專利名稱：柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法。
背景技術(shù)：
柴胡是大宗常用中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，為傘形科植物柴胡Bupleurumchinense DC或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根，味苦，微寒，歸肝、膽經(jīng)，是和解表里，疏肝，升陽之要藥。柴胡主要有效成分為柴胡揮發(fā)油和柴胡皂苷。研究表明，柴胡皂苷中，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量最高，藥理作用最顯著，具有明顯的解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、保肝等作用。因此提取高純度的柴胡皂苷a單體和柴胡皂苷d單體，對柴胡制 劑和新藥開發(fā)等具有重要意義。目前，本領(lǐng)域尚沒有一套系統(tǒng)的提取分離高純度柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的制備工藝。中國專利申請CN 101333240A (
公開日2008年12月31日)“一種提取分離高純度柴胡皂苷A的制備工藝”，公開了一種提取分離高純度柴胡皂苷a的制備工藝。具體是，取柴胡藥材，粉碎后，加熱提取，減壓濃縮，大孔吸附樹脂分離柱分離，收集洗脫液，然后采用高速逆流色譜分離濃縮液，紫外檢測收集柴胡皂苷a。前述方法雖提供了一種柴胡皂苷a的提取分離方法，但提取得到的柴胡皂苷a純度并不理想，并且由于高速逆流色譜法上樣量非常小，一次制備很難獲得大量柴胡皂苷a，而且儀器價格昂貴，生產(chǎn)成本高，該方法很難得到工業(yè)化推廣。因此，尋找一種能提取分離高純度的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，并能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，成本可控的工藝方法，是本領(lǐng)域尚未解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是，針對上述現(xiàn)有技術(shù)中提取方法獲得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d純度不高，且不適宜工業(yè)化生產(chǎn)的問題，提供一種柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法。該方法獲得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d純度高，方法適于工業(yè)化應用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，包括步驟(I)柴胡總皂苷的提??；(2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化；所述步驟(2)包括D.取步驟(I)制得的柴胡總皂苷，加入5 10倍量(mL/g)溶劑2，得上樣溶液；取相當于所述柴胡總皂苷15 50倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱，所述上樣溶液加入柱頂，用所述溶劑2以每小時I 3BV速度洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，分別合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，回收溶劑得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品；E.分別取柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品，加5 10倍量(mL/g)溶劑3，得上樣溶液；取相當于所述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品15 50倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，所述上樣溶液加入柱頂，用所述溶劑3以每小時O. 15 I. 5BV洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，分別合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，分別得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d ；所述溶劑2選自水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿或丙酮的任一種或它們的任意混合物；所述溶劑3選自水、甲醇、異丙醇或乙腈的任一種或它們的任意混合物。作為本發(fā)明的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟(I)柴胡總皂苷的提取可采用本領(lǐng)域已知的柴胡皂苷提取方法，如超聲提取、微波提取、高壓提取、加熱回流、煎煮中的任意一種。例如，可采用CN102166235A “一種柴胡皂苷的提取純化方法”所公開的柴胡皂苷的提取方法。本發(fā)明的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，在步驟(I)制得的柴胡總皂苷后，進行正相硅膠和反相硅膠吸附、洗脫，并通過篩選流動相、洗脫速度和固定相使用量，提取得到的柴胡皂苷a純度達到98%以上，柴胡皂苷d純度達到98%以上。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，所述步驟(I)包括步驟 A.取柴胡或者柴胡提取完揮發(fā)油后的藥渣，粉碎，溶劑提取，提取液濃縮回收溶齊U，得總提取物；B. A步驟制得的總提取物加水分散，上大孔樹脂吸附柱，堿水洗脫除雜，水洗脫至中性，體積百分比濃度20% 45%乙醇/水溶液洗脫除雜，體積百分比濃度70% 90%乙醇/水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮回收溶劑，得柴胡皂苷粗品；C.取步驟B制得的柴胡皂苷粗品，用3 5倍量(mL/g)溶劑I分散，加入相當于所述柴胡皂苷粗品2 5倍量(g/g)氧化鋁，拌干溶劑，得拌樣氧化鋁；或取步驟B制得的柴胡皂苷粗品，加入5 20倍量(mL/g)溶劑I溶解，得柴胡皂苷上樣溶液；取相當于所述柴胡皂苷粗品8 20倍量(g/g)氧化鋁，干法裝柱；將所述拌樣氧化鋁或所述柴胡皂苷上樣溶液加入柱頂，所述溶劑I以每小時5 IOBV速度洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得柴胡總皂苷；所述溶劑I選自水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿或丙酮的任一種或它們的任意混合物。通過在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化鋁純化步驟，得到的柴胡總皂苷質(zhì)量百分含量達到70% 90%，其中柴胡皂苷a+d的質(zhì)量百分量達到60% 80%，有利于進一步提高步驟(2)制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟D所述的正相硅膠柱的徑高比為I : 5 I : 15。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟E所述的反相硅膠柱的徑高比為I : 5 I : 15。徑高比是柱層析的重要工藝參數(shù)，影響到產(chǎn)物的純度和洗脫速度，徑高比過高影響洗脫速度，徑高比過低影響產(chǎn)物純度。發(fā)明人通過大量研究及篩選，獲得了本發(fā)明中正相硅膠柱和反相硅膠柱的徑高比。本發(fā)明篩選得到的正相硅膠柱和反相硅膠柱的徑高比，既能得到高純度的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，又能滿足工業(yè)化生產(chǎn)，有效提高提純效率。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟B所述大孔吸附樹脂選自非極性、弱極性、中等極性大孔吸附樹脂中的任一種；所述堿水溶液為堿性或弱堿性鹽類成分的水溶液。作為進一步優(yōu)選，所述堿性水溶液的PH值為7. 5 9。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟A所述溶劑選自任一醇類溶劑或水，或它們的任意混合物。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟C所述的氧化鋁柱的徑高比為I : 3 I : 5。通過優(yōu)選氧化鋁柱的徑高比，能進一步提高柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度，有效控制提取效率。作為優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟C所述的氧化鋁選自堿性氧化鋁或中性氧化鋁。通過優(yōu)選堿性氧化鋁或中性氧化鋁，制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度獲得進一步有效提高。作為進一步優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟D所述的正 相硅膠柱的徑高比為I : 15。作為進一步優(yōu)選，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，步驟E所述的反相硅膠柱的徑高比為I : 15。通過進一步優(yōu)選正相硅膠柱、反相硅膠柱的徑高比，本發(fā)明制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度達到最優(yōu)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是一、發(fā)明人通過在提取得到柴胡總皂苷后，增加正相硅膠和反相硅膠層析的方法，并篩選工藝條件，提取純化得到的柴胡皂苷a純度可達到98%以上，柴胡皂苷d純度可達到98%以上；并能根據(jù)需要同時或分別提取純化柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d ；二、發(fā)明人通過在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化鋁純化步驟，所得的柴胡總皂苷質(zhì)量百分含量達到70% 90%，其中柴胡皂苷a+d的質(zhì)量百分量達到60% 80%，進一步有效提高了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度。


圖I是步驟C不同氧化鋁對柴胡總皂苷提取效果的影響比較圖。圖2是步驟C不同上樣方式及流動相用量對柴胡總皂苷提取效果的影響比較圖。圖3是步驟C不同裝柱徑高比對柴胡總皂苷提取效果的影響比較圖。圖4是步驟D正相硅膠不同裝柱徑高比對柴胡皂苷a和d的影響比較圖。圖5是步驟E反相硅膠不同裝柱徑高比對柴胡皂苷a和d的影響比較圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下實施例、對比例及試驗例中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的測定方法HPLC測定方法高效液相色譜柱條件美國agilent高效液相色譜儀；色譜條件Zorbaxextend-C18 (250mm X 4. 6mm, 5. O μ m)色譜柱；流動相為乙腈-水；梯度洗脫，時間程序為O — 24 — 27 — 30min,乙腈體積分數(shù)相應為25% — 69% — 25% — 25% ;流速為O. 8ml/min ;柱溫為30°C ;檢測波長210nm。進樣量10微升。以下實施例及試驗例中，柴胡總皂苷的測定方法比色法對照品溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a 4. 6mg，加甲醇溶解，定容于IOmL容量瓶中，搖勻，制得每ImL含O. 46mg的標準品溶液。供試品的制備準確稱取柴胡總皂苷20mg，用20mL蒸餾水分兩次溶解，水溶液用20mL飽和正丁醇萃取5次，再分別經(jīng)過5%氨水洗2次，每次50mL，上層飽和正丁醇液于70°C 水浴中蒸干，殘留物用甲醇溶解，定容至20mL容量瓶中，搖勻。測定方法取供試品或?qū)φ掌啡芤篛. 2mL,加入O. 4%的對二甲氨基苯甲醛-乙醇溶液，在70°C水浴中反應lOmin，放至室溫，加入磷酸4ml，在50°C水浴中反應20min后，在545nm處測定吸光值，計算含量即可。實施例I本實施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取純化工藝步驟(I):A.取柴胡藥材20kg，清洗、切片、晾曬/干燥后，粉碎至16目，加入15倍量(L/g)的60%(v/v)、pH值為7的乙醇浸泡24小時，進行滲漉，滲漉流速為15mL/min，收集滲漉液，65°C減壓濃縮成相對密度為I. I I. 2的濃縮液；B.將濃縮液上DlOl大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為I : 3，攪拌吸附12h，再動態(tài)吸附，吸附流速為lBV/h，然后用5BV水洗柱除雜，再用3BV30% (v/v)乙醇除雜(前述堿水溶液PH值為 . 5-9)；85% (v/v)乙醇8BV洗脫，洗脫流速I. 5BV/h,收集85% (v/v)乙醇洗脫液，50°C減壓濃縮回收溶劑得柴胡總皂苷粗品，檢測可得柴胡皂苷a+d含量為35. 7%，柴胡總皂苷含量為54. 2% ；C.取上述柴胡總皂苷粗品100g，加11倍量(mL/g)二氯甲烷甲醇10 I (v/v),5000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液，上堿性氧化鋁柱，堿性氧化鋁用量為柴胡總皂苷粗品的10倍量(g/g)，徑高比為I : 3，二氯甲烷甲醇6 : I 10 : I混合溶劑洗脫，洗脫速度每小時8BV,收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得高純度柴胡總皂苷，檢測可得柴胡皂苷a+d質(zhì)量百分量為77. 4%，柴胡總皂苷質(zhì)量百分比含量為87. 3%。步驟(2):D.取C步驟中所得柴胡總皂苷用8倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，取相當于柴胡總皂苷15倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱徑高比為I : 10，二氯甲烷甲醇6 : 1-9 : I (V/V)梯度洗脫，洗脫速度每小時2BV，經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，各部分濃縮回收溶劑。E.取D步驟中第3部分用8倍量(mL/g) 70% (V/V)甲醇溶解，取相當于D步驟中第3部分15倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比為I : 10，用70%-100% (V/V)甲醇水溶液梯度洗脫，洗脫速度每小時O. 5BV，分離得到5個部分，經(jīng)薄層檢識，第3部分即為柴胡皂苷a，第5部分為柴胡皂苷d，經(jīng)液相色譜檢測，皂苷a純度為98. 3%，皂苷d純度為98. 9%。E-2.取D步驟中第5部分8倍量(mL/g) 60%(V/V)甲醇溶解，取相當于D步驟中第5部分15倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比為I : 10，用60%-80%(V/V)甲醇水溶液梯度洗脫，洗脫速度每小時O. 6BV,分離得到9個部分。經(jīng)薄層檢識，第5、6部分為柴胡皂苷a，合并5、6部分，經(jīng)液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 7%。實施例2本實施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取純化工藝步驟(I):A.取柴胡經(jīng)超臨界萃取揮發(fā)油后藥渣20kg，加入12倍量(L/kg)的65% (v/v),pH值為8的乙醇浸泡24小時，進行滲漉，滲漉流速為10mL/min，收集滲漉液，65°C減壓濃縮成相對密度為I. I I. 2的濃縮液； B.將濃縮液上DlOl大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:3，靜態(tài)吸附6小時，攪拌吸附6h，再動態(tài)吸附，吸附流速為I. 5BV/h，然后用6BV水洗柱除雜，再用4BV30% (v/v)乙醇除雜(前述堿水溶液PH值為7. 5-9)；80% (v/v)乙醇6BV洗脫，洗脫流速lBV/h，收集80% (v/V)乙醇洗脫液，50°C減壓濃縮回收溶劑得柴胡總皂苷粗品，檢測可得柴胡皂苷a+d含量為36. 5%，柴胡總皂苷含量為56. 8%。C.取上述柴胡總皂苷粗品200g，加15倍量(mL/g)乙醇溶解，5000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液，上堿性氧化鋁柱，堿性氧化鋁用量為柴胡總皂苷粗品的10倍量(g/g)，干法裝柱，徑高比為I : 5，二氯甲烷甲醇6 1-10 I (V/V)混合溶劑洗脫，洗脫速度每小時6BV，收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得高純度柴胡總皂苷，檢測可得柴胡皂苷a+d質(zhì)量百分比量為75. 4%，柴胡總皂苷質(zhì)量百分比含量為86. 7%。步驟(2):D.取C步驟中所得柴胡總皂苷用10倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (v/v)溶解，取相當于C步驟中所得柴胡總皂苷20倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱，徑高比I : 15，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (V/V)梯度洗脫，洗脫速度每小時I. 5BV，經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，各部分濃縮回收溶劑。E.取D步驟中4、5部分合并，用10倍量(mL/g) 50%(V/V)甲醇水溶液溶解，取相當于D步驟中4、5部分20倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比I : 15，50%-80% (v/v)甲醇水溶液洗脫，洗脫速度每小時O. 2BV，經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，第4部分為柴胡皂苷
a,第5部分為柴胡皂苷d，經(jīng)高效液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 0%，柴胡皂苷d純度為 98. 8%οE-2.取D步驟中第7部分濃縮回收溶劑，用5倍量(mL/g)60%(V/V)甲醇水溶液溶解，取相當于D步驟中第7部分20倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比I : 10，60%-80%甲醇水溶液洗脫，洗脫速度每小時O. 3BV,經(jīng)薄層檢識，得7部分，第4部分含皂苷a，第7部分含皂苷d，經(jīng)高效液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 5%，柴胡皂苷d純度為98. 1%。實施例3本實施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取純化工藝步驟(I):步驟A、步驟B同實施例2。C.取上述柴胡總皂苷粗品200g，加3倍量(mL/g)乙醇分散，加相當于上述柴胡總皂苷粗品2倍量(g/g)中性氧化鋁，拌干溶劑得拌樣氧化鋁；取相當于上述柴胡總皂苷粗品20倍量(g/g)中性氧化鋁，干法裝柱，徑高比為I :5，二氯甲烷甲醇6 1-10 I (v/v)混合溶劑洗脫，洗脫速度8BV，收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得高純度柴胡總皂苷，檢測可得柴胡皂苷a+d質(zhì)量百分量為70. 1%，柴胡總皂苷質(zhì)量百分比含量為83. 2%。步驟(2):D.取C步驟中所得柴胡總皂苷用10倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，得上樣溶液，取相當于C步驟中所得柴胡總皂苷50倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱，徑高比I : 15，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (V/V)梯度洗脫，洗脫速度每小時1.5BV，經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，各部分分別濃縮回收溶劑。。E.取D步驟中4、5部分合并，濃縮回收溶劑，用10倍量(mL/g) 50% (v/v)甲醇水溶液溶解，取相當于D步驟中4、5部分50倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比I : 15，50%-80% (V/V)甲醇水溶液洗脫，洗脫速度每小時O. 6BV,經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，第4部分為柴胡皂苷a，第5部分為柴胡皂苷d，經(jīng)高效液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 3%， 柴胡皂苷d純度為98. 8%。E-2.取D步驟中第7部分，用10倍量(mL/g) 60% (V/V)甲醇水溶液溶解，取相當于D步驟中第7部分20倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比I : 10，60%-80% (v/v)甲醇水溶液洗脫，洗脫速度每小時O. 9BV,經(jīng)薄層檢識，得7部分，第4部分含皂苷a，第7部分含皂苷d，經(jīng)高效液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 5%，柴胡皂苷d純度為98. 1%。實施例4本實施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取純化工藝步驟(I): 步驟A、步驟B同實施例2。步驟(2):C.取上述柴胡總皂苷粗品100g，加5倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇5 I (v/v)分散，加相當于上述柴胡總皂苷粗品5倍量(g/g)酸性氧化鋁，拌干溶劑，得拌樣氧化鋁；取相當于上述柴胡總皂苷粗品8倍量(g/g)酸性氧化鋁，干法裝柱，徑高比為I : 3，二氯甲烷甲醇6 I 10 I (V/V)混合溶劑洗脫，洗脫速度每小時5BV，收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得高純度柴胡總皂苷，檢測可得柴胡皂苷a+d質(zhì)量百分比量為62. 4%，柴胡總皂苷質(zhì)量百分比含量為76. 5%。步驟(2):D.取C步驟中所得柴胡總皂苷用5倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，取相當于C步驟中所得柴胡總皂苷15倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱，徑高比為I : 5，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (v/v)梯度洗脫，洗脫速度每小時3BV，經(jīng)薄層檢識，分離得7部分，各部分濃縮回收溶劑。E.取D步驟中第3部分用5倍量(mL/g) 70%(v/v)甲醇溶解,取相當于D步驟中第3部分15倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比為I : 5，用70%-100%(v/v)甲醇水溶液梯度洗脫，洗脫速度每小時O. 15BV，分離得到5個部分，經(jīng)薄層檢識，第3部分即為柴胡皂苷a，第5部分為柴胡皂苷d，經(jīng)液相色譜檢測，皂苷a純度為98. 1%，皂苷d純度為98. 2%。E-2.取D步驟中第5部分用5倍量(mL/g) 60%(v/v)甲醇溶解,取相當于D步驟中第5部分15倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，徑高比為I : 5，用60%-80%(v/v)甲醇水溶液梯度洗脫，洗脫速度每小時O. 15BV，分離得到9個部分。經(jīng)薄層檢識，第5、6部分為柴胡皂苷a，合并5、6部分，經(jīng)液相色譜檢測，柴胡皂苷a純度為98. 2%。對比例I采用CN102166235A中實施例3的方法，取使用超臨界 提取過揮發(fā)油的柴胡藥材Ikg,加入8倍藥材體積的30% (v/v)、pH值為8的乙醇浸泡24小時，進行滲漉，滲漉流速5mL/min,收集滲漉液，60°C減壓濃縮，濃縮成稀浸膏，再加pH值為8的堿水將濃縮浸膏稀釋至柴胡總皂苷含量為O. 8g/mL，將稀釋藥液上DlOl大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為I : 4，靜置6h，攪拌吸附10h，再動態(tài)吸附，吸附流速為2BV/h，然后用4BV水洗柱除雜，再用4BV30%(v/v)乙醇除雜；78% (v/v)乙醇6BV洗脫，洗脫流速2BV/h，收集洗脫液，60°C減壓濃縮，濃縮液凍干成淡黃色粉末。檢測可得柴胡皂苷a+d含量為34. 6%，總皂苷含量為58. 5%。對比例2按照CN 101333240A中實施例2進行取柴胡飲片10kg，O. 5%Na0H_55%乙醇15L回流提取3次，每次提取I. 5小時，回收溶劑，提取物加水分散溶解，使水溶液稀釋倍數(shù)為I 12(以生藥量計)通過6L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為I : 7，上樣量為O. 16g/ml (以生藥量計)，45%乙醇洗脫4倍樹脂體積進行除雜，除雜流速為2BV/h，85%乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集85%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為柴胡總皂苷提取物。測定柴胡總皂苷提取物中總皂苷含量為48. 2%，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷C、柴胡皂苷d三種成分的含量之和為23. 5%。通過以上兩個對比例可見，本發(fā)明通過在柴胡皂苷粗品基礎(chǔ)上增加氧化鋁純化步驟，得到的柴胡總皂苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量大大提高。以下就本發(fā)明篩選研究中的對比效果摘要如下試驗例I步驟C不同氧化鋁對柴胡總皂苷提取效果的影響本試驗例提取分離柴胡皂苷的方法，包括(I)藥材加工、(2)提取、(3)濃縮、(4)大孔樹脂處理、(5)氧化鋁處理、(6)含量測定，其中步驟(5)中所用氧化鋁分別為酸性、堿性、中性三種氧化鋁，方法同實施例I。用HPLC測定柴胡皂苷a+d的含量，用比色法測定柴胡總皂苷的含量，比較提取效果，結(jié)果如圖I。由此對比試驗可得，堿性和中性氧化鋁處理結(jié)果優(yōu)于酸性氧化鋁。試驗例2步驟C不同上樣方式及流動相用量對柴胡皂苷提取效果的影響.本試驗例提取分離柴胡皂苷的方法，包括(I)藥材加工、(2)提取、(3)濃縮、(4)大孔樹脂處理、(5)氧化鋁處理、(6)含量測定，其中步驟(5)中所用氧化鋁為中性氧化鋁，上樣方式及濃度分別為加相當于柴胡總皂苷粗品1，3、5、7倍量(g/g)堿性氧化鋁拌樣(5倍量溶劑分散)，加相當于柴胡總皂苷粗品3、5、10、15、20、25倍量(mL/g)溶劑溶解后上堿性氧化鋁柱，上藥液分別進行分離，其余方法同試驗例I。每種提取分離方法平行三份取均值，用HPLC測定柴胡皂a+d的含量，用比色法測定柴胡總皂苷的含量，比較提取效果，結(jié)果見圖2。
由圖2可知(I)氧化鋁拌樣時，氧化鋁用量選用3 5倍量效果較好，少于3倍量時，提取效果不好，多余5倍量時，提取效果并沒有相應明顯提高；(2)采用溶解上樣時，溶劑用量選用5 20倍量效果較好，當溶劑用量小于5倍時，提取效果不好，當溶劑用量大于20倍量時，提取效果沒有明顯提高。試驗例3步驟C不同裝柱徑高比對柴胡皂苷提取效果的影響本試驗例提取分離柴胡皂苷的方法，包括(I)藥材加工、(2)提取、(3)濃縮、(4)大孔樹脂處理、(5)氧化鋁處理、(6)含量測定，其中步驟(5)中所用氧化鋁為中性氧化鋁，裝徑高比分別為I : 1、1 3、1 5、1 7、I. 9中性氧化鋁柱，上藥液分別進行分離，其余方法同試驗例I。每種提取分離方法平行三份取均值，用HPLC測定柴胡皂苷a+d的含量，用比色法測定柴胡總皂苷的含量，比較提取效果，結(jié)果見圖3。由圖3可知步驟C氧化鋁柱的徑高比在I : 3 I : 5時，柴胡皂苷提取效果好，并在選取I : 5時效果最佳；徑高比小于I : 3時，提取效果有顯著下降；徑高比大于I 5時，提取效果并無明顯提高。試驗例4步驟D正相硅膠不同裝柱徑高比對柴胡皂苷a和d的影響本試驗例提取分離柴胡皂苷的方法，包括(I)藥材加工、(2)提取、(3)濃縮、(4)大孔樹脂處理、(5)氧化鋁處理、(6)正相硅膠處理、(7)含量測定，其中步驟(6)中所用硅膠裝柱徑高比分別為I : 3、1 5、1 IOU 15、1 20，上藥液分別進行分離，其余方法同實施例I。每種提取分離方法平行三份，用HPLC測定柴胡皂苷a和d的含量，結(jié)果見圖4。由圖4可知步驟D正相硅膠徑高比在I : 5 I : 15時，柴胡總皂苷及柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取效果好；并在選擇I : 15時效果最佳；徑高比小于I : 5時，提取效果有顯著下降；徑高比大于I : 15時，提取效果并無明顯提高。試驗例5步驟E反相硅膠不同裝柱徑高比對柴胡皂苷a和d的影響本試驗例提取分離柴胡皂苷的方法，包括(I)藥材加工、(2)提取、(3)濃縮、(4)大孔樹脂處理、(5)氧化鋁處理、(6)正相硅膠處理、(7)反相硅膠處理、(8)含量測定，其中步驟(7)中所用反相硅膠裝柱徑高比分別為I : 3、1 5、1 IOU 15、1 20，上藥液分別進行分離，其余方法同實施例I。每種提取分離方法平行三份取均值，用HPLC測定柴胡皂苷a和d的含量，結(jié)果見圖5。
由圖5可知步驟E反相硅膠徑高比在I : 5 I : 15時，柴胡總皂苷及柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取效果好；并在選擇I : 15時效果最佳；徑高比小于I : 5時，提取效果有顯著下降；徑高比大于I : 15時，提取效果并無明顯提高。
權(quán)利要求
1.柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在于，包括步驟 (1)柴胡總皂苷的提取； (2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化； 所述步驟(2)包括 D.取步驟(I)制得的柴胡總皂苷，加入5 10倍量(mL/g)溶劑2，得上樣溶液；取相當于所述柴胡總皂苷15 50倍量(g/g)正相硅膠，干法裝柱，所述上樣溶液加入柱頂，用所述溶劑2以每小時I 3BV速度洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，分別合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，回收溶劑得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品； E.分別取柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品，加5 10倍量(mL/g)溶劑3，得上樣溶液；取相當于所述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品15 50倍量(g/g)反相硅膠，濕法裝柱，所述上樣溶液加入柱頂，用所述溶劑3以每小時0. 15 I. 5BV洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，分別合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，分別得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d ； 所述溶劑2選自水、こ醇、甲醇、ニ氯甲烷、氯仿或丙酮的任ー種或它們的任意混合物；所述溶劑3選自水、甲醇、異丙醇或こ腈的任ー種或它們的任意混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在于，所述步驟(I)包括步驟 A.取柴胡或者柴胡提取完揮發(fā)油后的藥渣，粉碎，溶劑提取，提取液濃縮回收溶劑，得總提取物； B.A步驟制得的總提取物加水分散，上大孔樹脂吸附柱，堿水洗脫除雜，水洗脫至中性，體積百分比濃度20% 45%こ醇/水溶液洗脫除雜，體積百分比濃度70% 90%こ醇/水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮回收溶劑，得柴胡皂苷粗品； C.取步驟B制得的柴胡皂苷粗品，用3 5倍量(mL/g)溶劑I分散，加入相當于所述柴胡皂苷粗品2 5倍量(g/g)氧化鋁，拌干溶剤，得拌樣氧化鋁；或取步驟B制得的柴胡皂苷粗品，加入5 20倍量(mL/g)溶劑I溶解，得柴胡皂苷上樣溶液；取相當于所述柴胡皂苷粗品8 20倍量(g/g)氧化鋁，干法裝柱；將所述拌樣氧化鋁或所述柴胡皂苷上樣溶液加入柱頂，所述溶劑I以每小時5 IOBV速度洗脫，收集洗脫液，薄層檢識，合并含有柴胡皂苷的流分，濃縮回收溶劑，得柴胡總皂苷； 所述溶劑I選自水、こ醇、甲醇、ニ氯甲烷、氯仿或丙酮的任ー種或它們的任意混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟D所述的正相硅膠柱的徑高比為I : 5 I : 15。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟E所述的反相硅膠柱的徑高比為I : 5 I : 15。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟B所述大孔吸附樹脂選自非極性、弱極性、中等極性大孔吸附樹脂中的任ー種；所述堿水溶液為堿性或弱堿性鹽類成分的水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟A所述溶劑選自任ー醇類溶劑或水，或它們的任意混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟C所述的氧化鋁柱的徑高比為I : 3 I : 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟C所述的氧化鋁選自堿性氧化鋁或中性氧化鋁。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟D所述的正相硅膠柱的徑高比為I : 15。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，其特征在干，步驟E所述的反相硅膠柱的徑高比為I : 15。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥制備領(lǐng)域，具體公開了一種柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取純化方法。柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化方法，包括步驟(1)柴胡總皂苷的提??；(2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取純化，所述步驟(2)包括正相硅膠和反相硅膠層析。進一步，所述步驟(1)包括柴胡皂苷提取、大孔樹脂分離及氧化鋁純化步驟。本發(fā)明方法獲得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d純度高，并適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07J63/00GK102659903SQ20121014359
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者張翠鰲, 楊興旺, 楊占國, 索志榮, 馬家驊, 馬璇 申請人:青川德康源藥業(yè)有限公司