專利名稱：能防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白復(fù)合劑的生產(chǎn)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥與飼料添加劑領(lǐng)域，具體是指特效防治家禽呼吸道疾病的 免疫球蛋白與野馬追等復(fù)合制劑的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明特別適用于家禽呼吸道疾病的預(yù)防和治療，同時(shí)也適用于各種家畜 與寵物等動(dòng)物呼吸道疾病的防治。
(二)
背景技術(shù)：
家禽上呼吸道感染是指家禽上呼吸道受病原微生物侵襲所致的疾病。家禽 (以雞為例)常見呼吸道病主要由病毒、細(xì)菌和敗血霉形體等引起，其臨床的 主要特征為流淚、流鼻涕、咳嗽、氣喘、羅音和呼吸困難、眼腫。常見有傳染 性喉氣管炎和傳染性支氣管炎等，該病多發(fā)生于春季的3 6月份，病傳播快， 感染率高，死亡率與環(huán)境、管理及雞的個(gè)體健康狀況有關(guān)， 一般其死亡率一般 在10% 40%，繼發(fā)性感染死亡率則更高，產(chǎn)蛋率下降20%左右，甚者下降50 %，此類疾病對(duì)雞的生產(chǎn)性能，甚至對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展危害極大。
家禽傳染性呼吸道疾病對(duì)家禽的生產(chǎn)性能，對(duì)家禽業(yè)的發(fā)展危害極大，目 前較理想的治療藥物尚不多，常用的西藥不但價(jià)格貴，而且主要以抗菌素和糖 皮質(zhì)激素為主，有一定的副作用。據(jù)國(guó)外學(xué)者的一項(xiàng)專題調(diào)査統(tǒng)計(jì)，南美北部 的養(yǎng)雞戶中，呼吸道疾病的治療支出費(fèi)用占雞所有疾病總支出的59%，其中死 亡支出為46.56%，藥物支出占治療費(fèi)用的65%。
家禽呼吸道病主要是指家禽呼吸道感染性病癥，如家禽慢性呼吸道病、傳 染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、曲霉菌病等。這些常見、多發(fā)的傳染性疾病， 嚴(yán)重的影響了家禽生長(zhǎng)發(fā)育，以至造成大批死亡，給家禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。 防治此類疾病，由于多采用抗生素和化學(xué)藥物，且由于應(yīng)用的不規(guī)范、不合理， 經(jīng)長(zhǎng)期應(yīng)用后，除了藥物毒性較大容易造成藥物中毒以外，還導(dǎo)致抗藥性和藥 物在禽蛋產(chǎn)品中的殘留，被人攝食后，屢有中毒事件發(fā)生，以至造成人群慢性 中毒、致畸、致癌等不良后果。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外均越來(lái)越引起高度重視。2001年， 國(guó)家農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《無(wú)公害食品標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定減少化學(xué)藥品和抗生素的使 用，禁止使用激素或其他有激素作用的物質(zhì)及催眠鎮(zhèn)靜類藥物等等，因此，以 高效、低毒、低殘留為主攻方向，研制微生物制劑、開發(fā)現(xiàn)代中藥獸藥及發(fā)展 和充分利用生物技術(shù)搞好畜禽疾病防治已成為當(dāng)前獸藥界的努力方向和熱門話 題。
雞傳染性呼吸道疾病主要有雞傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、慢性呼 吸道病、傳染性鼻炎以及禽大腸桿菌病等。目前治療病毒引起的呼吸道疾病尚 沒有特效的西藥，對(duì)細(xì)菌引起的呼吸道疾病，主要使用抗菌素如高力米先、綠
消炎寶、紅霉素、卡那霉素等，可根據(jù)不同的病因，采用不同的治療方法對(duì)癥 治療。但細(xì)菌對(duì)抗菌素易產(chǎn)生抗藥性，且抗菌素毒副作用較大。近年來(lái)，我國(guó) 獸醫(yī)工作者根據(jù)傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)的理論，運(yùn)用野馬追等中獸藥防治雞呼吸道疾病， 尤其是病毒性呼吸道疾病取得了顯著成績(jī)。
野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(Eupatorium)多年生草本，分布于華東、華南、 華北、東北及臺(tái)灣等地。盛產(chǎn)于江蘇、安徽等地區(qū)，其它各省也有分布，藥源 豐富，并可引種野生為家種。中醫(yī)藥理論認(rèn)為野馬追有化痰止咳、清熱解毒、 利尿消腫、降壓的功能，用于感冒、咳嗽多痰、頭疼、扁桃體炎、菌痢、高血 壓。常用于治療慢性氣管炎，支氣管炎，高血壓等疾病。野馬追中含有豐富的 微量元素，主要以Fe、 Al、 Si為主，其次為Sr、 Ti、 Mn、 Ba，再次為Zn、 B、 Pb、 V、 Cu。據(jù)報(bào)道，中藥中的微量元素常與有機(jī)酸、氨基酸、肽等成分絡(luò)合， 產(chǎn)生協(xié)同作用而增強(qiáng)其療效。另外，盡管微量元素在人的機(jī)體內(nèi)只占總質(zhì)量的 萬(wàn)分之一以下，但它們?cè)谡麄€(gè)生命活動(dòng)中卻發(fā)揮了巨大作用。微量元素參與機(jī) 體各種酶及活性物質(zhì)的代謝，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。經(jīng)過(guò)對(duì)野馬追活性篩選 提示乙酸乙酯提取部位為主要活性部位，并從中分離得到6種黃酮類化合物， 結(jié)構(gòu)鑒定為棕矢車菊素、山柰酚、槲皮素、黃芪苷、三葉豆苷、金絲桃苷。
卵黃免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY)具有增強(qiáng)機(jī)體抗菌、免 疫功能，采用生物技術(shù)從產(chǎn)蛋雞卵黃中制備特異性多克隆免疫球蛋白，具有成
本低，產(chǎn)量高的特點(diǎn)。IgY能夠凝聚、吞噬和中和細(xì)菌及毒素成分；增強(qiáng)免疫系
統(tǒng)功能，預(yù)防呼吸道等疾病，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收。用于家禽的保健和疾病治療等。
在我國(guó)富含免疫球蛋白的原料很豐富，就全國(guó)范圍內(nèi)，每年可得豬血1125 1150 億千克，如果這些原料能被很好地利用起來(lái)，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 i。
經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，申請(qǐng)者進(jìn)行了一系列研究，其研究成果通過(guò)省級(jí)專家鑒定， 達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平，其結(jié)果如下
1、 按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將200只5周齡未免疫AA肉公雞按體重隨機(jī)分為4個(gè) 試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組40只雞。試驗(yàn)組每只雞每天灌服1.5mL野馬追等中 草藥與免疫球蛋白復(fù)合添加劑，對(duì)照組灌服1.5mL生理鹽水作安慰劑。按照野 馬追等中草藥與免疫球蛋白的不同配比分為試驗(yàn)組I、 II、 III和W，配比分別為 1:1， 1:0.8， 1:0.5， 1:0.2。試驗(yàn)表明，每天灌服1.5mL野馬追等中草藥與免疫球 蛋白復(fù)合添加劑，對(duì)傳染性支氣管炎的保護(hù)率可達(dá)到98.5%。而沒有灌服復(fù)合添 加劑的肉雞的保護(hù)率僅為12.5%。中草藥與免疫球蛋白配合使用后，肉雞對(duì)傳染 性支氣管炎的抵抗力有明顯增強(qiáng)?？贵w消長(zhǎng)規(guī)律同時(shí)表明這類復(fù)合添加劑在肉 雞體內(nèi)的有效期為18 21d。
2、 按照野馬追等中草藥與免疫球蛋白的不同配比分為試驗(yàn)組I、 II、 III和 IV，配比分別為l:l, 1:0.8， 1:0.5， 1:0.2。試驗(yàn)利用中草藥與免疫球蛋白不同配
比對(duì)禽大腸桿菌分離株(0422)、大腸桿菌(C84010)、大腸桿菌02型(C84002)、 大腸桿菌O78型(C84008)菌株等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，4種配比的復(fù)合制劑 對(duì)各型禽大腸桿菌都有一定的抗菌活性，MIC在15.6g/L至125g/L之間，中草 藥與免疫球蛋白為1:1時(shí)禽大腸桿菌敏感性最高，其余各組對(duì)不同血清型的禽大 腸桿菌也有較高的敏感性。試驗(yàn)證明抗大腸桿菌細(xì)胞壁膜的抗體可減弱或制 止大腸桿菌培養(yǎng)平板上該菌的生長(zhǎng)。卵黃免疫球蛋白防止大腸桿菌附著于腸細(xì) 胞的這類特性，在抗沙門氏菌方面也得到了證實(shí)。卵黃免疫球蛋白與中草藥之 間表現(xiàn)出協(xié)同作用，各組都有較好的抑菌作用。
3、 將不同配比的野馬追等中草藥與免疫球蛋白復(fù)合制劑體外抑制病毒的能 力進(jìn)行比較。抑病毒實(shí)驗(yàn)采用兩種方法病毒致細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)和血凝抑制 實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)生50%細(xì)胞病變的最高藥物稀釋度或不產(chǎn)生凝血的最小藥物濃度為 其最小抑病毒的濃度。樣品I對(duì)腺病毒7型(AdV7)的最小抑制濃度為1/640， 作用弱于樣品II，而對(duì)其它病毒的作用都最強(qiáng)。樣品IV除對(duì)腺病毒3型(AdV3) 的最小抑制濃度為1/640，對(duì)其余病毒的抑制作用在4種樣品中最弱。體外抑制 病毒實(shí)驗(yàn)表明選用1:1配比的復(fù)合制劑最能有效防治呼吸道疾病。急性上呼吸道 感染有70% 80%由病毒引起，實(shí)驗(yàn)所選7種病毒為呼吸道感染最常見的病毒， 尤其是合胞病毒，對(duì)呼吸道病毒感染具有一定代表性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中草藥 與免疫球蛋白配比為1:1，對(duì)各病毒的抑制效果最強(qiáng)。這也合理解釋了其防治呼 吸道疾病效果最佳。結(jié)果也與先前提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)蛋雞 法氏囊發(fā)育，有效保護(hù)傳染性支氣管炎等實(shí)驗(yàn)一致。
4、 選用體重相近的20周齡伊莎蛋雞200只，采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)，隨機(jī) 分為5個(gè)組，每個(gè)組設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只雞。研究觀察中草藥野馬追等 中草藥與免疫球蛋白復(fù)合制劑對(duì)蛋雞傳染性支氣管炎的治療效果。選用20周齡 伊莎蛋雞200只，隨機(jī)分為5組。試驗(yàn)組I、 II、 m和iv與對(duì)照組，試驗(yàn)組分別 吸入中草藥與免疫球蛋白配比為1:1， 1:0.8， 1:0.5, 1:0.2的復(fù)合制劑，連用7 天后觀察對(duì)免疫器官指數(shù)的影響，攻毒后觀察各組免疫保護(hù)效果，并在臨床上 加以觀察利用。試驗(yàn)結(jié)果表明，中草藥與免疫球蛋白復(fù)合制劑(配比l:l)能促 進(jìn)蛋雞法氏囊發(fā)育，對(duì)傳染性支氣管炎有很好的免疫保護(hù)效果。吸入復(fù)合制劑 對(duì)傳染性支氣管炎有較好的保護(hù)作用，保護(hù)率在85% 100%范圍內(nèi)。其中，以 試驗(yàn)組I (配比1:1)效果最優(yōu)，保護(hù)率達(dá)100%。利用復(fù)合制劑(配比為1:1) 進(jìn)行緊急治療，結(jié)果對(duì)三個(gè)雞場(chǎng)發(fā)病雞的治愈率分別為98.16%、99.02%、98.22%， 表現(xiàn)出較好的治療效果。
在畜禽呼吸道疾病防治方面，野馬追等中獸藥的研究開發(fā)和生物技術(shù)的應(yīng) 用取得了明顯的進(jìn)展。但大多藥物作用重在治標(biāo)，呼吸道疾病又多有反復(fù)發(fā)作， 往往呈現(xiàn)防不勝防之勢(shì)。有些生物制品能增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能，然而目前應(yīng)用還 不廣。使用野馬追等中獸藥與免疫球蛋白切合治療家禽呼吸道疾病，能達(dá)到低
毒、低殘留或無(wú)毒無(wú)殘留的目的，其禽蛋產(chǎn)品可為綠色和無(wú)公害食品，從而保 證了食品的安全性，有利于沖破一些國(guó)家對(duì)我國(guó)禽蛋產(chǎn)品出口的制約，贏得國(guó) 際市場(chǎng)，擴(kuò)大對(duì)外貿(mào)易。免疫球蛋白與野馬追等中獸藥復(fù)合制劑為綠色保健品， 具有無(wú)公害、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用、不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。在防治家禽呼吸道 疾病疾病方面，做到治標(biāo)與治本結(jié)合。推廣應(yīng)用后可減少化學(xué)藥品在動(dòng)物產(chǎn)品 中的殘留，實(shí)現(xiàn)禽產(chǎn)品的綠色無(wú)害化，提高我國(guó)禽產(chǎn)品的綜合競(jìng)爭(zhēng)力，帶動(dòng)和 促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收，保障人民群眾的食肉安全，市場(chǎng)前景廣闊。有利于 沖破一些國(guó)家對(duì)我國(guó)禽產(chǎn)品出口的制約，贏得國(guó)際市場(chǎng)，擴(kuò)大對(duì)外貿(mào)易，具有 重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提出防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白與野馬追或野馬 追等中草藥復(fù)合制劑的制備方法，在野馬追或野馬追等中草藥基料基礎(chǔ)上添加
特異性卵黃免疫球蛋白而形成的，本發(fā)明綜合了中草藥與免疫球蛋白的優(yōu)點(diǎn)， 是一種新型的抗生素替代品，可以替代抗生素，解決了傳統(tǒng)用抗生素治療家禽 呼吸道疾病產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)家禽產(chǎn)品的綠色無(wú)害化。
本發(fā)明的工藝如下
l.卵黃免疫球蛋白的制備方法
l.l雞蛋免疫制備選擇健康產(chǎn)蛋母雞，用市購(gòu)或自制的呼吸道病原微生物 多價(jià)疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯(lián)油乳劑滅活苗)
對(duì)蛋雞胸部肌肉分別多點(diǎn)注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球 蛋白水平達(dá)到高效價(jià)后，收集雞蛋。
1.2跑黃免疫球蛋白提取方法——乙酸一乙酸鈉緩沖液方法(一) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗，無(wú)菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無(wú)菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩沖液 (0.05mol/L， pH為5.0)， 二者攪拌時(shí)間為15min，混勻，4'C，靜置10h。離心 (1 900r/min, l(TC, 10min)，棄沉淀。收集沉淀，將沉淀溶于25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過(guò)濾除去其中的脂蛋白沉淀，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物冷凍真 空干燥—測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—制成卵黃免疫球蛋白制劑—粉 劑或注射劑
1.3卵黃免疫球蛋白提取方法——水稀釋法(二)
高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗。用蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液，用無(wú)菌水1:9倍 稀釋，經(jīng)攪拌(15min， 4。C)，靜置(10h),冷凍離心(4°C， 10000rpm， 25min)， 取上清液(WSF)得到卵黃免疫球蛋白粗提液(或經(jīng)過(guò)鹽析(NaCl)，然后預(yù)過(guò)濾，
分出殘?jiān)高^(guò)液超濾，所得超濾液最后經(jīng)DEAE離子交換層析(pH7.2磷酸鹽 緩沖液平衡后，并用其作洗脫液，收集蛋白液)分離后得到含高純度IgY液體) 用真空冷凍干燥機(jī)凍干，得到卵黃免疫球蛋白粉劑，或制成腸溶卵黃免疫球蛋 白膠囊和其他劑型。
1.4卵黃免疫球蛋白提取方法一超濾法(三)
利用水稀釋法得到的粗提卵黃免疫球蛋白液，采用超濾法，分子截留量采 用100kDa，操作壓力差為0.12MPa、進(jìn)料溫度為30'C， pH5.2，截留液免疫球 蛋白回收率達(dá)到91.89%，純度為86%;最后，經(jīng)DEAE離子交換層析得到高純 度的卵黃免疫球蛋白。
1.5卵黃免疫球蛋白提取工藝(以雞蛋為例)
鮮雞蛋—打蛋取蛋黃—制備蛋黃溶液—鹽析—超濾濃縮—冷凍真空干 燥—測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—制成卵黃免疫球蛋白制劑—粉劑或 注射劑
2. 血清免疫球蛋白的制備方法
2.1選擇健康動(dòng)物(如豬、馬、牛、羊等)，用市購(gòu)或自制的呼吸道病原微 生物多價(jià)疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯(lián)油乳劑滅活 苗)，采用口服免疫、注射或滴鼻方法，對(duì)其進(jìn)行免疫，劑量每頭0.1 3.0mL。 在免疫三天后進(jìn)行采血，自然凝固后，采用轉(zhuǎn)速2000~10000r/min,離心20 30min，取血清，得到血清免疫球蛋白粗提液。
2.2從血液中提取免疫球蛋白。常用的有鹽析法(如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸 銨鹽析法)、有機(jī)溶劑沉淀法(如冷乙醇分離法)、有機(jī)聚合物沉淀法、變性沉淀 法等。用于大規(guī)模生產(chǎn)的方法主要有:冷乙醇分離法、鹽析法、利凡諾法和柱層 析法等，應(yīng)用較多的為硫酸銨鹽析法和冷乙醇分離法。
2.3提取工藝(以硫酸銨鹽析法為例).-
豬血清—加入硫酸銨飽和溶液進(jìn)行沉淀—免疫球蛋白(Ig)粗品—加蒸餾水 轉(zhuǎn)移—超濾—透析—免疫球蛋白純品。工藝條件采用pH7.0 7.2、 40 50°C、 50。/。飽和度的(NH4)2S04溶液，此工藝可以大規(guī)模生產(chǎn)免疫球蛋白、安全無(wú)毒、 操作方便。既能保證免疫球蛋白的生物活性不受破壞，又能滿足大量生產(chǎn)的需要。
2.4噴霧干燥方法
將提取的血清免疫球蛋白粗提液，配制成蛋白濃度為10% 20%的溶液，分 別在入風(fēng)口溫度120 180°C,出風(fēng)口溫度60 80。C條件下進(jìn)行噴霧干燥，真空 包裝，置于冰箱保存。
3. 中草藥提取物制備方法
將野馬追單項(xiàng)中草藥或按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥 草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥1 10:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合，利用微粉碎200710161430.1說(shuō)明書第6/12頁(yè)機(jī)粉碎后混合，分別得到野馬追與野馬追等中草藥粉劑；利用超聲波提取中草 藥粉劑有效成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用20 40kHz， 超聲波處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成粉劑。3.1野馬追等中草藥提取物的制備取已經(jīng)粉碎好的一定量的野馬追等中草 藥，置于具塞三角瓶中，加入倍體積量的提取溶劑，置于超聲波裝置中，處理 30min后，過(guò)濾，濾液減壓濃縮后，在加入5倍體積量的提取溶劑超聲波處理 15min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，如此重復(fù)2次，合并3次提取物的濃縮物，即得 到該溶劑的超聲波提取的粗提物，置于4t;冰箱保存?zhèn)溆谩?.2野馬追等中草藥提取物微膠囊生產(chǎn)技術(shù)按照大豆白與麥芽糊精的比例1:2，中草藥提取物添加量為2.2%,均質(zhì)壓力 為30MPa,噴霧干燥塔進(jìn)風(fēng)口風(fēng)溫IOO'C，出風(fēng)風(fēng)溫70 80'C。經(jīng)噴霧干燥制 得中草藥提取物微膠囊。4. 中草藥粉碎采用微粉碎機(jī)或超微粉碎機(jī)對(duì)野馬追與野馬追等中草藥進(jìn)行粉碎。5. 中草藥與免疫球蛋白復(fù)合飼料添加劑制備方法5.1中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或未提取物) 按照野馬追等中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或未提取物) 與載體1:0.3:2的比例，先將中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或 未提取物)加入到混合機(jī)混合lmin，再加入載體(加入的比例為0. 1 99%) 混合4min，即得復(fù)合飼料添加劑。5.2利用提取的中草藥濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL，采用間歇法滅菌。 經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)進(jìn)行制成粉劑；卵黃免疫球蛋白粉劑由疫苗經(jīng)過(guò)蛋雞免疫 制備。中草藥提取粉劑與卵黃免疫球蛋白粉劑復(fù)合制備了中草藥免疫球蛋白復(fù) 合飼料添加劑。6. 中草藥免疫球蛋白復(fù)合制劑制備方法按照野馬追等中草藥提取液與免疫球蛋白提取液1:0.5的比例均勻混合，滅 菌—中草藥免疫球蛋白混合液—真空包裝—注射劑、口服劑或氣霧劑成品 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是-1. 通過(guò)應(yīng)用雞呼吸道疾病疫苗(如新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎 三聯(lián)油乳劑滅活苗或其他有關(guān)疫苗)免疫蛋雞，制備雞抗雞新城疫一傳染性法 氏囊一傳染性支氣管炎的特異性高免卵黃免疫球蛋白，或免疫豬等哺乳動(dòng)物獲得特異性血清免疫球蛋白。應(yīng)用平板式膜超濾技術(shù)對(duì)卵黃中的免疫球蛋白進(jìn)行 分離，采用真空冷凍干燥工藝，制備卵黃免疫球蛋白粉劑。2. 利用超聲波技術(shù)對(duì)野馬追等中草藥進(jìn)行了提取，采用真空冷凍干燥工藝， 制備中草藥卵黃免疫球蛋白飼料添加劑和氣霧劑產(chǎn)品。3. 原料來(lái)源廣泛，可再生；工藝流程簡(jiǎn)單，條件溫和；整個(gè)制備工藝無(wú)任何
廢水、廢氣廢液產(chǎn)生，無(wú)環(huán)境污染。4.本發(fā)明綜合了中草藥與免疫球蛋白的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的抗生素替代品， 具有增強(qiáng)機(jī)體抗菌、免疫功能，可抑制致病性雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染 性支氣管炎等致病微生物的生長(zhǎng)，是維持家禽健康所必需。具有創(chuàng)新性，可以 替代抗生素使用，有廣闊的市場(chǎng)前景。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式
一原料野馬追等中草藥提取物、卵黃免疫球蛋白、載體1. 野馬追等中草藥提取物制備按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機(jī)粉碎后混合，再利 用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用 20 40kHz，超聲波處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成 粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白制備-2.1雞蛋免疫制備選擇健康產(chǎn)蛋母雞，用市購(gòu)或自制的呼吸道病原微生物 多價(jià)疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯(lián)油乳劑滅活苗)對(duì)蛋雞胸部肌肉分別多點(diǎn)注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球 蛋白水平達(dá)到高效價(jià)后，收集雞蛋。2.2卵黃免疫球蛋白提取方法(以乙酸一乙酸鈉緩沖液方法為例) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗，無(wú)菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無(wú)菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩沖液 (0.05mol/L， pH為5.0)， 二者攪拌時(shí)間為15min，混勻，4°C，靜置10h。離心 (l卯Or/min， 10°C， 10min)，棄沉淀。收集沉淀，將沉淀溶于25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過(guò)濾除去其中的脂蛋白沉淀，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分一WSF)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物 冷凍真空干燥—測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—制成卵黃免疫球蛋白制 劑3. 免疫球蛋白復(fù)合制劑制備3.1按照野馬追等中草藥提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵 黃、血清免疫球蛋白)l:l比例混合，混合時(shí)，先將中草藥提取粉劑(或粉體) 與卵黃免疫球蛋白粉劑干粉(或未提取物)加入到混合機(jī)混合lmin，再添加30 80%玉米芯混合4min，即得復(fù)合制劑產(chǎn)品。3.2在卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵黃、血清免疫球蛋白)基礎(chǔ)上，添加經(jīng)過(guò) 粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的中草藥提取物或其原料混合后的粉體l 99%，制備免疫球蛋白復(fù)合制劑；3.3在經(jīng)過(guò)粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的中草藥提取物或其原料粉 體的基礎(chǔ)上，添加卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵黃、血清免疫球蛋白)1 99%， 制備免疫球蛋白復(fù)合制劑；3.4按照野馬追等中草藥提取液與卵黃免疫球蛋白提取液1:1的比例混合， 采用間歇?dú)⒕?，裝瓶，制備制成復(fù)合氣霧劑。3.5利用超聲波提取中草藥有效成分，合并濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL。 將制得的中草藥液體提取物與液體卵黃免疫球蛋白按照1:1混合—中草藥免疫 球蛋白液體—間歇滅菌—測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—進(jìn)行調(diào)配—裝瓶 處理后—成品(或制成腸溶卵黃免疫球蛋白膠囊或其他劑型)具體實(shí)施方式
二-原料野馬追等中草藥提取物、卵黃、載體1. 野馬追等中草藥提取物制備按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:I:1:I:1:1:1:1的比例混合， 利用微粉碎機(jī)粉碎后混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時(shí)間 是60 90min。超聲波頻率采用20 40kHz，超聲波處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò) 低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成粉劑。2. 卵黃制備取新鮮高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黃或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 中草藥與卵黃復(fù)合制劑制備-.按照野馬追等中草藥提取物與卵黃重量比1:1的比例進(jìn)行混合后—添加 20 80%脫脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—真空包裝—野馬追中草藥免疫球蛋白粉劑產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
三原料中草藥提取物、卵黃卵清、載體1. 1.野馬追等中草藥提取物制備按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃貧、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合， 利用微粉碎機(jī)粉碎后混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超聲波提取其有效 成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用20 40kHz，超聲波 處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成粉劑。2. 卵黃卵清制備取新鮮高免蛋消毒后，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3. 中草藥卵黃卵清制劑制備將制得的中草藥提取物與卵黃蛋清按照1: 1的比例進(jìn)行配比—添加20 60 %白碳黑，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—中草藥免疫球蛋白粉劑—測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—真空包裝—成品具體實(shí)施方式
四-原料中草藥微(超微)粉碎、卵黃免疫球蛋白、載體1. 中草藥微(超微)粉碎按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機(jī)粉碎后混合，，利 用微粉碎粉碎后混合，制備中草藥粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白制備(采用水稀釋法)-高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗，無(wú)菌打破蛋殼。分離蛋清與卵黃，卵黃加9倍無(wú) 菌水稀釋，用HCI調(diào)節(jié)pH5.2稀釋液混合后，于4'C冷藏5h，在4°C 1000g條件 下離心lh，上清液加入飽和硫酸銨及硫酸鈉鹽析沉淀，離心后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍 干燥機(jī)或噴霧干燥，即得粗提卵黃免疫球蛋白。3. 野馬追等中草藥免疫球蛋白制劑制備將制得的中草藥提取物與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的 比例進(jìn)行配比—添加20 60%白碳黑，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—中草藥免疫球 蛋白粉劑—真空包裝—成品具體實(shí)施方式
五原料野馬追等中草藥微(超微)粉碎、卵黃、載體1. 野馬追等中草藥提取物制備按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用 微粉碎機(jī)粉碎后，高速混合5min,制成野馬追等中草藥粉劑。2. 卵黃制備取新鮮高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黃或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 野馬追等中草藥與卵黃復(fù)合制劑制備按照中草藥提取物與卵黃重量比l: 1的比例進(jìn)行混合后—添加20 80%脫 脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—真空包裝—野馬追等中草藥 免疫球蛋白粉劑產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
六-原料野馬追等中草藥微(超微)粉碎、卵黃卵清、載體按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯零等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用超微粉碎或微粉碎機(jī)粉碎后 混合，制得中草藥粉劑。 2.卵黃卵清制備
取新鮮高免蛋消毒后，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3.野馬追等中草藥卵黃卵清制劑制備-將制得的野馬追等中草藥粉劑與卵黃蛋清按照1:1的比例進(jìn)行配比—添加 20 60%粉碎的大豆皮，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌4 5分鐘—中草藥免疫球蛋白 粉劑—真空包裝—成品具體實(shí)施方式
七原料野馬追提取物、卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、載體1. 野馬追提取物制備將野馬追烘干后，用微粉碎機(jī)粉碎后混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用20 40kHz，超聲波處理 30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白制備2.1雞蛋免疫制備選擇健康產(chǎn)蛋母雞，用市購(gòu)或自制的呼吸道病原微生物多價(jià)疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯(lián)油乳劑滅活苗)對(duì)蛋雞胸部肌肉分別多點(diǎn)注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球 蛋白水平達(dá)到高效價(jià)后，收集雞蛋。2.2卵黃免疫球蛋白提取方法(以乙酸一乙酸鈉緩沖液方法為例) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗，無(wú)菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無(wú)菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩沖液 (0.05mol/L， pH為5.0), 二者攪拌時(shí)間為15min，混勻，4'C，靜置10h。離心 (1 900r/min， l(TC， 10 min)，棄沉淀。收集沉淀，將沉淀溶于25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過(guò)濾除去其中的脂蛋白沉淀，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分一WSF)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物 冷凍真空干燥一測(cè)定卵黃免疫球蛋白的含量和活性一制成卵黃免疫球蛋白制 劑。3. 野馬追免疫球蛋白制劑制備3.1按照野馬追提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白) 粉劑干粉1:1比例混合，混合時(shí)，先將野馬追提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球 蛋白粉劑干粉(或未提取物)加入到混合機(jī)混合lmin，再添加30 80%玉米芯 混合4min，即得復(fù)合制劑產(chǎn)品。3.2按照野馬追提取液與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)提取液1:1 的比例混合，采用間歇?dú)⒕?，裝瓶，制備制成復(fù)合氣霧劑。3.3利用超聲波提取野馬追有效成分，合并濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL。 將制得的野馬追提取物與液體卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1混
合—中草藥免疫球蛋白液體—間歇滅菌—測(cè)定卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球 蛋白)的含量和活性—進(jìn)行調(diào)配—裝瓶處理后—成品(或制成腸溶卵黃免疫球 蛋白膠囊或其他劑型)
具體實(shí)施方式
八
原料野馬追、卵黃、載體
1. 野馬追提取物制備用微粉碎機(jī)將烘干的野馬追粉碎后，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用20 40kHz， 超聲波處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成粉劑。
2. 卵黃制備取新鮮高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黃或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。
3. 野馬追與卵黃復(fù)合制劑制備按照野馬追提取物與卵黃重量比1:1的比例進(jìn)行混合后—添加20 80%脫 脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—真空包裝—野馬追中草藥免 疫球蛋白粉劑產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
九
原料野馬追提取物、卵黃卵清、載體1. 1.野馬追提取物制備將野馬追烘干后，用微粉碎機(jī)粉碎后混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時(shí)間是60 90 min。超聲波頻率采用 20 40kHz，超聲波處理30min。過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥機(jī)或噴霧干燥制成
2. 卵黃卵清制備取新鮮高免蛋消毒后，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。
3. 野馬追卵黃卵清制劑制備將制得的野馬追提取物與卵黃蛋清按照1:1的比例進(jìn)行配比—添加20 60 %白碳黑，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—野馬追免疫球蛋白粉劑—測(cè)定卵黃免疫球 蛋白的含量和活性—真空包裝—成品
具體實(shí)施方式
十
原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、載體
1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘干后，用微粉碎機(jī)粉碎后混合，制備野馬追粉劑。
2. 卵黃免疫球蛋白制備(采用水稀釋法)高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的污物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精沖洗，無(wú)菌打破蛋殼。分離蛋清與卵黃，卵黃加9倍無(wú) 菌水稀釋，用1^1調(diào)節(jié)口1"15.2稀釋液混合后，于4t:冷藏5h，在4'C1000g條件 下離心lh，上清液加入飽和硫酸銨及硫酸鈉鹽析沉淀，離心后，經(jīng)過(guò)低溫冷凍 干燥機(jī)或噴霧干燥，即得粗提卵黃免疫球蛋白。 3.野馬追等中草藥免疫球蛋白制劑制備將制得的野馬追提取物與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的 比例進(jìn)行配比—添加20 60%白碳黑，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—中草藥免疫球 蛋白粉劑—真空包裝—成品具體實(shí)施方式
十一-原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃、載體1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘干后，用微粉碎機(jī)粉碎后混合，制備野馬追粉劑。2. 卵黃制備取新鮮高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黃或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 野馬追與卵黃復(fù)合制劑制備按照中草藥與卵黃重量比l:l的比例進(jìn)行混合后—添加20 80%脫脂米糠 與0.5%抗氧化劑—通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌—真空包裝—野馬追免疫球蛋白粉劑產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
十二原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃卵清、載體1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘干后，用微粉碎機(jī)粉碎后混合，制備野馬追粉劑。2. 卵黃卵清制備取新鮮高免蛋消毒后，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過(guò)蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3. 野馬追卵黃卵清制劑制備-將制得的野馬追粉劑與卵黃蛋清按照1:1的比例進(jìn)行配比—添加20 60% 粉碎的大豆皮，通過(guò)混合機(jī)混勻—滅菌4 5分鐘—野馬追免疫球蛋白粉劑—真 空包裝—成品。


圖1是免疫球蛋白提取純化制備工藝流程。其工藝流程圖說(shuō)明如下取新鮮高免蛋消毒后，通過(guò)蛋清/蛋黃分離器得到 蛋黃液，乙酸/乙酸鈉緩沖液(0.05mol/L， pH5.20) l:9倍稀釋,經(jīng)攪拌(15min， 4'C)，靜置(10h),冷凍離心(4'C， 10，000g, 25min),取上清液(WSF)，鹽 析(NaCl)，然后預(yù)過(guò)濾，分出殘?jiān)?，透過(guò)液超濾，所得超濾液最后經(jīng)DEAE離 子交換層析(pH7.2磷酸鹽緩沖液平衡后，并用其作洗脫液，收集蛋白液)分離后 得到高純度IgY。
權(quán)利要求
1、防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白復(fù)合制劑是在特異性免疫球蛋白基礎(chǔ)上添加基料而形成的，其特征在于，所謂的基料是以野馬追或按照野馬追、板藍(lán)根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中的2～9種原料的提取物或其粉體調(diào)配混勻而成的；所謂的特異性免疫球蛋白是利用市購(gòu)或自制的呼吸道病原微生物多價(jià)疫苗(如雞新城疫—傳染性法氏囊—傳染性支氣管炎三聯(lián)油乳劑滅活苗)等制備的單價(jià)或多加滅活疫苗免疫蛋雞，其免疫雞蛋再經(jīng)過(guò)消毒、分離純化工藝制備而成的，或由上述疫苗免疫哺乳動(dòng)物如家禽、兔等制備的血清免疫球蛋白；經(jīng)過(guò)粉碎(或提取)的中草藥與特異性免疫球蛋白(或卵黃、卵黃卵清)按照一定配比與載體復(fù)合混勻而成的固體或液體制劑。采用口服、注射、噴霧或伴飼料等方法給藥，對(duì)家禽呼吸道疾病有特效，治愈率達(dá)到91％以上，提高家禽生長(zhǎng)速度8％以上。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白復(fù)合制劑的制備方 法，其特征在于，復(fù)合制劑為粉劑、水劑、氣霧劑、顆粒劑或其他劑型，可 以做飼料添加劑和各種藥劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治冢禽呼吸道疾病中草藥免疫球蛋白復(fù)合制劑的制 備方法，其特征在于，中草藥基料采用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后 的提取物或其原料混合后的粉體，在復(fù)合制劑中加入的比例為1 99%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白復(fù)合制劑的制備方 法，其特征在于，特異性卵黃免疫球蛋白為提取，或特異免疫雞蛋經(jīng)過(guò)消毒 后直接打蛋，利用蛋清蛋黃或只用蛋黃，再與權(quán)利3中的中草藥混合，在復(fù) 合制劑中加入的比例為0. 1 99% 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白復(fù)合制劑的制備方 法，其特征在于，利用家禽呼吸道疾病致病性微生物等制備的單價(jià)或多加滅 活疫苗免疫蛋雞，其免疫雞蛋采用分離純化工藝制備而成的，再與權(quán)利3中 的中草藥混合，在復(fù)合制劑中加入的比例為0. 1 99% 。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白復(fù)合制劑的制備方 法，其特征在于，采用口服、注射、噴霧、伴料等方法給藥，對(duì)家禽呼吸道 疾病有特效，也用于各種家畜與寵物等動(dòng)物呼吸道疾病的防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸藥與飼料添加劑領(lǐng)域，具體是指特效防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白復(fù)合制劑的生產(chǎn)方法。其特征是用特異性免疫球蛋白或含有特異性免疫球蛋白的未提取物按一定配比添加部分載體或填充物等混勻而成。本發(fā)明綜合了免疫球蛋白與載體或填充物的優(yōu)點(diǎn)，形成了新型的抗生素替代品，達(dá)到標(biāo)本兼治，可以加快家禽呼吸道疾病的康復(fù)，達(dá)到防病與治病的目的，同時(shí)還降低了成本。是一種安全、無(wú)激素的綠色產(chǎn)品，對(duì)家禽呼吸道疾病有特效，治愈率達(dá)到98％以上，提高家禽生長(zhǎng)速度8％以上。本發(fā)明特別適用于家禽呼吸道疾病的預(yù)防和治療，同時(shí)也適用于各種家畜與寵物等動(dòng)物呼吸道疾病的防治。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101391102SQ200710161430
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月23日
發(fā)明者方希修, 王冬梅, 王壽軒 申請(qǐng)人:方希修;王壽軒;王冬梅