專利名稱：miR-199a及其抑制劑的應(yīng)用的制作方法
miR-199a及其抑制劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)microRNA的研究領(lǐng)域，更具體地講，涉及miR_199a及其抑制物在心臟疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心臟病是心臟疾病的總稱，包括風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、高血壓性心臟病、 冠心病、心肌疾病等各種心臟病。心臟病是目前危害人類健康的主要疾病之一。心臟在受到各種生理刺激，組織損傷或者內(nèi)分泌失調(diào)的情況下會產(chǎn)生肥厚性生長以維持心臟血輸出量。在體內(nèi)，引發(fā)心肌肥厚的信號種類繁多，包括超負(fù)荷的機械牽拉力， 血流動力學(xué)壓力，以及神經(jīng)活動，激素分泌等。通過模擬這些誘發(fā)因素，可以人為的建立實驗動物的心肌肥厚模型。例如通過主動脈縮窄方法建立整體壓力超負(fù)荷肥厚模型、α-腎上腺素能受體激動劑誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大模型。在以往的研究中，通過這些模型，人們檢測出了對心肌肥厚具有正性激活或負(fù)性抑制的一系列重要因子，繪制與心肌肥厚相關(guān)的信號途徑。MicroRNA是近年來在果蠅、線蟲、小鼠和人等多種生命體中被發(fā)現(xiàn)的一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的小分子RNA。這一內(nèi)源性的小分子RNA的大量發(fā)現(xiàn)得益于兩種技術(shù)，一種是 microRNA cDNA文庫的構(gòu)建和測序技術(shù)；另一種是生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針捕獲，通過接頭引物進行PCR擴增的技術(shù)。通過文庫的構(gòu)建和測序，人們掌握了 microRNA的大量序列信息，通過對這些序列進行生物信息學(xué)比對分析，人們發(fā)現(xiàn)大部分microRNA在物種間高度保守，在進化上高度同源。關(guān)于microRNAs的基因組定位，早期普遍認(rèn)為其位于基因間區(qū)域，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)大部分microRNAs位于基因的內(nèi)含子中，隨宿主基因的轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)錄，與宿主基因具有相似的表達譜；另一部分聚簇存在的microRNAs，能夠單獨轉(zhuǎn)錄，其表達水平受到多種因素的調(diào)節(jié)。例如miR-l的表達受到血清反應(yīng)因子(SRF)和MEF調(diào)控。這些microRNAs基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物須經(jīng)過多步剪切加工才能形成成熟的microRNAs，進而發(fā)揮其生物學(xué)功能。首先， microRNAs基因經(jīng)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，形成Pri_microRNA，再經(jīng)Drosha剪切，形成了具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的Pre-microRNA ；Exportin 5將其從胞核轉(zhuǎn)運至胞漿后，經(jīng)Dicer酶剪切，成雙鏈 microRNA分子；最后，雙鏈分離，一條被降解，另一條成為成熟microRNAs，并與其它分子一起形成了 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。RISC通過與mRNA的3'端非編碼區(qū)相互作用，引起mRNA的降解或者翻譯過程的抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個microRNA可能直接調(diào)控上百個基因的表達，進而調(diào)控了許多重要的細(xì)胞途徑和生理病理過程。例如=MicroRNAs能夠調(diào)控細(xì)胞的分裂、分化、增殖和凋亡；胚胎的發(fā)育，機體的能量代謝、激素分泌和造血功能以及應(yīng)對壓力脅迫等生理過程；腫瘤發(fā)生和心肌肥厚等病理過程。在心血管系統(tǒng)中，microRNAs參與了心臟和血管的疾病發(fā)生過程。MicroRNAs表達的紊亂，參與多種心血管疾病的發(fā)生過程，在心臟方面， William等將67個病人分為典型的四組疾病狀態(tài)缺血性心肌病、擴張型心肌病、主動脈縮窄和非心衰病人，然后對他們的心肌組織進行全基因組microRNA表達檢測，發(fā)現(xiàn)多種 microRNAs的表達水平在各種人類心臟疾病中均發(fā)生了顯著性改變。對于microRNAs作用機制的探討，目前認(rèn)為其通過負(fù)性蛋白的表達而參與各種生命活動過程。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在心臟發(fā)育早期的過表達，將促進心肌細(xì)胞分化，引起心臟發(fā)育停止，心室壁變薄；相反，miR-1的基因敲除小鼠中則出現(xiàn)心室壁變厚，室間隔缺損；進一步研究表明這一效應(yīng)主要是通過miR-1抑制Hand2的蛋白表達實現(xiàn)的。MicroRNAs在心肌肥厚中的功能研究有助于我們更好的理解其發(fā)病機理，進一步找到心肌疾病相關(guān)的藥物靶點，從而為這類疾病的預(yù)防或治療提供行之有效的途徑。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供miR-199a及其類似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，所述類似物是指能夠生成類似于miR-199a序列的重組質(zhì)?；虿《据d體或者是化學(xué)合成的類似miR-199a的序列；所述miR-199a 序列為CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。本發(fā)明第二個目的在于提供miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，所述miR-199a抑制劑是指能夠生成類似于miR-199a反義互補序列的重組質(zhì)?；虿《据d體或者是化學(xué)合成的類似miR-199a反義序列的RNA或DNA ；所述miR-199a 反義互補序列為GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。本發(fā)明第三個目的在于提供一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達miR-199a的體系；(2)檢測所述體系中miR_199a的表達或活性；若所述候選物質(zhì)可增強或降低miR-199a的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。microRNA-199a(miR-199a)為一種本領(lǐng)域已知的 microRNA(miRNA)小分子，其對于調(diào)控RNA是有用的。然而，現(xiàn)有技術(shù)中對于miR-199a生物學(xué)功能目前并不清楚。miR-199a具有如CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC所示的序列。其可以來自被分離細(xì)胞，或者可通過人工合成的方式獲得。在得知了 miR-199a的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得mi R_199a或其抑制物。MiR_199a 的用途MiRNA參與心肌肥厚的多個方面包括心肌增殖，電傳導(dǎo)和纖維化等。然而， miR-199a是否參與心肌肥厚過程仍未見報道。通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-133、 miR-499、miR-214、miR-24、miR-21和miR-199a等在心肌肥厚和慢性心衰中表達異常。通過 Northern blot的方法，本發(fā)明人確定了 miR_199a主要表達于肺臟和心臟，在心臟中主要表達于心肌細(xì)胞，在心肌成纖維細(xì)胞僅有微量表達。通過生物信息學(xué)靶點預(yù)測，本發(fā)明人確認(rèn)了缺氧誘導(dǎo)因子1是時1 -1993的一個靶基因。過表達1^1 -1993可以降低包含!1正-10 3， 非翻譯區(qū)的熒光素酶活性。在大鼠肥厚的心臟左室，miR-199a表達顯著上調(diào)。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中過表達miR-199a顯著增加細(xì)胞表面積，相反，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中抑制miR_199a的表達則降低細(xì)胞的表面積，另外，在苯腎上腺素誘發(fā)的肥大心肌細(xì)胞模型中抑制miR-199a的表達能夠抑制細(xì)胞表面積。此外，miR-199a在心肌細(xì)胞的過表達能夠抑制心肌收縮蛋白 myh6的表達，表明miR-199a的表達異常參與心肌收縮紊亂。此外，在血清剝奪的心肌細(xì)胞中miR-199a過表達能夠抑制心肌損傷標(biāo)志分子anp和serCa2的表達，表明在心肌缺血中 miR-199a具有保護作用?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種miR-199a的用途，用于保護缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的發(fā)生。MiR_199a抑制劑及其用途本發(fā)明人在深入研究后發(fā)現(xiàn)miR-199a的表達異常參與心肌收縮紊亂，能夠抑制心肌收縮蛋白myh6的表達。MiR-199a的表達上調(diào)能夠促進心肌細(xì)胞肥大。深入研究后發(fā)現(xiàn)，MiR-199a的抑制劑能夠抑制心肌細(xì)胞肥大。因此，本發(fā)明還提供了 miR-199a抑制劑的用途，用于制備預(yù)防或治療心臟疾病的組合物。所述的心臟疾病特別是心肌疾病，尤其是心肌肥厚或心衰。miR-199a的抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可降低 miR-199a的活性、降低miR_199a的穩(wěn)定性、抑制miR_199a的表達、減少miR_199a的有效作用時間、或抑制miR-199a的轉(zhuǎn)錄和加工的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于預(yù)防或治療心臟疾病的有效物質(zhì)。所述的miR-199a的抑制劑也可以是經(jīng)過修飾的形式。在得知了 miR_199a對于心臟疾病的作用后，本領(lǐng)域人員可以方便地得知可以通過miR-199a抑制劑來防治心臟疾病的發(fā)生或發(fā)展。因此，任何miR-199a的抑制劑都可用于本發(fā)明，根據(jù)miR-199a的特性，本領(lǐng)域人員可以獲得多種miR_199a的抑制劑。所述的miR-199a的抑制劑例如包括但不限于特異性結(jié)合miR_199a的蛋白；特異性干擾miR-199a基因表達、加工的小干擾分子，如siRNA分子、miRNA分子、反義核苷酸寸。所述的miR-199a的抑制劑優(yōu)選為反義核苷酸，或是序列與其反義核苷酸的序列具有80%以上的相同性(較佳地具有85%以上的相同性)的反義核苷酸；它們均具有 miR-199a反義核苷酸相同的功能。所述的miR-199a的抑制劑可以是miR-199a的反義核苷酸。從理論上來講，根據(jù)反義技術(shù)獲得的反義分子可用于治療任何由基因表達或者基因缺失引起的疾病。所述的“反義核苷酸”還包括經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核苷酸的活性、穩(wěn)定性或治療效果。對反義核苷酸的修飾包括但不限于甲氧基化修飾、鎖核酸修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替。本發(fā)明對小干擾RNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學(xué)合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本發(fā)明所提供的反義核苷酸的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達所述的反義核苷酸。所述的反義核苷酸可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。篩選方法在得知了所述的miR-199a與心臟疾病的相關(guān)性后，可以基于該特征來篩選調(diào)節(jié) miR-199a的表達或活性，進而可預(yù)防或治療心臟疾病的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達miR-199a的體系接觸；和檢測候選物質(zhì)對miR_199a的影響；若所述候選物質(zhì)可降低miR-199a的表達或活性，就表明該候選物是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。所述的體系包括(但不限于)溶液體系、亞細(xì)胞體系、細(xì)胞體系、組織體系、 器官體系、或動物體系。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的 miR-199a抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所
接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的miR-199a抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。通常，當(dāng)本發(fā)明的miR-199a抑制劑每天以約0. 001-100mg/kg(優(yōu)選的為 0.01-20mg/kg)動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為 0.005-100mg，較佳地約為0.008-50mg?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉給予、局部給予、植入、緩釋給予、心臟內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明提供了一種miR_199a的用途，用于保護缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的發(fā)生，可通過改變miR-199a的基因表達來達到預(yù)防或治療這些疾病的目的，miR-199a及其抑制劑在治療相關(guān)疾病的藥物中具有廣闊的前景。

圖1.定量PCR或Northern blot對心肌高豐度microRNAs的組織表達譜進行分析，以期獲得心肌特異的microRNA，定量PCR結(jié)果如圖IA所示miR_21、miR-23、miR-24、 miR-181、miR-199a、miR-214、miR-451 為組織廣譜表達，而 miR-1、miR-133、miR-499 僅在肌組織表達，miR-126為組織廣譜表達(圖IB)；圖2.腹主動脈縮窄(AAC)建立大鼠心肌肥厚模型A，假手術(shù)對照組(Sham)及 AAC大鼠心臟的H&E染色，標(biāo)尺為2mm ；B,與對照組相比，腎上腹主動脈縮窄后大鼠的心重 /體重比明顯升高；C，與對照組相比，腎上腹主動脈縮窄后大鼠心肌組織的中anp和myh7 的mRNA表達水平顯著升高；D，心肌高豐度microRNAs在腹主動脈縮窄1周表達異常，與對照組相比，miR-1、miR-133和miR-499表達顯著降低，而miR_199a表達顯著升高，心肌高豐度microRNAs在腹主動脈縮窄4周表達異常，與對照組相比，miR_181a表達顯著降低，而miR-214、miR-24、miR-21 表達顯著升高；圖3. MiR-199a和miR-214在心肌肥厚中表達升高A，miR_199a和miR-214基因定位于非編碼RNA Dmn3os中，在人、小鼠、大鼠及斑馬魚物種間高度保守；B，在大鼠各器官中miR-199a主要表達心臟和肺臟，在心臟中，miR-199a主要表達于心肌細(xì)胞，在心肌成纖維細(xì)胞中表達較低；C，MiR-214在AAC 4周、8周、12周中的肥厚心肌中表達明顯升高， miR-199a在心肌肥厚過程表達異常，在AAC12周時，表達升高最為明顯；圖4. MiR-199a過表達促進培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大，使其表面積顯著增加A，定量 PCR和Northern blot檢測腺病毒轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞中miR_199a的表達，miR-199a的表達量約上調(diào)10倍左右；B，miR-199a過表達后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的肥大表型；隨機選取 10個視野的200個細(xì)胞，對其表面積進行統(tǒng)計分析，表明miR-199a過表達能夠顯著促進基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞表面積增加；C，MiR-199a過表達抑制心肌收縮蛋白Myh6的表達；D， MiR-199a過表達抑制ANP、ATP2a2的表達；圖5. miR-199a反義寡核苷酸沉默miR_199a，抑制培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大A，定量 PCR和Northern blot檢測反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞中miR_199a的表達，miR-199a 的表達量約下調(diào)至心肌細(xì)胞基礎(chǔ)水平的左右；B，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-199a 的As-RNA 48h后，心肌細(xì)胞表面積明顯降低；C，在PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型中，沉默 miR-199a抑制心肌細(xì)胞肥大；圖6. Hifl α可能是miR_199a的靶基因A，miR_199a與缺氧誘導(dǎo)因子(Hifl α ) 和Sirtuinl的3'端非編碼區(qū)序列匹配程度較好；B，Luciferase實驗表明，miR_199a能夠抑制融合Hifl α 3'端非編碼區(qū)的報告基因的表達，但不能抑制融合Sirtuinl 3'端非編碼區(qū)的報告基因的表達；C，Western blot結(jié)果表明miR_199a過表達不能抑制Sirtuin的
蛋白表達。
具體實施方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法RNA 制備 人心臟總RNA購于Ambion，Inc.，小鼠、大鼠組織以及培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA用 TRIzol(Invitrogen)抽提。實時熒光定量PCR常規(guī)方法抽提RNA，通過頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的microRNA，然后進行實時熒光定量PCR檢測，以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法定量，分析各樣本的microRNA濃度，并通過溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定基因擴增的特異性。Northern blot 檢測 miRNA
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總RNA經(jīng)PAGE尿素變性膠電泳后轉(zhuǎn)膜，行紫外交聯(lián)，然后與同位素標(biāo)記的特異性探針雜交過夜，洗膜后，-80°C條件下進行X膠片顯影。以非編碼RNA TO或5.8S RNA作為內(nèi)參照分析mi croRNA的表達量。乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)和肥大模型取出生1-3天的SD乳鼠，無菌條件下取心室肌，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞、計數(shù)并接種。常規(guī)培養(yǎng)2天后，再以無血清培養(yǎng)24小時，然后給予ΙΟΟμΜ苯腎上腺素 (phenylephrine, ΡΕ)孵育48小時，誘導(dǎo)細(xì)胞肥大，觀察細(xì)胞表型并進行microRNA、肥厚標(biāo)志分子等檢測。過表達microRNA的腺病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染將microRNA前體序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒(可表達綠色熒光蛋白)， 線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞， 在293細(xì)胞中進行病毒包裝，獲得第一代腺病毒。按IOMoI滴度，多次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得較高滴度的病毒液，經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化。純化后的病毒原液以10倍梯度稀釋后， 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下計數(shù)呈綠色熒光的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以確定病毒滴度。腺病毒以50MoI、IOOMoI滴度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以確定轉(zhuǎn)染效率；通過定量PCR和Northern blot檢測microRNA表達量以確定病毒的表達效率。 MicroRNA反義序列的設(shè)計及沉默效率分析Mirbase獲得microRNAs成熟序列，設(shè)計其反義互補RNA，化學(xué)合成該序列，并進行堿基的2'甲氧修飾。將反義序列按照40nM濃度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，孵育48小時，通過定量PCR 和Northern blot分析其對靶microRNA的沉默效率。生物信息學(xué)法預(yù)測microRNAs的靶基因利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站和軟件，對大鼠的microRNA的二級結(jié)構(gòu)和靶基因進行預(yù)測分析，尋找序列匹配程度高、二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、靶序列在物種間高度保守的基因進行后續(xù)驗證。雙熒光報告基因法檢測microRNA的靶基因?qū)谢虻?’非編碼區(qū)中能與microRNA相互作用的序列克隆至pGL3質(zhì)粒中熒光素酶的3’非編碼區(qū)，構(gòu)建重組的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。將其與表達相應(yīng)microRNA的 PSuper載體按一定的比例共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞。24小時后裂解細(xì)胞，采用雙熒光報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達量，從而反映microRNA在離體體系中能否調(diào)控靶基因表達。大鼠心肌肥厚模型采用腎上腹主動脈縮窄方法建立大鼠心肌肥厚模型，具體操作如下成年健康SD 大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離腹主動脈，在右腎動脈上方沿腹主動脈用4號絲線將其與外徑為0. 6mm的注射針管一并扎緊，后迅速將針管移去，縫合關(guān)腹，對照組不做絲線結(jié)扎，其它處理相同。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)動物，定期處死動物并取心肌，通過 HE染色、肥厚標(biāo)志分子檢測、心重/體重比值等監(jiān)測心肌肥厚發(fā)生情況。組織學(xué)分析取sham和AAC組大鼠心臟，用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋。石蠟切片(4 μ m) 后用蘇木精&伊紅染色(H&E)，觀察分析。
細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞表面積分析4%多聚甲醛細(xì)胞固定15分鐘后用0. Triton X-100通透15分鐘，5%山羊血清室溫封閉1小時，以1 500稀釋度加入anti-α -actinin抗體(Sigma) 4°C孵育過夜。用 PBS洗三遍后加入Alexa-555 (Molecular Probes)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。細(xì)胞核用 4，，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)標(biāo)記，最后封片。細(xì)胞表面積用軟件 AxioVision 4. 7. 1 (Carl Zeiss, Inc)進行計算。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對于相對基因表達分析，對照組的平均值定義為 1。用非配對Student’ s t test進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。Sigma plot程序用于數(shù)據(jù)分析。P < 0. 05為顯著差異。實施例l、miR-199a在心肌肥厚中表達升高，可能是心肌肥厚的一個檢測指標(biāo)MicroRNA，特別是心肌高豐度特異的microRNAs的表達異常，在心血管疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的功能。本課題組在前期工作中已確定多種心肌高豐度的microRNAs。本實驗將通過定量PCR或Northern blot對這部分microRNAs的組織表達譜進行分析，以期獲得心肌特異的 microRNA。結(jié)果如圖 IA 所示miR-21、miR-23、miR-24、miR-181、miR-199a、 miR-214、miR-451為組織廣譜表達，而miR-l、miR-133、miR-499僅在肌組織表達(圖1B)。心肌組織中存在多種高豐度的microRNAs。本實驗采用經(jīng)典的腎上腹主動脈縮窄的方法，成功建立了大鼠心肌肥厚模型(圖2)。大鼠在腹主動脈縮窄1周后，腎素-血管緊張素系統(tǒng)被激活，同時外周阻力增大，引起心臟的后負(fù)荷增加。為了維持正常的泵血功能，心臟開始出現(xiàn)代償性的肥厚反應(yīng)，表現(xiàn)為收縮蛋白合成增多，從而引起心臟重量增加， 因此通過對心重/體重比這一指標(biāo)進行檢測，將有助于我們了解整個模型的病理進程。本實驗中，我們分別對腹主動脈縮窄后1周、4周、8周、12周的大鼠心重/體重比進行了統(tǒng)計分析，表明在腹主動脈縮窄1周后，腹主動脈縮窄(AAC)組的心重/體重比明顯高于假手術(shù)(sham)組，并且隨縮窄時間的延長，心重/體重比持續(xù)升高，在第8周時達到最高峰，但在12周時AAC組的心重/體重比仍高于sham組(圖2B)。在心肌肥厚的過程中，許多胎兒期基因?qū)⒅匦卤磉_，心房鈉尿肽(ΑΝΡ)、β-重鏈肌球蛋白(β MHC)、內(nèi)皮素-I(ET-I)分子表達水平可以間接反映心肌肥厚和損傷的程度。在本實驗中，我們通過定量PCR檢測這些分子標(biāo)志物的mRNA表達水平，結(jié)果表明與sham組相比，ANP在腹主動脈縮窄1周時，即顯著上調(diào)，并持續(xù)升高至4周，隨著心臟代償機制的激活，其表達量在4周后略有下降，但仍明顯高于對照組；8周后，ANP的mRNA水平又持續(xù)升高至12周(圖2C)。β MHC與ANP有類似的變化趨勢，表現(xiàn)為雙峰相1周時，表達急劇升高，后逐漸下降，但隨心肌損傷的加劇，其表達在8周、12周又再次被激活(圖2C)。ΑΝΡ、β MHC,ET-I這些分子的mRNA表達水平，表明心肌肥厚建立成功。腎上腹主動脈縮窄1周大鼠的心臟，縱切面和橫斷面H-E染色，結(jié)果表明-MC組與sham組相比，大鼠心臟左心室壁已明顯增厚，左心室變小，表明心肌肥厚模型建立成功。腹主動脈縮窄1周時，肥厚心肌microRNAs表達異常，其中miR-l、miR-133和 miR-499表達顯著降低，而miR-199a表達顯著升高，最為明顯。腹主動脈縮窄4周時，肥厚心肌 microRNAs 表達異常，其中 miR_23a、miR-133、miR-145、miR-199a 和 miR-499 表達未發(fā)生改變，miR-181a表達顯著降低，而miR-21、miR-24和miR-214表達顯著升高(圖2D)。Northern blot結(jié)果表明，miR_199a主要表達于心臟和肺臟(圖3B)。為了進一步分析miR-199a在心臟各個細(xì)胞類型的表達譜，本發(fā)明人分離了大鼠心臟的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并檢測了 miR-199a的表達水平。通過Northern blot方法，miR_199a主要在心肌細(xì)胞檢測到，而在成纖維細(xì)胞表達量較低(圖3B)。因此本發(fā)明人的結(jié)果表明，miR-199a 主要表達于心肌細(xì)胞。前一工作中，我們通過定量PCR對腹主動脈縮窄1周、4周大鼠的肥厚心肌進行 microRNAs表達檢測，發(fā)現(xiàn)miR-199a和miR-214表達異常最為明顯；我們將進一步探討這2 種microRNAs在整個心肌肥厚病理進程中的異常表達，探索其可能的病理意義。結(jié)果表明 miR-199a在前期表達顯著升高，在12周時間點上，表達升高最為明顯，提示了在心肌肥厚的病理進程中，miR-199a可能主要在心肌由代償期向失代償期過渡中起作用；miR-214的表達量在AAC 1周時沒有變化，4周時表達開始升高達sham組的1. 5倍，12周的表達量較 sham組升高1倍左右，提示miR-214可能在心肌肥厚的發(fā)生過程起重要功能(圖3C)。實施例2、過表達miR-199a可誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。MiR-199a過表達腺病毒以IOOMoI的量轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞48h后(圖4A)，行免疫熒光染色，結(jié)果如圖4B所示miR-199a過表達后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的肥大表型；隨機選取10個視野的200個細(xì)胞，對其表面積進行統(tǒng)計分析，表明miR-199a過表達能夠顯著促進基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞表面積增加。實施例3、MiR-199a沉默抑制培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大。前一部分實驗結(jié)果表明，miR_199a過表達能夠顯著促進基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞肥大。為更好的探討miR-199a的內(nèi)源性功能，本工作通過心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染2’甲氧修飾的 miR-199a的反義RNA，進而沉默內(nèi)源性的miR_199a。通過定量PCR和Northern blot檢測表明miR-199a的As-RNA能夠顯著抑制內(nèi)源性的miR_199a的水平(圖5A)。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-199a的As-RNA 48h后，細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果表明與對照組相比， 心肌細(xì)胞的肥大表型受到明顯抑制；隨機選取10個視野的200個細(xì)胞，對其表面積進行統(tǒng)計分析，表明miR-199a沉默后能夠顯著抑制基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞肥大(圖5B)。為了進一步探討miR-199a能否抑制PE誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大，本實驗將在PE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中進一步沉默miR-199a，觀察其對肥大心肌細(xì)胞的影響。結(jié)果如圖5C所示miR-199a沉默后抑制心肌細(xì)胞肥大，隨機選取10個視野的200個細(xì)胞，對其表面積進行統(tǒng)計分析，表明miR-199a過表達抑制PE誘導(dǎo)條件下心肌細(xì)胞表面積增加。實施例4、MiR-199a過表達引起心肌細(xì)胞收縮蛋白的表達異常。重鏈肌球蛋白的異構(gòu)體轉(zhuǎn)變是心肌肥厚中肌纖維發(fā)生的一個顯著性改變。我們通過定量PCR對這兩種肌收縮蛋白進行mRNA表達檢測，結(jié)果如圖4C所示miR-199a過表達能夠明顯抑制myh6的mRNA表達水平，而對myh7的mRNA表達水平的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。實施例5、MiR-199a降低心肌損傷的生物標(biāo)志分子的表達。通過前期對細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)miR-199a能夠明顯的改善心肌細(xì)胞的生長狀態(tài)，同時鑒于miR-199a在AAC 12周時表達升高最為明顯，我們推測其可能在心力衰竭的發(fā)生過程中起重要作用。為此我們通過定量PCR檢測心肌損傷的生物標(biāo)志分子 ANP、ATP2a2的mRNA表達水平，結(jié)果如圖4D所示ANP、ATP2a2的mRNA表達均下調(diào)，暗示了 miR-199a在基礎(chǔ)水平有可能具有改善心肌細(xì)胞的功能。實施例6、MiR-199a作用靶基因的尋找及驗證。
通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Ddrl、MAP3kll、SIRTl、Hifl α、、JUNB, Gsk3 β、 Arhgapl2、均可能是miR-199a的潛在靶基因(表1)。表1. miR-199a靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測
權(quán)利要求
1.miR-199a及其類似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，所述類似物是指能夠生成類似于miR-199a序列的重組質(zhì)?；虿《据d體或者是化學(xué)合成的類似miR-199a的序列；所述 miR-199a 序列為CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。
2.miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，所述 miR-199a抑制劑是指能夠生成類似于miR-199a反義互補序列的重組質(zhì)?；虿《据d體或者是化學(xué)合成的類似miR-199a反義序列的RNA或DNA ；所述 miR-199a 反義互補序列為GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。
3.一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達miR-199a的體系；(2)檢測所述體系中miR-199a的表達或活性；若所述候選物質(zhì)可增強或降低miR-199a的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-199a及其類似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，以及miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，并且在此基礎(chǔ)上，公開了一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達miR-199a的體系；(2)檢測所述體系中miR-199a的表達或活性；若所述候選物質(zhì)可增強或降低miR-199a的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。
文檔編號A61K48/00GK102266569SQ20101019305
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者宋曉偉, 李青, 秦永文, 荊清, 袁文俊 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)