5-E或Hsp 17.3畫B (Gurley等人，1986， Mol. Cell. Biol. ， 6: 559-565 )。這些構(gòu)建體可以使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體；直 接DNA轉(zhuǎn)化；顯微注射，電穿孔等引入植物細(xì)胞內(nèi)。關(guān)于此種技術(shù)的 綜迷，參見(jiàn)例如Weissbach和Weissbach， 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, Section VIII， pp. 421-463; 和Grierson和Corey, 1988, Plant Molecular Biology,第2版，Blackie, London,第7-9章。
可以用于表達(dá)多肽標(biāo)記或包含多肽標(biāo)記的融合蛋白的可替代表達(dá) 系統(tǒng)是昆蟲(chóng)系統(tǒng)。在一種此種系統(tǒng)中，苜蓿丫紋夜蛾(Jwtograp/za ca/z/orm'ca)核型多角體病毒(AcNPV)用作載體以表達(dá)外來(lái)基因。該病毒在草地夜蛾(印otfo/^ra/h^; erc/a )細(xì)胞中生長(zhǎng)。PGHS-2序列可 以克隆到病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)中且置于AcNPV啟 動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。編碼序列的成功插入將導(dǎo)致 多角體蛋白基因的滅活和非包含體型重組病毒(即，缺乏由多角體蛋白 基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)的生產(chǎn)。這些重組病毒隨后用于感染其 中表達(dá)插入的基因的草地夜蛾細(xì)胞(例如，參見(jiàn)Smith等人，1983, J. Virol.， 46: 584， Smith,美國(guó)專利號(hào)4,215,051 )。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)的具體實(shí)施方案中，將編碼改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽 的DNA克隆到pBlueBacIII重組轉(zhuǎn)移載體(Invitrogen, San Diego, Calif.) 內(nèi)多角體蛋白啟動(dòng)子的下游，且轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(衍生自草地夜蛾 卵巢細(xì)胞，可從Invitrogen, San Diego, Calif.獲得)內(nèi)，以產(chǎn)生重組病 毒。重組病毒噬斑純化后，制備依次將用于感染Sf9或High FiveTM (衍 生自粉紋夜蛾(TWc/z^/wwa m')卵細(xì)胞勻漿的BTI-TN-5B1-4細(xì)胞；可 從Invitrogen, San Diego, Calif.獲得)昆蟲(chóng)細(xì)胞的高效價(jià)病毒原液，以 產(chǎn)生大量適當(dāng)?shù)胤g后修飾的主題多肽。
在其他實(shí)施方案中，改造抗體和應(yīng)激蛋白分開(kāi)生產(chǎn)且隨后彼此進(jìn)行 連接，例如共價(jià)連接。例如，改造抗體和應(yīng)激蛋白在體外分開(kāi)生產(chǎn)、純 化、和在標(biāo)記將能夠與目的多肽連接的條件下混合在一起。例如，應(yīng)激 蛋白和/或改造抗體可以從它已知存在的來(lái)源獲得(分離)，可以由細(xì)胞 培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)和收獲，可以通過(guò)克隆和表達(dá)編碼所需應(yīng)激蛋白或改造抗 體的基因進(jìn)行生產(chǎn)，或可以酶促合成。此外，編碼所需應(yīng)激蛋白或改造 抗體的核酸序列可以化學(xué)合成。綴合蛋白質(zhì)的此種混合物可以具有不同 于單個(gè)融合蛋白的性質(zhì)。
接頭(也稱為"接頭分子"或"交聯(lián)劑")可以用于使改造抗體和應(yīng)激 蛋白綴合。接頭包括能夠與幾種通常為2種分子的限定的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)， 且因此使其綴合的化學(xué)制劑。大多數(shù)已知交聯(lián)劑與胺、羧基和巰基反應(yīng)。 耙化學(xué)基團(tuán)的選擇是關(guān)鍵的，如果基團(tuán)可能涉及待綴合多肽的生物活性 的話。例如，與巰基反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺可能滅活需要Cys以與靶結(jié)合的 包含Cys的肽或蛋白質(zhì)。接頭可以是同功能的(包含相同類型的反應(yīng)基 團(tuán))、異功能的(包含不同的反應(yīng)基團(tuán))、或光反應(yīng)性的(包含在照射 后變得反應(yīng)性的基團(tuán))。
接頭分子可能負(fù)責(zé)綴合組合物的不同性質(zhì)。接頭的長(zhǎng)度應(yīng)根據(jù)在綴合步驟期間的分子柔性，和綴合分子對(duì)于其靶(細(xì)胞表面分子等)的可
及其制備的^易性。接頭的、幾何纟^構(gòu)可J用于使分子定向用于與靶的最 佳反應(yīng)。具有柔性幾何結(jié)構(gòu)的接頭可以允許交聯(lián)多肽在它們結(jié)合其他多 肽時(shí)構(gòu)象上適應(yīng)。接頭的性質(zhì)可以對(duì)于其他各種目的進(jìn)行改變。例如，
發(fā)現(xiàn)MBuS的芳基結(jié)構(gòu)的免疫原性比MBS的芳族間隔基小。此外，接 頭分子的疏水性和功能性可以受組分分子的物理性質(zhì)的控制。例如，聚 合接頭的疏水性可以受沿著聚合物的單體單元順序的控制，例如其中存 在散布親水單體嵌段的疏水單體嵌段的嵌段聚合物。
制備和利用廣泛多樣的分子接頭的化學(xué)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且 用于在綴合分子中使用的許多預(yù)制接頭可從廠商例如Pierce Chemical Co.， Roche Molecular Biochemicals, United States Biological等商購(gòu)可得。
3.炎^^道戎琳-^浚f ^凝合/農(nóng)和乂,^適合的邀合參W才法 本文描述的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽可以施用于受試者以增強(qiáng) 受試者的針對(duì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解應(yīng)答，所述 細(xì)胞表達(dá)融合多肽的改造抗體結(jié)構(gòu)域針對(duì)的抗原。融合多肽可以僅增強(qiáng) 免疫應(yīng)答(因此充當(dāng)免疫原性組合物)，或賦予保護(hù)性免疫(因此充當(dāng) 疫苗)。
因此，如上所述生產(chǎn)的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽可以純化至合適 的純度用于用作藥物組合物。 一般地，純化的組合物將具有包含組合物 中存在的所有種類的超過(guò)約85%,存在的所有種類的超過(guò)約85%、 90 %、 95%、 99%或更多的一個(gè)種類。目標(biāo)種類可以純化至基本同質(zhì)性(污 染種類通過(guò)常規(guī)檢測(cè)法無(wú)法在組合物中檢測(cè)到)，其中組合物基本上由 單一種類組成。技術(shù)人員可以依照本發(fā)明的教導(dǎo)使用用于蛋白質(zhì)純化的 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽，例如免疫親和層析、尺寸排 阻層析等。多肽的純度可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法進(jìn)行測(cè) 定，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝膠電泳和質(zhì)譜分析法分析。
因此，提供了包含上述改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的藥物組合物。 在一個(gè)方面，提供了藥學(xué)上可接受的組合物，其包含與一種或多種藥學(xué) 上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑一起配制的，治療有效量的一種 或多種上文描述的化合物。在另一個(gè)方面，在某些實(shí)施方案中，化合物可以照那樣或與藥學(xué)上可接受的載體混合施用，或還可以與其他試劑結(jié) 合施用。結(jié)合(組合)療法因此包括活性化合物的順次、同時(shí)和分開(kāi)、 或共施用，其方式為當(dāng)后續(xù)的施用時(shí)，第一種施用的活性化合物的療效 尚未完全消失。
本文描述的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽可以以多種方式施用于受 試者。施用途徑包括真皮內(nèi)、經(jīng)皮(例如，緩釋聚合物)、肌內(nèi)、腹膜 內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、硬膜外和鼻內(nèi)途徑?？梢允褂萌魏纹渌Ｒ?guī) 施用途徑，例如輸注或彈丸注射，或通過(guò)上皮或粘膜皮膚襯料吸收。此 外，本文描述的組合物可以包含其他藥學(xué)上可接受的組分，且與之一起
施用，例如生物學(xué)活性劑(例如佐劑例如明礬(alum))、表面活性劑 (例如甘油酯)、賦形劑(例如，乳糖)、載體、稀釋劑和媒介物。此 外，組合物可以作為刺激得自受試者的白細(xì)胞的手段先體外后體內(nèi)使 用，以在體外引發(fā)、擴(kuò)增和繁殖隨后重新引入受試者內(nèi)的抗原特異性免 疫細(xì)胞。
此外，改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽可以通過(guò)體內(nèi)表達(dá)編碼此種蛋白 質(zhì)序列的核酸而施用到人受試者內(nèi)。此種核酸的表達(dá)還可以作為刺激得 自受試者的白細(xì)胞的手段來(lái)先體外后體內(nèi)完成，以在體外引發(fā)、擴(kuò)增和 繁殖隨后重新引入受試者內(nèi)的抗原特異性免疫細(xì)胞。適合于指導(dǎo)改造抗 體-應(yīng)激蛋白融合多肽表達(dá)的表達(dá)載體可以選自本領(lǐng)域常用的大量各種 載體。優(yōu)選的將是能夠生產(chǎn)高水平的表達(dá)以及在目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中有效的 載體。例如，可以使用重組腺病毒載體pJM17 (All等人，Ge"e77 erapy 1: 367-84 ( 1994 ) ; Berkner K. L., 5zo"c/m,々wes 6: 616-24 1988), 第二代腺病毒載體DE1/DE4 (Wang和Finer, A^we A/ed/c,"e 2: 714-6
(1996 )),或腺伴隨病毒載體AAV/Neo ( Muro-Cacho等人，J. /mmw"of/zera/y 11: 231-7 ( 1992))。此外，可以使用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體MFG ( Jaffee等人，C""cer 53: 2221-6 ( 1993 ))或LN、 LNSX、 LNCX、 LXSN (Miller和Rosman, 5/》^:/2"/々w^ 7: 980-9 ( 1989))。 基于單純皰瘆病毒的載體例如pHSVl( Geller等人，TVoc. Ato7爿cad 87: 8950-4 ( 1990 )，或痘苗病毒載體例如MVA ( Sutter和Moss.尸toc. AW/爿cac/. 89: 10847-51 ( 1992))可以充當(dāng)可替4戈物。
包括啟動(dòng)子和3'序列的常用的特定表達(dá)單位是在質(zhì)粒CDNA3
(Invitrogen)、質(zhì)粒AH5、 pRC/CMV (Invitrogen ) 、 pCMU II ( Paabo等人，EMBOJ. 5: 1921-1927 ( 1986) ) 、 pZip-Neo SV ( Cepko等人， Cell 37: 1053-1062 ( 1984))和pSRa ( DNAX、 Palo Alto, CA)中發(fā)
現(xiàn)的那些?；蛞氡磉_(dá)單位和/或載體內(nèi)可以使用遺傳工程技術(shù)來(lái)完 成,^口手冊(cè)^口 Molecular Cloning and Current Protocols in Molecular Biology ( Sambrook, J.等人,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press
(1989); Ausubel, F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersdence ( 1989 ))中描述的。 所得到的可表達(dá)的核酸可以通過(guò)能夠?qū)⒑怂嵋钥杀磉_(dá)形式置于細(xì)胞內(nèi) 的任何方法引入人受試者的細(xì)胞內(nèi)，例如作為如上所述的病毒載體的部 分，作為棵質(zhì)粒或其他DNA，或被嚢化在靶向的脂質(zhì)體或紅細(xì)胞血影中
(Friedman, T.， 244: 1275-1281 ( 1989) ; Rabi謂ich， N.R.
等人，265: 1401-1404 ( 1994 ))。轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括直接注射到 組織和肺瘤內(nèi)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Fraley等人，W"/we 370: 111-117( 1980 ))， 受體介導(dǎo)的胞吞作用(Zatloukal等人，Z朋.虹JcW. 660: 136-153
(1992 )),和粒子轟擊介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Eisenbraun等人，DA^4 & Ce〃. 祝o/. 12: 791-797 ( 1993 ))。
在本發(fā)明的組合物中的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽(如上文所討論 的融合、綴合或非共價(jià)連接的)的量是在受試者中產(chǎn)生有效的免疫刺激 應(yīng)答的量。有效量是這樣的量，從而使得當(dāng)施用時(shí)，它誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。 此外，施用于受試者的改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的量將依賴于多種因 素而變，包括使用的改造抗體和應(yīng)激蛋白，受試者的大小、年齡、體重、 一般健康、性別和飲食及其一般的免疫學(xué)反應(yīng)性。確立的劑量范圍的調(diào) 整和操作完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。例如，改造抗體-應(yīng)激蛋白融 合多肽的量可以為約l微克-約l克，優(yōu)選地約IOO微克-約1克，和 約1毫克-約1克。包含表達(dá)載體的有效量的組合物是這樣的量，從而 使得當(dāng)施用時(shí)，它誘導(dǎo)針對(duì)改造抗體所針對(duì)的抗原的免疫應(yīng)答。此外， 施用于受試者的表達(dá)載體的量將依賴于多種因素而變，包括表達(dá)的改造 抗體和應(yīng)激蛋白，受試者的大小、年齡、體重、 一般健康、性別和飲食 及其一般的免疫學(xué)反應(yīng)性。需要考慮的另外因素是應(yīng)用途徑和使用的載 體類型。例如，當(dāng)預(yù)防或治療性治療用包含編碼改造抗體-應(yīng)激蛋白融合 多肽的核酸的病毒載體來(lái)進(jìn)行時(shí)，有效量將是104-1012無(wú)輔助病毒、 復(fù)制缺陷型病毒/kg體重，優(yōu)選地105-1011病毒/kg體重，和更優(yōu)選地106- 10"病毒/kg體重。
用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效量的融合多肽的測(cè)定完全在 本領(lǐng)域技術(shù)人員能力內(nèi)，特別是根據(jù)本發(fā)明提供的詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容。
有效劑量可以最初由體外測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。例如，劑量可以使用本領(lǐng) 域眾所周知的技術(shù)配制到動(dòng)物模型中，以達(dá)到免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)?；趧?dòng) 物數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地最優(yōu)化對(duì)人的施用。劑量的量和間隔 可以個(gè)別調(diào)整。例如，當(dāng)用作疫苗時(shí)，本發(fā)明的多肽和/或菌林可以以約 1 - 3劑于1 - 36周時(shí)間段施用。優(yōu)選地，以約3 - 4個(gè)月的間隔施用3 劑，和加強(qiáng)接種疫苗可以在其后定期給予。替代規(guī)程對(duì)于個(gè)別患者可能 是合適的。合適的劑量是當(dāng)如上所述施用時(shí)能夠在被免疫的患者中產(chǎn)生 免疫應(yīng)答的多肽或菌林的量，所述免疫應(yīng)答足以保護(hù)受試者至少1-2 年免于狀況或感染。
組合物還可以包括佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。此外，此種蛋白質(zhì)可以進(jìn) 一步懸浮在油乳劑中，以引起蛋白質(zhì)注射后在體內(nèi)的較緩慢釋放。制劑 中的每種組分的最適比率可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)進(jìn) 行測(cè)定。
多種佐劑中的任何 一 種都可以用于本發(fā)明的疫苗中以增強(qiáng)免疫應(yīng) 答。大多數(shù)佐劑包含設(shè)計(jì)為保護(hù)抗原不受快速分解代謝的物質(zhì)，例如氫 氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答的特異性或非特異性刺激物，例如脂質(zhì) A,或百日咳博德特氏菌(Swtoc/e〃a ; eWim^ )。合適的佐劑是商購(gòu)可 得的，并且包括例如弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(Difco Laboratories )和Merck Adjuvant 65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)。其他合適的佐劑包括明礬、生物可降解的小球體，單磷酰脂質(zhì) A、 quilA、 SBASlc、 SBAS2 ( Ling等人，1997, Vaccine 15: 1562-1567)、 SBAS7、 Al (OH) 3和CpG寡核苷酸(WO96/02555 )。
在本發(fā)明的疫苗中，佐劑可以包括Thl型免疫應(yīng)答。合適的佐劑系 統(tǒng)包括例如單磷酰脂質(zhì)A,優(yōu)選地3-脫-0-酰單磷酰脂質(zhì)A ( 3D-MPL ) 連同鋁鹽的組合。增強(qiáng)的系統(tǒng)涉及單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合， 特別地如WO 94/00153中公開(kāi)的3D-MLP和急苷QS21的組合，或如 WO 96/33739中公開(kāi)的其中QS21用膽固醇猝滅的反應(yīng)原性 (reactogenic )較小的組合物。先前實(shí)馬t已證實(shí)3D-MLP和QS21的組 合在誘導(dǎo)體液和Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答中明確的協(xié)同效應(yīng)。涉及在水包油乳劑中的QS21、 3D-MLP和生育酚的特別有效的佐劑制劑在WO 95/17210中得到描述且可以包含制劑。
4.試浙#
本發(fā)明提供了用于表達(dá)改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的試劑盒。此種 試劑盒可以包含編碼改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的核酸。核酸可以包括 在質(zhì)?；蜉d體內(nèi)，例如細(xì)菌質(zhì)?；虿《据d體。其他試劑盒包含改造抗體 -應(yīng)激蛋白融合多肽。此外，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)和/或純化改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽的試劑盒。
本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療患者中的傳染性、炎性、自身免疫性 或惡性病的試劑盒。例如，試劑盒可以包含如上所述的一種或多種藥物 組合物，和任選地關(guān)于其使用的說(shuō)明書。在另外其他的實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了包含一種多種藥物組合物和用于實(shí)現(xiàn)此種組合物的施用的 一種或多種設(shè)備的試劑盒。
試劑盒組分可以包裝用于前述方法的手工或部分或全部自動(dòng)化實(shí) 踐。在涉及試劑盒的其他實(shí)施方案中，可以提供關(guān)于其使用的說(shuō)明書。
實(shí)施例
本發(fā)明現(xiàn)在進(jìn)行一般描述，通過(guò)參考下述實(shí)施例將更容易對(duì)其進(jìn)行 理解，所述實(shí)施例僅為了舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案的目的 而包括，并且不意欲以任何方式限制本發(fā)明。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子 生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)， 其在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。此種技術(shù)在文獻(xiàn)中得到描述。參見(jiàn)例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版,Sambrook, Fritsch和Maniatis 編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989 ) ; DNA Cloning,第I 和II巻(D. N. Glover編輯1985 ) ; Oligonucleotide Synthesis ( M. J. Gait 編輯，1984 ) ; Mullis等人美國(guó)專利號(hào)4,683,195; Nucleic Acid Hybridization( B. D. Hames和S. J. Higgins編輯1984 ); Transcription And Translation ( B. D. Hames和S. J. Higgins編輯1984 ) ; Culture Of Animal Cells ( R. I. Freshney, AlanR. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To MolecularCloning ( 1984 ) ; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells ( J. H. Miller 和M. P. Calos編輯，1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Methods In Enzymology,第154和155巻(Wu等人編輯)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology ( Mayer和Walker,編輯，Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir和C. C. Blackwell,編輯，1986 ) ; Manipulating the Mouse Embryo, ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1986)。
實(shí)施例1: Mab-HSP70綴合物的構(gòu)建和使用綴合物的免疫接種 長(zhǎng)14個(gè)氨基酸的MISR2肽(SEQ ID NO 3: NANYSHLPPSGNRG ) 由于其穩(wěn)定性、親水性以及與小鼠MISR2的相似性進(jìn)行選擇。肽使用 25 %戊二醛與HSP70進(jìn)行綴合。Balb/c小鼠以100|ug MISR肽-HSP70綴 合物以2周間隔2次免疫到爪墊內(nèi)。巴結(jié)細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤 細(xì)胞融合。上清液通過(guò)間接ELISA使用MISR肽或MISR-HSP70融合蛋 白或純HSP70進(jìn)行篩選。將陽(yáng)性物克隆2 - 4次并在小鼠進(jìn)行繁殖用于 腹水。
抗體通過(guò)復(fù)鹽沉淀使用碌b酸銨從腹水中進(jìn)行純化?？贵w在PAAG電 泳中在變性條件下進(jìn)行測(cè)試(圖3)。抗體在間接ELISA中就與 MISR-HSP70綴合物、MISR肽或HSP70結(jié)合進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示于圖 4中。
預(yù)示實(shí)施例#1:包含scFv和HSP70的Tandab
圖1描述了包含四價(jià)Tandab (改造抗體)和HSP70 (應(yīng)激蛋白)的 示例性改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽。四fT Tandabs基本上如WO 99/57150， US20050089519和Kipriyanov等人，1999,丄Mo/. AW. 293: 41-56中所述進(jìn)行制備，所有這些參考文獻(xiàn)都特別引入本文作為參考。 簡(jiǎn)言之，編碼包含4個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域的單鏈分子的構(gòu)建體可以另外摻 入應(yīng)激蛋白基因例如HSP70?？商娲?，包含4個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域的單 鏈分子可以分開(kāi)生產(chǎn)，且隨后與應(yīng)激蛋白例如HSP70進(jìn)行連接，例如共 價(jià)連接。
預(yù)示實(shí)施例#2:scFv在大腸桿菌中的生產(chǎn)
38大腸桿菌菌抹GX6712 ( F galk2 rspL c1857 )和質(zhì)粒pGX8773可以 得自Genexcorp ( Gaithersburg, MD )。表達(dá)載體pGX8773成功地編碼 與OmpA信號(hào)序列融合的單鏈抗體構(gòu)建體，且包含結(jié)構(gòu)域間接頭。接頭 是里氏木霉(7Wc/zo&，a ^ew')的柔性接頭肽。表達(dá)載體pLY3編碼與 OmpA信號(hào)序列融合的scFV VH和VL基因，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域由 接頭栓系。表達(dá)載體利用雜交OL/PIU (lamba)啟動(dòng)子，其中蛋白質(zhì) 表達(dá)在大腸桿菌GX6712中由從30。C到42。C的溫度變動(dòng)來(lái)起始 (Mallender和Voss, 腸/. C7^m ( 1994 ) 269: 199-206 )。
scFv可以分別表達(dá)且隨后與HSP70栓系，或scFv可以如本說(shuō)明書 自始至終和下文實(shí)施例3中描述的摻入融合多肽內(nèi)。
預(yù)示實(shí)施例#3: 結(jié)核分枝桿菌HSP70-scFv融合物在大腸桿菌中的
生產(chǎn)
結(jié)核分枝桿菌HSP70與scFv的融合物可以如下在大腸桿菌中生產(chǎn) /. ^:,f ^,"Fv^DwaA: (7/S尸761」?jié)搚i為V乂^^嚴(yán)W義應(yīng)yf^"^" 輛參大腸桿菌菌抹DLT 1270依靠用Dl-轉(zhuǎn)導(dǎo)將基因lac 1整合到染色體 內(nèi)由DH10A產(chǎn)生。DH10A的基因型如下DH 10B ( ara D139 △ ( ara， leu ) 7697 A (lac ) X74 galU galK rpsL deoR小801acZ DM 15 endAl n叩G recAl mcrA A ( mrr hsdRMS mcrAN ))。關(guān)于DH 10B的參考文獻(xiàn)，參 見(jiàn)Grant, S., G.,等人/Voc.y4cad S". WSL4 ( 1990 ) 87: 4645國(guó)4649。
〃.f在^參
作為載體，可以使用質(zhì)粒"QIAGEN，， pQE - 30 ( "QIAGEN" Product Guide, www.qiagen.com)。
///. scFv《的差^^^/^^,逸我謬t/"a〖/^^^^
關(guān)于克隆，可以使用先前獲得的載體pQE30 - dnaK -Y。重組質(zhì)粒 PQE30-E711- dnaK通過(guò)允許表達(dá)在N末端與序列6HIS融合的蛋白質(zhì) dnaK來(lái)生產(chǎn)雜種蛋白質(zhì)6HIS-E7 (類型11 ) - dnaK。具有正確方向的重 組產(chǎn)物已使用限制酶切分析進(jìn)行鑒定。scFv目的基因(例如來(lái)自如上所 述的載體pGX8773和/或使用PCR擴(kuò)增的)可以通過(guò)限制酶切消化與來(lái) 源切開(kāi)且用pQE30 - dnaK-Y質(zhì)粒在BamHI位點(diǎn)上克隆。
/K. f f潛祟^y^f ^#scFv斧D""《(7/S尸70J潛^"為V^^^"W 赫聰在對(duì)于培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基Luria-Bertani (LB)可以在蒸餾水中進(jìn)行制 備，并且它的pH用NaOH或檸檬酸調(diào)整至7.5。培養(yǎng)基應(yīng)在高壓滅菌器 中以1 atm滅菌40分鐘。當(dāng)培養(yǎng)基已冷卻至40。C時(shí)，可以無(wú)菌加入氨 節(jié)青霉素至50 jig/mL的終濃度。具有瓊脂的培養(yǎng)基可以無(wú)菌轉(zhuǎn)移至培養(yǎng) 皿。
生產(chǎn)菌林隨后加入新鮮制備的具有瓊脂的培養(yǎng)基LB中。培養(yǎng)皿可 以置于恒溫器中且于37。C溫育過(guò)夜以允許培養(yǎng)物生長(zhǎng)。對(duì)于夜間培養(yǎng)物 的制備，所需量的LB培養(yǎng)基可以在錐形瓶中進(jìn)行制備。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移 至耐熱的錐形瓶?jī)?nèi)，從而使得量不超過(guò)瓶體積的1/4。大腸桿菌的分離的 菌落可以從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移且接種到錐形瓶中。將瓶置于熱搖動(dòng)器 (thermoshaker )中且于37°C以50 rev/分鐘溫育過(guò)夜。
K. -/7^五3^ycFv-^af ^發(fā)#
雜種肽scFv-DnaK的合成可以通過(guò)將IPTG加入培養(yǎng)物中進(jìn)行誘導(dǎo)。 在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的過(guò)夜培養(yǎng)物DLT1270/ pQE30- scFv-DnaK可以1: 100稀釋且在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD600二0.5。力口入O.l mM IPTG且培 養(yǎng)繼續(xù)3小時(shí)。培養(yǎng)物的密度可以使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。在發(fā)酵結(jié) 束后，生物量可以通過(guò)在3000xG下于4。C離心15分鐘進(jìn)行收集。蛋白 質(zhì)的產(chǎn)生隨后可以為在聚丙烯酰胺凝膠中電泳。
當(dāng)量
本發(fā)明尤其提供了改造抗體-應(yīng)激蛋白融合多肽。雖然本發(fā)明的具體 實(shí)施方案已得到討論，但上述說(shuō)明書是舉例說(shuō)明性的而不是限制性的。 在回顧本說(shuō)明書后，本發(fā)明的許多變化將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn) 的。附加權(quán)利要求不意欲要求保護(hù)所以此種實(shí)施方案和變化，并且本發(fā) 明的全部范圍應(yīng)通過(guò)參考權(quán)利要求，連同其等同方案的全部范圍，和說(shuō) 明書，連同此種變化進(jìn)行確定。
參考文獻(xiàn)
整體引入作為參考的是任何多核苷酸和多肽序列，其參考關(guān)于在環(huán) 球網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information ) ( NCBI)的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的條目的登記號(hào)。 所有引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括如本申請(qǐng)自始至終引用的文獻(xiàn)參考、授權(quán)的專利、公開(kāi)或未公開(kāi)的專利申請(qǐng)，特別在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種融合多肽，其包含改造抗體和應(yīng)激蛋白。
2. 權(quán)利要求l的融合多肽，其中所述改造抗體包含至少一個(gè)scFv。
3. 權(quán)利要求1的融合多肽，其中所述改造抗體包含至少一個(gè)Fab片段。
4. 權(quán)利要求l的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是HSP70。
5. 權(quán)利要求4的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是結(jié)核分枝桿菌 HSP70。
6. 權(quán)利要求4的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是牛分枝桿菌 HSP70。
7. 權(quán)利要求l的融合多肽，其中所述改造抗體是多價(jià)的。
8. 權(quán)利要求7的融合多肽，其中所述多價(jià)改造抗體是多特異性的。
9. 權(quán)利要求7的融合多肽，其中所述改造抗體是四價(jià)的。
10. 權(quán)利要求9的融合多肽，其中所述改造抗體是Tandab。
11. 權(quán)利要求9的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是HSP70。
12. 權(quán)利要求11的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是結(jié)核分枝桿菌 HSP70。
13. 權(quán)利要求11的融合多肽，其中所述應(yīng)激蛋白是牛分枝桿菌 HSP70。
14. 一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1 - 13中任一項(xiàng)的融合多肽。
15. —種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求14的核酸。
16. —種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15的表達(dá)載體。
17. —種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1 - 13中任一項(xiàng)的 融合多肽，和藥學(xué)上可接受的載體。
18. —種免疫原性組合物或疫苗，其包含權(quán)利要求1 - 13中任一項(xiàng) 的融合多肽。
19. 一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1 - 17中任一項(xiàng)的組合物。
20. 權(quán)利要求19的試劑盒，其進(jìn)一步包含關(guān)于所述組合物的使用的 說(shuō)明書。
全文摘要
提供了包含改造抗體和應(yīng)激蛋白的融合多肽，其以高親和力與抗原結(jié)合，是高免疫原性的，顯示MHC I類致敏，并且能夠在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如大腸桿菌中生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101410140SQ200780010776
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月2日
發(fā)明者J·A·蓋爾芬德 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司