專利名稱：一種放射性錸標記人纖溶酶原kringle5蛋白及其制備方法
一種放射性錸標記人纖溶酶原kr ingle 5蛋白及其制備方
法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種放射性標記蛋白及其制備方法以及該放射性標記蛋白的應用。
背景技術(shù)：
目前國際上以腫瘤血管為靶點的藥物已有多種，許多已進入臨床試驗或者被批準臨床應用。如Endostatin(內(nèi)皮抑素)已于2005年被FDA批準進入臨床；Angiostatin(血管抑素)也已進入臨床試驗I期。Cao 等已發(fā)現(xiàn)重組人纖溶酶原 Kringle 5 (Recombinant HumanPlasminogen Kringle5, rhk5)作為腫瘤血管生成抑制劑，活性等各方面優(yōu)于上述藥物，具有潛在的應用價值。核素標記血管生成抑制劑可通過β射線達到增強腫瘤靶向治療的效果，降低腫瘤血管生成抑制劑的用量，降低成本。目前國外已有類似研究，如Yang等使用99mTc標記 Endostatin的實驗研究顯示腫瘤可以清晰顯像；Lee等使用123I標記的Agiostatin取得了同樣的效果。目前尚未見采用具有優(yōu)良理化性質(zhì)的放射性核素188Re標記具有更強腫瘤血管抑制作用的rhk5的研究、特別是治療的研究報道。Endostatin及Angiostatin等若要達到治療效果需持續(xù)給藥，且費用昂貴。99mTc標記Endostatin的實驗研究顯示腫瘤可以清晰顯像，但不能用于治療；Lee等使用123I標記的Agiostatin取得了同樣的效果，但標記不穩(wěn)定。 核素直接標記蛋白常會造成蛋白活性的損傷。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效的抗腫瘤藥物188Re-rhk5，即核素188Re標記的重組入纖溶酶原Kringle 5蛋白。本發(fā)明的第二個目的是提供188Re-rhk5的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供188Re-rhk5在抑制腫瘤生長中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案一種核素標記rhk5蛋白，其特征在于，所述核素為188Re。188Re-rhk5的制備方法，包括步驟(1)和步驟(2)步驟(l)rhk5蛋白的表達，形成羧基端連接6XHis -Tag的融合蛋白，可以優(yōu)選通過下述兩種方式獲得將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達載體質(zhì)粒pET_22b (+)—氨基端加入信號肽序列一羧基端加入6 XHis序列一當pET-22b (+) _k5在BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導后，在rhk5氨基端表達信號肽段，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，同時切除信號肽，形成羧基端連接6 X Hi s · Tag的融合蛋白。
或者，將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達載體質(zhì)粒pFastbacl —羧基端加入 6XHis序列一當pFaStbacl-rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲sf9細胞內(nèi)孵育后，以可溶性方式表達rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白。步驟(2)三羰基錸標記rhk5的核心步驟1)取5mg BH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min。2)在lmL188Re04_的生理鹽水淋洗液中，力口入7 μ L濃Η3Ρ04。3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加熱15min。4)測定反應后生成的中間體fac-[188Re[(CO)3(H2O)3]+的螯合率。5)三羰基錸標記rhk5，優(yōu)化后的標記條件為rhk520 μ g，加入0. lmL188Re04"淋洗液，調(diào)節(jié)溶液的PH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育lh。步驟⑵中測定反應后生成的中間體faC-[188Re[(C0)3(H20)3] +的螯合率，以GF254 硅膠薄板為固定相，V(甲醇)V(濃鹽酸)=99 1為流動相，在放射性薄層掃描儀上進行測定。步驟(2)中使用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值為5. 0。荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布研究表明腫瘤組織的188Re-rhk5攝取隨時間延長逐漸增高，在2h時最高；rhk5能在新生血管密集部位積聚，用放射性核素標記rhk5進行腫瘤顯像是可行的；初步治療實驗顯示單次瘤內(nèi)注射37MBq188Re-rhk5，對腫瘤及腫瘤血管有放射治療作用，18天后抑瘤率達37.2%。本發(fā)明的積極效果(1)三羰基錸標記法采用組氨酸作為雙功能螯合劑，間接標記rhk5，不與二硫鍵作用，保留了 rhk5蛋白活性；(2)核素188Re標記rhk5，通過核素的β 射線及交叉火力作用，不但增強抗腫瘤血管生成作用、減少了藥物用量，而且彌補了靶向性之不足；(3)188Re_rhk5在使用β射線治療的同時可以用其發(fā)射的Y射線來進行顯像，監(jiān)測治療效果。

圖1中間體fac- [188Re (CO) 3 (H2O) 3] +的合成并用放射薄板層析法(RTLC)鑒定；圖2純化前標記產(chǎn)物在9g/L生理鹽水展開體系中RTLC分析結(jié)果；圖3純化后標記產(chǎn)物在9g/L生理鹽水展開體系中RTLC分析結(jié)果；圖4純化后標記產(chǎn)物在乙醇氨水(2 1 5V/V/V)展開體系中RTLC分析結(jié)果；圖5188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的組織分布(η = 3)；圖6188Re-rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)阻斷前后的組織學分布(2h) (η = 3)；圖7 :188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的顯像圖A，B分別為各時間點的顯像圖； A，0. 5h ；B，2h ；箭頭所指部位為腫瘤；圖8188Re-rhk5 治療后腫瘤生長抑制曲線188Re_rhk5 (37MBq)、188Re (37MBq)、 rhk5(15mg/kg)和0.9%生理鹽水治療后18天內(nèi)腫瘤大小的改變，每組6只，*代表P < 0. 05，**代表P < 0. 01 (188Re-rhk5治療組與其余各組比較)。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明。制備實施例1(l)rhk5蛋白的表達將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達載體質(zhì)粒 pET-22b(+)—氨基端加入信號肽序列一羧基端加入6XHi s序列一當pET-22b(+)-k5在 BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導后，可以在rhk5氨基端表達信號肽段，通過信號肽可以將蛋白產(chǎn)物分泌到大腸桿菌內(nèi)、外膜間的外周質(zhì)，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成具有功能的可溶性融合蛋白，同時切除信號肽，使其接近天然蛋白。羧基端連接6XHis -Tag的融合蛋白，利用His -Tag不但可用來進行鎳柱純化，而且為蛋白質(zhì)的western blot鑒定及后續(xù)的核素三羰基錸間接法標記rhk5奠定了基礎(chǔ)。(2)三羰基錸標記rhk5 取5mg BH3 -NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min —在lmL188Re04_的生理鹽水淋洗液中，加入7 μ L濃H3PO4 —混勻后注射到已通好CO 的西林瓶中，70°C水浴加熱15min—采用放射薄板層析法(RTLC)測定反應后生成的中間體 faC-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅膠薄板為固定相，V(甲醇)V(濃鹽酸)= 99 1為流動相，在放射性薄層掃描儀上進行測定。如圖1所示，放射薄板層析法鑒定顯示， 中間體fac-[188Re (CO) 3 (H2O) 3]+合成后純度很高(前面的峰)，幾乎無雜質(zhì)，可直接用來進行下一步實驗。一采用正交實驗得出優(yōu)化后的標記條件rhk520y g，加入0. lmL188Re04_淋洗液(37_370MBq)，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育 lh。標記產(chǎn)物經(jīng)RTLC分析結(jié)果如圖1所示，標記率可達65%以上，放射化學純度可達95% 以上，如圖3、圖4所示。制備實施例2(l)rhk5蛋白的表達將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達載體質(zhì)粒 pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一當pFastbacl_rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲sf9細胞內(nèi)孵育后，可以以可溶性方式表達rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成具有功能的可溶性融合蛋白，羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白，利用His · Tag不但可用來進行鎳柱純化，而且為蛋白質(zhì)的western blot鑒定及后續(xù)的核素三羰基錸間接法標記rhk5奠定了基礎(chǔ)。真核表達的rhk5蛋白活性較高，但是產(chǎn)量較低。大規(guī)模制備時還是選用原核表達的方法更適合。(2)三羰基錸標記rhk5的方法同實施例1。應用實施例1荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布研究表明腫瘤組織的188Re-rhk5攝取隨時間延長逐漸增高，在2h時最高；rhk5能在新生血管密集部位積聚，用放射性核素標記rhk5進行腫瘤顯像是可行的；初步治療實驗顯示單次瘤內(nèi)注射37MBq188Re-rhk5，對腫瘤及腫瘤血管有放射治療作用，18天后抑瘤率達37.2%。188Re_rhk5經(jīng)單劑量靜脈注射后，如圖2所示，188Re-rhk5在血中清除較快。腎臟與其他器官組織相比，在不同時間段有明顯的高放射性攝取，是由于標記物主要通過泌尿系統(tǒng)排泄所致。其余臟器放射性攝取相對較低，隨時間延長而攝取逐漸減低。腫瘤組織有相對高的攝取，且與其它臟器相反，在0-2h內(nèi)，隨時間延長而攝取逐漸增高，在腫瘤內(nèi)滯留時間較長。隨后的特異性阻斷實驗中于188Re_rhk5顯像前30min靜脈注射IOOyg rhk5，在注射后2h處死裸鼠，各臟器的分布測定結(jié)果如圖3所示腫瘤部位的188Re-rhk5攝取下降。證實了 188Re_rhk5與腫瘤結(jié)合的特異性。其余臟器分布在阻斷前后未見明顯變化。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種核素標記rhk5蛋白，其特征在于，所述核素為188Re。
2.如權(quán)利要求1所述的188Re_rhk5的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)rhk5蛋白的表達，形成羧基端連接6XHis· Tag的融合蛋白；(2)三羰基錸標記rhk51)取5mgBH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min ；2)在ImL188ReO4-的生理鹽水淋洗液中，力Π入7μ L濃H3PO4 ；3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加熱15min；4)測定反應后生成的中間體fac_[188Re [ (CO) 3 (H2O) 3] +的螯合率；5)三羰基錸標記rhk5，優(yōu)化后的標記條件為rhk520yg，加入0. lmL188Re04_淋洗液，調(diào)節(jié)溶液的PH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育lh。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(l)rhk5蛋白的表達包括如下步驟將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達載體質(zhì)粒pET_22b (+)—氨基端加入信號肽序列一羧基端加入6XHis序列一當pET-22b (+)_k5在BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導后， 在rhk5氨基端表達信號肽段，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，同時切除信號肽，形成羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(l)rhk5蛋白的表達包括如下步驟將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達載體質(zhì)粒pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一當pFaStbacl-rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲sf9細胞內(nèi)孵育后，以可溶性方式表達rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成羧基端連接6 X His · Tag的融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(2)中測定反應后生成的中間體fac-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅膠薄板為固定相，V甲醇V濃 asg= 99 1為流動相，在放射性薄層掃描儀上進行測定。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(2)中使用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的PH值為5.0。
7.如權(quán)利要求1所述的188Re_rhk5在抑制腫瘤生長中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種188Re-rhk5蛋白及其制備方法，三羰基錸標記法采用組氨酸作為雙功能螯合劑，間接標記rhk5，不與二硫鍵作用，保留了rhk5蛋白活性。核素188Re標記rhk5，通過核素的β射線及交叉火力作用，不但增強抗腫瘤血管生成作用、減少了藥物用量，而且彌補了靶向性的不足。
文檔編號A61P35/00GK102268423SQ20101019305
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者張嵐, 曹本紅, 李彪 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院, 上海原子科興藥業(yè)有限公司, 中國科學院上海應用物理研究所