專利名稱：柴胡總皂苷提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中藥柴胡總皂苷提取物及制備方法、質(zhì)量控制方法及其在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柴胡為常用中藥，來源于傘形科植物北柴胡Bupleurum chinense DC.和南柴胡Bupleurum scorzonerifolium willd.的干燥根。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為柴胡歸肝、膽經(jīng)，具有和表解里，疏肝，升陽的功效，主治感冒發(fā)熱，寒熱往來，胸脅脹痛，月經(jīng)不調(diào)，子宮脫垂，脫肛等證，現(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有解熱、抗病毒、抗細(xì)菌內(nèi)毒素、抗炎、降血脂、保肝、抗腫瘤、提高免疫力、抗驚厥等多種功效。柴胡中主要含有皂苷、揮發(fā)油、多糖等成分，其中皂苷類成分為其主要活性成分。存在于柴胡藥材中的皂苷，為一類在其結(jié)構(gòu)中的C-13、28位之間含有環(huán)氧醚鍵的柴胡皂苷，如柴胡皂苷a、c、d等。該類皂苷不穩(wěn)定，在加熱(如煎煮等)及植物中酸性成分的雙重作用下，易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，生成一系列次生柴胡皂苷，如柴胡皂苷b1、b2、h等(匡海學(xué)，中藥化學(xué)，北京中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003)。柴胡皂苷a、c、d及次生皂苷b1、b2、h均具有顯著的藥理活性?，F(xiàn)有的關(guān)于柴胡皂苷提取物制備方法的專利主要涉及柴胡皂苷a、c、d，如專利“一種柴胡提取物、其制備方法及其應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?00610099498.7)等。為了避免這些柴胡皂苷的次生化，常需要控制嚴(yán)格的提取條件，如溶劑酸堿性、加熱溫度和時(shí)間等，且不能最大限度地避免皂苷的轉(zhuǎn)變。因此在柴胡傳統(tǒng)使用過程中，柴胡皂苷的次生產(chǎn)物，如柴胡皂苷b1、b2、h，是大量存在的，是柴胡提取物的重要組成部分，是柴胡、柴胡提取物和柴胡總皂苷的主要功效成分之一。為此，本專利發(fā)明涉及的柴胡總皂苷提取物所包含的皂苷類成分既包括了柴胡皂苷a、c、d等原型皂苷，也包括了次生皂苷柴胡皂苷b1、b2、h等，與已有專利發(fā)明有明顯區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種柴胡總皂苷提取物及其制備方法。
本發(fā)明提出的柴胡總皂苷提取物，是從中藥柴胡中提取的含有多種皂苷類活性成分的組合，其中主要化合物結(jié)構(gòu)如下




本發(fā)明所述原料柴胡，來源于傘形科柴胡屬的任意一種植物。作為提取柴胡總皂苷的原材料，可以是市售柴胡飲片，也可以是這些植物的莖、葉、花穗、果實(shí)、地下根莖及根等任一部位或全部植株，其中優(yōu)選的藥材部位為這些植物未抽花莖的干燥根。上述所述的柴胡包括未經(jīng)任何炮制處理的原藥材及飲片，還包括各種炮制品，如“醋炙柴胡”等。
本發(fā)明所述的柴胡總皂苷提取物，是指從上述任一植物的任何部位提取得到的，包含多種柴胡類活性成分的組合物，其中優(yōu)選的是從北柴胡Bupleurumchinense DC.和南柴胡Bupleurum scorzonerifolium willd.的未抽花莖的干燥根中提取制備得到的，含有多種皂苷類活性成分的組合物。這些皂苷類成分主要包括以下圖所示結(jié)構(gòu)為母核的一系列衍生物 作為柴胡總皂苷提取物，其中各皂苷類成分百分含量的總和為5～100％(w/w)，其中優(yōu)選的為50～100％(w/w)。
在本發(fā)明所述的柴胡總皂苷提取物所涵蓋的各種柴胡皂苷類活性成分之中，最主要的是柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h等成分。
本發(fā)明還提出了所述柴胡總皂苷提取物的制備工藝，它可以采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合進(jìn)行制備(1)溶劑提取法；(2)溶劑萃取法；(3)大孔吸附樹脂法；(4)超臨界流體萃取法；(5)柱色譜法；(6)液-液逆流分配色譜法。其中優(yōu)選的方法為大孔吸附樹脂法。
在使用這些方法進(jìn)行制備時(shí)，一般包括以下幾個(gè)步驟
(1)提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑。提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取等。
優(yōu)選的提取工藝為柴胡藥材加0～70％乙醇或這些溶劑與堿性物質(zhì)配成的堿性溶劑，回流提取2～3次，每次提取1～2小時(shí)，溶劑用量為5～15倍量(L/kg)。
(2)過濾包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等。
(3)濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮等。
(4)干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。
當(dāng)采用溶劑萃取法進(jìn)行制備時(shí)，一般先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得到總皂苷提取物。
當(dāng)采用大孔吸附樹脂法進(jìn)行制備時(shí)，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任意一種類型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中優(yōu)選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中優(yōu)選的為70～100％的乙醇。
優(yōu)選的柴胡總皂苷提取物樹脂純化工藝為選用AB-8、HPD400等中等極性或弱極性大孔吸附樹脂作為純化用樹脂，柴胡提取物上樣液稀釋倍數(shù)1∶6～16(以生藥量計(jì))，吸附流速3～9BV/h，樹脂柱徑高比1∶5～1∶10，上樣量為0.1～0.5g/mL(以生藥量計(jì))，0～60％乙醇洗脫1～4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為3～8BV/h，用70～100％乙醇洗脫3～6倍樹脂體積，洗脫流速為3～9BV/h。
當(dāng)采用超臨界流體萃取法進(jìn)行制備時(shí)，可以對(duì)柴胡原材料直接進(jìn)行萃取，也可以對(duì)上述任一方法和步驟所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行萃取。萃取時(shí)可以使用或不使用以下任一種類溶劑及溶劑混合物水、醇類、酮類及酯類溶劑。
當(dāng)采用柱色譜法進(jìn)行制備時(shí)，其處理的對(duì)象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也可以是經(jīng)上述溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化后的產(chǎn)物。所用的固定相可以是硅膠、聚酰胺、氧化鋁、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纖維素等，所用的洗脫液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等組成的混合溶劑。
當(dāng)采用液-液逆流萃取法進(jìn)行制備時(shí)，其處理的對(duì)象可以是上述提取步驟的產(chǎn)物，也可以是經(jīng)上述溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化后的產(chǎn)物。一般先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得總皂苷提取物。
該提取物可以單獨(dú)或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品，所制得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料等。
本發(fā)明質(zhì)量控制方法可包括以下含量測(cè)定方法中的一種或兩種1.總皂苷精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品適量(約4mg)，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密吸取柴胡皂苷a對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置于10ml具塞刻度試管，加0.1％對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5ml，70℃水浴10min，取出放置至室溫，加磷酸4.0ml，70℃水浴5min，放置至室溫，于545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以柴胡皂苷a對(duì)照品取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
精密稱取柴胡總皂苷提取物樣品各3份，每份100mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述樣品溶液0.1mL，柴胡皂苷a對(duì)照品溶液0.2mL、0.8mL，置于10ml具塞刻度試管，加0.1％對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5ml，70℃水浴10min，取出放置至室溫，加磷酸4.0ml，70℃水浴5min，放置至室溫，于545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。
2.柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d色譜條件色譜柱Hypersil-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水梯度洗脫，22％～50％乙腈(0～70min)；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫35℃。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密吸取柴胡皂苷a對(duì)照品溶液(濃度為0.217μg/μL)、柴胡皂苷c對(duì)照品溶液(濃度為0.218μg/μL)、柴胡皂苷d對(duì)照品溶液(濃度為0.193μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色譜儀，測(cè)定各色譜峰峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
含量測(cè)定精密稱取3批柴胡總皂苷提取物樣品各3份，每份約20mg，置10mL量瓶中，加70％乙醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d含量測(cè)定的供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定各色譜峰峰面積，計(jì)算含量。
3.柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h色譜條件色譜柱Hypersil-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水梯度洗脫，22％～50％乙腈(0～70min)；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫35℃。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密吸取柴胡皂苷b1對(duì)照品溶液(濃度為0.190μg/μL)、柴胡皂苷b2對(duì)照品溶液(濃度為0.354μg/μL)、柴胡皂苷h對(duì)照品溶液(濃度為0.163μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色譜儀，測(cè)定各色譜峰峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
含量測(cè)定精密稱取3批柴胡總皂苷提取物樣品各3份，每份約20mg，置10mL量瓶中，加70％乙醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h含量測(cè)定的供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定各色譜峰峰面積，計(jì)算含量。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1柴胡總皂苷提取物制備工藝取柴胡飲片1kg，0.4％NaOH-50％乙醇10L回流提取3次，每次提取1小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物，加水分散溶解，使水溶液稀釋倍數(shù)為1∶14(以生藥量計(jì))，通過8L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速3BV/h，樹脂柱徑高比為1∶8，上樣量為0.125g/mL(以生藥量計(jì))，50％乙醇洗脫4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為3BV/h，90％乙醇洗脫5倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集90％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為柴胡總皂苷提取物。測(cè)定柴胡總皂苷提取物中總皂苷含量為62％，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d三種成分的含量之和為25％。
實(shí)施例2柴胡總皂苷提取物制備工藝取柴胡飲片10kg，0.5％NaOH-55％乙醇15L，回流提取3次，每次提取1.5小時(shí)，回收溶劑，提取物加水分散溶解，使水溶液稀釋倍數(shù)為1∶12(以生藥量計(jì))，通過6L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶7，上樣量為0.16g/mL(以生藥量計(jì))，45％乙醇洗脫4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為2BV/h，85％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集85％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為柴胡總皂苷提取物。測(cè)定柴胡總皂苷提取物中總皂苷含量為65％，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d三種成分的含量之和為27％。
實(shí)施例3柴胡總皂苷提取物制備工藝取柴胡飲片1kg，水12L水蒸氣蒸餾6小時(shí)，分離揮發(fā)油。藥渣用0.05％NaOH-50％EtOH回流提取2次，每次提取2小時(shí)，回收溶劑，與水蒸餾液合并，加水分散溶解，使水溶液稀釋倍數(shù)為1∶14(以生藥量計(jì))，通過10L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶8，上樣量為0.1g/mL(以生藥量計(jì))，50％乙醇洗脫4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為2BV/h，90％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集90％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為柴胡總皂苷提取物。測(cè)定柴胡總皂苷提取物中總皂苷含量為65％，其中柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h、柴胡皂苷a四種成分的含量之和為22％。
實(shí)施例4柴胡總皂苷提取物制備工藝取柴胡飲片10kg，水12L水蒸氣蒸餾6小時(shí)，分離揮發(fā)油。藥渣用0.05％NaOH-50％EtOH回流提取3次，每次提取1小時(shí)，回收溶劑，與水蒸餾液合并，加水分散溶解，使水溶液稀釋倍數(shù)為1∶12(以生藥量計(jì))，通過10L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速3BV/h，樹脂柱徑高比為1∶8，上樣量為0.1g/mL(以生藥量計(jì))，55％乙醇洗脫4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為2BV/h，85％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集85％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為柴胡總皂苷提取物。測(cè)定柴胡總皂苷提取物中總皂苷含量為65％，其中柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h、柴胡皂苷a四種成分的含量之和為25％。
實(shí)施例5柴胡總皂苷片的制備柴胡總皂苷提取物100g淀粉100g上述組分混合均勻，加滑石粉適量，壓制成1000片。
實(shí)施例6柴胡總皂苷復(fù)方制劑的制備柴胡總皂苷提取物50g甘草總黃酮提取物50g枳實(shí)總黃酮提取物100g白芍乙醇提取物 300g上述組分混合均勻，裝入硬明膠膠囊中，共2000粒膠囊。
權(quán)利要求
1.一種柴胡總皂苷提取物，其特征在于該提取物由中藥柴胡中提取獲得，并含有以下皂苷類成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h。
2.如權(quán)利要求1所述的柴胡總皂苷提取物，其特征在于柴胡為市售柴胡飲片或傘形科柴胡屬任一種植物的全部植株或任何部位，如根、根莖、莖、葉、花穗、果實(shí)等，還包括經(jīng)過炮制的各種炮制品，如“醋炙柴胡”等。
3.如權(quán)利要求1所述的柴胡總皂苷提取物，其特征在于上述總皂苷類成分含量總和以重量計(jì)為5～100％。
4.如權(quán)利要求3所述的柴胡總皂苷提取物，其特征在于各皂苷類成分中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h的含量之和占全部總皂苷含量以重量計(jì)為5～100％。
5.如權(quán)利要求1～4所述的柴胡總皂苷提取物，其特征在于采用溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、柱色譜法、液-液逆流分配色譜法等任意一種方法，或這些方法的任意組合進(jìn)行制備。
6.如權(quán)利要求5所述的柴胡總皂苷提取物制備方法，其特征在于，在使用這些方法進(jìn)行制備時(shí)，包括以下一個(gè)或幾個(gè)步驟提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑；提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取等；過濾包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任一種澄清劑或其組合醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等；濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮等；干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。
7.如權(quán)利要求6所述的柴胡總皂苷提取物制備方法，其特征在于當(dāng)使用大孔吸附樹脂法時(shí)，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任何一種類型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中優(yōu)選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等，所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等。
8.如權(quán)利要求7所述的柴胡總皂苷提取物制備方法，其特征在于選用AB-8、HPD400等中等極性或弱極性大孔吸附樹脂作為純化用樹脂，柴胡提取物上樣液稀釋倍數(shù)1∶6～16(以生藥量計(jì))，吸附流速3～9BV/h，樹脂柱徑高比1∶5～1∶10，上樣量為0.1～0.5g/mL(以生藥量計(jì))，0～60％乙醇洗脫1～4倍樹脂體積進(jìn)行除雜，除雜流速為3～8BV/h，用70～100％乙醇洗脫3～6倍樹脂體積，洗脫流速為3～9BV/h。
9.如權(quán)利要求1～4所述的提取物的應(yīng)用，其特征在于，該提取物可以單獨(dú)或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品，所制得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從中藥柴胡中提取得到的總皂苷提取物及其制備方法。該提取物主要包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h及其類似物。該提取物可由溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、柱色譜法、超臨界流體色譜法、液－液逆流分配色譜法等任意一種方法，或這些方法的任意組合制備獲得。所制得的柴胡總皂苷提取物中各種皂苷類成分百分含量的總和為5～100％(w/w)，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h等成分的含量之和占全部總皂苷含量以重量計(jì)為5～100％。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101062071SQ200710111230
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日
發(fā)明者石任兵, 劉斌, 李軍 申請(qǐng)人:石任兵, 劉斌