一種同時檢測禽4種呼吸道疾病病原的pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于禽類疾病檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種同時檢測禽4種呼吸道疾病病原的PCR檢測方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]禽流感(Avian influenza, Al,包括H5亞型及H9亞型)、雞新城疫(Newcastledisease, ND)、雞傳染性支氣管炎(infect1us bronchitis, IB)感染是4種給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失的傳染病。它們在臨床上具有共同的呼吸道癥狀，可感染不同年齡雞、鴨、鵝、鴿子及飛鳥等，引起高的發(fā)病率和死亡率。能否及時準(zhǔn)確地檢測該4種病原對臨床疾病防控至關(guān)重要。
[0004]由于該4種病原均屬于RNA病毒，要得出實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，該傳統(tǒng)方法須進(jìn)行兩步反應(yīng)才能完成(即反轉(zhuǎn)錄和PCR)。傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)須先利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再在DNA聚合酶及針對單一病原弓I物的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終電泳出目標(biāo)片段則判為陽性，相反則判為陰性。
[0005]由于反應(yīng)條件不同，反轉(zhuǎn)錄和PCR須先后分別在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)增多，增加了實(shí)驗(yàn)污染的概率。又由于擴(kuò)增不同病原目標(biāo)片段所須引物的最佳Tm值不同，傳統(tǒng)方法每次在PCR反應(yīng)體系中只能加一種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，一次也就只能得到針對一種病原的檢測結(jié)果。若送檢病料當(dāng)中含有多種病原的混合感染，則必須經(jīng)過多次PCR實(shí)驗(yàn)才能--確診。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種同時檢測禽4種呼吸道疾病病原的一步法多重PCR檢測方法，該檢測方法簡單、方便操作，準(zhǔn)確、重復(fù)性穩(wěn)定、高效。
[0008]解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種同時檢測禽4種呼吸道疾病病原的PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:
Cl)設(shè)計引物:分別設(shè)計針對AIVH5、AIVH9、NDV及IBV基因組保守區(qū)的4對引物: AIVH5 上游引物:5 z ACAAAGCTCTCTATCAAAACCCAAC3 ^
下游引物:3 z TACCATCTACCAACCATACCCAT5 ^
AIVH9 上游引物:5 z ATCGGCTGTTAATGGAATGTGTT3 ^
下游引物:3 z AATGGGATAAGTTCTGCGGGT5 ^
NDV 上游引物:5 z GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA3 ^
下游引物:3 z TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC5 ^
IBV 上游引物:5 z ACTGAACAAAAGACAGACTTAGT3 ^
下游引物:3 z CACTCTGAGCTGTTTGTGTTTG5 ^ 在設(shè)計的單一引物對病原的目標(biāo)片段分別都能擴(kuò)增出來的前提下，分別將4種引物的上下游先行按體積比1:1混合，再按體積比將四種引物1:1:1:1比例混合，混合后的引物作為本發(fā)明的使用引物；
(2)組織總RNA的抽提與純化:從禽組織中提取總RNA并純化；
(3)將反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需的組份加到一個PCR管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及采用步驟(I)中的引物進(jìn)行PCR檢測。
[0009]所述步驟(3)中PCR檢測的反應(yīng)體系為50ul，包括反應(yīng)酶2ul，緩沖液25ul，步驟
(I)中混合后的引物2ul，待檢模版lul，水補(bǔ)充至50ul，待檢模板為從禽組織中提取的總DNA。反應(yīng)酶及緩沖液為大連寶生物生產(chǎn)訴試劑盒提供。
[0010]所述步驟(3)中PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)樵赑CR儀上先50°C反轉(zhuǎn)錄30min，再將溫度提高至94°C反應(yīng)2min，然后43個循環(huán)的95°C變性15s，退火58°C、20s，72°C延伸10s，最后 72°C、5 min，4°C保溫。
[0011](4)本發(fā)明中經(jīng)PCR檢測后的電泳判斷結(jié)果為依據(jù)待檢物中電泳出的核酸片段的分子量大小來確定陰陽性，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為:AIVH5 500bp;AIVH9 220bp;IBV 980bp;NDV759bp0
[0012]本發(fā)明中一種用于同時檢測禽4種呼吸道疾病病原的的引物，其特征在于:其序列為:
AIVH5 上游引物:5 z ACAAAGCTCTCTATCAAAACCCAAC3 ^
下游引物:3 z TACCATCTACCAACCATACCCAT5 ^
AIVH9 上游引物:5 z ATCGGCTGTTAATGGAATGTGTT3 ^
下游引物:3 z AATGGGATAAGTTCTGCGGGT5 ^
NDV 上游引物:5 z GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA3 ^
下游引物:3 z TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC5 ^
IBV 上游引物:5 z ACTGAACAAAAGACAGACTTAGT3 ^
下游引物:3 z CACTCTGAGCTGTTTGTGTTTG5 ^
分別將4種引物的上下游先行按體積比1:1混合，再按體積比將四種引物1:1:1:1比例混合作為本發(fā)明的檢測引物。
[0013]本發(fā)明中引物設(shè)計分別針對AIVH5、AIVH9、NDV及IBV基因組保守區(qū)的4對引物，為防止引物間形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，設(shè)計長度不能超過30個堿基；在設(shè)計的單一引物對病原的目標(biāo)片段分別都能擴(kuò)增出來的前提下，將4種引物按等比例混合，混合后的引物作為本發(fā)明的使用引物；將反轉(zhuǎn)錄及PCR兩個反應(yīng)所需的各種組份加到一個PCR管中(同一反應(yīng)體系)，利用反轉(zhuǎn)錄酶高溫將失活而DNA聚合酶卻不失活的原理，在PCR儀上先50°C (反轉(zhuǎn)錄酶最適溫度)反轉(zhuǎn)錄30分鐘，再將溫度提高至94°C反應(yīng)2分鐘，這樣就確保了剩余的反轉(zhuǎn)錄酶完全失活，即使在同一反應(yīng)體系中也不會影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了將本來須要兩步才能完成的反應(yīng)整合成了一步法反應(yīng)。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
A、將反轉(zhuǎn)錄過程及PCR過程合二為一，實(shí)現(xiàn)了一步法擴(kuò)增目標(biāo)片段，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，提升了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0015]B、原來檢測鑒別某一病料中是否含有AIV H9、AIV H5、IBV及NDV須要做4次病原檢測實(shí)驗(yàn)才能確診，通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一次實(shí)驗(yàn)即可確診該病料中是否含有上述4種病原，節(jié)約了檢測費(fèi)用(節(jié)約了 3/4)，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。
[0016]本發(fā)明中的檢測方法直接以RNA為模版，在同一個反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)一步法PCR擴(kuò)增，減少中間操作環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)檢測的便捷性；加入針對4種病原的特異性引物，在同一個反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)一次同時檢測鑒別4種病原，實(shí)現(xiàn)檢測的高效性。
[0017]
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的電泳結(jié)果圖片
(注:圖中M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1?6病毒模板依次為:NDV(NDV+H5 二聯(lián)疫苗)、IBV、H5 (NDV+H5 二聯(lián)疫苗)、H9、NDV+IBV+H5+H9、IBV+H5+H9)
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明。
[0020]實(shí)施例1
(1)組織總RNA的抽提與純化:用trizol方法或用試劑盒提取待檢樣品的核酸，用于PCR反應(yīng)體系中所使用的模版；
(2)設(shè)計引物:根據(jù)Genbank上登陸的禽類組織中mRNA序列,利用Primer5.0設(shè)計出用于PCR技術(shù)檢測禽類基因表達(dá)的引物，即分別設(shè)計針對AIVH5、AIVH9、NDV及IBV基因組保守區(qū)的4對引物:
AIVH5 上游引物:5 z ACAAAGCTCTCTATCAAAACCCAAC3 ^
下游引物:3 z TACCATCTACCAACCATACCCAT5 ^
AIVH9 上游引物:5 z ATCGGCTGTTAATGGAATGTGTT3 ^
下游引物:3 z AATGGGATAAGTTCTGCGGGT5 ^
NDV 上游引物:5 z GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA3 ^
下游引物:3 z TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC5 ^
IBV 上游引物:5 z ACTGAACAAAAGACAGACTTAGT3 ^
下游引物:3 z CACTCTGAGCTGTTTGTGTTTG5 ^