專利名稱：：抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為抑制VEGF蛋白表達(dá)和增殖的siRNA序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，在此情況下啟動(dòng)子是活躍的，靶基因能被轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)21-23個(gè)nt的短雙鏈RNA，即siRNA(shortinterferenceRNA，siRNA)，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無(wú)須象反義核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全"敲除"，從而產(chǎn)生缺失突變表型。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯(cuò)誤均會(huì)導(dǎo)致RNA傲應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對(duì)點(diǎn)突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。已證明，siRNA技術(shù)可單獨(dú)或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于突變所致的疾病，如病毒感染、脊髓延髓肌肉萎縮癥(SBMA)，還可用于治療腫瘤。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、生存和遷移而刺激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生長(zhǎng)以及生殖活動(dòng)中是一種生理性血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在各種腫瘤和白血病細(xì)胞中，都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)上調(diào)，而且它與腫瘤和白血病的進(jìn)展和預(yù)后差密切相關(guān)。肝癌作為實(shí)體瘤，其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤血管生成有著密切的聯(lián)系。VEGF在肝癌中高表達(dá)，與肝癌的分期、分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)。將VEGF作為RNA干擾的靶標(biāo)，禾ij用VEGFsiRNA阻斷VEGF及其受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而阻斷VEGF促血管形成，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的。因此，通過(guò)干擾VEGFmRNA，阻斷血管形成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移己經(jīng)成為腫瘤治療的一種新策略。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供能在細(xì)胞和蛋白水平上抑制肝癌和白血病細(xì)胞株VEGF表達(dá)的siRNA以及提供該siRNA在制藥中的應(yīng)用。為達(dá)上述目的，發(fā)明人采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA序列，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選以下9條高效VEGFsiRNA序列(見(jiàn)表l):表l9條高效VEGFsiRNA序列靶標(biāo)位置正義鏈序列反義鏈序列名稱(Target)Sense(5'-3')Antisense(3'-5')VEGFsiRNAl106-126UCAUCACGAAGUGGUGAAGUUUUAGUAGUGCUUCACCACUUCVEGFsiRNA2386-406UGCAGACCAAAGAAAGAUAUUUUACGUCUGGUUUCUUUCUAUVEGFsiRNA3539-559GAUCCGCAGACGUGUAAAUUUUUCUAGGCGUCUGCACAUUUAVEGFsiRNA4337-357GGCCAGCACAUAGGAGAGAUUUUCCGGUCGUGUAUCCUCUCUVEGFsiRNA5588-608GGCGAGGCAGCUUGAGUUAUUUUCCGCUCCGUCGAACUCAAUVEGFsiRNA6615-635CGUACUUGCAGAUGUGACAUUUUGCAUGAACGUCUACACUGUVEGFsiRNA7401-421GAUAGAGCAAGACAAGAAAUUUUCUAUCUCGUUCUGUUCUUUVEGFsiRNA8610-630CGAACGUACUUGCAGAUGUUUUUGCUUGCAUGAACGUCUACAVEGFsiRNA9423443UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUUUUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU上述任一條VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤、抗肝癌或抗白血病的藥物。RNA干擾技術(shù)是將一段雙鏈的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，使具有同源序列的基因表達(dá)受到抑制，是腫瘤基因治療的新領(lǐng)域。本發(fā)明的siRNA序列的長(zhǎng)度均為19bp，這些siRNAs既足夠長(zhǎng)誘導(dǎo)基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主干擾素反應(yīng)。本發(fā)明將上述針對(duì)VEGFmRNA編碼區(qū)不同位置的9條VEGFsiRNA序列分另導(dǎo)入肝癌7721細(xì)胞和白血病細(xì)胞HL60，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞的增殖受到抑制，同時(shí)VEGF蛋白的表達(dá)量降低。雖然針對(duì)同一耙基因，但位置不同，效果不同。本發(fā)明從細(xì)胞的增殖和靶基因蛋白的表達(dá)得到的結(jié)果是一致的。9條VEGFsiRNA序列均能抑制肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，以VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6和VEGFsiRNA9的效果好，且均優(yōu)于反義寡核苷酸對(duì)照組。ELISA法檢領(lǐng)lJ，與空白對(duì)照組相比，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平明顯地降低，VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7抑制耙基因表達(dá)的效果最好?？梢?jiàn)，RNA干擾在腫瘤和白血病的基因治療方面的效果優(yōu)于與反義技術(shù)。VEGFsiRNA因其序列的特異性，可以特異地降解VEGFmRNA，從而降低VEGF蛋白的表達(dá)水平；VEGFsiRNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)，比反義寡核苷酸更易抵御細(xì)胞內(nèi)核酶的降解；VEGFsiRNA不需要化學(xué)修飾，可以避免反義寡核苷酸全硫代修飾引起的細(xì)胞毒性。因此，VEGFsiRNA可成為腫瘤和白血病基因治療的重要工具。圖l是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后MTT法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后CCK8法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后ELISA法測(cè)得各組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于HL60細(xì)胞后MTT法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一VEGFsiRNA的設(shè)計(jì)與合成。從Genbank獲得VEGFmRNA全序列，采用以下原則設(shè)計(jì)siRNA序列①在mRNA的起始密碼子AUG的下游50100nt處開(kāi)始設(shè)計(jì)；②以AA(N19)為模式；③G/C的百分比為30%70%;④一行中不要有4個(gè)以上的A或T;⑤一行中不要有4個(gè)及以上的G;⑥一行中不要有7個(gè)連續(xù)的GC鏈延伸；⑦完成序列比對(duì)(BLAST),以保證特異性；⑧結(jié)合RNAstructure3.7軟件，計(jì)算總自由能overallAG37。表2顯示，設(shè)計(jì)VEGFsiRNA序列9條，同時(shí)設(shè)計(jì)反義寡核苷酸對(duì)照(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3139788.3)，陽(yáng)性對(duì)照(針對(duì)GAPDH基因)。siRNA模板和反義藥物(全硫代修飾)由上海生工生物工程有限公司合成，使用Ambion公司的siRNA構(gòu)建試劑盒合成VEGFsiRNA。表2設(shè)計(jì)的VEGFsiRNA及反義對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照名稱耙標(biāo)位置正義鏈序列反義鏈序列總自能TargetSense(5'國(guó)3')Antisense(3'-5')Overall△G37VEGFsiRNAl106-126UCAUCACGAAGUGGUGAAGUUUUAGUAGUGCUUCACCACUUC-12.7VEGFsiRNA2386-406UGCAGACCAAAGAAAGAUAUUUUACGUCUGGUUUCUUUCUAU-15.9VEGFsiRNA3539-559GAUCCGCAGACGUGUAAAUUUUUCUAGGCGUCUGCACAUUUA-9.9VEGFsiRNA4337-357GGCCAGCACAUAGGAGAGAUUUUCCGGUCGUGUAUCCUCUCU-5.3VEGFsiRNA5588-608GGCGAGGCAGCUUGAGUUAUUUUCCGCUCCGUCGAACUCAAU-0.8VEGFsiRNA6615-635CGUACUUGCAGAUGUGACAUUUUGCAUGAACGUCUACACUGU-17.2VEGFsiRNA7401-421GAUAGAGCAAGACAAGAAAUUUUCUAUCUCGUUCUGUUCUUU-14.3VEGFsiRNA8610-630CGAACGUACUUGCAGAUGUUUUUGCUUGCAUGAACGUCUACA-17.8VEGFsiRNA9423-443UCAGUUCGAGGAAAGGGAAUUUUAGUCAAGCUCCUUUCCCUU-12.8VEGF反義81-100GGGTGCAGCCTGGGACCACT陽(yáng)性對(duì)照GAPDH模板由ambion公司試劑盒提供實(shí)施例二MTT法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果。人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPM1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37"、含5%(302溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞，配制2.0Xl(TVmL起始濃度細(xì)胞，每孔加100iJL到96孔培養(yǎng)板內(nèi)(Coming,美國(guó))，設(shè)空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(Invitrogen公司)、陽(yáng)性對(duì)照組(針對(duì)GAPDH基因)、反義組(25nmol/L)及siRNAl-9組(25nmol/L)。每組5孔，接種24h后棄去上清，轉(zhuǎn)染siRNAl-9和對(duì)照組，置37。C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱中無(wú)血清繼續(xù)培養(yǎng)4h，再各補(bǔ)加無(wú)雙抗含10%胎牛血清的1640100|jl，72h后加入MTT20|jL/L孵箱內(nèi)孵育4h后棄上清，加入DMSO150ijL/孔，在570nm的波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下檢測(cè)各組的吸光度。MTT實(shí)驗(yàn)中通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)組別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.21，PO.Ol)。VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組與空白對(duì)照組之間均有顯著差異，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果均好于反義藥物組。結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。表3MTT法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果組別x±s(OD值)細(xì)胞存活率％VEGFsiRNAl0.103±0.024**AA26.12VEGFsiRNA20.074±0.011**△△18.83VEGFsiRNA30.157±0.020**39.95VEGFsiRNA40.080±0.011**20.36VEGFsiRNA50.111±0扁**AA28.24VEGFsiRNA60.087±0.006**AA22.22VEGFsiRNA70.129±0.011**A32.82VEG諸NA80.097±0.012**AA24.60VEGFsiRNA90.093±0.007**23.66陽(yáng)性對(duì)照組0.152±0.01238.85脂質(zhì)體對(duì)照組0.209±0.09853.35反義藥物組0.202±0週51.40空白對(duì)照組0.393±0.005100.00與空白對(duì)照組相比，與反義藥物組相比，承表示P0.05，"表示PO.OlA表示P0.05，AA表示PO.Ol實(shí)施例三CCk8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組siRNA抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖的效果。人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37r、含5%002溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的7721細(xì)胞，配制1.0Xl()S/mL起始濃度細(xì)胞，接種96孔板，每孔100ul，置37"，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于72h每孔加入10ul的CCK8試劑，然后把培養(yǎng)板放在C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)為655nm。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度X100M。使用CCK8試劑盒測(cè)定各個(gè)藥物組別。經(jīng)過(guò)方差分析，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=17.46，P<0.01)，VEGFsiRNAlVE^FsiRNA9組與空白對(duì)照組之間均有顯著差異(PO.01);兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFs顧A6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9的效果均好于反義藥物組，而VEGFsiRNAl、VEGFsiRNA3、VEGFsiRNA5與反義藥物組沒(méi)有差異。結(jié)果見(jiàn)圖2和表4。表4CCK8法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白對(duì)照組相比，*表示？<0.05，^表示P0.01與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol實(shí)施例四VEGFsiRNA抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的測(cè)定。人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPM1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37t:、含5%(:02溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞接種96孔板，每孔100ul，置37。C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。SiRNAl-9組和反義寡核苷酸藥物組按25nm分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72h后離心收取上清夜，VEGF蛋白測(cè)定按人VEGFELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(晶美生物工程有限公司)，加入終止液混勻后即刻用酶標(biāo)儀(BIO-RID公司)測(cè)定OD45。值，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔的OD值減去空白孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(pg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。通過(guò)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)求出樣品VEGF濃度。結(jié)果見(jiàn)圖3和表5。表5ELISA法分析各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平組別細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF濃度pg/ml(x±s)VEGF蛋白抑制率。/。VEGFsiRNAl2510.53土30.87"34.74VEGFsiRNA21906.84±160.15**△△50.43VEGFsiRNA32568.95±267.10**33.22VEGFs畫(huà)A42086.32±45.83**45.77VEGFsiRNA52171.58±170.52**A43.55VEGFsiRNA62620.53±307.01**31.88VEGFsiRNA71821.58±158.82**AA52.65VEGFsiRNA82085.26±60.57**AA45.79VEGFsiRNA92585.79±52.71**32.78陽(yáng)性對(duì)照組2963患136.7022.96脂質(zhì)體對(duì)照組2918.95±167.9524.12反義藥物組2735.26±102.1528.90空白對(duì)照組3846.84±906.150與空白對(duì)照組相比，*表示？<0.05，"表示PO.Ol與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示P〈0.01實(shí)施例五CCK8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組siRNA抑制白血病HL60細(xì)胞增殖的效果。分別用25nM，50nM，100nM的VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7和反義藥物組作用HL60細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染24小時(shí)，采用嵌套設(shè)計(jì)資料的方差分析發(fā)現(xiàn)，同一藥物的不同濃度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而不同組別之間差異顯著(F=4.231，P-0.016),其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7與空白對(duì)照組有差異，而反義藥物組與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)圖4和表6。表6轉(zhuǎn)染藥物24小時(shí)后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例六VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。取實(shí)施例一合成的VEGFsiRNAl9中任一條序列，配制成濃度為25nmo1/1的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過(guò)靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進(jìn)行治療。實(shí)施例七VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。取實(shí)施例一合成的VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7，混合配制成濃度為25nmol/l的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過(guò)靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進(jìn)行治療。SEQUENCELISTING<110>暨南大學(xué)<120>抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA及應(yīng)用〈130〉1<160>18<170>Patentlnversion3.2<210〉1〈211>21<212>脆〈213>Artificialsequence<220〉<223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNAl序列正義鏈〈400〉1ucaucacgaaguggugaaguu21〈210〉2<211>21〈212〉■〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNAl序列反義鏈〈400〉2uu3gueigugcuucaccacuuc21<210>3〈211>21<212>畫(huà)〈213>Artificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA2序列正義鏈<400>3Ugcag3CC38Elg肪8g8U肌u21<210>4<211>21〈212>RNA〈213>Artificialsequence<220><223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA2序列反義鏈<400〉4UU3CgUCUggUUUCUUUCU3u21〈210>5<211>21<212>腿<213>Artificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA3序列正義鏈〈400〉5g3UCCgCag3CgUgUEl3ElUUu21〈210〉6〈211>21〈212〉腿<213>Artificialsequence〈220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA3序列反義鏈<400〉6uucuaggcgucugcacauuua21<210>7〈211〉21<212〉RNA<213>Artificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA4序列正義鏈<400>7ggcc3gC3C3U3ggag3gauu21〈210>8<211>21<212〉腿〈213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA4序列反義鏈<400>8uuccggucgugu加ccucucu21<210>9<211>21〈212〉腿<213>Artificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA5序列正義鏈<400>9ggCg3ggC3gCUUg3gUU3UU21<210>10〈211>21<212>腿〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA5序列反義鏈〈400〉10uuccgcuccgucgaacucaau21〈210〉11<211〉21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA6序列正義鏈<400>11cguacuugcagaugugacauu21<210>12<211>21〈212〉麗<213>Artificialsequence<220><223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA6序列反義鏈<400〉12uugcaug幼cgucuacacugu21<210>13〈211〉21<212>腿<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA7序列正義鏈<400>13g3U叫3gC33g8C肪g333UU21<210>14<211〉21〈212〉■<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA7序列反義鏈<400>14uucu叫cucguucuguucuuu21<210>15<211〉21<212〉RNA〈213>Artificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA8序列正義鏈<400>15cgaacguacuugcagauguuu21<210〉16〈211〉21〈212〉腿〈213>Artificialsequence〈220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA8序列反義鏈〈400〉16uugcuugcaugaacgucuaca21<210>17<211>21<212>RNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223〉采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA9序列正義鏈<400>17uc3guucgeigg幼3ggg幼u(yù)u21<210>18〈211〉21〈212>腿<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstmcture3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA9序列反義鏈<400>18uuaguc幼gcuccuuucccuu2權(quán)利要求1、一種抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA，其特征在于所述siRNA序列如下VEGFsiRNA4正義鏈GGCCAGCACAUAGGAGAGAUU，反義鏈UUCCGGUCGUGUAUCCUCUCU。2、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗腫瘤的藥物。3、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗肝癌的藥物。4、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗白血病的藥物。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為9條抑制VEGF蛋白表達(dá)的增殖的siRNA序列。經(jīng)過(guò)MTT和CCK8法檢測(cè)，9條VEGFsiRNA改變SMMC7721細(xì)胞的生物學(xué)特性，抑制腫瘤和白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，ELISA檢測(cè)9條VEGFsiRNA序列均可下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)。形態(tài)學(xué)觀察，VEGFsiRNA能引起腫瘤和白血病細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化。因此，VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤和白血病的藥物。文檔編號(hào)A61K48/00GK101113445SQ20071013725公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2005年6月3日優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日發(fā)明者洹張,荊春霞申請(qǐng)人:暨南大學(xué)