專利名稱：：一種治療結(jié)核桿菌感染的抗菌肽藥物制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：-本發(fā)明提供一種合成抗菌肽藥物及其制備方法，用于治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌的感染，屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：(一)多耐藥結(jié)核病現(xiàn)狀結(jié)核病是對人類健康威脅最大的傳染性疾病之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球約有20億人口感染結(jié)核桿菌，每年新發(fā)病例達800萬左右，死亡人數(shù)約3百萬，占人口死亡率的7%。結(jié)核病發(fā)病率及死亡率上升的最主要原因之一就是結(jié)核桿菌耐藥株的出現(xiàn)和傳播。據(jù)報道，全球結(jié)核病人中約有36%感染了耐藥菌，這種現(xiàn)象在發(fā)展中國家及AIDS病人中尤為重要。此外，全球五大洲35個國家和地區(qū)報告的各常用抗結(jié)核藥原發(fā)耐藥率為異煙肼(7.3%),鏈霉素(7.3%)，利福平(1.8%)，乙胺丁醇(1.0%),而獲得性耐藥率還原高于此值。因此，研發(fā)一種新型的治療多耐藥結(jié)核桿菌感染的藥物有著十分重要的意義。(二)抗菌肽的應(yīng)用抗菌肽(antimicrobialpeptides)是生物體中經(jīng)誘導(dǎo)而合成的一種內(nèi)源性多肽，在機體抵抗病原微生物的入侵方面起著重要的作用，更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕牡淖饔脵C理與常用的抗生素明顯不同，它主要通過在細胞膜表面形成離子通道來殺死細菌，現(xiàn)在有報道廣泛被研究應(yīng)用于抗菌、抗結(jié)核、抗癌。在目前結(jié)核菌的耐藥性明顯增強，而尋找新的抗生素又極為困難的情況下，尋找一種新的抗結(jié)核菌多肽藥物具有非常重要意義。(三)兩棲類動物提取中藥研究現(xiàn)狀兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍、大蹼鈴蟾、黑斑蛙、沼蛙和澤蛙。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報道的有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用。在國外，從兩棲類動物尋求藥理活性單體化合物已是新藥發(fā)明的熱點，國外報道，從爪蟾皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國己獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，；Magainin制藥公司宣布，他們生產(chǎn)的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類似物MSI-78用于治療糖尿病患者足部潰瘍與ofloxacin有同樣的效果，但產(chǎn)生更小的副作用。國外學(xué)者也已報道從東方鈴蟾和花鈴蟾中分離出若干具廣譜抗微生物活性的多肽類物質(zhì)，如Bombinin和BLP-like多肽。我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等，有機小分子多肽類物質(zhì)的研究還較少。天龍屬爬行綱，蜥蝎目，壁虎科，其又名守宮、壁虎等，現(xiàn)代醫(yī)藥書籍或雜志上收載品種為無蹼壁虎(GekkoswinhonisGunther)和多痣壁虎(多疣壁虎Gjaponicus)及其它幾種壁虎的干燥全體。壁虎，咸寒有小毒，入心、肝經(jīng)，具有補肺腎、養(yǎng)精血、止咳平喘、祛風(fēng)定驚、解毒通絡(luò)散結(jié)等功效。早在1978年，駱和生等人經(jīng)實驗證明天龍對結(jié)核桿菌有抑制作用，對致病性真菌有抑制作用，此后關(guān)于天龍在臨床結(jié)核病的應(yīng)用日漸增多，并顯示出很好的療效。主要用于肺結(jié)核、脊柱結(jié)核、胸腰椎結(jié)核、淋巴結(jié)核、頸淋巴結(jié)核或腫大以及骨與關(guān)節(jié)結(jié)核(骨癆)等。如焦起周等用回生膏外敷加服復(fù)方中藥湯劑治療結(jié)核病355例；李守信等用攻瘰丹、化離散加消核膏埋入或外貼治療淋巴結(jié)核1239:例，治愈率98.3%總有效率99.9%。于立君等人的專利申請"治療結(jié)核病的中藥及其制作方法"(專利號03132605.6)報道了天龍用于治療瘰疬結(jié)核，雖然天龍治療結(jié)核有效，但是關(guān)于天龍抗結(jié)核的藥理活性成分未有相關(guān)的文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種抗多耐藥結(jié)核桿菌的抗菌多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于結(jié)核分枝桿菌的抑制。本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于多耐藥結(jié)核菌感染的治療。本發(fā)明所述天龍抗菌肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。使用本發(fā)明所述的天龍抗菌肽，對于結(jié)核分支桿菌生長有抑制作用。本發(fā)明所述的抗菌肽、多耐藥結(jié)核病、結(jié)核分枝桿菌，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)書籍中有其準(zhǔn)確的定義。通過以下實施例對本發(fā)明的天龍抗菌肽的制備和應(yīng)用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來說明而非限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他常用制備方法及其他引起結(jié)核病的分支桿菌均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例一天龍抗菌肽的制備方法將天龍干藥材粉碎過80目篩，稱取2500g藥粉，用4500ml用蒸餾水混勻泡脹，4度冰箱靜置24hr,低溫高速離心得上清800ml,0.45urn膜過濾即得到天龍抗菌肽粗提液，將粗提液過固相萃取柱ODS-SPE(C18，封端)，分別用水和甲醇洗脫，凍干得到水溶部分和醇溶部分，經(jīng)HPLC色譜分析(0DSC18柱，SHIMADZU150L*4.6)，甲醇溶部分經(jīng)凝膠過濾柱層析，透析脫鹽和反相高壓液相色譜分離純化即得多肽。其中-凝膠過濾柱層析為將收集的天龍凍千粉溶于蒸餾水后上樣于SephadexG-50凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長IOOOmm，直徑26mm,用0.01MNa2HPO4—NaH2P04pH6.5緩沖液洗脫,收集70分鐘以后的峰。反相高壓液相色譜為:凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰上樣于經(jīng)含0.1%三氟醋酸的超純水平衡的C18反相柱，柱長250mm直徑10mm，用含0.1%三氟醋酸的甲醇從10%到100%的梯度洗脫，收集時間為16.2分鐘處的峰。然后用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。在上述制備所得的天然提取抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計合成，即得到一種合成抗菌肽，肽一級全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-谷氨酸-組氨酸-異亮氨酸-組氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-半胱氮酸-酪氨酸-異亮氮酸-賴氨酸-精氨酸(NH2-VNNGGSCLCEHIHLIRGVCHHLMRCYIKR-COOH)。天然抗菌肽衍生物的制備過程包括首先設(shè)計合成編碼抗菌肽基因，將抗菌肽的編碼基因克隆到載體pPIC9載體中，然后轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株，甲醇誘導(dǎo)表達蛋白。有關(guān)的DNA分離、純化、PCR擴增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙穆克魯克等編著的《分子克隆試驗指南》進行。實施例二抗菌肽對分支桿菌的抑菌作用研究1.培養(yǎng)基7H9瓊脂半流培養(yǎng)基:Middlebrook7H9干粉(SIGMAM0178)4.7g，丙三醇4rd,瓊脂粉0.5g,加蒸餾水至900ml，15磅121'C高壓滅菌10分鐘，冷卻后加入OADC至lOOOml,待用。蘇通半流體培養(yǎng)基稱取谷氨酸鈉4.0g,枸櫞酸1g，KJiP(W).25g,MgS047H200.25g,枸櫞酸鐵銨0.025g，甘油15ml，瓊脂粉0.25g，加入蒸餾水后加熱使其完全溶解，冷卻后以8%NaOH調(diào)pH至7.2，用蒸餾水定容至500ral，分裝，121"C高壓滅菌20分鐘，待用。2.藥物對照藥品為異煙肼；測試藥品為天龍抗菌肽。3.菌株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(^ycotecteri咖fu6ercWos/sH37Rv，ATCC27294);金色分枝桿菌說a:/77/取力7Cr^J56W，耐異煙肼結(jié)核桿菌株；多耐藥結(jié)核桿菌株:耐利福平結(jié)核桿菌株4.藥效評價標(biāo)準(zhǔn)肉眼觀察各個培養(yǎng)管中分支桿菌的生長，并同麥?zhǔn)媳葷峁?號、2號、3號、4號比濁，無分支桿菌生長表示"-"；有分支桿菌生長并同1號比濁管相近表示"+";同2號比濁管相近表示"++",依次類推,其中+號的多少反映出分支桿菌相對生長的多少。操作步驟將藥液倍比稀釋為3個梯度，分別為20jig/ml，10|ig/ml,5ng/ml，2.5ng/ml，1.25|ig/m。接種菌株取分枝桿菌新鮮分支桿菌，加0.5OTween-80生理鹽水磨菌稀釋，與1號麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，制成lmg/ml菌液上述新鮮菌落，稀釋成10—3mg/ml菌液，每管培養(yǎng)基接種0.lml。最終接種量為10、g。37'C溫箱孵育15天觀察結(jié)核菌生長實驗為雙管平行操作，每次實驗重復(fù)兩次，取平均值，結(jié)果如表一表一天龍抗菌肽抑制結(jié)核菌生長的作用最小抑菌濃度(ug/ml)菌株_天龍抗菌肽<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例三女，41歲，2000年時因咳嗽、咳痰，拍片檢查診斷為肺結(jié)核，用異煙肼、利復(fù)平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治療后病情無明顯好轉(zhuǎn)，藥敏試驗為多耐藥難治性結(jié)核(耐異煙肼、利復(fù)平)，咳嗽、咳痰，痰菌陽性，且肺上有空洞?？诜隹咕?0mg，tid,維持3周，空洞閉合，痰菌陰轉(zhuǎn)，臨床癥狀消失，遂停藥。實施例四男，59歲。2001年時因咳嗽、咳痰、乏力不適，拍片檢査發(fā)現(xiàn)患空洞型肺結(jié)核，用異煙肼、利福平、乙胺丁醇等抗結(jié)核治療，病情無明顯好轉(zhuǎn)，經(jīng)?？人?、咳痰、盜汗、納差，痰菌3(+)，且藥敏試驗為多耐藥難治性結(jié)核，胸片顯示兩肺繼發(fā)型肺結(jié)核伴空洞。2004年用天龍抗菌肽40mg，tid,治療4周，患者無不適癥狀，痰菌陰轉(zhuǎn)，空洞閉合，胸片上病灶穩(wěn)定，遂停藥。序列表<110〉王鶴堯<120〉種治療結(jié)核桿菌感染的抗菌肽藥物制備和應(yīng)用<160>].<400〉1ValAsnAsnGlyGlySerCysValCysGlu1510HislieHisLeulieArgGlyValCysHis1520HisLeuMetArgCysTyrlieLysArg25<210〉1<211〉29〈212〉PRT<213>人工序列<22()><221〉CHAIN權(quán)利要求1.一種合成抗菌肽，其特征在于該抗菌肽是依據(jù)天龍中天然分離多肽而衍生合成得到的一種單鏈多肽。2.權(quán)利要求1所述多肽全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸_天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-谷氨酸-組氨酸-異亮氨酸-組氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-精氨酸(NHrVNNGGSCLCEHIHLIRGVCHHLMRCY1KR-COOH)。3.權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在制備治療多耐藥結(jié)核桿菌包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供一種天龍抗菌肽衍生物制備方法，用于治療結(jié)核桿菌的感染。天龍抗菌肽衍生物，為依據(jù)中國兩棲類動物天龍中分離得到的天然多肽而合成的一種單鏈多肽，多肽一級全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-谷氨酸-組氨酸-異亮氨酸-組氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-精氨酸(NH₂-VNNGGSCLCEHIHLIRGVCHHLMRCYIKR-COOH)。天龍抗菌肽衍生物藥物可顯著抑制包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌生長，可應(yīng)用于治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染的藥物。文檔編號A61P31/00GK101293926SQ20071009728公開日2008年10月29日申請日期2007年4月29日優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日發(fā)明者孔繁翠,王鶴堯,葵邱,鄭文婕,昊顧申請人:王鶴堯;鄭文婕