專利名稱：：一種胰蛋白酶抑制劑的滅菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種胰蛋白酶抑制劑制品的滅菌方法，特別是一種利用超高壓滅菌的方法。
背景技術(shù)：
：胰蛋白酶抑制劑(Trypsininhibitor,TI)普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，如抑肽酶(aprotinin)、人尿胰蛋白酶抑制劑(urinaiytrypsininhibitor,UTI)、大豆胰蛋白酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor,SBTI)、南瓜胰蛋白酶抑制劑(Cucurbitamaximatrypsininhibitor,CMTI)等。目前多數(shù)已開發(fā)的TI來源于人和動(dòng)物，如人尿胰蛋白酶抑制劑、抑肽酶等，但由于其分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以對(duì)其提取分離、研究合成并進(jìn)一步開發(fā)；且在發(fā)揮治療作用的同時(shí)存在諸多缺點(diǎn)，如易受到病原微生物如病毒等的污染，且可引起過敏反應(yīng)等。為了克服動(dòng)物來源TI的缺點(diǎn)，人們將目光轉(zhuǎn)向了品種繁多的植物，并已從多種植物組織中發(fā)現(xiàn)并提取了各類TI。植物來源的TI具有分子量較小、在自然界的含量豐富、活性明確的優(yōu)點(diǎn)。研究證明，這些TI對(duì)胰蛋白酶、血漿激肽釋放酶、凝血酶、血纖維溶解酶、凝血因子Xa、凝血因子XIIa等都具有較強(qiáng)的抑制作用(OtlewskiJ，JaskolskiM,BuczekO,etal,Structure-functionrelation-shipofserineprotease-proteininhibitorinteraction,說'oc/w'mPo/,2001，48(2):419-28)。Sporamin就是一禾中胰蛋白酶抑帝!j齊iJ(Y.H丄in.Trypsininhibitorsofsweetpotato:reviewandprospect,in:Y.I.Hsing,C.H.Chou(Eds),RecentAdvancesinBotany,AcademiaSinicaMonographSeriesNo.13,Taipei,1993:179-185)，是甘薯特有的一種儲(chǔ)藏性蛋白質(zhì)，占?jí)K根可溶性蛋白質(zhì)的60%-80%(Maeshima.M.;Sasaki,T.;Asahi,T.Characterizationofmajorproteinsinsweetpotatotuberousroots,尸/j;toc/^m;s^v,1985,24:1899-1902)。與Sporamin具有同源性的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制劑，具有抗腫瘤的功效。此外，Sporamin還具有在抗蟲'性(K.-W.Yeh,M.-I丄in,S.-J.Tuan.Sweetpotato(Ipomoeabatatas)trypsininhibitorexpressedintransgenictobaccoplantsconferresistanceagainstSpodopteralitura,戶/a"/Ce〃i印or"，1997，16:696-699)，以及抗氧化活性(Wen-ChiHou.etal.Glutathioneperoxidase陽likeactivityof33kDatrypsininhibitorfromrootsofsweetpotato(IpomoeabatatasL.Lam'Tainong57，).P/咖5We臟，2004,166:1541-1546;Wen-ChiHou,Yaw陽HueiLin.Polyamine-boundtrypsininhibitorsinsweetpotatostorageroots,sproutedrootsandsprouts.PlantScience.1997.126:11-19)，且Sporamin的分子量比人血清中廣泛存在的間a胰蛋白酶抑制劑(分子量45000-55000，正常人血清中含量約為0.4g/L)小，因此，Sporamin作為一種新型的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥品或保健食品，在未來醫(yī)療及保健食品領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前學(xué)盡管甘薯中的胰蛋白酶抑制劑在7(TC下具有活性穩(wěn)定性，但在13(TC條件下保持30min即可完全破壞TI的活性(Chein,S.L.andP.K.Lee.Theeffectofphysicaltreatmentontheavailablelysineandtrypsininhibitorofsweetpotato,ra/麗wZi薦tocA:，1980,13:75-84)。因此，若采用高溫滅菌的方法，會(huì)使胰蛋白酶抑制劑制品的活性被鈍化；而采用膜濾除菌技術(shù)則存在著設(shè)備昂貴、處理量小和膜不易于清洗等問題。為此，亟待開發(fā)出一種既能有效地抑制制品微生物指標(biāo)，又能有效地保持其活性的滅菌新方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種胰蛋白酶抑制劑的滅菌方法。本發(fā)明提供的方法是將胰蛋白酶抑制劑置于200-800MPa條件下進(jìn)行滅菌。上述滅菌方法中，滅菌壓力優(yōu)選為200-600MPa，更優(yōu)選為600MPa。本發(fā)明提供的滅菌方法對(duì)溫度沒有限制，常溫下即可操作，在25-5(TC下進(jìn)行滅菌即可達(dá)到本發(fā)明的目的，該滅菌溫度優(yōu)選25"C。該滅菌方法中，瞬時(shí)滅菌即可達(dá)到滅菌效果，但將滅菌時(shí)間控制在l個(gè)小時(shí)以內(nèi)可達(dá)到更好的滅菌效果，且不會(huì)引起胰蛋白酶抑制劑失活。該滅菌時(shí)間優(yōu)選5-60分鐘，更優(yōu)選為20-60分鐘。在實(shí)際滅菌處理過程中，一般可將上述胰蛋白酶抑制劑用pH值為6.0-8.0的緩沖液配制成濃度為10-100mg/ml的溶液。該緩沖液為Tris-HCl緩沖液或磷酸緩沖液。本方法適用于各種具有胰蛋白酶抑制劑活性的動(dòng)植物制品，比較常用的有甘薯蛋白Sporamin胰蛋白酶抑制劑制品、大豆胰蛋白酶抑制劑制品等。本發(fā)明提供的滅菌方法，不僅可以保持樣品溶液中胰蛋白酶抑制劑的活性不發(fā)生顯著性變化，而且能夠起到很好的滅菌作用，使樣品溶液中的微生物含量符合保健食品通用衛(wèi)生要求(1996年7月18日衛(wèi)生部文件衛(wèi)監(jiān)發(fā)[1996]第38號(hào)發(fā)布)，即菌落總數(shù)(cfii/g.mL)$1000、大腸菌MPN(100g.mL)￡40、霉菌(cfti/g.mL)^10、酵母(cfu/g,mL)30、無致病菌。該方法還具有工藝簡便、生產(chǎn)成本較低、處理量大的優(yōu)點(diǎn)。圖1為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖2為加壓(600MPa，25°C，20min)與未加壓處理?xiàng)l件下濃度對(duì)Sporamin胰蛋白酶抑制劑活性的影響。圖3為滅菌壓強(qiáng)對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響；加壓條件200-600MPa，20min，25°C，溶液濃度0.6mg/ml;O.lMPa表示未加壓狀態(tài)。圖4為滅菌時(shí)間對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響；加壓條件600MPa，25°C，溶液濃度0.6mg/ml。圖5為加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響；加熱條件70-100°C，20min，溶液濃度0.6mg/ml;O表示未加熱狀態(tài)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明滅菌方法是將胰蛋白酶抑制劑在高壓下進(jìn)行滅菌，即能達(dá)到良好的滅菌效果，并能夠很好地保持其活性。整個(gè)滅菌過程，只需將所處理樣品放入介質(zhì)中，在一定的壓力下保持一段時(shí)間，就能產(chǎn)生與加熱處理一樣使酶、蛋白質(zhì)、淀粉等生物高分子物質(zhì)失活、變性及糊化，同時(shí)殺死微生物。由于高壓處理僅會(huì)引發(fā)生物高分子中氫鍵之類弱結(jié)合鍵的變化，不會(huì)破壞其中的共價(jià)鍵。因而與其他方法相比，能達(dá)到很好的滅菌效果，并能保持樣品的生物活性。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的滅菌方法作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。以甘薯胰蛋白酶抑制劑Sporamin為例，在利用本發(fā)明提供的高壓滅菌方法對(duì)其進(jìn)行處理之前，需要將其從甘薯中進(jìn)行分離純化，其具體方法如下1、制備甘薯粗蛋白將甘薯洗凈、去皮、切成條，再將其與含有0.1MNaCl的0.05MTris-HCl(pH值為7.5)緩沖液以1.5:l(v/g)比例混合，均質(zhì)后，以3,000g速度離心(LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠)30min，離心兩次，取其上清液，在冰浴條件下一邊攪拌一邊加入固體(NH4)2SO4至60。/。的飽和度，靜置至少lh后，在10,000g(TGL-16M型低溫高速離心機(jī)，湘儀儀器廠)條件下離心30min，得到的沉淀即為甘薯粗蛋白。2、制備甘薯胰蛋白酶抑制劑Sporamin將甘薯粗蛋白用一定量含有0.1MNaCl、lmMEDTA的0.05MpH值為7.5的Tris-HCL緩沖液溶解后，透析過夜，然后在10,000g條件下離心30min，再用0.22|im的微孔濾膜過濾，濾液用DEAE-纖維素(DEAE-52，2.6x20cm)離子交換柱和SephadexG-75凝膠柱純化，制備Sporamin。DEAE-52柱先用含有0.1MNaCl和lmMEDTA的0.05MpH值為7.5的Tris-HCL緩沖液平衡3個(gè)柱體積，上樣后先用平衡液洗脫，在280nm波長紫外檢測(cè)儀(HD-3，上海滬西分析儀器廠)下檢測(cè)，待有蛋白檢出后，將NaCl的濃度增加至0.2mM，并用電腦全自動(dòng)部分收集器(DBS-IOO，上海滬西分析儀器廠)收集，用電泳(AE-6450,日本ATTO公司)檢測(cè)各部分的蛋白情況，合并含有Sporamin的洗脫峰。取一定量該溶液再上樣到凝膠過濾層析(SephadexG-75，25mmx600mm)柱中，上樣前用含有O.lMNaCl和lmMEDTA的0.05MpH值為7.5的Tris-HCL緩沖液平衡3個(gè)柱體積，洗脫溶液與平衡溶液相同，收集洗脫液，并用電泳分析各部分吸收峰的蛋白構(gòu)成情況，合并含有Sporamin的洗脫液，置于-40。C冰箱(BD-255LTA，青島海爾特種電冰柜有限公司)中保存?zhèn)溆?。其中，?duì)胰蛋白酶抑制劑活性染色的方法如下對(duì)純化后的Sporamin胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳(AE-6450,日本ATTO公司)完成后，膠片浸于0.1MpH值為7.5的磷酸緩沖液中震蕩lh。然后將膠片在37"C下浸于胰蛋白酶溶液中l(wèi)h(8mg胰蛋白酶/100ml磷酸緩沖液，O.IM、pH值為7.5)。用去離子水漂洗后膠片浸入新配的160ml底層染液中37。C在黑暗中靜置30min。(底層染液40mgAPNE溶于16ml二甲基甲酰胺中，加入含有80mg固蘭B鹽的144ml0.1M磷酸緩沖液至160ml)。染色后用蒸餾水漂洗膠片。該電泳結(jié)果如圖l所示，其中，圖la為考馬斯亮蘭染色，圖lb為胰蛋白酶抑制劑活性染色；其中'T，為P-乳球蛋白，"2"為大豆胰蛋白酶抑制劑，"3"為Sporamin，"4"為加熱處理的Sporamin(IO(TC;20min)，"5，，為加壓處理的Sporamin(600MPa;20min)，"6"為甘薯粗蛋白粉。由圖1可知，與甘薯中的其他蛋白相比，Sporamin具有的胰蛋白酶抑制劑活性較強(qiáng)。本發(fā)明中對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性進(jìn)行測(cè)定的方法如下a、標(biāo)樣分析在裝有l(wèi).Oml含有1%酪蛋白(35°C，5min)、pH值為7.6的磷酸緩沖液的試管中加入0.5ml雙蒸水，l.Oml胰蛋白酶溶液；其中，該胰蛋白酶溶液是將8mg胰蛋白酶溶解在100ml0.25mMHC1中得到的。在37'C條件下水解反應(yīng)20min，然后加入3.0mllO。/。的TCA終止反應(yīng)，離心后，取上清液于25。C條件下放置至少1小時(shí)，用紫外分光光度計(jì)(U-3010紫外分光光度計(jì)，日本HITACHI)在280nm波長下測(cè)定其吸光值。b、對(duì)照分析將0.3ml胰蛋白酶抑制劑和0.2ml雙蒸水、1.0mliy。的酪蛋白在37"C保溫15min，然后再加入l.Oml雙蒸水，混勻后再在37"C條件下水解反應(yīng)20min，終止反應(yīng)和檢測(cè)分析方法同標(biāo)樣分析。C、樣品分析將0.3ml胰蛋白酶抑制劑和0.2ml雙蒸水、1.0ml1%的酪蛋白在37。C保溫15min，然后再加入l.Oml胰蛋白酶溶液，水解反應(yīng)按照標(biāo)樣分析的方法進(jìn)行。胰蛋白酶的抑制活性可用抑制百分率來表示，其計(jì)算公式如下抑制百分率=(A280標(biāo)樣+A280對(duì)照-A280樣品)/A280標(biāo)樣xl00y。。本發(fā)明實(shí)施例中所用超高壓設(shè)備的型號(hào)為UHPF/320ml/0-800MPa，由包頭科發(fā)新型高技術(shù)食品機(jī)械有限責(zé)任公司制造。實(shí)施例l、胰蛋白酶抑制劑的加壓滅菌及其微生物檢測(cè)將幾種不同的蛋白粉配成50mg/ml的溶液后，在1000xg,5'C下離心30min，取上清液分成兩份，一份用于測(cè)定胰蛋白酶活性和微生物指標(biāo)。另一份在600MPa、25°C條件下，加壓60min后，測(cè)定胰蛋白酶抑制劑活性和微生物指標(biāo)。其中，菌落總數(shù)參照GB/T4789.2-2003檢測(cè)方法進(jìn)行；大腸菌群的總數(shù)參照GB/T4789.3-2003檢測(cè)方法進(jìn)行；霉菌和酵母菌參照GB/T4789.15-2003檢測(cè)方法進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。表1中，甘薯粗蛋白為按上述方法制備的甘薯粗蛋白，其中蛋白含量約70%、水分含量約6%、灰分約3%、粗纖維4%。大豆分離蛋白粉購自鄭州金海博源食品有限公司，其中蛋白含量約84%、水分含量約7%、灰分約6%、粗纖維約5%。表1、加壓與未加壓處理的胰蛋白酶抑制劑的活性和微生物檢驗(yàn)結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>已有的研究表明，甘薯可溶性蛋白就是一種胰蛋白酶抑制劑并具有抑制劑活性，而甘薯粗蛋白中大部分是由可溶性蛋白所構(gòu)成，因此，甘薯粗蛋白溶液也具有胰蛋白酶抑制劑活性。此外，大豆蛋白酶抑制劑是一類小分子量的蛋白質(zhì)或多肽構(gòu)成，研究表明，占大豆分離蛋白約15%的2S成分由Bowman-Birk型和Kunitz型胰蛋白酶抑制劑構(gòu)成，并具有胰蛋白酶抑制劑活性。由表1可知，加壓處理不僅能極顯著降低樣品中的菌落總數(shù)，使其微生物的含量符合國家保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)GB16740-1997，而且能夠保持胰蛋白酶抑制劑活性不發(fā)生顯著性的變化。并且，這種處理方法不僅對(duì)于純度高的胰蛋白酶抑制劑適用，同樣也適用于一些純度較低的胰蛋白酶抑制劑制品。由此可見，加壓處理是一種保持胰蛋白酶抑制劑活性的、安全有效的滅菌方法。實(shí)施例2、滅菌過程中胰蛋白酶抑制劑濃度對(duì)其活性的影響將純化后的甘薯蛋白Sporamin分別稀釋為3、2、1、0.6、0.3、0.2、0.15、0.1mg/ml不同濃度的溶液，在600MPa、25"C的條件下保持20min，測(cè)定Sporamin胰蛋白酶劑的活性。圖2即為Sporamin的濃度與胰蛋白酶抑制百分率的關(guān)系圖。由該圖可知，Sporamin濃度不同，其對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響程度也有差異。在0.1mg/ml時(shí)，Sporamin對(duì)于胰蛋白酶(80ng/ml)的抑制率可以達(dá)到50%;Sporamin濃度在0.1-0.3mg/mi之間時(shí)，提高Sporamin的濃度，其對(duì)胰蛋白酶的抑制率明顯增加；在0.6mg/ml時(shí)其抑制率可達(dá)到90%。但在0.6-3mg/ml濃度之間時(shí)，Sporamin對(duì)于胰蛋白酶的抑制率變化不明顯。采用與Sporamin完全相同的實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定大豆胰蛋白酶抑制劑的活性，其變化趨勢(shì)與Sporamin相同。實(shí)施例3、滅菌壓強(qiáng)對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響在溫度為25X:的條件下，分別在200MPa、300MPa、400MPa、500MPa和600MPa壓力下，對(duì)濃度為0.6mg/ml的甘薯蛋白Sporamin胰蛋白酶抑制劑溶液加壓20min，測(cè)定不同壓強(qiáng)對(duì)該胰蛋白酶抑制活性的影響。采用與Sporamin完全相同的實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定大豆胰蛋白酶抑制劑的活性。圖3即為不同壓強(qiáng)對(duì)甘薯蛋白Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制劑活性影響的關(guān)系圖。由圖3可知，在200600MPa的壓力條件下加壓20min，對(duì)Sporamin和大豆的胰蛋白酶抑制劑活性沒有顯著性影響。實(shí)施例4、滅菌時(shí)間對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響在600MPa下，分別對(duì)濃度為0.6mg/ml的Sporamin胰蛋白酶抑制劑溶液加壓20min、30min、40min、50min、60min，測(cè)定該加壓滅菌時(shí)間對(duì)Sporamin胰蛋白酶抑制劑活性的影響。采用與Sporamin完全相同的實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定大豆胰蛋白酶抑制劑的活性。圖4即為滅菌時(shí)間對(duì)Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制劑活性影響的關(guān)系圖。由圖4可知，在600MPa的壓力條件下，連續(xù)滅菌20min、40min和60min，同不加壓的樣品相比，Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制劑的活性也均沒有顯著性變化。由此可推斷，600MPa的壓力仍沒有達(dá)到導(dǎo)致胰蛋白酶抑制劑變性的臨界壓力，在此壓力范圍內(nèi)，提高加壓強(qiáng)度或延長加壓滅菌時(shí)間不會(huì)改變胰蛋白酶抑制劑活性。對(duì)比例1、加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響分別在60°C、70°C、80°C、卯。C、IO(TC條件下對(duì)濃度為0.6mg/ml的Sporamin溶液加熱20min，測(cè)定加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響。采用與Spommin完全相同的實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定大豆胰蛋白酶抑制劑的活性。圖5即為不同加熱溫度對(duì)Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制劑活性影響的關(guān)系圖。由圖5可知，加熱溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響較大。與不加熱的樣品相比，在7(TC的條件下滅菌20min，Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制劑活性沒有發(fā)生顯著性變化；但在8(TC的條件下滅菌20min，二者胰蛋白酶抑制劑的活性均極顯著下降；并且隨著溫度的升高，胰蛋白酶抑制劑活性呈繼續(xù)下降的趨勢(shì)。說明，溫度過高會(huì)造成甘薯蛋白Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制劑活性的鈍化。權(quán)利要求1、一種胰蛋白酶抑制劑的滅菌方法，是將所述胰蛋白酶抑制劑置于200-800MPa條件下進(jìn)行滅菌。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述滅菌壓力為200-600MPa。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述滅菌壓力為600MPa。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述滅菌溫度為25-5(TC。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述滅菌溫度為25"C。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述滅菌時(shí)間為l個(gè)小時(shí)之內(nèi)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述滅菌時(shí)間為5-60分鐘。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述滅菌時(shí)間為20-60分鐘。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在滅菌過程中，可先將所述胰蛋白酶抑制劑用pH值為6.0-8.0的緩沖液配制成濃度為10-100mg/ml的溶液。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述緩沖液為Tris-HCl緩沖液或磷酸緩沖液。全文摘要本發(fā)明公開了一種胰蛋白酶抑制劑制品的滅菌方法。該方法是將胰蛋白酶抑制劑置于200-800MPa條件下進(jìn)行滅菌。其中，滅菌壓力優(yōu)選為200-600MPa，更優(yōu)選為600MPa，滅菌溫度為25-50℃，滅菌時(shí)間為5-60分鐘，優(yōu)選20-60分鐘。本發(fā)明提供的滅菌方法，不僅可以保持樣品溶液中胰蛋白酶抑制劑的活性不發(fā)生顯著性變化，而且能夠起到很好的滅菌作用，使樣品溶液中的微生物含量符合保健食品通用衛(wèi)生要求，其中的菌落總數(shù)，大腸菌群、霉菌和酵母菌的檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到衛(wèi)生要求，且無致病菌檢出。該方法在食品加工領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。文檔編號(hào)A61L2/02GK101195033SQ20071017734公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日發(fā)明者木泰華,郁李申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所