專利名稱：：包含血管抑素或其片段的復(fù)合物、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有血管抑素或其片段，優(yōu)選片段Kl-3的復(fù)合物和緩釋制劑及其制備方法。本發(fā)明涉及的復(fù)合物無毒副作用、具有更高的生物活性以及更好的代謝穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供含有這種復(fù)合物和緩釋制劑的藥物組合物以及含有這種復(fù)合物的試劑盒。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明中的復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合和試劑盒來預(yù)防、診斷、治療腫瘤、制備抗腫瘤藥物以及抗新生血管疾病的方法。
背景技術(shù)：
：癌癥是當(dāng)今世界的常見病以及多發(fā)病，是威脅人類生命的頭號殺手。因此抗癌藥物的開發(fā)以及研制一直是國內(nèi)外的熱門課題。目前臨床上常用的抗癌藥物多為傳統(tǒng)的化療藥物，長期使用易導(dǎo)致耐藥性以及對人體也有很大的毒副作用，在臨床應(yīng)用上受到很大的限制。1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長和遷移依賴于新生血管生成理論，新生血管生成是指在原有血管上生成新的毛細(xì)血管。因此，阻斷腫瘤新生血管生成就可能阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。將腫瘤中的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作為癌癥治療的靶點(diǎn)，為治療腫瘤提供了一種治療方式，即抗血管生成治療(FolkmanJ.NEnglJMed1971;285:1182-1186)。血管抑素(Angiostatin)是1994年O'Reilly等在Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清和尿液中提取的內(nèi)源性血管生成抑制劑。它是小鼠血纖溶酶原(Plasminogen)N端從第98位氨基酸殘基(以起始氨基酸殘基Met為第一位氨基酸)起始的一段序列(O'ReillyMS，HolmgrenL,ShingY,etal.Cell,1994,79:315-328)，它至少包括血纖溶酶原5個Kringles結(jié)構(gòu)中的前4個，每個Kringle結(jié)構(gòu)由80個左右氨基酸殘基組成(LerchPG，RiskliEE,LergierW,etal.EurJBiochem，1980,107:7-13)。研究發(fā)現(xiàn)重組人纖溶酶原的K1、K2、K3、K5、Kl-3、K2-3、Kl-5等都能有效抑制牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(bovinecapillaryendothelialcell,BCE)細(xì)胞增殖，而K4幾乎無此活性。Kl-3抑制細(xì)胞增殖的活性明顯強(qiáng)于最初發(fā)現(xiàn)的血管抑素Kl-4(CaoY,JiRW,DavidsonD,etal.JBiolChem，1996，271(46):29461-29467.)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Kl-3能抑制小鼠Lewis肺癌生長及轉(zhuǎn)移作用，也能抑制小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤及小鼠血管內(nèi)皮瘤等在內(nèi)的多種原發(fā)瘤的生長。血管抑素發(fā)揮活性的機(jī)理在于它通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而抑制了腫瘤組織新生血管的生成，從而切斷提供腫瘤組織營養(yǎng)和氧氣的運(yùn)輸通路，最后餓死腫瘤。O'Reilly指出，血管抑素是內(nèi)源性纖溶酶原內(nèi)部的一個片斷，它特異性的作用于增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此一般不會引起免疫反應(yīng)，長期注射也不出現(xiàn)體重減輕、活動減少、食欲下降及條件致病菌的感染等副作用(SimBKL，O'ReillyMS,etal.CancerRes,1997,57:1329-1334,)，同時也不會影響肝、腎的功能(KirschM，StrasserJ，AllendeR,etal.JBiolChem,1996,271(46):29461-29467)。相比之下，目前市場上大部分的化療藥物，主要是針對腫瘤細(xì)胞，但是腫瘤細(xì)胞具有遺傳的不穩(wěn)定性以及高的突變率，故而極易產(chǎn)生耐藥性，影響藥效。鑒于以上原因，血管抑素在腫瘤細(xì)胞的治療上已經(jīng)取得很明顯的療效，有望成為二十一世紀(jì)的主打抗癌藥物。然而，盡管包括血管抑素在內(nèi)的多肽和蛋白質(zhì)類藥物相比于化學(xué)藥物具有毒副作用小，以及不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，并且為了盡可能的提高蛋白藥物的生物利用度以及減少其在體內(nèi)的降解，通常采用靜脈給藥方式，但是對于分子量小的蛋白來說，靜脈給藥的體內(nèi)半衰期很短。體內(nèi)的蛋白降解只是其中一方面的原因，另一個重要的方面是，小分子蛋白能夠通過腎過濾的途徑很快的被消除。研究發(fā)現(xiàn)，血液中水力半徑超過白蛋白或是分子量大于約66,000道爾頓(66kDa)的蛋白，通?？梢苑€(wěn)定的保留在循環(huán)系統(tǒng)中。但是小分子卻會通過腎小球過濾很快的被消除。所以，為維持小分子量蛋白在血液中的有效治療濃度，需要進(jìn)行頻繁的注射或點(diǎn)滴。這種治療方式雖然能達(dá)到治療的目的，但是卻給病人帶來了嚴(yán)重的不便與痛苦，提高了用藥成本，對某些藥物長期的使用還有可能產(chǎn)生一些副作用，例如免疫反應(yīng)。作為蛋白藥物的血管抑素同樣存在半衰期短，體內(nèi)清除率高的缺點(diǎn)。本發(fā)明的目的就在于改善該蛋白的體內(nèi)代謝特征，使其具有更高的穩(wěn)定性和更長的體內(nèi)半衰期，取得更好療效。高分子聚合物是改變和控制藥物的動力學(xué)特性如半衰期、免疫學(xué)特征、毒理特性的常用方法。它具有水溶性好、生物相容性好、無或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是應(yīng)用最為普遍的一種蛋白修飾分子。PEG分子具有兩親性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多數(shù)的有機(jī)溶劑，無毒、無免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性質(zhì)，是被包括美國FDA、中國SFDA在內(nèi)的很多，家的藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，可用于藥物制備的高分子之一。將蛋白質(zhì)與親水性的高分子(如聚乙二醇)偶聯(lián)，可增加蛋白穩(wěn)定性、減少非特異性吸附和抗原性。當(dāng)偶聯(lián)物達(dá)到一定分子量時，可大大降低腎臟的排除效率，這種方法是延長蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的一種有效方法(FrokjaerS.etal.Nat.Rev.DrugDiscov.2005Apr4(4):298-306;HarrisJM.etal.Nat.Rev.DrugDiscov.2003Mar2(3):214-21)。最初PEG修飾都是以氨基作為反應(yīng)位點(diǎn)，主要包括蛋白的N端(x-氨基和賴氨酸殘基側(cè)鏈上的s-氨基。這一類反應(yīng)的產(chǎn)物是一個蛋白分子與一個或多個PEG分子偶聯(lián)。對于賴氨酸殘基側(cè)鏈s-氨基上的修飾也往往因?yàn)榉磻?yīng)位點(diǎn)不特異而產(chǎn)生修飾后的同分異構(gòu)體。目前，針對蛋白N端a-氨基和賴氨酸殘基側(cè)鏈s-氨基的等電點(diǎn)差異，又新開發(fā)出了只針對蛋白N端的PEG修飾試劑，使得修飾位點(diǎn)一致，修飾產(chǎn)物組成均一。另一種可用于PEG修飾的蛋白位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基。由于巰基在蛋白中的數(shù)目通常少于氨基，所以這類修飾的位點(diǎn)更加特異。利用基因工程技術(shù)，可以在蛋白任的何部位引入半胱氨酸作為特異的修飾位點(diǎn)。但是此類引入半胱氨酸作為修飾位點(diǎn)也是有一定的局限性，因?yàn)閷δ承┍旧韼в邪腚装彼岬牡鞍?，可能會造成二硫鍵的錯配或無法復(fù)性。另外蛋白的羧基也是一種常用的修飾位點(diǎn)(VeroneseFMetal.DrugDiscov.Today.2005Nov1;10(21》1451-8.)。PEG修飾技術(shù)已經(jīng)成功地運(yùn)用在許多蛋白類藥物上，比較成功的包括PEG-天冬酰胺酶(GrahamMLAdv.DrugDeliv.Rev.55，1293-1302AvramisVassiliosI.etal.W09939732andUS6689762)、PEG-腺酐脫氨酶(LevyYetal.J.Pediatr.113,312—:317;DavisSetal.ClinExp.Immunol.46:649-652;HershfieldMSetal.NEnglJMed316:589-596)和PEG-干擾素(BailonPetal.C.Bioconjug.Chem.12，195—202，WangYSetal.Adv.DrugDeliv,Rev.54，547—570，MengXiantaietal.WO2005077421，VanVlasselaerPeteretal.WO2004076474，BallonPascalSebastianetal.US2004030101,KarasiewiczRobertetalEP0593868)等。本領(lǐng)域希望得到半衰期較長以及生物活性更高的血管抑素片段或含有其的復(fù)合物。除PEG外，本領(lǐng)域常用的其他的高分子修飾劑有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。將血液蛋白或其片段作為載體，與藥用蛋白偶聯(lián)或融合表達(dá)，從而起到增加蛋白分子量的目的，也是一種延長藥用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fc片段和目的蛋白偶聯(lián)以延長其半衰期，例如將此方法用在Notchl受體蛋白(KitajewskyJanetal.WO2005-111072)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)(GilliesStephenDetal.WO2005-063808)、人生長激素(KimYoungMinetal.WO2005047337)等蛋白上。血漿白蛋白也是一種常用的偶聯(lián)載體，可以運(yùn)用在抗生素類，消炎類，抗氧化物等蛋白上(EzrinAlanMetal.WOO117568，OtagiriMasakietal.EP1571212)。另一種延長蛋白體內(nèi)半衰期的方法是將蛋白做成緩釋劑型。將蛋白藥物放入一種藥用載體中，使得蛋白從載體中緩慢釋放，在體內(nèi)維持一種穩(wěn)定的藥物濃度。常用的方法有水凝膠、微膠囊、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體等(PeppasNAetal.Eur.J.Pharm.Biopharm.50,2746(2000);PackhaeuserCBetal.Eur丄Pharm.Biopharm.58，445—45:5(2004);MetselaarJMetal.MiniRev.Med.Chem.4，319—329(2002))。脂質(zhì)體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的空球形態(tài)的超顯微粒子。該雙層膜由兩親分子多為磷脂構(gòu)成并有水性的內(nèi)腔。將親水性的蛋白藥物包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)腔中，在體內(nèi)緩慢釋放，可以維持蛋白的血藥濃度，達(dá)到增加半衰期的作用。一些實(shí)例包括用在神經(jīng)生長因子(HouXiipuetal.CN1616087)、血紅蛋白(FarmerMarthaCetal.US4911929)等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明中描述的"Kl"、"K2"、"K3"、"K5"、"Kl-2"、"Kl-3"、"K1畫5"、"K2-3"、"K2-5"、"K3畫5"、"kringlesl-3"，凃特殊說明外，是指血纖溶酶原(Plasminogen)的片段，其中人血纖溶酶原的序列如SEQIDNO:7所示。(參見U.S.PatentNO:7，157,556和WO02/26782A2)-其中"K1-3"是指"Kringlesl-3"。PEG除特殊說明外，是指聚乙二醇，優(yōu)選單甲基聚乙二醇(methylpolyethyleneglycol,mPEG)。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了一種修飾物與血管抑素或其片段形成的復(fù)合物，所述復(fù)合物具有比未修飾的血管抑素或其片段更長的體內(nèi)半衰期，所述修飾物選自高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，該復(fù)合物不僅保持原有的抑制血管生成的活性，而且具有更高的生物活性和更長的體內(nèi)半衰期，并且對細(xì)胞以及動物沒有毒副作用，長期使用，也不會產(chǎn)生耐藥性等副作用。另外，Henkin等人公開了PEG與K5所形成的復(fù)合物保持K5原有的生物活性，其半衰期提高到5.53h(WO02/26782A2)，但本發(fā)明中所描述的PEG與K1-3所形成的復(fù)合物體內(nèi)半衰期延長至81.5h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PEG與K5所形成的復(fù)合物(參見本發(fā)明實(shí)施例4)。對于臨床應(yīng)用來說，具有更長的給藥間隔或者是更少的給藥劑量，這對于患者無論是經(jīng)濟(jì)上還是精神上，都是具有非常重要的意義。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的血管抑素是人、鼠或其他哺乳動物來源的。更優(yōu)選地，所述血管抑素是人血管抑素。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的血管抑素是重組血管抑素。更優(yōu)選地，所述重組血管抑素是重組人血管抑素。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的血管抑素的片段選自血管抑素K1、K2、K3、K5、Kl-2、Kl-3、Kl-5、K2-3、K2-5和K3-5。更優(yōu)選地，所述血管抑素片段是具有SEQIDNO:3所示序列的血管抑素Kl、具有SEQIDNO:4所示序列的血管抑素K2或具有SEQIDNO:5所示序列的血管抑素K3。最優(yōu)選地，本發(fā)明所述血管抑素的片段是具有SEQIDNO:l所示序列的血管抑素Kl-3，并且當(dāng)所述人血管抑素是由大腸肝菌表達(dá)的重組人血管抑素Kl-3時，其具有SEQIDNO:2的序列，其中N末端的Met在大腸肝菌表達(dá)時任選地被刪除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的復(fù)合物的血管抑素或其片段還包括血管抑素或其片段的具有活性的突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在血管抑素或其片段的N端或C端附加一段長度為1-15個氨基酸的肽鏈形成的。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在人血管抑素的N端附加一段7個氨基酸組成的含有His-tag的肽鏈MHHHHHH，該衍生物具有SEQIDNC):6的序列，并且當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時其N末端的Met任選地被刪除。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在人血管抑素的N端附加一段序列為MGGSHHHHH或MGGSHHHHHH的肽鏈，并且當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時其N末端的Met任選地被刪除。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述復(fù)合物中的修飾物與血管抑素或其片段通過共價鍵連接。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述復(fù)合物中的修飾物與血管抑素或其片段通過非共價鍵連接。優(yōu)選地，修飾物可以通過化學(xué)偶聯(lián)的方法連接到血管抑素或其片段上，也可以通過融合表達(dá)的方式和血管抑素或其片段連接到一起。本發(fā)明的高分子聚合物可以有生物活性，也可以沒有生物活性。合適的聚合物包括但不限于聚烯醇類化合物、聚醚類化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚與馬來酸酐的共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖、聚氧乙基多醇、肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酰胺(a,P-Poly((2-Hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛的共聚物(polyoxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰嗎啉(polyacryloylmorpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透明質(zhì)酸、聚環(huán)氧化(pdyoximnes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精或其他藥學(xué)上可接受的高分子聚合物。本發(fā)明的聚醚類化合物包括但不限于聚烷撐二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)或它們的衍生物，所述聚烯醇類化合物包括但不限于聚乙二醇(包括單甲基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它們的衍生物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述修飾物是聚乙二醇。一個更優(yōu)選的方案中，所述聚乙二醇選用單甲基聚乙二醇。本發(fā)明使用的聚乙二醇分子是線性的或是分叉的。優(yōu)選地，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于1,000到100,000道爾頓之間。更優(yōu)選地，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于5,000到40,000道爾頓之間。最優(yōu)選地，所述聚乙二醇是分子量為20kDa的單甲基聚乙二醇。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，一個血管抑素分子或其片段和一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)。優(yōu)選地，所述修飾是位點(diǎn)特異性的，不會影響血管抑素或其片段的生物活性。該修飾產(chǎn)物具有抗新生血管生成的活性，并且相比于無修飾物的血管抑素或其片段在代謝上更穩(wěn)定，具有更長的血液半衰期，可以作為抗新生血管生成疾病或抗腫瘤的藥物。優(yōu)選地，所述血管抑素分子或其片段與聚乙二醇分子偶聯(lián)的位點(diǎn)選自血管抑素或其片段的N端a-氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的s-氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一或多種。更優(yōu)選地，所述血管抑素分子或其片段與聚乙二醇分子偶聯(lián)的位點(diǎn)選自血管抑素或其片段N端ot-氨基或SEQIDNO:l所示序列第2、7、15、17、24、69、94、97、121、125、128、129、150、175、215、228、246位的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的s-氨基中的一或多個。更優(yōu)選地，一個血管抑素分子或其片段與一個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素或其片段N端的a-氨基。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的復(fù)合物中，一個具有SEQIDNO:2的重組人血管抑素分子的片段Kl-3與一個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素片段Kl-3N端的a-氨基。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的復(fù)合物中，一個具有SEQIDNO:2的重組人血管抑素分子的片段Kl-3與一個20kDa單甲基聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用PEG特異修飾Kl-3N端的ot-氨基，其產(chǎn)物具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，抑制腫瘤細(xì)胞增殖,，抑制小鼠腫瘤生長的生物活性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，一個血管抑素分子或其片段與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)方法為在血管抑素分子或其片段內(nèi)部或其N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽鏈，使得偶聯(lián)位點(diǎn)為附加的半胱氨酸殘基側(cè)鏈上的巰基。根據(jù)本發(fā)明，合適的聚氨基酸包括，但不限于同種氨基酸的聚合物，兩種或兩種以上的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸。根據(jù)本發(fā)明，適合用作修飾載體的蛋白分子優(yōu)選天然存在的蛋白或其片段，包括但不限于甲狀腺結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它們的片段。上述的載體蛋白優(yōu)選為人源的。上述蛋白的片段是指任何比該蛋白小卻保持了載體功能的部分。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合物是白蛋白偶聯(lián)的血管抑素或其片段，其特征為一個血管抑素分子或其片段和一個或多個白蛋白偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過化學(xué)修飾得到的，或是通過融合表達(dá)得到的，或是通過其他方法得到的，其中的白蛋白優(yōu)選人血清白蛋白或其片段。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合物是免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)的血管抑素或其片段，其特征為一個血管抑素分子或其片段和一個或多個免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過化學(xué)修飾得到的，或是通過融合表達(dá)得到的，或是通過其他方法得到的，其中的Fc片段優(yōu)選人免疫球蛋白IgG中的Fc區(qū)域的片段。本發(fā)明的修飾物還包括小分子或是小肽或是其他化合物。在-一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合物是小分子或是小肽或是其他化合物修飾的血管抑素或其片段，其特征是該復(fù)合物具有同體內(nèi)其他分子或成分反應(yīng)或結(jié)合的活性，使得該聚合物可以在體內(nèi)和其他成分形成更大的復(fù)合物，其中所述活性是由可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成共價鍵的反應(yīng)活性基團(tuán)產(chǎn)生的，優(yōu)選地所述反應(yīng)活性基團(tuán)是馬來酰亞胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巰基反應(yīng)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合物是血管抑素或其片段被糖基化、磷酸化或?；漠a(chǎn)物，其中修飾的位點(diǎn)是原來蛋白序列中存在的氨基酸殘基，或是通過突變產(chǎn)生的氨基酸殘基。該復(fù)合物沒有很大的分子量，但是因?yàn)樾揎椄淖兞薑l-3的性質(zhì)，從而延長了其半衰期。本發(fā)明的血管抑素或其片段與上述修飾物直接或間接共價相連，直接連接指的是血管抑素或其片段的某一個氨基酸和載體蛋白的某一氨基酸直接相連，可以通過肽鍵或二硫鍵。間接相連指的血管抑素或其片段和載體蛋白通過一定的化學(xué)基團(tuán)或幾個基團(tuán)的組合連接。當(dāng)本發(fā)明的血管抑素或其片段與修飾物通過非共價鍵相互作用時，該復(fù)合物具有特定的組成式，其中的修飾物優(yōu)選地是蛋白、小分子或其他i'七學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的另一方面提供一種緩釋制劑，它是由血管抑素或其片段，優(yōu)選片段Kl-3，或上述的任一復(fù)合物與生物相容性物質(zhì)形成的。該組合物中的血管抑素或其片段仍然具有生物活性，但卻可以依靠該載體改變藥物代謝特征達(dá)到延長體內(nèi)保留時間的目的。所述的緩釋制劑包括但不限于微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體等。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其由上述復(fù)合物或緩釋制劑與藥學(xué)上可接受的載體形成，所述復(fù)合物由一種修飾物與血管抑素或其片段，優(yōu)選血管抑素片段Kl-3形成。本發(fā)明使用的藥學(xué)上可接受的載體包括對于以所用劑量和濃度與其接觸的細(xì)胞或哺乳動物無毒的藥用上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑。通常生理學(xué)上可接受的載體是含水的pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體的例子包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機(jī)酸在內(nèi)的緩沖液；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(不超過10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖類；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；和/或諸如TWEEN⑧、聚乙二醇、和PLURONICS⑧等非離子表面活性劑。賦形劑優(yōu)選無菌且一般不含不良物質(zhì)。這些組合物可通過常規(guī)的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。本發(fā)明的另一方面還提供一種試劑盒，其包括上述復(fù)合物、緩釋制劑或藥物組合物和使用說明，其中所述復(fù)合物由一種修飾物與血管抑素或其片段形成，優(yōu)選地是聚乙二醇修飾的血管抑素片段Kl-3。本發(fā)明還涉及到制備本發(fā)明的復(fù)合物的方法，所述復(fù)合物由一種修飾物與血管抑素或其片段，優(yōu)選片段Kl-3形成。特別涉及制備聚乙二醇(PEG)修飾的血管抑素或其片段的方法，即將活化的PEG與血管抑素或其片段混合，在適當(dāng)?shù)娜芤?、溫度、pH、摩爾比條件下反應(yīng)，并任選地用陽離子柱或分子篩純化偶聯(lián)產(chǎn)物。其中反應(yīng)的:)H優(yōu)選pH3-10之間，更優(yōu)選pH5-7之間，聚乙二醇與血管抑素摩爾比為1:1到10:1。本發(fā)明還提供一種上述復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療腫瘤中的用途，其中所述復(fù)合物由一種修飾物與血管抑素或其片段形成，優(yōu)選地是聚乙二醇修飾的血管抑素片段Kl-3。本方法適合的癌癥包括但不限于肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、彝咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤等。本發(fā)明還提供一種上述含有血管抑素或其片段，優(yōu)選K卜3的復(fù)合物、藥物組合物或緩釋制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中所述藥物適于靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式，給藥時間由每天到每21天給藥，優(yōu)選每天至每周給藥。本發(fā)明還提供一種上述復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療非腫瘤疾病的藥物中的用途，其中所述復(fù)合物由一種修飾物與血管抑素或其片段形成，優(yōu)選地是聚乙二醇修飾的血管抑素片段Kl-3。所述非腫瘤疾病的特征為新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變，所述藥物適于靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式，給藥時間由每天到每21天給藥，優(yōu)選每天至每周給藥。本發(fā)明還提供一種延長血管抑素或其片段，優(yōu)選延長片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含將修飾物與血管抑素或其片段形成復(fù)合物的步驟以及任選地包含制備由上述復(fù)合物和生物相容性物質(zhì)形成的緩釋制劑的步驟。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中的PEG與K1-3N端偶聯(lián)的復(fù)合物，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小鼠腫瘤生長的活性，與Kl-3相比，活性明顯提高，并且體內(nèi)藥代學(xué)研究表明修飾后的Kl-3能有效的減緩Kl-3在體內(nèi)的代謝，延長體內(nèi)代謝時間。本發(fā)明中提到的血管抑素或其片段，除特殊說明以外，包括野生型的血管抑素或其片段，即體內(nèi)自然存在的形式或其具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體、衍生物等或它們的組合。血管抑素或其片段的來源可以是但不限于動物細(xì)胞表達(dá)的，也可以是從酵母或大腸肝菌中發(fā)酵純化而來的。其中來源于動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞表達(dá)的人血管抑素片段Kl-3具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，或在此序列的N端和/或C端有10個氨基酸以內(nèi)的增加或缺失的序列；來源于大腸肝菌表達(dá)的Kl-3具有SEQIDNO:2的序列，但其N末端的Met在表達(dá)后有時會被刪除。Kl-3的突變體指的是通過氨基酸的取代、缺失、增加而得到的Kl-3。其片段是指序列屬于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的任何更小的部分，可以是但不限于通過酶切得到的，或基因工程表達(dá)的，或通過多肽合成的方法得到的。優(yōu)選地，所述突變體與SEQIDNO:l具有60%氨基酸序列同源性，或是具有70%氨基酸序列同源性，更期望的是具有80%以至90%的同源性，特別是有95%的序列同源性。所述片段是指包含SEQIDNO:l的一部分的序列，例如具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的序列。曾有報道具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的序列的片段具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性(CattaneoMGetal.THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY.Vol.271,No.46,IssueofNovember15,pp.29461—29467,1996)。Kl-3的異構(gòu)體是指具有和SEQIDNO:l相同的氨基酸序列或分子式，但是卻有不同的構(gòu)象，包括蛋白二級或三級結(jié)構(gòu)的不同或是局部氨基酸旋光性的改變，異構(gòu)體的來源可以是天然存在的突變或是通過人為設(shè)計而得到的。Kl-3的衍生物是指在SEQIDNO:l的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾的產(chǎn)物，其中的修飾是指在蛋白上共價連接一個或多個其他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是30個氨基酸以內(nèi)的小肽鏈，連接位點(diǎn)可以是蛋白內(nèi)的任意一個氨基酸。Kl-3具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體、衍生物的組合是指同時具有兩種或兩種以上上述特征變化的產(chǎn)物，但不限于片段的突變體、突變體的修飾產(chǎn)物等。圖1:顯示人血管抑素片段Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:l。圖2:顯示大腸桿菌表達(dá)的人血管抑素片段Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:2。這里N末端的Met在表達(dá)后有時會被刪除。圖3:顯示人血管抑素kl的氨基酸序列SEQIDNO:3。圖4:顯示人血管抑素k2的氨基酸序列SEQIDNO:4。圖5:顯示人血管抑素k3的氨基酸序列SEQIDNO:5。圖6:顯示一種具有活性的N端附加氨基酸的Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:6。N末端的Met在表達(dá)后有時會被刪除。圖7:PEG與具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶聯(lián)。反應(yīng)條件是4。C，10h。反應(yīng)后溶液用SDS-PAGE檢測，泳道.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:Kl-3;泳道38分別是PEG與Kl-3摩爾比均為5:1，pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0條件修飾后的Kl-3;泳道9~12分別是pH5.5、20k:DaPEG與Kl-3摩爾比分別為1:1、2:1、5:1、10:l條件修飾后的Kl-3。圖8:PEG與具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶聯(lián)。反應(yīng)條件是室溫，10h。反應(yīng)后溶液用SDS-PAGE檢測，泳道:l:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:Kl-3;泳道38分別是PEG與Kl-3摩爾比均為5:1，pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0條件修飾后的Kl-3;泳道912分別是pH5.5、PEG與Kl-3摩爾比分別為1:1、2:1、5:1、:0:l條件修飾后的Kl-3。圖9:PEG與具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶聯(lián)。反應(yīng)前后溶液用SDS-PAGE檢測，泳道l:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:Kl-3;泳道3:PEG修飾的Kl-3。圖10:PEG修飾具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端偶聯(lián)后，用陽離子柱SP純化。使用陽離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測純化效果。泳道l:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:純化前；泳道3:上樣穿透的溶液；泳道4-13:分布收集的洗脫液。圖11:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物的體內(nèi)代謝試驗(yàn)結(jié)果。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。圖12:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。圖13:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的自我修復(fù)活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的K1-3。圖14:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。圖15:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)增殖的活性。Kl曙3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。圖16:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞(Hela)增殖的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。圖17:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制小鼠黑色素瘤(B16)的活性。Kl-3-4.5-1:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每天給藥；PEG-K1-3-1.5-1:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，1.5mg/kg體重，每天給藥；PEG-Kl-3-4.5-1:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每天給藥；PEG-Kl-3-4.5-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每3天給藥；PEG-Kl-3-4.5-6:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每6天給藥。PEG-Kl-3-4.5-9:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每9天給藥。圖18:PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制小鼠肝癌(H22)的活性。Kl-3-4.5-1:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每天給藥PEG-K1-3-1.5-1:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，1.5mg/kg體重，每天給藥；PEG-Kl-3-4.5-hPEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每天給藥；PEG-Kl-3-4.5-3:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每周給藥2次；PEG-Kl-3-4.5-7:PEG修飾的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg體重，每周給藥1次。具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，提供下述實(shí)施例。下述實(shí)施例僅是為了說明本發(fā)明而非對本發(fā)明進(jìn)行具體限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚本發(fā)明同時還包括對下述實(shí)施例所述的技術(shù)方案進(jìn)行任何無需創(chuàng)造性勞動的改變所產(chǎn)生的技術(shù)方案。除非特別說明，下述實(shí)施例中所用聚乙二醇(PEG)是082MOP01MPEG-BUTYRALD-20K,NETKTAR,Lot#:PT-03G-05。實(shí)施例l、不同條件下PEG與Kl-3N端的偶聯(lián)。本實(shí)施例涉及的Kl-3(購自普羅吉公司，中國)是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。將Kl-3透析到pH5.5的30mM醋酸鈉(購自北京化學(xué)試劑公司，中國)溶液中。用紫外分光光度計(8453，Agilent)在280nm波長下測量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到1mg/ml。Kl-3與特異修飾蛋白N端的PEG偶聯(lián)。第一種情況，在pH值5.5時，取10ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白10mg)，按照PEG與Kl-3的摩爾比分別為1:1、2:1、5:1、10:1，加入20kDaPEG固體，并室溫攪拌，直到完全溶解，加入還原劑CH3BNNa(Sigma)，濃度為20mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.5。第二種情況，取10ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白10mg)，按照PEG與Kl-3的摩爾比為5:1，加入PEG固體，室溫攪拌，直到完全溶解,加入還原劑CH3BNNa，濃度為20mM，最后調(diào)節(jié)pH值分別為5.0，5.5,6.0,6.5,7.0，8.0。分別在室溫和4i:靜置不同時間以后，觀察比較Kl-3被單一PEG修飾的情況，即一個PEG與一個Kl-3偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是Kl-3N端的a-氨基，少量Kl-3會被非特異性的多位點(diǎn)修飾。這樣就可以找出PEG與Kl-3反應(yīng)的最佳條件。反應(yīng)前后溶液電泳結(jié)果如圖7-8所示。實(shí)施例2、PEG與K1-3N端的偶聯(lián)。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。將Kl-3透析到pH5.5的30mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計在280nm波長下測量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到1mg/ml。與特異修飾蛋白N端的PEG偶聯(lián)時，取20ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白20mg)，加入PEG固體100mg，并室溫攪拌，直到完全溶解，使得PEG與Kl-3的摩爾比為5:1。加入還原劑CH3BNNa,濃度為20mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.5。室溫靜置6h以后，高于80%的Kl-3被單一PEG修飾，即一個PEG與一個Kl-3分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點(diǎn)是Kl-3N端的a-氨基，少量Kl-3會被非特異性的多位點(diǎn)修飾。這時反應(yīng)液可直接上柱純化。反應(yīng)前后溶液電泳結(jié)果如圖9所示。實(shí)施例3、PEG修飾K1-3N端后用陽離子柱SP純化。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。將PEG修飾的Kl-3用SP層析柱(Amersham)純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為5。層析柱用含有20mM醋酸鈉，pH值為5.0的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有20mM醋酸鈉，1M氯化鈉，pH5.0的洗脫緩沖液梯度洗脫，未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎桲l-3、單修飾Kl-3、Kl-3。根據(jù)280nm的紫外檢測可以收集不同的分離組分。純化結(jié)果如圖IO所示。實(shí)施例4、PEG與K1-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在血液中的長效效應(yīng)。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。測定K1-3和PEG修飾的Kl-3在Wistar大鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心)體內(nèi)的代謝速率來檢驗(yàn)PEG修飾后產(chǎn)物在血液中的長效效益。選用2只200克左右體重的健康大鼠，分別尾靜脈注射Kl-3和PEG修飾的K1-3N端偶聯(lián)產(chǎn)物，4.5mg/kg體重。按照0、5、10、30分鐘、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96、120、144h的時間間隔眼眶取血。收集血漿，用夾心法ELISA分別測K1-3和PEG修飾的K1-3的濃度。體內(nèi)藥代動力學(xué)顯示，PEG修飾的Kl-3在大鼠體內(nèi)的半衰期為81.5h，而Kl-3在大鼠體內(nèi)的半衰期僅為12.2h，這表明偶聯(lián)高分子量的PEG能有效的增加Kl-3在體內(nèi)代謝的半衰期，以達(dá)到長效的目的。結(jié)果如圖ll所示。實(shí)施例5、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。將HUVEC(普羅吉公司，北京)在含有20。/。胎牛血清(Hyclone)的M199培養(yǎng)液(Hyclone)中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后饑餓12h。之后加入測細(xì)胞遷移皿(Millipore,USA)中，每孔細(xì)胞數(shù)104個。遷移條件為含5%胎牛血清的M199培養(yǎng)液。加藥組分別加入Kl-3和PEG修飾的Kl-3，濃度分別為0.004昭/ml、0.04昭/ml、0.4嗎/ml、4嗎/ml。37°C楚泰8h，用1%戊二醛(北京化工廠，中國)固定細(xì)胞，刮掉膜上層的未遷移細(xì)胞，用蘇木精、伊紅(北京化學(xué)試劑公司，中國)染色。在顯微鏡下，取大小相同三個視野，計算細(xì)胞數(shù)，最后算出抑制率。結(jié)果顯示在0.04-4ng/ml的范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，對細(xì)胞遷移的抑制增強(qiáng)，結(jié)果顯示具有SEQIDNO:2序列的Kl-3對細(xì)胞遷移的抑制率分別為43%、68%、76%，PEG修飾后的Kl-3對細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到58%、65%、69%。以上結(jié)果表明經(jīng)過PEG修飾的Kl-3保持其原有的生物活性。結(jié)果如圖12所示。實(shí)施例6、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷修復(fù)的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3對HUVEC損傷修復(fù)的影響。將HUVEC以2xl()S個/ml的密度接種在12孔板(Coming公司)中，在含20%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后饑餓12h，在孔中輕輕劃一十字交叉線,,洗凈懸浮細(xì)胞。試驗(yàn)設(shè)為陰性對照組(PBS)，陽性對照組(Kl-3濃度分別為0.04jxg/ml、0.4pg/ml、4嗎/mO，給藥組(PEG修飾的Kl-3的濃度分別為0.04嗎/ml、0.4嗎/ml、4嗎/ml)。37。C培養(yǎng)16h，測細(xì)胞的遷移量。通過對細(xì)胞遷移的抑制來計算其藥效。結(jié)果顯示在0.04-4嗎/ml的范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，對細(xì)胞遷移的抑制增力口，其抑制率分別為0%、20%、25%;PEG修飾的Kl-3的抑制率分別為35%、40%、105%。結(jié)果表明經(jīng)PEG修飾后的Kl-3不僅保持而且大大加強(qiáng)其生物活性，同時在4嗎/ml濃度時，伴隨一些細(xì)胞的皺縮死亡。結(jié)果如圖13所示。實(shí)施例7、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。釆用饑餓過夜的HUVEC，以2xl0"個/ml的密度接種在96孔板(Corning)中，含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后饑餓12h。在按照試驗(yàn)設(shè)計加入不同濃度的Kl-3以及PEG修飾的Kl-3。實(shí)驗(yàn)設(shè)為陰性對照組(PBS)、陽性對照組(Kl-3濃度分別為0.04昭/ml、0.4嗎/ml、4嗎/ml)、給藥組(PEG修飾的Kl-3的濃度分別為0.04|ig/ml、0.4fig/ml、4pg/ml)。37。C培養(yǎng)48h，加入MTT(Amresco公司)，37。C孵育4h，加入DMSO(生工生物工程公司，中國)，酶標(biāo)儀(Model550,Biorad公司)570nm測其吸收值。結(jié)果如圖14所示。實(shí)施例8、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)增殖的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。采用饑餓過夜HMEC(ATCC弁CRL10636，USA)，以2xl()4個/ml的密度接種在96孔板中，在含10%血清的DMEM中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后饑餓12h。在預(yù)先試驗(yàn)設(shè)計加入不同濃度的未修飾以及修飾后的Kl-3。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(PBS)、陽性對照組(Kl-3濃度分別為0.04嗎/ml、0.4(ig/ml、4嗎/ml)、給藥組(PEG修飾的Kl-3的濃度分別為0.04fxg/ml、0.4lag/ml、4嗎/ml)。37。C培養(yǎng)48h，加入MTT，37。C孵育4h，加入DMSO，酶標(biāo)儀570nm測其吸收值。結(jié)果如圖15所示。實(shí)施例9、PEG與K1-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞，Hda)增殖的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。以2x104的密度將Hela細(xì)胞(ATCC弁CCL-2，USA)接種在96孔板中，在含10。/。血清的DMEM中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后饑餓12h。在按照試驗(yàn)設(shè)計加入不同濃度的Kl-3以及PEG修飾的Kl-3。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(PBS)、陽性對照組(Kl-3濃度分別為0.4)ag/ml、4|j.g/ml、40ng/ml、150pg/ml)、給藥組(PEG修飾的Kl-3的濃度分別為:0.4(xg/ml、4昭/ml、40嗎/ml、150嗎/ml)。37。C培養(yǎng)48h，力口入MTT，37r孵育4h，加入DMSO，酶標(biāo)儀570nm測其吸收值。結(jié)果顯示，PEG修飾后的Kl-3比Kl-3具有更好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，Kl-3和PEG修飾的Kl-3在濃度為40pg/ml時的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性最好，明顯的高于150pg/ml以及0.4pg/ml、4pg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示。實(shí)施例10、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在小鼠黑色素瘤(B16)模型晚期治療中的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDN0:2序列的Kl-3。實(shí)驗(yàn)觀察了PEG修飾的Kl-3對小鼠B16腫瘤的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用20克體重的C57B/L小鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心)，背部接入lxl()S個黑色素瘤細(xì)胞(ATCC井CRL-6475TM，USA)。待腫瘤長起分組，每組8只，分別設(shè)陰性對照組(20mM醋酸鈉溶液)、陽性對照組(Kl-34.5mg/kg體重，每天給藥)、給藥組(PEG修飾的Kl-31.5mg/kg體重，每天給藥；PEG修飾的Kl-34.5mg/kg體重，分別每l、3、6、9天給藥)。待腫瘤長至lci^開始分組，分組后即可給藥，給藥方式為皮下注射。給藥周期為IO天，第ll天處死小鼠，稱瘤重，以抑瘤率來評價藥效。對于具有SEQIDN0:2序列的重組人血管抑素Kl-3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性對照組的抑瘤率為45%，給藥組1.5mg/kg體重，每天給藥組的抑瘤率為28%;4.5mg/kg體重每l、3、6、9天給藥組的抑瘤率分別為60%、34%、25%、24%。表明同劑量的PEG修飾的Kl-3，比Kl-3具有體內(nèi)更高的抑瘤活性;并且較低給藥劑量的PEG修飾的Kl-3也具有一定的抑瘤效果。結(jié)果如圖17所示。實(shí)施例11、PEG與Kl-3N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在小鼠肝癌(H22)模型早期治療中的活性。本實(shí)施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。實(shí)驗(yàn)觀察了PEG修飾的Kl-3對小鼠肝癌的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用20克體重的Babl/c小鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心)，背部接入lxl06個肝癌細(xì)胞。分別設(shè)定陰性對照組(20mM醋酸鈉溶液)、陽性對照組(Kl-34.5mg/kg體重，每天給藥)、給藥組(PEG修飾的Kl-31.5mg/kg體重，每天給藥；4.5mg/kg體重，分別每天、每周2次、每周1次給藥)。接瘤的第2天分組給藥。給藥方式為皮下注射。給藥周期為3周，第22天處死小鼠，稱瘤重，以抑瘤率來評價藥效。對于具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性對照組的抑瘤率為51%，給藥組1.5mg/kg體重，每天給藥組的抑瘤率為54%;4.5mg/kg體重每天、每周2次、每周1次給藥組的抑瘤率分別為60%、84%、50%。表明同劑量的Kl-3，比Kl-3具有體內(nèi)更高的抑制肝癌生長的活性；并且低劑量修飾的Kl-3組對肝癌生長的抑制率高于高劑量Kl-3組；同時由于PEG修飾的Kl-3在體內(nèi)代謝速度減慢:，因此在延長給藥間隔的情況下，相同劑量的PEG修飾的Kl-3高于Kl-3的生物活性，其中每周給藥2次的抑瘤效果最好，達(dá)到了80%以上。結(jié)果如圖18所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>ThrThrProProProSerSerGlyProThrTyrGinCysLeuLysGly165.170175ThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHis180185190ThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrProHisThrHisAsnArgTh]:195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGinVal225230235240ArgTrpGluTyrCysLyslieProSerCys245250<210>2<211>260<212>PRT<213>Homosapiens<400>2MetValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArg151015GlyThrMetSerLysThrLysAsnGlylieThrCysGinLysTrpSer202530SerThrSerProHisArgProArgPheSerProAlaThrHisProSer354045GluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspProGin505560GlyProTrpCysTyrThrThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCys65707580AsplieLeuGluCysGluGluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsn859095TyrAspGlyLyslieSerLysThrMetSerGlyLeuGluCysGinAla100105110TrpAspSerGinSerProHisAlaHisGlyTyrlieProSerLysPhe115120125ProAsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGlu130135140LeuArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeu145150155160CysAsplieProArgCysThrThrProProProSerSerGlyProThr165170175TyrGinCysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAla180185190ValThrValSerGlyHisThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrPro195200205HisThrHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAsp210215220GluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHis225230235240ThrThrAsnSerGinValArgTrpGluTyrCysLyslieProSerCys245250255AspSerSerPro260<210>3<211>79<212>PRT<213>Homosapiens<400>3CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlylieThrCysGinLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGinGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAsplieLeuGluCys657075<210>4<211>78<212>PRT<213>Hoiaosapiens<400>4CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLyslieSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGinAlaTrpAspSerGinSerProHisAla202530HisGlyTyrlieProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAsplieProArgCys657075<210>5<211>78<212>PRT<213>Homosapiens<400>5CysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThr151015ValSerGlyHisThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrProHisThr202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThr50556065<210><211><212><213>70756266PRTHomosapiens<400>6MetHisHisHisHisHisHisValTyrLeuSerGluCysLysThrGly151015AsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThrLysAsnGlylie202530ThrCysGinLysTrpSerSerThrSerProHisArgProArgPheSer354045ProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn505560ProAspAsnAspProGinGlyProTrpCysTyrThrThrAspProGlu65707580LysArgTyrAspTyrCysAsplieLeuGluCysGluGluGluCysMet859095HisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLyslieSerLysThrMetSer100105110GlyLeuGluCysGinAlaTrpAspSerGinSerProHisAlaHisGly115120125TyrlieProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCys130135140ArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThrAspPro145150155160AsnLysArgTrpGluLeuCysAsplieProArgCysThrThrProPro165170175ProSerSerGlyProThrTyrGinCys!LeuLysGlyThrGlyGluAsn180185190TyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHisThrCysGinHis195200205TrpSerAlaGinThrProHisThrHisAsnArgThrProGluAsnPhe210215220ProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyLys22523023524CArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGinValArgTrpGluTyr245250255CysLyslieProSerCysAspSerSerPro260265<210>7<211>715<212>PRT<213i>Homosapiens<徹>7MetProSerThrSerPheProValProSerLysPheProLeuGlyPro151015AlaAlaAlaValPheGlyArgGlyGluThrLeuGlyProAlaProArg202530AlaGlyGlyThrLysSerAlaGluGluGluHisTyrGlyTyrAlaSer354045SerAsnValSerProAlaLeuProLeuProThrAlaHisSerThrLeu505560ProAlaProCysHisAsnLeuGinThrSerThrProGly工leliePro65707580ProAlaAspHisProSerGlyTyrGlyAlaAlaLeuAspGlyGlyPro859095AlaGlyTyrPheLeuSerSerGlyHisThrArgProAspGlyAlaPro100105110AlaLeuGluSerProArglieGlulieThrSerCysLeuGlyLeuTyr115120125HisAsnAsnAsnGinPhePheHisAspValGluValGlu.AspValLeu130135140ProSerSerLysArgSerProSerThrAlaThrLeuSerLeuProSer145150155160LeuGluAlaTyrArgAspProSerCysLeuSerProAlaSerSerLeu165170175SerSerArgSerCysAsnSerGluAlaSerSerTyrGluSerAsnTyr180185190SerTyrProTyrAlaSerProGinThrSerProTrpGinSerProCys195200205ValSerProLysThrThrAspProGluGluGlyPheProArgGlyLeu210215220GlyAlaCysThrLeuLeuGlySerProArgHisSerProSerThrSer225230235240ProArgAlaSerValThrGluGluSerTrpLeuGlyAlaArgSerSer245250255ArgProAlaSerProCysAsnLysArgLysTyrSerLeuAsnGlyArg260265270GinProProTyrSerProHisHisSerProThrProSerProHisGly275280285SerProArgValSerValThrAspAspSerTrpLeuGlyAsnThrThr290295300GinTyrThrSerSerAlalieValAlaAlalieAsnAlaLeuThrThr305310315320AspSerSerLeuAspLeuGlyAspGlyValProValLysSerArgLys325330335ThrThrLeuGluGinProProSerValAlaLeuLysValGluProVal340345350GlyGluAspLeuGlySerProProProProAlaAspPheAlaProGlu355360365AspTyrSerSerPheGinHislieArgLysGlyGlyPheCysAspGin370375380LeuSerProThrSerTyrMetSerProThrLeuProAlaLeuAspTrp405410415GinLeuProSerHisSerGlyProTyrGluLeuArglieGluValGin420425430ProLysSerHisHisArgAlaHisTyrGluThrGluGlySerArgGly435440445AlaValLysAlaSerAlaGlyGlyHisProlieValGinLeuHisGly450455460TyrLeuGluAsnGluProLeuMetLeuGinLeuPhelieGlyThrAla465470475480AspAspArgLeuLeuArgProHisAlaPheTyrGinValHisArglie485490495ThrGlyLysThrValSerThrThrSerHisGluAlalieLeuSerAsn500505510ThrLysValLeuGlulieProLeuLeuProGluAsnSerMetArgAla515520525VallieAspCysAlaGlylieLeuLysLeuArgAsnSerAsplieGlu530535540LeuArgLysGlyGluThrAsplieGlyArgLysAsnThrArgValArg545550555560LeuValPheArgValHisValProGinProSerGlyArgThrLeuSer565570575LeuGinValAlaSerAsnProlieGluCysSerGinArgSerAlaGin580585590GluLeuProLeuValGluLysGinSerThrAspSerTyrProValVal595600605LeuAlaValProGinHisProTyrGinTrpAlaLysProLysPro390395400r5y8T3GlyGlyLysJLysMetValLeuSerGlyHisAsnPheLeuGinAspSer610615620LysValliePheValGluLysAlaProAspGlyHisHisValTrpGlu625630635640MetGluAlaLysThrAspArgAspLeuCysLysProAsnSerLeuVal645650655ValGlulieProProPheArgAsnGinArglieThrSerProValHis660665670ValSerPheTyrValCysAsnGlyLysArgLysArgSerGinTyrGin675680685ArgPheThrTyrLeuProAlaAsnGlyAsnAlaliePheLeuThrVal690695700SerArgGluHisGluArgValGlyCysPhePhe70571071權(quán)利要求1.一種修飾物與血管抑素片段K1-3形成的復(fù)合物，所述復(fù)合物具有比未修飾的血管抑素片段K1-3更長的體內(nèi)半衰期，所述修飾物選自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。2.權(quán)利要求l的復(fù)合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是人、鼠或其他哺乳動物來源的血纖溶酶原片段Kl-3或其具有活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是具有SEQIDNO:l所示序列的人血管抑素片段Kl-3或其具有活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。4.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是重組血管抑素片段Kl-3。5.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述重組血管抑素片段Kl-3是具有SEQIDNO:2所示序列的重組人血管抑素片段Kl-3或其具有活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。6.權(quán)利要求5的復(fù)合物，其中所述重組人血管抑素片段Kl-3由大腸肝菌表達(dá)，其中N末端的Met在大腸肝菌表達(dá)時任選地被刪除。7.權(quán)利要求l-6任一項的復(fù)合物，所述修飾物與血管抑素片段Kl-3通過共價鍵連接。8.權(quán)利要求1的復(fù)合物，所述修飾物是聚乙二醇。9.權(quán)利要求8的復(fù)合物，所述聚乙二醇是單甲基聚乙二醇。10.權(quán)利要求8的復(fù)合物，其中所述聚乙二醇是線性的或是分叉的。11.權(quán)利要求8-10的復(fù)合物，其中所述聚乙二醇分子量位于1,000到100，000道爾頓之間，優(yōu)選分子量為20kDa的單甲基聚乙二醇。12.權(quán)利要求8-10任一項的復(fù)合物，其特征為一個血管抑素片段Kl-3與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管抑素的N端a-氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的s-氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一種或其組13.權(quán)利要求12的復(fù)合物，其特征為一個血管抑素片段Kl-3與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管抑素片段Kl-3的N端a-氨基或SEQIDNO:l所示序列第2、7、、17、24、69、94、97、121、125、128、129、150、175、215、228、246位的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的s-氨基或其組合。14.權(quán)利要求12的復(fù)合物，其特征為一個血管抑素片段Kl-3與一個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素片段Kl-3N端的a-氨基。15.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其特征為一個具有SEQIDNO:2的重組人血管抑素分子的片段Kl-3與一個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。16.權(quán)利要求15的復(fù)合物，其特征為一個具有SEQIDNO:2的重組人血管抑素分子的片段Kl-3與一個20kDa單甲基聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。17.權(quán)利要求12的復(fù)合物，其特征為一個血管抑素片段Kl-3與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管抑素天冬氨酸或谷氨酸殘基側(cè)鏈上的羧基。18.權(quán)利要求8-11任一項的復(fù)合物，其特征為一個血管抑素片段Kl-3與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)方法為在血管抑素片段Kl-3分子內(nèi)部或其N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽鏈，使得偶聯(lián)位點(diǎn)為附加的半胱氨酸殘基側(cè)鏈上的巰基。19.權(quán)利要求1-18任一項的復(fù)合物與生物相容性物質(zhì)形成的緩釋制劑。20.權(quán)利要求19的緩釋制劑，所述的緩釋制劑選自微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。21.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-20中任一項的復(fù)合物或緩釋制劑和藥學(xué)上可接受的載體。22.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-21的復(fù)合物、緩釋制劑或藥物組合物和使用說明。23.制備權(quán)利要求8-18任一項的復(fù)合物的方法，其特征是在足以使活化的聚乙二醇與血管抑素片段Kl-3發(fā)生反應(yīng)的溶液、溫度、pH、摩爾比的條件下將活化的聚乙二醇與血管抑素片段Kl-3混合。24.權(quán)利要求23的方法，其中pH為5-7，聚乙二醇與血管抑素片段Kl-3摩爾比為1:1至U10:1。25.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括將偶聯(lián)產(chǎn)物用陽離子柱純化。26.權(quán)利要求1-21的復(fù)合物、緩釋制劑或藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。27.權(quán)利要求26的用途，所述腫瘤選自肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤或其他腫瘤。28.權(quán)利要求1-21的復(fù)合物、緩釋制劑或藥物組合物在制備治療非腫瘤疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征為新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變。29.權(quán)利要求26-28的用途，其中所述藥物適于靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式。30.—種延長血管抑素片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含將修飾物與血管抑素片段Kl-3形成復(fù)合物的步驟，所述修飾物選自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。31.—種延長血管抑素片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含將血管抑素片段Kl-3或由一種修飾物與血管抑素片段Kl-3形成的復(fù)合物與生物相容性物質(zhì)形成緩釋制劑的步驟，所述修飾物選自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗腫瘤或抗新生血管生成疾病的藥物及含有這種藥物的藥物組合物及試劑盒，同時也公開了制備這種抗腫瘤或抗新生血管生成疾病藥物的方法。本發(fā)明中的抗腫瘤或抗新生血管生成疾病的藥物包含一種修飾物與血管抑素或其片段形成的復(fù)合物，所述復(fù)合物具有比無修飾物的血管抑素或其片段更長的體內(nèi)半衰期，所述修飾物選自高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。文檔編號A61K47/48GK101219219SQ200710004558公開日2008年7月16日申請日期2007年1月10日優(yōu)先權(quán)日2007年1月10日發(fā)明者常國棟,楊恕玲,羅永章,磊高申請人:北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司