專利名稱：一種高麗參提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高麗參提取物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肌肉萎縮是指橫紋肌營養(yǎng)不良，肌肉體積較正?？s小，肌肉纖維變細(xì)或消 失。失重、廢用和疾病均可導(dǎo)致肌肉萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致肌無力使患者失去生活能
力甚至死亡。目前，對于肌肉萎縮的預(yù)防和治療還沒有4亍之有效的方法(Bodine SC， et al. Science 294: 1704-1798,2001 )。
.骨骼肌主要由I型(慢肌)和II型(快肌)肌肉纖維組成。I型肌比II型 肌含有更多的線粒體，以氧化代謝作為主要能量來源。而II型肌主要以糖酵解 產(chǎn)生ATP,同時伴有酸性物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，II型肌更易于疲勞(Bassel-DubyR and Olson EN. A腿.Rev. Biochem. 75:19-37， 2006)。
PGC-loc是轉(zhuǎn)錄因子共活化因子，它不直接與DNA結(jié)合，而是通過與結(jié)合在 DNA上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。其功能包括，1:參與適應(yīng)性產(chǎn) 熱的調(diào)節(jié)；2:參與線粒體生成的調(diào)節(jié)；3:參與褐色脂肪細(xì)胞的分化(Puigserver P， et al. Endocrine Rewiews 24:78-90， 2003 )。最近發(fā)現(xiàn)PGC-1 oc在I型肌 中的表達(dá)高于II型肌。并且PGC-loc能促進(jìn)I型肌的生成(Lin J, et. al. Nature 418: 797 801， 2002 )。疾病和廢用性肌肉萎縮，PGC-1 oc降低，同時伴有線粒 體數(shù)量的下降，萎縮基因Atrogin-l和MuRFl表達(dá)上調(diào)。而過表達(dá)PGC-l oc能防 止肌肉纖維的變細(xì)，促進(jìn)肌肉線粒體的生成，下調(diào)萎縮基因Atrogin-l和MuRFl 的表達(dá)，發(fā)揮4氐抗肌肉萎縮的作用(SandriM， et. al. PMS 103: 16260-16265，2006. Adhihetty PJ，et.al.J Appl Physiol 102: 1143-1151,2007 )。持續(xù)性 鍛煉也能通過上調(diào)PGC-loc來促進(jìn)I型月幾的生成(Baar K, et al. FASEB， 16: 1879-1886， 2002. Norrbom J. et al. J A卯l. Physiol 96:189-194， 2004 )。 因此，上調(diào)PGC-lcc促進(jìn)I型肌的生成，防止肌肉纖維蛋白的降解，對于預(yù)防和 治療肌肉萎縮具有重要意義，但持續(xù)性鍛煉顯然有其局限性。
高麗參具有治療疾病的功能，又有強(qiáng)身健體的功能。中醫(yī)講究的是"陰陽 調(diào)和"，認(rèn)為疾病是由于寒熱失調(diào)所引起的，這些理論體系顯得過于虛幻，缺少 現(xiàn)代分子生物學(xué)研究支持。本發(fā)明以高麗參的提取物為研究對象，充分運(yùn)用分 子生物學(xué)手段展開試驗(yàn)和研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高麗參提取物及 其應(yīng)用，充分運(yùn)用了分子生物學(xué)手段，揭示了高麗參能抵抗萎縮骨骼肌中的 PGC-la的下調(diào)，促進(jìn)I型肌的生成。同時，通過抑制Atrogin-1和MuRFl的 表達(dá)，抵抗失重和廢用導(dǎo)致的肌肉纖維蛋白的降解。因此，高麗參提取物可作 為新的預(yù)防失重和廢用導(dǎo)致的肌肉萎縮的藥物，能夠有效預(yù)防失重和廢用等導(dǎo) 致的肌肉萎縮。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案 一種高麗參提取物，其特征在于
(1) 稱取高麗參，按每克高麗參中加入10-15毫升水的比例加水后燒開， 再用文火煎煮20—30分鐘，留取上清，并吹干制成干粉，
(2) 加水調(diào)節(jié)濃度，每1.5—2.5克干粉加入1ml水，得到高麗參提取液。 所述的高麗參為紅參。
'上述高麗參提取物的應(yīng)用，用于制備預(yù)防和治療失重、廢用導(dǎo)致的肌肉萎
縮的藥物。
本發(fā)明的有益效果
首次闡明了高麗參提取物具有抵抗肌肉萎縮時PGC-la表達(dá)的下調(diào)和萎縮 基因atrogin-1和MuRF-l表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)II型肌纖維向I型肌纖維轉(zhuǎn)變， 防止肌肉纖維變細(xì)及重量減輕。該結(jié)果表明高麗參能有效預(yù)防失重和廢用導(dǎo)致 的肌肉萎縮。
本發(fā)明通過灌胃尾部懸吊造成后肢無負(fù)荷的肌肉萎縮模型大鼠，分離腓腸 肌、比目魚肌和趾長伸肌，測定肌肉的重量、PGC-la和肌肉類型標(biāo)志基因的表 達(dá)。近一步證明高麗參提取物能有效防止失重和廢用導(dǎo)致的骨骼肌組織中 PGC-la和I型肌標(biāo)志基因表達(dá)的下調(diào)，以及萎縮基因的上調(diào)，更為重要的是高 麗參提取物能有效預(yù)防失重和廢用導(dǎo)致的肌肉重量的減輕和肌肉纖維變細(xì)。


圖1為懸吊給藥大鼠比目魚肌重量的變化；
圖2為懸吊給藥大鼠14曰后，比目魚肌形態(tài)(圖2A圖)及橫截面積(圖 2B圖的變化；
圖3為懸吊給藥大鼠14日后，Western blot檢測腓腸肌(Gas )、比目魚 肌(Sol)和跖肌(PI) I型肌標(biāo)志蛋白troponin I (slow)的變化；
圖4為懸吊給藥大鼠比目魚肌3種基因mRNA水平表達(dá)的變化，圖4A: PGC-la;圖4B: MHC-I ( I型肌標(biāo)志基因)；圖4C: MHC-IIb(II型肌標(biāo)志基因)；
圖5為懸吊給藥大鼠2種導(dǎo)致肌肉萎縮基因mRNA水平表達(dá)的變化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述高麗參提取物為紅參提取物。
高麗參的提取和濃縮過程高麗參加水(10-15毫升水/克高麗參)燒開后， 文火煎煮30分鐘，留取上清，殘淹重復(fù)上述過程一次，并吹干制成干粉，加水 調(diào)節(jié)濃度，每2克干粉加入1毫升水，得到高麗參藥液，于4。C保存?zhèn)溆谩?下面通過試驗(yàn)闡述本發(fā)明的應(yīng)用
高麗參藥液灌胃尾部懸吊造成后肢無負(fù)荷的肌肉萎縮模型大鼠(200克左 右Wistar大鼠)按1亳升/只的量每日灌胃一次，共28日。發(fā)現(xiàn)高麗參能有 效預(yù)防失重和廢用導(dǎo)致的肌肉萎縮。本模型為公認(rèn)的模仿失重所造成的肌肉萎 縮的動物模型。
試驗(yàn)用材料與來源 i式劑Trizol購于Invitrogen 7〉司；M—MLV逆舉爭錄酵購于Promega公司； Tag酶購于TaKaRa公司；ECL增敏化學(xué)發(fā)光底物為Santa Cruz試劑；羊抗 Troponin-1 (slow)購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG 為北京中山生物/>司產(chǎn) 品。
儀器ABI Prism 7000 Sequence Detection System PCR儀；Bio-radmini 電泳儀。
實(shí)施例
1. 高麗參的提取和濃縮過程取高麗參5000克加水(10-15毫升水/克高 麗參)燒開后，文火煎煮30分鐘，留取上清，殘渣重復(fù)上述過程一次，并吹干 制成干粉，加水調(diào)節(jié)濃度，每2克干粉加入1毫升水，得到高麗參藥液，于4 匸保存?zhèn)溆谩?br> 2. 動物模型及樣品準(zhǔn)備60只200克左右Wistar大鼠在動物房內(nèi)飼養(yǎng) 一周后，隨機(jī)分為地面對照組，尾部懸吊組，地面灌藥組，尾部懸吊灌藥組。
尾懸吊方法使大鼠后肢剛好離地，身體與地面的傾斜角度大約為30° 。大鼠可 以在鼠籠內(nèi)頭低位自由活動、攝食和飲水。動物均單籠飼養(yǎng)，室溫保持在23± 2'C，每日保持12小時光照。于實(shí)驗(yàn)第3， 7， "， 21, 28天，取大鼠后月支背側(cè) 腓腸肌、比目魚肌和跖肌，剪除多余脂肪及筋膜，稱重。凍存于液氮中，待樣 本齊全后共同提取RNA及蛋白。
3.組織RM的提取、RT-PCR和rea卜time PCR取適量組織加lml Trizol 研磨充分，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，室溫放置30分鐘后，加入200ial氯仿強(qiáng)烈 振蕩，室溫放置2-3分鐘，4'C，12000g離心15分鐘，小心吸取上清至另一潔 凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，4。C，U000g離心10分鐘，棄上 清，75%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，適量DEPC水溶解，紫外分光法檢測濃度和 純度。2 jag RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為25jul，含2jugRNA, lmM dNTP， RNA 酶抑制劑1 U/|il, 01ig(dT)15引物2. 5 pmol/|il, M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶8 U/p 1， 輕輕混勻，42°C 90分鐘，95。C10分鐘，水上放置2分鐘，所得cDNA可用于 real-time PCR。 real—time PCR為20jal反應(yīng)體系，應(yīng)用Sybr green染料法， Mix購于天根生化科技有限公司。所用引物序列Atroginl:上游5， GCAGAGAGTCGGCAAGTC 3，，下游5，CAGGTCGGTGATCGTGAG 3，(退火溫度58 °C ) ; MuRFl : 上游5 ， CAACCTGTGCCGCAAGTG 3 ，， 下游5 ， CAACCTCGTGCCTACAAGATG 3，(退火溫度62°C ) ;PGC-1 oc:上游5， AAAGGATGCGCTCTCGTTCA 3，，下游5， GGAATATGGTGATCGGGAACA 3，(退火溫 度58 °C) ; GAPDH:上游5， TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3，下游5， AGATCCACAACGGATACATT 3， (退火溫度60°C ) 。
PCR反應(yīng)條件95°C5分 鐘，95°C30秒-不同退火溫度(見各基因引物后的退火溫度)30秒-72匸30秒 (40個循環(huán))72。C延伸3分鐘。
4. 蛋白質(zhì)的提取及Western blot 50-100mg肌肉組織加入到lmL組織裂解 液中(lMTris， 0. 5MEDTA， 5M NaCl， 10% Briji 96， NP40，使用時加入PMSF、 Leup印tin和Aprotinin，終濃度分另'j為100jig/ml、 2 n g/ml和2 |u g/ml )于 冰上充分勻漿。水上裂解30分鐘。4'C，12000g離心20分鐘。留取上清。常規(guī) SDS-PAGE電泳，80jig/孔。電泳完畢，以1. 25mA/cii^恒流半干轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后， 5%脫脂奶粉室溫封閉2小時。加一抗4'C過夜。洗膜3次。加二抗，室溫2小 時。洗膜3次，ECL顯色。
5. 冰凍切片的制備及肌肉纖維直徑的變化將新鮮組織放置于包埋劑中， 置于用液氮預(yù)冷的異戊烷中0. 5-l分鐘，待包埋劑變成乳白色，切片。將切片 放置丙酮中固定5分鐘，-20。C保存。將切片依次用抗兔抗Laminin(Calbiochem 公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (北京中山生物公司)二抗處理，顯 色后拍照。ITP軟件分析肌肉纖維直徑的變化。
如圖1-圖5所示，圖1為懸吊給藥大鼠比目魚肌重量的變化(Con:對照 組；Drug:給藥組，以下相同)。給藥組肌肉重量降低明顯低于對照。
圖2為懸吊給藥大鼠14日后，比目魚肌形態(tài)(A圖)及4黃截面積(B圖，ground 為地面組，unloading為懸吊組)的變化。高麗參有效保護(hù)后肢懸吊所導(dǎo)致的肌 肉萎縮。
圖3為懸吊給藥大鼠14日后，Western blot檢測腓腸肌(Gas )、比目魚 肌(Sol)和跖肌(PI)I型肌標(biāo)志蛋白troponin I (slow)的變化。高麗參能有效 刺激比目魚肌和跖月幾troponin I (slow)的表達(dá)。
圖4為懸吊給藥大鼠比目魚肌3種基因mRNA水平表達(dá)的變化。A: PGC-la;
B: MHC-I (I型肌標(biāo)志基因)；C: MHC-IIb (II型肌標(biāo)志基因)。高麗參能有效 預(yù)防后肢懸吊所導(dǎo)致的PGC-la和MHC-I的下調(diào)以及MHC-IIb的上調(diào)。
圖5為懸吊給藥大鼠2種導(dǎo)致肌肉萎縮基因mRNA水平表達(dá)的變化。與對照 組相比較，高麗參能有效抑制后肢懸吊所導(dǎo)致的atrogin-1 (圖5A)和MuRF-l (圖5B)的mRNA表達(dá)的上調(diào)。
本發(fā)明通過對人體的臨床試驗(yàn)對高麗參提取物的應(yīng)用作進(jìn)一步的驗(yàn)證 6名志愿者，隨機(jī)分為2組，每組3名(其中A組為對照組，B組為服藥組 每次服用2. 5-3. 5ml高麗參提取物藥液，每日3次)，按30天為一個療程進(jìn)行 地面人體臥床實(shí)驗(yàn)，兩組人員均預(yù)先在小腿部圍徑最大處作標(biāo)記，以備實(shí)驗(yàn)期 間測量。用皮尺測量臥床前(-7天)、臥床中(1, 5， 10, 18， 22， 29天)和 臥床后(2天)人體下肢小腿圍徑的動態(tài)變化，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果如下
表30天臥床小腿圍徑的變化(mm)
controlbr-ldaybr-5daybr-10daybr-18daybr-22daybr-29dayR+2day
A333. 2±332. 6±329. 4 ±324. 0±320. 0±317. 2±315. 8±315. 5±
組19. 1821.0420. 39*21.12**18. 26**17. 69氺*承20. 17承氺承20. 06***
B335. 8 ±335. 3 ±334. 9±333. 7±330, 6±328. 8 ±326. 2 ±326. 1±
組16.8111,7813.9812, 37承13. 14*11.08*13. 03**10. 45*
*p<0.05，氺承p〈0.01，氺氺承p〈0. 001， as compared with control .以往實(shí)驗(yàn)和理論已證明，隨著模擬失重時間的延長，下肢肌萎縮程度逐漸
增加，該實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果與其相一致。兩組受試人員自身臥床前后小腿圍徑測試
結(jié)果顯示，隨著臥床時間的延長，受試人員的小腿圍徑值逐漸減小，其中A組
人員受試前與臥床29天后對比有顯著性差異(P = 0. 0005， P復(fù)畫5)， B組人
員受試前與臥床29天后對比雖然也有顯著性差異(P = 0.009, P<0.01),但其
肌萎縮發(fā)生時間較A組明顯延后且其萎縮程度明顯減輕。
本發(fā)明中的高麗參提取物的藥液最好在4攝氏度的環(huán)境中，保質(zhì)期可達(dá)3 個月，而且根據(jù)病人肌肉萎縮程度的不同，服用量和療程可作適當(dāng)?shù)淖儞Q。
權(quán)利要求
1.一種高麗參提取物，其特征在于(1)稱取高麗參，按每克高麗參中加入10-15毫升水的比例加水后燒開，再用文火煎煮20-30分鐘，留取上清，并吹干制成干粉，(2)加水調(diào)節(jié)濃度，每1.5-2.5克干粉加入1ml水，得到高麗參提取液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高麗參提取物，其特征在于，所述的高麗 參為紅參。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高麗參提取物，其特征在于，所述的留取 上清后的殘渣可以重復(fù)使用 一次。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高麗參提取物用于制備預(yù)防和治療失重、廢用 導(dǎo)致的肌肉萎縮的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種高麗參提取物及其應(yīng)用，(1)稱取高麗參，按每克高麗參溶液中加入10-15毫升水的比例加水后燒開，再用文火煎煮20-30分鐘，留取上清，并吹干制成干粉，(2)加水調(diào)節(jié)濃度，每1.5-2.5克干粉加入1ml水，得到高麗參提取液。該藥液可用于制備預(yù)防和治療失重、廢用導(dǎo)致的肌肉萎縮的藥品。
文檔編號A61K36/258GK101181325SQ20071017750
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者姜世忠, 孫國勛, 鵬 張, 張辰宇, 白延強(qiáng), 陳曉萍 申請人:中國航天員科研訓(xùn)練中心