專利名稱：：包含hsp90蛋白抑制劑的治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療或預(yù)防與TNFa和/或IL-6的水平升高相關(guān)的病癥的藥物。本發(fā)明還涉及降低患者中TNFa和/或IL-6水平的方法，以及還涉及診斷與TNFa和/或IL-6的水平升高相關(guān)的病癥的方法。
背景技術(shù)：
：膿毒癥是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)病癥，典型由導(dǎo)致全身性免疫應(yīng)答的嚴(yán)重感染引起。癥狀包括發(fā)燒、寒冷、不適和低血壓。甚至在接受治療時(shí)，患有膿毒癥的患者還發(fā)展為多器官功能紊亂綜合癥或死亡。也觀察到膿毒癥的癥狀在已知不會(huì)發(fā)生感染的情況中出現(xiàn)，在這種情況中所述病癥己知為全身性炎性反應(yīng)綜合癥(SIRS)。白介素6(IL-6)是感染中急性期應(yīng)答的一部分，因此患者中其水平升高已與多種嚴(yán)重感染和患者較差的效果相關(guān)聯(lián)。最近，已經(jīng)報(bào)道升高的IL-6水平與膿毒癥和SIRS相關(guān)。在新生兒中在最佳截?cái)嘀?cutoff)31pg/ml，升高的IL-6水平具有89%的敏感度，在第0天檢測(cè)晚期出現(xiàn)感染的陰性預(yù)測(cè)值為91%(Ngetal1997)。在真菌感染中，與革蘭氏陽(yáng)性膿毒癥相比，IL-6水平顯著升高(p=0.035)，在死于真菌膿毒癥的嬰兒中具有非常高的水平(Ngetal2003)。在手術(shù)患者中，升高的IL-6與SIRS相關(guān)(Miyaokaetal2005)并且在截?cái)嘀?10pg/ml，在膿毒并發(fā)癥患者中在其術(shù)后頭5天，當(dāng)區(qū)分有無(wú)術(shù)后膿毒并發(fā)癥的患者時(shí)進(jìn)行的測(cè)試具有90%的敏感度及58%的特異性(Mokarteta12005)。與具有SIRS推定不感染(平均值80.9pg/ml)的相比，升高的IL-6與具有SIRS并推定感染的患者相關(guān)(平均值222.8pg/ml)(Terreginoeta12000)。白介素6的產(chǎn)生部分由腫瘤壞死因子(TNF-ot)誘導(dǎo)。本領(lǐng)域中已報(bào)道為治療目的而中和TNF-a并且使用白介素6的水平作為TNF-a活性的替代標(biāo)記物(surrogatemarker)。例如，在單克隆抗TNF-a抗體F(ab，)2(已知為Afelimomab)的效力和安全性的研究中，在具有高白介素6水平的患者中活性明顯，在白介素6為陰性的患者中則無(wú)(Panaceketa12004)。提出的這種治療基于的理論是TNF-ot是宿主破壞細(xì)胞因子，LPS(脂多糖)觸發(fā)TNF-a釋放，這導(dǎo)致膿毒性休克發(fā)生(HehlgansandPfeffer2005)。這個(gè)理論基于的觀測(cè)是在膿毒癥中存在高水平的TNF-a，其預(yù)示了患者死亡，而TNF-a水平下降則與患者存活相關(guān)。研究的另一領(lǐng)域是開(kāi)發(fā)了包含針對(duì)真菌應(yīng)激蛋白質(zhì)hsp90的抗體的藥物Mycograb⑧。這發(fā)展自這樣的觀測(cè)，即具有侵入性念珠菌病的患者在從所述疾病中恢復(fù)時(shí)對(duì)于hsp90產(chǎn)生血清轉(zhuǎn)化。WO-A-01/76627報(bào)道了應(yīng)用Mycograb⑧抗體和多烯(如兩性霉素B)或者棘球白素(echinocandin)抗真菌物質(zhì)的組合治療真菌感染。已報(bào)道在臨床試驗(yàn)中與兩性霉素B和安慰劑(鹽水)相比時(shí)，所述藥物和兩性霉素B的組合由于其作為抗真菌劑的直接活性以及所述藥物中和循環(huán)hsp90的能力而示出了協(xié)同作用。Ma他ewsetal.2005報(bào)道hsp90在人類疾病中可能起何種作用。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即給予hsp90蛋白質(zhì)導(dǎo)致TNF-a和IL-6水平升高并且這種作用可以被在先的hsp90和Mycograb⑧藥物的交叉吸收而中和(但是和包含針對(duì)MRSA的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體的Aurograb⑧則不是)。不希望被任何理論所局限，相信本發(fā)明可行是因?yàn)閭€(gè)體中循環(huán)的hsp90蛋白質(zhì)的存在導(dǎo)致了個(gè)體中TNF-a和IL-6水平升高。個(gè)體中hsp90蛋白質(zhì)的存在可以直接作用以升高個(gè)體中的BL-6水平或者可以是升高的TNF-a水平導(dǎo)致個(gè)體中IL-6水平升高。個(gè)體中較高水平的這兩種細(xì)胞因子(TNF-a和IL-6)的存在引起觀測(cè)為膿毒癥或SIRS的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)在將解釋這個(gè)理論的推理過(guò)程?，F(xiàn)有技術(shù)己報(bào)道Mycograb⑧藥物在治療真菌感染中通過(guò)中和真菌hsp90蛋白質(zhì)起作用。Mycograb⑧抗體特異的表位在人hsp90蛋白中是保守的，所以Mycograb⑧抗體也結(jié)合并中和人hsp90蛋白。這種結(jié)合已被本文實(shí)施例l(Mycograb與人和真菌hsp90的結(jié)合)中報(bào)道的數(shù)據(jù)證實(shí)。Hsp90被認(rèn)為是只在細(xì)胞壞死而不是細(xì)胞凋亡時(shí)釋放的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(Saitoeta12005)。因此患者中壞死細(xì)胞釋放hsp90進(jìn)入循環(huán)，在沒(méi)有微生物的陽(yáng)性培養(yǎng)物的情況下導(dǎo)致患者出現(xiàn)類似膿毒癥的癥狀(即SIRS-全身性炎性反應(yīng)綜合癥)。這種情形在真菌hsp90作為人hsp90的直接模擬物的真菌膿毒癥中是惡化的。這種情形在可能釋放細(xì)菌同源物htpG的細(xì)菌膿毒癥中也是惡化的并產(chǎn)生或惡化臨床表現(xiàn)。在膿毒癥中，游離的hsp90/htpG可以誘導(dǎo)膿毒癥表現(xiàn)并且這可以通過(guò)現(xiàn)已報(bào)道的誘導(dǎo)高水平的白介素6而間接觀察到(見(jiàn)實(shí)施例3)。白介素6的水平在患者血清中通過(guò)雙盲安慰劑-控制研究測(cè)量。IL-6水平的降低與用Mycograb⑧治療組的恢復(fù)相關(guān)，但是這在安慰劑組中沒(méi)有發(fā)生。最顯著的，安慰劑組中念珠菌致死的患者具有持續(xù)的高水平IL-6。本文報(bào)道的數(shù)據(jù)支持了如下想法，hsp90導(dǎo)致白介素6直接釋放，所以hsp90的中和有效地阻斷了IL-6釋放。其也支持了如下想法，中和hsp90阻斷將阻斷TNF-a釋放，由此抑制hsp90蛋白將有效的治療其中TNF-a是最重要分子的自身免疫疾病。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了hsp90蛋白的抑制劑在制備用于治療或預(yù)防與TNF-a和/或IL-6的水平升高相關(guān)的病癥的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，提供了降低患者中TNF-a和/或IL-6水平的方法，包括給予患者h(yuǎn)sp90蛋白抑制劑，優(yōu)選量足以降低患者的TNF-a和/或IL-6的水平。在一些實(shí)施方案中，所述患者患有由于TNF-a和/或IL-6水平升高造成的病癥。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了診斷與TNF-a和/或IL-6水平升高相關(guān)的患者中病癥的方法，包括確定患者中循環(huán)的hsp90蛋白的水平的步驟，其中hsp90蛋白的水平升高是所述病癥存在的指征。確定患者中循環(huán)的hsp90蛋白的水平可以直接在患者中進(jìn)行，但是通過(guò)確定取自患者的樣品(例如血液樣品)中hsp90蛋白的水平可以更方便地實(shí)現(xiàn)。如此，所述診斷方法可以離體(exvivo)進(jìn)行。所述患者典型的是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。與TNF-a(腫瘤壞死因子a)或IL-6(即白介素6)的水平升高相關(guān)的病癥是這樣的病癥，其中TNF-a或IL-6用于在患者所述病癥的患者中處于正常水平之上而分別作為所述病癥的標(biāo)記物。與IL-6水平升高相關(guān)的病癥的進(jìn)一步解釋以及IL-6作為標(biāo)記物的應(yīng)用在Miyaokaetal.2005，Mokarteta1.2005，Ngl997，Ngetal.2004和Terreginoetal.2000中提供。這種病癥的例子包括膿毒癥和SIRS(全身性炎性反應(yīng)綜合癥)。TNF-a的水平升高涉及例如自身免疫疾病如Crohn's病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎和全身性紅斑狼瘡(SLE)。患者中TNF-a或IL-6的水平可以通過(guò)例如使用實(shí)施例2中報(bào)道的TNF-a測(cè)定和白介素6測(cè)定評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，是其異常水平指征的TNF-a或IL-6水平是患者中正常濃度的5、10或20倍。然而，注意在一些患者中觀察到幾百倍(例如100倍)于正常值的水平。已知膿毒癥可以是由于感染或其他原因(即SIRS)造成的，本發(fā)明包括了這兩種情況。在一些實(shí)施方案中，膿毒癥是真菌或細(xì)菌感染的結(jié)果，但是也可以理解為本發(fā)明也涉及不是真菌或細(xì)菌感染造成的膿毒癥。Hsp90蛋白是在許多生物體中產(chǎn)生的高度保守的應(yīng)激蛋白質(zhì)家族。例如，EP-A-0406029報(bào)道了白色念珠菌(Ca"必foa/6/cara)的hsp90蛋白。WO-A-92/01717報(bào)道了杰氏棒桿菌(Co7"e6acten'w附力汰e/wm)的hsp90蛋白。人的hsp卯蛋白也為本領(lǐng)域所已知，包括在本文SEQIDNO:3中。本文所用術(shù)語(yǔ)"hsp90蛋白"因此包括這些蛋白質(zhì)的每一種并且還包括例如大腸桿菌(Esc/zen'c/K'aco//)的細(xì)菌同源物htpG。而且，WO-A-94/04676報(bào)道了許多不同生物體的hsp90蛋白中存在的保守序列。因此，本發(fā)明涉及這個(gè)應(yīng)激蛋白家族中的任一種hsp卯蛋白。在某些實(shí)施方案中，hsp90蛋白被更特異的限定，這將在本發(fā)明中解釋。在一個(gè)實(shí)施方案中，hsp90蛋白包含氨基酸序列XXXLXVIRKXIV，其中X是任意氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hsp90蛋白包含氨基酸序列XXILXVIXXXXX，其中X是任意氨基酸。已知上述兩種共用序列在WO-A-94/04676中報(bào)道，應(yīng)理解在本發(fā)明其他實(shí)施方案中，hsp90蛋白被引入本文參考的WO-A-94/04676中報(bào)道的任何其他共用序列限定。在其他一些實(shí)施方案中，hsp90蛋白包含氨基酸序列LKVIRK，優(yōu)選LKVIRKNIV。在一些實(shí)施方案中，hsp90蛋白與白色念珠菌的hsp90的序列即SEQIDNO:2具有至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的相同性。在這點(diǎn)上，己知白色念珠菌的hsp90蛋白的序列與人hsp90a同種型2的序列具有58%相同性，因此與白色念珠菌的hsp90蛋白序列具有至少58%相同性的水平也是本發(fā)明hsp90蛋白的定義。在本說(shuō)明書中，兩個(gè)序列間的百分比"相同性"使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden,AlejandroA.Schaffer，JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller,andDavidJ.Lipman(1997)，"GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",NucleicAcidsRes.25:3389-3402)使用默認(rèn)參數(shù)確定。特別的，BLAST算法可以使用URLwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast在互聯(lián)網(wǎng)上評(píng)估。Hsp90蛋白的抑制劑可以是任何蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸、寡糖或其他可以降低體內(nèi)hsp90蛋白活性的生物學(xué)相容產(chǎn)物。更特異的，所述抑制劑降低了hsp90蛋白升高IL-6水平的作用。因此生物學(xué)相容產(chǎn)物作為hsp卯蛋白抑制劑的效力可以通過(guò)確定應(yīng)用了或未應(yīng)用所述產(chǎn)物的患者中循環(huán)hsp90蛋白的水平或者通過(guò)確定應(yīng)用或未應(yīng)用所述產(chǎn)物的患者中循環(huán)IL-6的水平而評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑包括抗體或其抗原結(jié)合片段。然而，這不是本發(fā)明必需的，所述抑制劑可以是任何類型的活性成分如抗生素格爾德霉素、根赤殼素(radicicol)或新生霉素或藥物順鉑(cisplatin)。抗體，其制備及使用是熟知的并且公開(kāi)在例如Harlow，E.andLane，D.，Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1999。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以產(chǎn)生抗體?？贵w的例子包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段以及抗體的抗原結(jié)合片段。"抗原結(jié)合片段"包括能夠結(jié)合靶抗原的任何抗體片段并因此包括Fab片段和F(ab')2片段?？贵w可以在許多宿主中生產(chǎn)，例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人和其他宿主。它們可以通過(guò)注射念珠菌屬的熱激蛋白例如白色念珠菌的hsp90或具有免疫原性的任何其片段或寡肽而免疫。作為另一個(gè)例子，宿主可以用人熱激蛋白免疫。根據(jù)宿主種類，可以使用不同的佐劑增加免疫應(yīng)答。這種佐劑包括但不限于Freund's佐劑、礦物凝膠(mineralgel)如氫氧化鋁和表面活性劑如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚。用于人中的佐劑中，BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Co/y"e6acfen-ww/arvww)特另(J有用。針對(duì)hsp90熱激蛋白的單克隆抗體或其任意片段或寡肽可以使用用于通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)制備。這些包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV雜交瘤技術(shù)(Koehleretal.，1975，Nature,256:495-497;Kosboretal.，1983，Immunol.Today4:72;Coteetal.，1983，PNASUSA，80:2026-2030;Coleetal.，1985，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR丄issInc.，NewYork,pp.77-96)。另外，可以使用為生產(chǎn)"嵌合抗體"而開(kāi)發(fā)的技術(shù)，將小鼠抗體基因剪接人抗體基因以獲得具有適當(dāng)抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Moirisonetal.，1984，PNASUSA，81:6851-6855;Neubergeretal.，1984，Nature,312:604-608;Takedaetal.，1985，Nature,314:452-454)。或者，使用本領(lǐng)域己知的方法，改造用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)生產(chǎn)hsp90熱激蛋白特異性單鏈抗體。除了獨(dú)特的特應(yīng)組合物，具有相關(guān)特異性的抗體均可以通過(guò)隨機(jī)組合免疫球蛋白文庫(kù)的鏈改組(chainshuffling)產(chǎn)生(Burton,D.R.，1991，PNASUSA,88:11120-11123)?？贵w也可以通過(guò)在淋巴細(xì)胞群中誘導(dǎo)體內(nèi)生產(chǎn)或通過(guò)篩選高度特異性結(jié)合試劑的重組免疫球蛋白文庫(kù)或組而產(chǎn)生(Orlandietal.，1989，PNASUSA，86:3833-3837;Winter,G.etal.，1991，Nature,349:293-299)。也可以產(chǎn)生抗原結(jié)合片段，例如F(ab')2片段可以通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生以及Fab片段可以通過(guò)還原F(ab')2片段二硫鍵而產(chǎn)生。或者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以快速簡(jiǎn)便鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huseetal.，1989，Science,256:1275-1281)?？梢允褂貌煌庖邷y(cè)定篩選鑒定具有所需活性的抗體。本領(lǐng)域熟知使用具有已建立特異性的多克隆或單克隆抗體的眾多的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方案或免疫放射分析。這種免疫測(cè)定典型地包括測(cè)量hsp90熱激蛋白或其任意片段或寡肽與其特異性抗體之間的復(fù)合物的形成?？梢允褂美锰禺愑趦蓚€(gè)非干擾hsp卯熱激蛋白表位的多個(gè)單克隆抗體的二位(two-site)基于單克隆抗體的免疫測(cè)定，但也可以使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析(Maddoxetal,，1983，J.Exp.Med.，158:1211-1216)。有利地，抗體或抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合或特異于具有氨基酸序列LKVIRK、優(yōu)選LKVIRKMV的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含Mycograb⑧的抗體成分的序列即SEQIDNO:1。在診斷方法中為了確定hsp卯蛋白的水平，在一些實(shí)施方案中使用了能夠結(jié)合hsp90蛋白的抗體(或其抗原結(jié)合片段)。所述抗體或抗原結(jié)合片段例如結(jié)合于熒光標(biāo)記以觀察與hsp90蛋白結(jié)合并因此測(cè)定存在的hsp90蛋白的水平(濃度或絕對(duì)量)。在診斷方法中因此也可以使用涉及hsp90蛋白抑制劑的上述抗體。在一些診斷方法的其他實(shí)施方案中，其中待診斷的病癥是病原性感染，也確定了造成感染的物種。可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)的一種方法是確定hsp90蛋白羧基末端存在的物種特異性表位的序列。例如，真菌白色念珠菌在物種特異性表位上具有肽序列DEPAGE(見(jiàn)SEQIDNO:2的氨基酸殘基695-700)，因此特異于這個(gè)表位的抗體的結(jié)合表示作為感染病原體的白色念珠菌的存在。然而，應(yīng)注意所述診斷方法不限于診斷由病原體感染造成的病癥。事實(shí)上，所述診斷方法特別用于沒(méi)有病原體存在而產(chǎn)生的病癥如SIRS中?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明藥物的方法是熟知的。例如，除了hsp90蛋白的抑制劑之外，藥物可以包括藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(Remington'sPharmaceuticalSciencesandUSPharmacopoeia,1984，MackPublishingCompany,Easton，PA，USA)。給予患者的藥物的準(zhǔn)確劑量(即藥學(xué)可接受的劑量)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，例如通過(guò)使用簡(jiǎn)單的劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)確定。在藥物是抗體或抗原結(jié)合片段的情況中，優(yōu)選劑量范圍在0.1-10mg/kg體重或0.5-5mg/kg體重，特別優(yōu)選大約lmg/kg體重的劑量。所述藥物可以口服給予。附圖簡(jiǎn)述本說(shuō)明書中，參考如下附圖。圖1示出了注射不同濃度的Mycograb⑧相對(duì)于固定肽的結(jié)合曲線圖。圖2示出了注射不同濃度的Mycograb⑧相對(duì)于念珠菌hsp90的結(jié)合曲線圖。圖3示出了注射系列濃度的Mycograb⑧相對(duì)于固定的人hsp90a的結(jié)合曲線圖。圖4示出了顯示不同溫度下Mycograb⑧與LKVIRK-肽結(jié)合的傳感圖。圖5示出了重組hsp90的IMAC純化的凝聚分析圖像。凝膠的泳道如下泳道l-流經(jīng)液(Flowthrough);泳道2-洗液la;泳道3-洗液lb;泳道4-洗液lc;泳道5-洗液ld;泳道6-洗液le;泳道7-洗脫液la;和泳道8-洗脫液lb。圖6示出了小鼠對(duì)未被Mycograb⑧交叉吸收的hsp卯的應(yīng)答圖。圖7示出了小鼠對(duì)用0.1mg/kg濃度的Mycograb⑧交叉吸收的hsp卯的應(yīng)答圖。圖8示出了小鼠對(duì)用0.5mg/kg濃度的Mycograb⑧交叉吸收的hsp90的應(yīng)答圖。圖9示出了小鼠對(duì)用lmg/kg濃度的Mycograb⑧交叉吸收的hsp90的應(yīng)答圖。序列簡(jiǎn)述SEQIDNO:1是Mycograb的抗體成分的氨基酸序列。SEQIDNO:2是白色念珠菌的hsp90應(yīng)激蛋白的氨基酸序列。SEQIDNOSEQIDNO基酸序列。SEQIDNO酸序列。SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO實(shí)驗(yàn)實(shí)施例l:證實(shí)Mycograb結(jié)合靶表位LKVIRK，人和真菌hsp90Mycograb⑧與來(lái)自于其最初匹配的hsp90中的LKVIRK-肽(SEQIDNO:4)的結(jié)合以及與重組形式的衍生自代表了白色念珠菌和人hsp90oc的同源物的序列的hsp90的結(jié)合使用實(shí)時(shí)Biacore分析證實(shí)。溫度對(duì)于與LKVIRK-肽的結(jié)合的作用被額外研究。材料和方法生物素化的LKVIRK肽固定在傳感器芯片SA上通過(guò)以20pl/min的流速運(yùn)行HBS-EP緩沖液連續(xù)經(jīng)過(guò)2個(gè)鄰近流動(dòng)池(flowcell)進(jìn)行的非共價(jià)捕獲實(shí)現(xiàn)，所述HBS-EP緩沖液由10mMHepes、150mMNaCl、0.005%Tween20和3.4mMEDTA組成，pH7.4。白色念珠菌hsp90，透析至10mM醋酸鈉pH4.0中，使用氨基偶聯(lián)共價(jià)結(jié)合至CM-5芯片的表面。人hsp卯a(chǎn)(1.15mg/ml)在10mM醋酸鈉pH4.0中1:50稀釋，并使用氨基偶聯(lián)共價(jià)結(jié)合至CM-5芯片的表面。如并入本文參考的WO-A-01/76627(特別見(jiàn)11和12頁(yè))所述配制Mycograbo結(jié)果13:3是人hsp90a同種型2蛋白的氨基酸序列。:4是SEQIDNO:1的抗體特異于其的hsp90的表位的氨:5是具有鄰近氨基酸殘基的SEQIDNO:4的表位的氨基:6是hsp90上表位的共有序列。:7是hsp90上表位的共有序列。:8是實(shí)施例中所用的PCR引物序列。:9是實(shí)施例中所用的PCR引物序列。分析系列濃度的Mycograb⑧與肽的結(jié)合的結(jié)果示于圖1，使用Biacore評(píng)估軟件評(píng)估。配體和分析物之間1:1結(jié)合的Langmuir模型給出了結(jié)合曲線的良好擬合，ka(結(jié)合速率常數(shù))計(jì)算為226xlt^ivrV以及kd(解離速率常數(shù))為6.47xlO"V。KD(解離常數(shù))為2.86xlO-8M，意味著結(jié)合具有幾天的長(zhǎng)半衰期。觀測(cè)速率常數(shù)(observedrateconstant,K。bs)針對(duì)用于測(cè)試Mycograb樣品中存在聚集物或溶解度問(wèn)題的Mycograb⑧濃度作圖。這產(chǎn)生了一條直線，證明聚集物不是問(wèn)題。在與念珠菌hsp卯結(jié)合的情況中，1:1的Langmuir模型給出了結(jié)合曲線的良好擬合，ka(結(jié)合速率常數(shù))計(jì)算為373M—V'以及kd(解離速率常數(shù))為2.67xl(rV1。結(jié)果示于圖2。KD(親和常數(shù)，、和kd的比值)為7.17xl(T7M。擬合的Chi值為1.58(小于2為良好擬合)。為排除在用于實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)Mycograb樣品中存在聚集物或溶解度問(wèn)題，K^針對(duì)濃度作圖，結(jié)果為直線，表示樣品中不存在聚集物。在與人hsp90結(jié)合的情況中，該結(jié)果示于圖3，1:1的Langmuir模型給出了結(jié)合曲線的良好擬合。模型計(jì)算ka為981M-V以及kd為3.21xltrY1。KD計(jì)算為3,27xl(r6M，擬合的Chi值為0.82。為了排除Mycograb⑧樣品中存在聚集物或溶解度問(wèn)題，k。bs針對(duì)濃度作圖。這產(chǎn)生直線，證明沒(méi)有聚集物。在系統(tǒng)溫度有變化時(shí)Mycograb⑧與肽的結(jié)合譜具有明顯的變化，該結(jié)果示于圖4。圖4證明，在疊加的減去參考的傳感圖中，隨溫度上升最大RU值也增加。如果結(jié)合外推至飽和點(diǎn)則在更高溫度下更多的Mycograb結(jié)合芯片表面。在溫度系列的低端，10-25°C，Rmax存在一個(gè)5至20RU的少量增加。在37。C，應(yīng)答增加顯著，Rmax增加至118RU。檢查解離曲線顯示解離速率常數(shù)保持相對(duì)恒定，與溫度無(wú)關(guān)。Mycograb⑧緊密結(jié)合代表LKVIRK肽的肽。結(jié)合速率常數(shù)(ka)為2.26xl0(4)M-1s-1，當(dāng)其結(jié)合時(shí)，解離速率常數(shù)(kd)為6.47xl0(-4)s-1，顯示其與其靶強(qiáng)烈相互作用。獲得的KD為2.86x10(-8)M,意味著結(jié)合具有幾天的長(zhǎng)半衰期。Mycograb⑧與白色念珠菌hsp90和人hsp90的結(jié)合的KD分別為7.17x1(T7M和3.27x1(T6M。與具有、為373M'V1(念珠菌hsp卯)和981IVrV1(人hsp90)的分離的肽相比、與2,26xl04M-V1(肽)相比，Mycograb證實(shí)了對(duì)于hsp90蛋白具有明顯大體上更低的結(jié)合速率。然而，天然相互作用系統(tǒng)的kd為2.67xl(T4s"(白色念珠菌Hsp90)和3.21xl(T3s"(人hsp90)均顯示對(duì)于LKVIRK肽的結(jié)合(6.47xl(T4s")具有相似的強(qiáng)相互作用。天然hsp90是大約80KDa的相當(dāng)較大的大分子，其降低了Mycograb在特異時(shí)間框架內(nèi)到達(dá)特異結(jié)合位點(diǎn)的可能性，因此降低了ka。hsp90的大分子結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的分離的肽相比可以顯著修飾表位的靜電環(huán)境。然而，一旦成功?？?dock),Mycograb⑧將無(wú)論表位前后序列為何，均足以維持相互作用，對(duì)于3個(gè)不同測(cè)試系統(tǒng)產(chǎn)生相似的特征性kd。在較高溫度Mycograb⑧與肽的結(jié)合增加。最佳結(jié)合在37'C觀測(cè)到，這個(gè)溫度也是Mycograb⑧用于患者的溫度。因?yàn)镸ycograb⑧基于人免疫系統(tǒng)最佳化的結(jié)構(gòu)，可以預(yù)測(cè)在體溫下所述結(jié)合最有效。實(shí)施例2:小鼠模型中白介素6的誘導(dǎo)這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)測(cè)量在注射純化的念珠菌hsp90后小鼠中TNF-a和白介素6的產(chǎn)生。也測(cè)試了通過(guò)在注射前在37"C用Mycograb交叉吸收15分鐘來(lái)中和這種現(xiàn)象的能力。材料和方法克隆和表達(dá)念珠菌Hsp90蛋白為克隆和表達(dá)念珠菌Hsp90蛋白，編碼序列直接PCR擴(kuò)增自使用DNeasyTMspin柱(Qiagen)根據(jù)廠商指導(dǎo)制備的念珠菌基因組DNA。使用的寡核苷酸是5'-ATGGCTGACGCAAAAGTTG-3，(SEQIDNO:8)和5'誦ATCAACTTCTTCCATAGCAG國(guó)3，(SEQIDNO:9)，由Sigmagenosys.合成。擴(kuò)增使用TaqDNA聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行，直接連接-獨(dú)立克隆進(jìn)表達(dá)載體pYES2，l/V5-His-TOPO⑧(Invitrogen)，在GAL1啟動(dòng)子的控制下將C末端融合的His6-標(biāo)記加入表達(dá)的Hsp90蛋白中?？寺』旌衔镛D(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)表達(dá)株TOP10F，(Invitrogen)并使用SDS-PAGE鑒定重組子并使用單克隆抗-His-標(biāo)記過(guò)氧化物酶綴合抗體(Sigma)進(jìn)行免疫印跡。所得質(zhì)粒稱為pHspl。純化念珠菌Hsp90蛋白為過(guò)表達(dá)6-His-標(biāo)記Hsp卯蛋白，使用S.c.EasyComp試劑盒(Invitrogen)根據(jù)廠商指導(dǎo)用pHspl轉(zhuǎn)化釀酒酵母(S(3cc/wramycMcerev&^e)株INVScl。INVScl(pHspl)在10ml的SC-U生長(zhǎng)培養(yǎng)基(0.67%酵母氮堿(SIGMAcat.Y-0626)、0.19°/。酵母合成點(diǎn)滴(drop-out)培養(yǎng)基補(bǔ)充物，無(wú)尿嘧啶(SIGMAcat.Y-1501)、2%棉子糖)中生長(zhǎng)過(guò)夜。離心(5000g，10min，4°C)收獲細(xì)胞并且將沉淀在10ml的Sc-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.67%酵母氮堿(SIGMAcat.Y-0626)、0.19%酵母合成點(diǎn)滴(drop-out)培養(yǎng)基補(bǔ)充物，無(wú)尿嘧啶(SIGMAcat.Y-1501X2%半乳糖)中洗滌。洗滌的細(xì)胞重懸于10ml的SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并加入到1L的SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并在3(TC搖動(dòng)生長(zhǎng)再24小時(shí)。離心(lOOOOg，10min，4°C)收獲細(xì)胞并重懸于20ml的裂解緩沖液(50mM磷酸鈉，pH7.4，5%甘油，ImM的PMSF)中并通過(guò)弗氏壓碎器(2噸，1passage)破裂。不溶物質(zhì)通過(guò)另外的離心步驟(lOOOOg，lOmin,室溫)去除。細(xì)胞裂解物通過(guò)添加500mM尿素和調(diào)節(jié)至pH8.0的pH緩沖液調(diào)節(jié)。Hsp90蛋白使用固定化金屬離子親和層析(IMAC)純化。15ml預(yù)裝料(pre-charged)鎳IMAC柱用5柱體積(CV)的平衡緩沖液(500mM尿素，100mMNaH2PO4，pH8.0)平衡。緩沖液調(diào)節(jié)的細(xì)胞裂解物然后加到柱上。柱用5CV的平衡緩沖液洗滌，然后用5CV的洗滌緩沖液(500mM尿素，lOOmMNaH2P04，pH8.0，50mM咪唑)洗滌。Hsp90蛋白用3CV的洗脫緩沖液(500mM尿素，100mMNaH2PO4，pH8.0，500mM咪唑)從柱上洗脫。用SDS-PAGE分析所有級(jí)分，凝聚如下所示?？贵w來(lái)源Mycogmb⑧是針對(duì)hsp90的人重組抗體片段。其結(jié)合的表位在人和真16菌hsp90之中是保守的。Aurograb⑧是針對(duì)MRSA的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人重組抗體。Aurograb⑧的制劑在并入本文參考的WO-A-03/046007中揭示。注射實(shí)驗(yàn)方案使用6-8周齡的雌性CD-1小鼠，通常體重在24和30g之間。在每次實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)稱重小鼠。hsp卯和Mycograb⑧和Aurograb⑧的濃度基于小鼠體重計(jì)算，為0.1、0.5、1.0和10mg/kg。對(duì)照樣品是無(wú)菌PBS(對(duì)于hsp90)和無(wú)菌配制緩沖液(500mM尿素，200mM精氨酸pH9.5)(對(duì)于Mycograb)。當(dāng)組合使用時(shí)，hsp卯和Mycograb⑧在注射前在37'C交叉吸收15分鐘。所有小鼠置于41'C的加熱箱中。經(jīng)側(cè)尾靜脈用適當(dāng)?shù)臉悠缝o脈內(nèi)注射小鼠，并放回鼠籠中，讓它們自由取食和飲水。在特定時(shí)間點(diǎn)，小鼠被末端麻醉(使用鹵垸)。使用無(wú)菌針頭進(jìn)入心臟(心臟穿刺)提前血液，通過(guò)頸脫臼處死小鼠。在3000ipm離心血液樣品IO分鐘，使用無(wú)菌吸樣器吸取血清。血清樣品儲(chǔ)存在-20'C直至用于測(cè)試。TNF-a測(cè)定根據(jù)BDOptEIA目錄號(hào)555268對(duì)小鼠值進(jìn)行(BDBiosciencesPharmingenSanDiegoUSA)。在每種情況中，反應(yīng)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行。每個(gè)測(cè)定中需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線均一式二份。ELISA平板用100^1/孔的在包被緩沖液中稀釋(推薦的稀釋度見(jiàn)批次特異性分析證書(lot-specificcertificateofanalysis)中)的捕獲抗體包被。密封平板并在4-C保溫過(guò)夜。吸干孔并用洗滌緩沖液洗三次。最后一次洗滌后，平板倒置并在吸水紙吸干。平板用200pI/孔的測(cè)定稀釋液在室溫封閉1小時(shí)。如前洗滌平板三次。如下制備TNF-a標(biāo)準(zhǔn)物溫至室溫后，將冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)物用1ml的去離子水重構(gòu)(reconstitute)并在渦旋混合前平衡15分鐘。制備來(lái)自原液標(biāo)準(zhǔn)物的1000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)物(稀釋指導(dǎo)在批次特異性分析證書中)。從這個(gè)原液使用測(cè)定稀釋液制備1000pg/ml至15.6pg/ml的兩倍稀釋液。測(cè)定稀釋液用作陰性對(duì)照。lOO)Lll的每種標(biāo)準(zhǔn)物、樣品和對(duì)照加入到適當(dāng)?shù)目字?。密封平板并在室溫保?小時(shí)。由于可獲得的血清體積低，在測(cè)定稀釋液中小鼠血清稀釋1/2。如前洗滌平板，但共5次。將所需體積的檢測(cè)抗體加入到測(cè)定稀釋液中并渦旋混合。僅在使用前將所需體積的酶試劑加入到溶液中并渦旋混合。向每個(gè)孔中加入ioow的檢測(cè)抗體。密封平板并在室溫保溫1小時(shí)。如前洗滌平板，共7次。通過(guò)加入等體積的底物A和底物B制備底物，之后立即將lOOpl加入每個(gè)孔中。黑暗中保溫平板30分鐘。通過(guò)向每個(gè)孔中加入50^11的終止溶液終止反應(yīng)。在450nm讀平板。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)樣品的TNF-a濃度。白介素6測(cè)定對(duì)于人血清根據(jù)BDOptEIATM試劑組B目錄號(hào)550534以及對(duì)于小鼠值根據(jù)BDOptEIATM目錄號(hào)555240(BDBiosciencesPharmingenSanDiegoUSA)進(jìn)行。在每種情況中，根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行反應(yīng)。在每個(gè)測(cè)定中均需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)物均一式二份。ELISA平板用100inl/孔的在包被緩沖液中稀釋的(推薦的稀釋度見(jiàn)批次特異性分析證書中)捕獲抗體包被。密封平板并在4"C保溫過(guò)夜。吸干平板并用洗滌緩沖液洗滌三次。最后一次洗滌后，倒置平板并用吸水紙吸干。用200^1/孔的測(cè)定稀釋液室溫封閉平板1小時(shí)。如前洗滌平板三次。如下制備IL-6標(biāo)準(zhǔn)物溫至室溫后，將冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)物用lml的去離子水重構(gòu)并在渦旋混合前平衡15分鐘。制備來(lái)自原液標(biāo)準(zhǔn)物的1000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)物(稀釋指導(dǎo)在批次特異性分析證書中)。從這個(gè)原液使用測(cè)定稀釋液制備1000pg/ml至15.6pg/ml的兩倍稀釋液。測(cè)定稀釋液用作陰性對(duì)照。100nl的每種標(biāo)準(zhǔn)物、樣品和對(duì)照加入到適當(dāng)?shù)目字?。密封平板并在室溫保?小時(shí)。由于可獲得的血清體積低，在測(cè)定稀釋液中小鼠血清稀釋1/2。如前洗滌平板，但共5次。將所需體積的檢測(cè)抗體加入到測(cè)定稀釋液中并渦旋混合。僅在使用前將所需體積的酶試劑加入到溶液中并渦旋混合。向每個(gè)孔中加入ioopi的檢測(cè)抗體。密封平板并在室溫保溫1小時(shí)。如前洗滌平板，共7次。通過(guò)加入等體積的底物A和底物B制備底物，之后立即將100|il加入每個(gè)孔中。黑暗中保溫平板30分鐘。通過(guò)向每個(gè)孔中加入50)ul的終止溶液終止反應(yīng)。在450nm讀平板。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)樣品的IL-6濃度。實(shí)驗(yàn)l純化的hsp90以lmg/kg和10mg/kg注射小鼠并在0、15、30、60和120和對(duì)于10mg/kg另外在1440分鐘時(shí)處死兩只小鼠。如上述測(cè)量TNF-a和白介素6水平。結(jié)果顯示pg/ml的TNF-a水平的結(jié)果總結(jié)于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a—只小鼠TNF-a在應(yīng)答給予的低和高濃度的hsp90時(shí)水平均升高，在60分鐘達(dá)到峰值。給予更高劑量的hsp90后應(yīng)答更強(qiáng)。顯示pg/ml的白介素6水平的結(jié)果總結(jié)于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a—只小鼠結(jié)果證明30分鐘后具有可檢測(cè)的應(yīng)答，在60分鐘達(dá)到峰值，在更高的劑量在1440分鐘不可檢測(cè)。給予更高劑量的hsp卯后應(yīng)答更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)2小鼠靜脈內(nèi)注射1.lmg/kgMycograb2.lmg/kgAurograb3.lmg/kgHSP904.配制緩沖液5.用lmg/kgMycograb交叉吸收的lmg/kgHSP90(15分鐘，37°C)在1小時(shí)和2小時(shí)處死小鼠。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)試一式二份并測(cè)量TNF-a和白介素6。結(jié)果顯示pg/ml的TNF-a濃度的結(jié)果總結(jié)于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注射配制緩沖液、Mycograb和Aurograb略微升高了TNF-a的水平。在1小時(shí)時(shí)對(duì)HSP90的應(yīng)答時(shí)顯著的并且達(dá)到峰值。用Mycograb交叉吸收在1小時(shí)僅具有邊際效應(yīng)，在2小時(shí)在兩只小鼠中水平更高。顯示pg/ml的IL-6濃度的結(jié)果總結(jié)于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>白介素6的水平不受注射配制緩沖液、Mycograb和Aurograb的影響。在1小時(shí)對(duì)HSP90的應(yīng)答是顯著的并且達(dá)到峰值。用Mycograb交叉吸收降低了1小時(shí)時(shí)白介素的水平。實(shí)驗(yàn)315只大約25g的CD-1小鼠注射了不同濃度的hsp卯(0-lmg/kg)，在注射前用或未用Mycograb(0-lmg/kg)在37'C交叉吸收15分鐘。在1小時(shí)處死所有小鼠并且監(jiān)測(cè)IL-6水平。實(shí)驗(yàn)415只大約25g的CD-1小鼠注射了不同濃度的hsp卯(0-lmg/kg)，在注射前用或未用Mycograb(0-lmg/kg)在37'C交叉吸收15分鐘。在1小時(shí)處死所有小鼠并且監(jiān)測(cè)IL-6水平。實(shí)驗(yàn)530只大約25g的CD-1小鼠注射了不同濃度的hsp90(0-lmg/kg)，在注射前用或未用Mycograb(0-lmg/kg)在37'C交叉吸收15分鐘。在1小時(shí)處死所有小鼠并且監(jiān)測(cè)IL-6水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)3、4和5的結(jié)果總結(jié)于表5和圖6至9，其中圖6示出對(duì)hsp90的IL-6應(yīng)答；圖7示出當(dāng)用0.1mg/kg濃度的Mycograb⑧交叉吸收時(shí)對(duì)hsp90的IL-6應(yīng)答；圖8示出當(dāng)用0.5mg/kg濃度的Mycograb交叉吸收時(shí)對(duì)hsp90的IL-6應(yīng)答；圖9示出當(dāng)用lmg/kg濃度的Mycograb⑧交叉吸收時(shí)對(duì)hsp90的IL-6應(yīng)答。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>這些結(jié)果證明增加劑量0、0.1、0.5和lmg/kg的注射的hsp90導(dǎo)致IL-6誘導(dǎo)增加。這部分被在注射前用O.l、0.5或lmg/kg的Mycograb交叉吸收hsp卯所阻斷。這種作用在注射更高劑量的hsp90(0.5和lmg/kg)時(shí)最顯著，減少至原始信號(hào)的43.8-59.9%。實(shí)施例1和2的結(jié)論上述證明了給小鼠注射hsp90誘導(dǎo)了TNF-ot和白介素6水平的升高。這與患有侵入性念珠菌病患者中IL-6的高水平一致，并證明IL-6是導(dǎo)致應(yīng)答的分子。IL-6水平的升高被預(yù)先用Mycograb⑧交叉吸收以部分劑量依賴方式逆轉(zhuǎn)，但是Aurograb⑧則不行。實(shí)施例3-患者研究進(jìn)行了兩個(gè)研究。第一個(gè)是包括募集21名患者(稱為Pilot研究)的初步研究，第二個(gè)是從歐洲和US招募139名患者的(稱為ConfirmatoryStudy)的確認(rèn)研究，117是在修改的意向治療群(modifiedintention-to-treatpopulation)中。這兩個(gè)研究均是雙盲、隨機(jī)化的，并且進(jìn)行以確定是否在培養(yǎng)物證實(shí)侵入性念珠菌病患者中脂質(zhì)相關(guān)兩性霉素B加上Mycograb⑧優(yōu)于兩性霉素B加上安慰劑?；颊呓邮軆尚悦顾谺加上5天療程的Mycograb或安慰劑的脂質(zhì)相關(guān)制劑。選擇標(biāo)準(zhǔn)包括在開(kāi)始試驗(yàn)和研究治療開(kāi)始3天內(nèi)臨床顯著部位的念珠菌生長(zhǎng)的臨床跡象。主要功效變量(primarye迅cacyvariable)是在第10天對(duì)于治療的總體應(yīng)答(臨床和真菌消退)。材料和方法招募被招募的患者必須W8歲，并且在前3天內(nèi)必須具有一或多種來(lái)自臨床顯著部位的陽(yáng)性念珠菌培養(yǎng)物以及在研究開(kāi)始時(shí)至少一種如下跡象過(guò)高熱[>38°0]，低體溫[〈36'C]，心動(dòng)過(guò)速[>110/分鐘]，低血壓[平均血壓<70mmHg]，高白細(xì)胞計(jì)數(shù)[〉11000/mm3]，左偏移(leftshift)，需要血管加壓藥或其他與正在發(fā)生的感染性疾病過(guò)程相關(guān)的異常。顯著部位包括血液培養(yǎng)物和/或來(lái)自深處、通常無(wú)菌部位的培養(yǎng)物。研究過(guò)程招募后，患者隨機(jī)分配為每24小時(shí)接受靜脈內(nèi)Mycograb(lmg/kg體重)或安慰劑(鹽水)，5天。另外，每名患者用廠商推薦劑量的Abdcet(5mg/kg每日)或Ambisome(3mg/kg每日)處理最少10天。在整個(gè)研究中保持患者和研究者不知情。除了全身性抗真菌治療，不檢査其他的伴隨藥物治療。真菌和臨床應(yīng)答均用于評(píng)估效力。研究藥物(Mycograb或安慰劑)給予5天(1-5天)并且在第2、3、4、5、6、8和10天取得培養(yǎng)物，或直至感染跡象或癥狀消退及培養(yǎng)物重復(fù)陰性。對(duì)于治療的臨床應(yīng)答在第4、5、6、8、10和33天評(píng)估，根據(jù)每日評(píng)估前24小時(shí)的疾病療程直至第10天。臨床應(yīng)答的評(píng)估由當(dāng)?shù)匮芯空咦龀?，如果認(rèn)為是由于念珠菌感染引起的所有跡象和癥狀消退則認(rèn)為是完全的。在篩選和第1、2、4、6和IO天進(jìn)行血液學(xué)、臨床化學(xué)、凝血譜和尿分析。效力評(píng)估最主要的效力終點(diǎn)是第10天對(duì)于治療的總體應(yīng)答，這是最后劑量研究藥物和用L-兩性霉素治療的最小期間后5天。有利的總體應(yīng)答定義為完全臨床和真菌學(xué)應(yīng)答，所有念珠菌病跡象和癥狀消退以及培養(yǎng)物證實(shí)根除。部分改良，缺少進(jìn)展或念珠菌病惡化分類為是不利的。因此患者分為感染消退(稱為"治愈的")那些和未如此(稱為"失敗的")那些。存活3個(gè)月的患者稱為"幸存者"，這包括到第IO天沒(méi)有產(chǎn)生全部應(yīng)答的一些患者。進(jìn)一步的亞組是死亡(稱為"全部死亡")的患者，其再分為念珠菌致死亡(稱為"念珠菌死亡")和不是由于念珠菌感染死亡的那些(稱為"非念珠菌死亡")。念珠菌致死亡定義為這樣的死亡，其中研究者陳述念珠菌病明顯促成死亡，存在持續(xù)念珠菌病的臨床跡象，和/或在48小時(shí)陽(yáng)性血液培養(yǎng)物內(nèi)的死亡(Pappaseta1.2003)。白介素6水平如上述測(cè)量。血清得自進(jìn)入研究(第l天)、中點(diǎn)(第3天)和最后一天Mycograb或鹽水治療(6天)的不同數(shù)目的患者。根據(jù)他們來(lái)自初步研究或確認(rèn)研究而進(jìn)行分析并將兩組數(shù)據(jù)組合產(chǎn)生Meta分析(確認(rèn)/初步研究)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析平均值用截?cái)嘀礟<0.05通過(guò)Mann-Whitney測(cè)試比較不同患者組的平均值(GraphPadInStat版本3.0)。第1天的平均值結(jié)果與第3和6天的比較，第3天的結(jié)果與第6天比較。預(yù)示分析在患者死亡的情況中，通過(guò)受試者工作特征曲線(ReceptorOperatingCharacteristicCurves)檢査高水平的白介素6預(yù)測(cè)念珠菌致死或非念珠菌死亡的能力(Bewicketal2004)。這比較了死亡患者或幸存者水平以回答是否第1天最初的高水平白介素6能夠預(yù)測(cè)隨后的死亡并且這在死于念珠菌和非念珠菌死亡的患者中是否是不同的問(wèn)題。在安慰劑組中，由于循環(huán)hsp90造成的高水平白介素6持續(xù)存在，所以這應(yīng)該是預(yù)測(cè)性的。在Mycograb組中，這種hsp90將被Mycograb中和，因此最初的白介素6的水平不再是預(yù)測(cè)性的。在安慰劑組中對(duì)于總體死亡和將患者分為念珠菌和非念珠菌致死之后均進(jìn)行了檢測(cè)。在Mycograb⑧組中，非常少的患者進(jìn)行這種亞分析。死于Mycograb的確認(rèn)/初步研究中患者在第1天的平均值是235±327pg/ml，其與安慰劑組225±307pg/ml相似(表8和11)。結(jié)果比較平均值這總結(jié)于表中。表6-8總結(jié)了Mycograb⑧組的結(jié)果。表6示出的結(jié)果證明降低，當(dāng)將第1天的結(jié)果與第3天和第6天的比較時(shí)，其在所有患者和治愈組中對(duì)于初步研究組是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。表7示出的結(jié)果證明降低，當(dāng)將第1天的結(jié)果與第6天的比較時(shí)，其在所有患者和幸存者組中對(duì)于確認(rèn)研究組是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。表8示出的結(jié)果證明降低，當(dāng)將第1天的結(jié)果與第3天和第6天的比較時(shí)，其在所有患者、在第10天治愈的患者和幸存者組中對(duì)于確認(rèn)/初步研究組是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。表9至11示出在安慰劑組中水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化。表6-Mycograb⑧組的初步研究結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表7-Mycograb⑧組的確認(rèn)研究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表8-Mycograb⑧組的確認(rèn)/初步5開(kāi)究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表9-安慰劑組的初步研究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表11-安慰劑組的確認(rèn)/初步研究結(jié)果劑組I確認(rèn)和初步研究<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表10-確認(rèn)組的初步研究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)死于Mycograb⑧的確認(rèn)/初步研究中患者在第1天的平均水平是235±327pg/ml，其與安慰劑組225±307pg/ml相似(表8和11)。Mycograb幸存者的平均值253±372pg/ml比安慰劑組的147±202pg/ml略高。結(jié)果的比較基于AUROC(曲線下面積)(見(jiàn)表12)，使用GraphPadPrism4軟件通過(guò)敏感性對(duì)l-特異性的圖進(jìn)行。表12-白介素6的受試者工作特征曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>結(jié)論理想測(cè)試的AUROC為1，而隨機(jī)猜測(cè)的AUROC為0.5。這個(gè)數(shù)據(jù)證明了Mycograb⑧組具有低預(yù)測(cè)值(0.5202)。這與hsp90為Mycograb⑧所中和一致，意味著高水平白介素6改變結(jié)果的作用被抵消了。安慰劑組中非念珠菌死亡與幸存者比較時(shí)可見(jiàn)相似的圖(0.5510)。在AUROC值為0.7552的念珠菌致死中這個(gè)圖改變了。這證明在沒(méi)有Mycograb⑧中和循環(huán)hsp90時(shí)高水平白介素6導(dǎo)致由于念珠菌而造成死亡的機(jī)會(huì)大大升高。實(shí)施例4-細(xì)胞因子釋放研究為了進(jìn)一步定性細(xì)胞因子釋放與暴露于hsp90和Mycograb⑧的相關(guān)性，研究了白細(xì)胞的應(yīng)答。方法來(lái)自每個(gè)健康志愿者的新鮮肝素化的20ml血樣置于具有等體積組織培養(yǎng)基的50ml離心管中。向每個(gè)15ml離心管中加入4ml的Histopaque并將8ml的血液/培養(yǎng)基混合物加入到histopaque中。在400g離心樣品30分鐘并且除去淋巴細(xì)胞。用組織培養(yǎng)基將管中體積加滿至40ml并洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以5x1()S細(xì)胞/ml重懸于組織培養(yǎng)基中。離心后將1.5ml細(xì)胞懸液用作0時(shí)間樣品。將3ml的細(xì)胞懸液置于6孔組織培養(yǎng)平板中的每一孔中并加入測(cè)試試劑。在37°C5%C02保溫4小時(shí)和24小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在測(cè)試細(xì)胞因子TNF-a、IL-6和在24小時(shí)測(cè)試INF々前將1.5ml的上清在4'C儲(chǔ)存過(guò)夜。Mycograb的濃度(如上配制)為4嗎/ml，接近接受lmg/kg的Mycograb⑧患者的血清中的C,。測(cè)試物品血液收集自5個(gè)健康志愿者(HV6-HV10)單核細(xì)胞暴露于配制緩沖液(6)ul/ml)hsp90(50ng/ml)Mycograb(4ng/ml)和hsp90(50ng/ml)。結(jié)果結(jié)果總結(jié)于表13至16中。這證明了4小時(shí)后應(yīng)答hsp90的TNF-a的水平略微增加，24小時(shí)后應(yīng)答hsp90的水平顯著增加，而對(duì)于Mycograb則不是。在24小時(shí)對(duì)于hsp90的應(yīng)答仍比Mycograb⑧的大。INF-y的測(cè)定在24小時(shí)全是陰性。結(jié)論這個(gè)研究證實(shí)了非常低水平的hsp90(50ng/ml)誘導(dǎo)TNF-a和IL-6二者的能力，而INF-Y則不是。對(duì)于4pg/ml的Mycograb的應(yīng)答更少。表13:4小時(shí)的TNF-ocpg/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表14:24小時(shí)的TNF-apg/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表15:4小時(shí)的IL-6pg/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表16:24小時(shí)的IL-6pg/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>參考文獻(xiàn)Bewick,V.etal.CriticalCareDecember2004Vol8No6，508-512Hehlgans，T.etal.Immunology,115，1-20Matthews,R.C.etal.CurrentMolecularMedicine2005,5,403-411Miyaoka,K.etal.JournalofSurgicaResearch125,144-150(2005)Mokart,D.etal.BritishJournalofAnaesthesia94(6):767-73(2005)Ng，P.C.etal.Arch.Dis.Child.Fetal.NeonatalEd.1997;77;221-227Ng，P.C.etal.Arch.Dis.Child.Fetal.NeonatalEd.2003;88;209-213Ng,P.C.etal.Arch.Dis.Child.Fetal.NeonatalEd.2004;89;229-235Panacek，E.A.etal.CritCareMed2004Vol.32，No.11;2173-2182Saito,K.etal.ExperimentalCellResearch2005Terregino,C.A.etal.AnnalsofEmergencyMedicine,35:1,Jan2000;26-3權(quán)利要求1、hsp90蛋白的抑制劑在制備治療或預(yù)防涉及TNF-α和/IL-6的水平升高的病癥的藥物中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述病癥包括膿毒癥、SIRS或自身免疫疾病、優(yōu)選Crohn's病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎或全身性紅斑狼瘡。3、權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述膿毒癥是由于感染造成的膿毒癥。4、權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述感染是細(xì)菌或真菌感染。5、權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述膿毒癥不是真菌感染造成的。6、權(quán)利要求2或5的應(yīng)用，其中所述膿毒癥不是細(xì)菌感染造成的。7、權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述膿毒癥不是感染造成的。8、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述hsp90蛋白包含氨基酸序列XXXLXVIRKXIV，其中X是任意氨基酸(SEQIDNO:6)。9、權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述hsp90蛋白包含氨基酸序列XXILXVIXXXXX，其中X是任意氨基酸(SEQIDNO:7)。10、權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述hsp90蛋白包含氨基酸序列LKVIRK(SEQIDNO:4)。11、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述hsp90蛋白與SEQIDNO:2具有至少50%、60%、70%、80%、90%或95°/。的相同性。12、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述抑制劑包含抗體或其抗原結(jié)合片段。13、權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合或特異于具有氨基酸序列LKVIRK(SEQIDNO:4)的表位。14、權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述抗體包含SEQIDNO:1的序列。15、降低患者中TNF-a和/或IL-6水平的方法，包括給予所述患者h(yuǎn)sp90蛋白的抑制劑。16、權(quán)利要求15的方法，其中所述患者患有由于TNF-a和/或IL-6水平升高造成的病癥。17、權(quán)利要求15或16的方法，其中所述抑制劑包括抗體或其抗原結(jié)合片段。18、在患者中診斷涉及TNF-a和/或IL-6水平升高的病癥的方法，包括確定患者中循環(huán)的hsp90蛋白水平的步驟，其中所述hsp90蛋白的水平升高是存在所述病癥的指征。19、權(quán)利要求18的方法，其中所述確定患者中循環(huán)的hsp卯蛋白水平的步驟包括確定得自所述患者的樣品中hsp90蛋白的水平。20、權(quán)利要求18或19的方法，其中所述確定患者中循環(huán)的hsp90蛋白水平的步驟包括將抗體或其抗原結(jié)合片段與hsp90蛋白結(jié)合。21、權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的方法，其中所述病癥包括膿毒癥、SIRS或自身免疫疾病優(yōu)選Crohn's病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎或全身性紅斑狼瘡。22、權(quán)利要求21的方法，其中所述膿毒癥是由于感染造成的膿毒癥。23、權(quán)利要求22的方法，其中所述感染是細(xì)菌或真菌感染。24、權(quán)利要求21的方法，其中所述膿毒癥不是真菌感染造成的。25、權(quán)利要求21或24的方法，其中所述膿毒癥不是細(xì)菌感染造成的。26、權(quán)利要求21的方法，其中所述膿毒癥不是感染造成的。27、權(quán)利要求15-26任一項(xiàng)的方法，其中所述hsp90蛋白包含氨基酸序列XXXLXVIRKXIV，其中X是任意氨基酸(SEQIDNO:6)。28、權(quán)利要求15-26任一項(xiàng)的方法，其中所述hsp卯蛋白包含氨基酸序歹ijXXILXVIXXXXX，其中X是任意氨基酸(SEQIDNO:7)。29、權(quán)利要求15-26任一項(xiàng)的方法，其中所述hsp90蛋白包含氨基酸序歹!jLKVIRK(SEQIDNO:4)。30、權(quán)利要求15-29任一項(xiàng)的方法，其中所述hsp90蛋白與SEQIDNO:2具有至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的相同性。31、權(quán)利要求17或20的方法，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合或特異于具有氨基酸序列LKVIRK(SEQIDNO:4)的表位。32、權(quán)利要求31的方法，其中所述抗體包含SEQIDNO:1的序列。全文摘要本發(fā)明涉及hsp90蛋白的抑制劑在制備用于治療或預(yù)防與TNFα和/或IL-6的水平升高相關(guān)的病癥的藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K39/395GK101365488SQ200780001898公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2007年1月5日優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日發(fā)明者J·P·伯尼,R·C·馬修斯申請(qǐng)人:紐泰克醫(yī)藥有限公司