專利名稱：：用于介導(dǎo)蛋白質(zhì)干擾的手段和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于功能蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，更特別地，屬于蛋白質(zhì)聚集(aggregation)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種用于干擾靶蛋白功能的方法和非天然的、用戶設(shè)計的分子的應(yīng)用，所述分子稱為干擾子(interferor)，具有針對靶蛋白的特異性并且一旦與所述靶蛋白接觸便誘導(dǎo)聚集。本發(fā)明還公開了這些干擾子分子及其在治療應(yīng)用方面的用途。
背景技術(shù)：
：生物學(xué)正在進入一個由全基因組范圍內(nèi)的信息增長所帶來的令人激動的時代。隨著基因組測序和高通量功能基因組學(xué)方法產(chǎn)生越來越多的數(shù)據(jù)，研究人員需要新的方式解析出生物學(xué)相關(guān)信息。在將生物學(xué)手段應(yīng)用于基因組數(shù)據(jù)方面，功能基因組學(xué)正在特別地產(chǎn)生快速進步。基因組中編碼的信息包括基因和控制元件，所述基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在生物體中介導(dǎo)大多數(shù)功能。蛋白質(zhì)被認為是細胞中最重要的效應(yīng)器(effector)，盡管最近非編碼RNA也被鑒定為調(diào)節(jié)過程中的重要參與者。一些關(guān)鍵生物學(xué)問題是繼續(xù)進行基因組課題的關(guān)鍵，并且與從細菌到人體的所有細胞生物體相關(guān)。一個挑戰(zhàn)是要明白基因組中編碼的基因是如何操控并相互作用以產(chǎn)生復(fù)雜的活系統(tǒng)的。一個相關(guān)的挑戰(zhàn)是確定基因組中全部序列元件的功能。功能基因組學(xué)的工具箱已經(jīng)給出了一些系統(tǒng)方法，對于基因組中的大多數(shù)基因，所述方法能夠為一些基礎(chǔ)問題提供答案，包括一個基因何時表達、其產(chǎn)物定位于何處、其與何種其他基因產(chǎn)物相互作用以及如果一個基因被突變將會得到何種表型結(jié)果。突變體的表型分析已經(jīng)是一種確定基因功能的有力方法?；蚬δ芸梢酝ㄟ^基因缺失、插入突變和RNA干擾(RNAi)而被改變。RNAi是用于降低基因表達的一項相對較新的進展。其源自植物和其他模型生物體內(nèi)的基因靜默的報道，并基于秀麗隱桿線蟲(C.e/egara)中觀察到的將雙鏈RNA(dsRNA)加入到細胞中經(jīng)常會以序列特異性方式干擾基因功能的現(xiàn)象。在很多情況下，功能降低的水平不能被充分控制，不完全，特異性的水平不能完全預(yù)測，并且在一些生物體中，RNAi并沒有作用(例如在酵母白色假絲酵母(Cam^aa/Z)z'cflra)中)。很明顯功能基因組學(xué)已經(jīng)改變了之前生物學(xué)的方式，但是就詳盡地描述生物學(xué)系統(tǒng)內(nèi)的復(fù)雜性(例如基因調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)相互作用和形成細胞的生物化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò))而言，這個領(lǐng)域仍處于其幼年期。很明顯需要開發(fā)創(chuàng)新型的技術(shù)，特別是在功能蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，以加快發(fā)現(xiàn)的速度并使功能基因組學(xué)中的互補方法提供的潛力最大化。期望擁有一種靈活的技術(shù)，能夠直接靶向特定細胞外或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能而不是靶向翻譯其的mRNA或操作編碼其的基因。正?？扇艿牡鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)化為構(gòu)象改變的不可溶蛋白質(zhì)被認為是導(dǎo)致多種疾病的過程，例如阿爾茨海默病和淀粉樣腦血管病中出現(xiàn)的淀粉狀蛋白P肽、帕金森病中Lewy小體內(nèi)沉積的a突觸核蛋白、克雅病(Creutzfeldt-Jacobdisease)中的朊病毒、肌萎縮性側(cè)索硬化癥中的超氧化物歧化酶和額顳葉癡呆癥(frontaltemporaldementia)及皮克病(Pick，sdementia)中神經(jīng)元纖維纏結(jié)中的tau。迄今為止，蛋白質(zhì)聚集已經(jīng)主要作為一種不需要的、導(dǎo)致疾病的現(xiàn)象研究，并且已經(jīng)廣泛接受交叉P(cross-beta)介導(dǎo)的聚集是發(fā)生頻率最高的，并且是聚集的生物學(xué)相關(guān)機制2。術(shù)語"交叉卩聚集(cross-betaaggregation)"用于指聚集通過形成分子伺的p-折疊而成核(nucleated),聚集體中的每一個分子貢獻一條相同的鏈，所述鏈典型地包含至少三個相鄰氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有大量數(shù)據(jù)顯示單個鏈相互作用以形成分子間的P-折疊，并且這個結(jié)構(gòu)形成聚集體的骨架3，4。靶蛋白中的自締合區(qū)(self-associationregion)可以通過開發(fā)出來以用于預(yù)測肽和蛋白質(zhì)的聚集傾向的計算機程序例如TANGO6確定。本領(lǐng)域已經(jīng)研究了一種特殊形式的聚集，即高度有序的淀粉狀蛋白纖維(highlyorderedamyloidfibre)5用于材料科學(xué)中的潛在用途。另夕卜，WO03102187(Scegen,PtyLtd)公開了一種用于通過將一種分子與一種膜轉(zhuǎn)位序列融合而增強所述分子活性的方法，其中所得到的嵌合分子自我組裝為更高分子量的聚集體。US20050026165(Aret6Associates)公開了能夠與不可溶蛋白質(zhì)例如朊病毒的P-折疊構(gòu)象相互作用的構(gòu)象肽作為用于朊病毒疾病的診斷工具的應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于特定耙蛋白的可控和可誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集的技術(shù)。本發(fā)明還提供了從頭設(shè)計的分子，本文中稱為干擾子分子，所述分子包括至少一個聚集區(qū)(aggregationregion),所述聚集區(qū)衍生自靶蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子包含至少一個自締合區(qū)，所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的一種成分融合。當(dāng)選定的靶蛋白和特異性設(shè)計的干擾子分子接觸時，在所述靶和所述干擾子之間發(fā)生特異性共聚集，導(dǎo)致所述靶蛋白的生物學(xué)功能的功能性敲除或下調(diào)(down-regulation)。這種蛋白質(zhì)敲低(knock-down)條件性依賴于聚集體的存在，所述聚集體由干擾子分子的存在誘導(dǎo)。另外的一個優(yōu)點是所述蛋白質(zhì)干擾的強度可以通過改變干擾子分子內(nèi)的聚集區(qū)的數(shù)目而通過實驗控制。本發(fā)明不僅提供了一種下調(diào)特定細胞外或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的有效工具，還具有重要的治療、農(nóng)業(yè)和診斷應(yīng)用。圖1.使用4種不同干擾子構(gòu)建體的重組表達的大腸桿菌中的蛋白質(zhì)干擾，所述構(gòu)建體靶向參與氨基酸生物合成的特定酶。每種干擾子分子的B部分由3個合成的自締合序列組成，所述序列被2個氨基酸的接頭和衍生自所述酶的一個特定自締合區(qū)分開。所述自締合區(qū)(合成的并且特異性的)偶聯(lián)至作為阻止所述自締合區(qū)聚集的成分的蛋白質(zhì)NusA(即所述干擾子分子的A部分)。圖2.用空質(zhì)粒、僅具有聚合子(aggregator)序列的質(zhì)?；蚓哂芯酆献?Um3融合構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有t/W3內(nèi)源野生型拷貝的釀酒酵母(5"."w^&e)。細胞在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長過夜，漂洗，然后在含有葡萄糖(左)或半乳糖(右)的培養(yǎng)基上鋪板。將5pl10倍稀釋物鋪板(006()()=1作為最高濃度)。圖3.用空質(zhì)粒和具有干擾子-Tupl融合構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有兩個7Z/尸7內(nèi)源野生型拷貝的白色假絲酵母細胞。細胞在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長過夜，漂洗，然后在含有葡萄糖(左)或酪蛋白氨基酸(右)的培養(yǎng)基上將20個菌落鋪板。上方組是用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落，下方組是用具有干擾子構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落("+aggreg.-TUPl"表示干擾子-TUPl構(gòu)建體)。照片攝于生長4天后。發(fā)明目的和發(fā)明詳述在本發(fā)明中，我們開發(fā)了一種通過使用用具有針對靶蛋白的特異性的干擾子分子下調(diào)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的方法。一旦與靶蛋白接觸，在所述干擾子分子和所述革E之間便發(fā)生共聚集。所述聚集使所述靶從其可溶性環(huán)境中退出并導(dǎo)致所述耙蛋白的功能性敲低。因此在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與包含分離自所述蛋白質(zhì)的至少一個自締合區(qū)的非天然存在的分子接觸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與由分離自所述蛋白質(zhì)的至少一個自締合區(qū)組成的非天然存在的分子接觸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與包含分離自所述蛋白質(zhì)的至少一個自締合區(qū)的非天然存在的分子接觸，其中所述自締合結(jié)構(gòu)域與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與由分離自所述蛋白質(zhì)的至少一個自締合區(qū)組成的非天然存在的分子接觸，其中所述自締合結(jié)構(gòu)域與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分是阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，ii)B部分包含至少一個由至少3個相鄰氨基酸組成的自締合區(qū)，其中所述區(qū)域分離自所述功能將被下調(diào)的蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分是阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，從而B部分與所述分子和所述蛋白質(zhì)所在的溶劑直接接觸，ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成，并且其中所述區(qū)域分離自所述功能將被下調(diào)的蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭。在另一個實施方案中，所述非天然存在的分子的B部分包含至少2個自締合區(qū)，其中至少一個所述區(qū)域衍生自所述功能將被干擾的蛋白質(zhì)。術(shù)語"非天然存在的分子"是指這種干擾子分子是人造的。例如，當(dāng)干擾子分子是多肽時(即A部分和B部分都是肽)，所述多肽通過將B部分從靶蛋白分離(即所述自締合區(qū))并將所述B部分偶聯(lián)至A部分而設(shè)計，其中所述A部分可以衍生自(i)另一個蛋白質(zhì)或(ii)同一靶蛋白，在(ii)的情況下所述A部分不與B部分直接相鄰。換句話說，衍生自靶的自締合區(qū)與阻止自締合區(qū)聚集的成分(當(dāng)所述干擾子是多肽所述成分也是多肽時)融合與A部分和B部分之間天然存在的融合之間存在至少一個天然氨基酸的區(qū)別。典型地，干擾子分子在由非重組基因組中的基因編碼的蛋白質(zhì)中不以相鄰多肽的形式存在。應(yīng)當(dāng)清楚的是干擾子分子可以通過引入重復(fù)及改變A和B部分的順序而以模式化方式設(shè)計。以下組合的一個非限制性列表是具有A-B-結(jié)構(gòu)的干擾子、具有B-A-結(jié)構(gòu)的干擾子、具有A-B-A-結(jié)構(gòu)的干擾子、具有B-A-B-結(jié)構(gòu)的干擾子、具有A'-B-A"結(jié)構(gòu)的干擾子和具有B'-A-B"結(jié)構(gòu)的干擾子，其中在A、A，、A"和B、B，、B"部分之間任選地存在接頭(間隔區(qū))。A、A，和A"是不同的相似成分(例如不同的肽序列)。B、B'和B"是不同的或相似的自締合序列(例如B是衍生自靶蛋白的自締合序列，B'是合成的自締合序列)。換句話說，本發(fā)明提供了一種用于下調(diào)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的方法，包括將所述蛋白質(zhì)與包含分離自所述蛋白質(zhì)的至少一個自締合區(qū)的分子接觸，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，從而所述自締合區(qū)與所述分子和所述蛋白質(zhì)所在的溶劑直接接觸。如上所述，應(yīng)當(dāng)清楚所述"成分(moiety)"與術(shù)語"A部分"等價，"B部分"與術(shù)語"至少一個自締合區(qū)"等價。術(shù)語"下調(diào)蛋白質(zhì)的功能"是指蛋白質(zhì)的正常生物學(xué)活性被降低(被抑制、被下調(diào)、被降低和被破壞在這里是等價術(shù)語)或所述蛋白質(zhì)被從其正常生物學(xué)環(huán)境中退出(例如正常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)通過下調(diào)其功能而不再存在)。因此，通過應(yīng)用本發(fā)明的方法，一種蛋白質(zhì)的功能通過將所述蛋白質(zhì)與本發(fā)明的非天然分子接觸而引起所述蛋白質(zhì)的聚集而被破壞。所述非天然分子在本文中稱為"干擾子"或"干擾子分子"。"聚集(aggregation)"是指正?？扇艿牡鞍踪|(zhì)通過直接接觸干擾子或與干擾子結(jié)合而在其正常生物學(xué)環(huán)境中變?yōu)椴豢扇艿鞍踪|(zhì)或聚集的蛋白質(zhì)。術(shù)語"下調(diào)蛋白質(zhì)的功能"也可以用術(shù)語"敲低(knockingdown)蛋白質(zhì)的功能"或"負干擾(negativdyinterferingwith)蛋白質(zhì)的功能"代替。蛋白質(zhì)功能的下調(diào)也可以指蛋白質(zhì)在細胞中不再以可溶形式存在或蛋白質(zhì)在其正常生物學(xué)環(huán)境中(例如(亞)-細胞或細胞外定位)不再以可溶形式存在。另外，其也可以指聚集的蛋白質(zhì)通過細胞的天然清除機制被降解并且以可溶形式或不可溶形式都不再可以檢測到。另外，其也可以指一種跨膜受體蛋白經(jīng)過干擾子誘導(dǎo)的所述跨膜蛋白的聚集而不再能結(jié)合其正常的配體。因此蛋白質(zhì)功能的下調(diào)也可以指正常位于例如線粒體的蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)干擾的方法而不再位于那里。在一個特定實施方案中，術(shù)語"蛋白質(zhì)功能的下調(diào)"或"蛋白質(zhì)功能的負干擾"或"敲低蛋白質(zhì)的功能"是與所述蛋白質(zhì)的正常(100。/。)功能相比，功能喪失至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少95%或甚至100%。在其正常生物學(xué)環(huán)境(定位)中蛋白質(zhì)的功能或缺少蛋白質(zhì)的存在可以通過本領(lǐng)域已知方法方便地確定。例如，根據(jù)感興趣的靶蛋白，所述功能可以通過測定降低的酶活性確定。一種蛋白質(zhì)在其正常生物學(xué)定位中存在減少可以例如通過缺少復(fù)合物的形成、缺少亞細胞結(jié)構(gòu)(compartment)內(nèi)靶蛋白的出現(xiàn)、靶蛋白以可溶形式存在、靶蛋白以聚集(此處不可溶是等價術(shù)語)形式存在測定。或者，耙蛋白的下調(diào)的效應(yīng)可以在細胞檢測中測定(例如喪失或獲得生長、喪失或獲得擴張、喪失或獲得蛋白水解活性)。在一個特定實施方案中，蛋白質(zhì)的這種正常生物學(xué)活性(或正常功能或正常定位)可以被細胞內(nèi)或細胞外干擾。"細胞內(nèi)"是指蛋白質(zhì)定位于生物體或宿主的細胞內(nèi)部(例如細胞質(zhì)、線粒體、溶酶體、液泡、細胞核、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、細胞膜、線粒體膜、葉綠體膜.......)。"細胞外"不僅指蛋白質(zhì)定位于細胞的細胞外培養(yǎng)基中，還指與細胞外培養(yǎng)基接觸的蛋白質(zhì)，例如膜錨定蛋白、跨膜蛋白等等。細胞外蛋白的非限制性實例是分泌性蛋白(例如蛋白酶、抗體和血液或血漿中的細胞因子)或存在于細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)(例如基質(zhì)金屬蛋白和跨膜蛋白(例如生長因子受體))?？梢杂帽景l(fā)明的方法靶定的細胞或宿主包括原核和真核細胞。非限制性實例是病毒、細菌、酵母、真菌、原生動物、植物和哺乳動物包括人。應(yīng)當(dāng)清楚蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的下調(diào)方法可以用于同時干擾l、2、3、4、5或甚至更多蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。特別是因為B部分包含至少一個自締合區(qū)，所以B部分可以例如包含不同的自締合區(qū)，每一個特異性針對一個不同蛋白質(zhì)。用于干擾至少一個靶蛋白的生物學(xué)功能的干擾子在自然界中不是天然存在的，而可以通過化學(xué)合成或通過重組蛋白質(zhì)表達或通過將其組合而制備。因此一個干擾子分子包含至少一個自締合區(qū)(因此B部分包含至少一個自締合區(qū))。一個"自締合區(qū)"在本文中定義為一個相鄰氨基酸序列，所述序列具有高度傾向與相同的或非常緊密相關(guān)的序列形成緊密的分子集合(assembly)。術(shù)語"具有高度傾向形成緊密的分子集合"也可以解釋為"具有高親和力"。親和力通常以解離值(Kd值)表示。干擾子和靶蛋白之間的Kd值典型地位于微摩至納摩范圍內(nèi)，但可以低于納摩或高于微摩。自締合區(qū)的實例是分子間p-折疊區(qū)、a-螺旋元件、發(fā)夾環(huán)(hairpinlo叩)、跨膜序列和信號序列。在一個特定實施方案中，B部分中存在至少一個自締合區(qū)。在另一個特定實施方案中，B部分中存在至少兩個自締合區(qū)。在另一個特定實施方案中，B部分中存在3、4、5、6或更多個自締合區(qū)。所述自締合區(qū)可以通過接頭區(qū)(例如大約2個至大約4個氨基酸的間隔區(qū))互相連接。B部分中存在的一個(或至少一個)自締合區(qū)衍生自一個靶蛋白。在一個特定實施方案中，B部分中的2、3、4、5、6或更多個自締合區(qū)衍生自一個靶蛋白。在另一個特定實施方案中，B部分中的2、3、4、5、6或更多個自締合區(qū)衍生自多于一個靶蛋白。在另一個特定實施方案中，B部分中的至少兩個自締合區(qū)衍生自同一個靶蛋白。靶蛋白在本文中是指人們要干擾其功能的蛋白。因此，為了使B部分特異性針對至少一個蛋白質(zhì)，B部分中的至少一個自締合區(qū)應(yīng)當(dāng)"衍生自"靶蛋白或至少一個自締合區(qū)應(yīng)當(dāng)存在于所述靶蛋白中。"衍生自"是指至少一個相鄰的自締合區(qū)應(yīng)當(dāng)與所述靶蛋白的一個相鄰區(qū)域在氨基酸序列方面相同或同源。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個自締合區(qū)與所述靶蛋白區(qū)域中的自締合區(qū)至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%相同。優(yōu)選地，自締合區(qū)的長度由至少3個相鄰氨基酸組成。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述區(qū)域由大約3個至大約30個氨基酸組成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述區(qū)域由大約3個至大約25個氨基酸組成。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述區(qū)域由大約5個至大約20個氨基酸組成。干擾子分子的B部分中的自締合區(qū)也可以確定并分離自靶蛋白之外的蛋白質(zhì)，并且所述自締合區(qū)與衍生自靶蛋白的至少一個自締合區(qū)偶聯(lián)，任選地在所述自締合區(qū)之間有一個間隔區(qū)(或接頭)。例如，可用的自締合區(qū)可衍生自正常情況下不在用來進行靶蛋白的生物學(xué)功能下調(diào)的宿主中的蛋白質(zhì)的自締合區(qū)(從而B部分中的一些自締合區(qū)可以得自不相關(guān)的生物體)。所述自締合區(qū)的性質(zhì)決定了通過誘導(dǎo)的聚集進行的靶蛋白抑制的水平(即抑制強度)。在一個干擾子分子內(nèi)可以使用得自一個靶蛋白的多于一個的自締合區(qū)，也可以將合成的自締合區(qū)或衍生自不同的靶蛋白的自締合區(qū)與得自一個靶蛋白的一或多個自締合區(qū)組合使用。在一個特定實施方案中，這些自締合區(qū)由一個非衍生自己知蛋白質(zhì)的合成序列組成，因此不是天然存在的。這種合成的自締合區(qū)的實例在L6pezdelaPazM.etal(2002)PNAS99,25,p.16053，表1中描述，通過參考并入本文。如果至少一個自締合區(qū)(即干擾子分子的B部分)具有輸水性質(zhì)(因為其誘導(dǎo)聚集的性質(zhì))，優(yōu)選地將其與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分(即千擾子分子的A部分)融合(或連接或偶聯(lián)，在這里是等價術(shù)語)并將所述自締合區(qū)暴露，與干擾子所在的溶劑直接接觸。這樣，在特定實施方案中，A部分具有增溶功能以將B部分保持在溶液中。在這些實施方案中，所述A部分例如是肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)(優(yōu)選與靶蛋白不同，參見實施例2)、糖基化結(jié)構(gòu)、(親水)化學(xué)基團或環(huán)糊精或其衍生物。在其他特定實施方案中，所述A部分是瓊脂糖珠、乳膠珠、纖維素珠、磁性珠、硅膠珠、聚丙烯酰胺珠、微球體、玻璃珠或任何固體支持物(例如聚苯乙烯、塑料、硝酸纖維素膜、玻璃)。在干擾子分子中，B部分和A部分可以任選地通過接頭區(qū)(間隔區(qū)是等價術(shù)語)方式連接(或偶聯(lián))。所述接頭區(qū)可以例如是通過化學(xué)合成制造的非天然的接頭(例如柔軟接頭如羥基取代的垸烴鏈、葡聚糖、聚乙二醇或者所述接頭還可以由氨基酸類似物組成)或所述接頭可以存在天然氨基酸例如聚蘇氨酸或聚絲氨酸。優(yōu)選地當(dāng)所述接頭包含氨基酸時，所述接頭區(qū)的長度在大約3個至大約15個氨基酸之間，更優(yōu)選地在大約5個至大約10個氨基酸之間。通常可以選擇柔軟接頭，但是預(yù)期硬接頭也會起作用。柔軟接頭序列可以得自自然界，大多數(shù)情況下這些區(qū)域在天然存在的蛋白質(zhì)中連接結(jié)構(gòu)域，例如src酪氨酸激酶SH2和SH3結(jié)構(gòu)域之間的接頭或BRCA1的BRCT結(jié)構(gòu)域之間的接頭。術(shù)語"接觸"是指干擾子與靶蛋白相互作用的過程。在一種形式下，干擾子被加入到含有靶蛋白的樣品中(例如干擾子在溶液中以特定濃度存在)。在另一種形式下，千擾子分子被注入含有靶蛋白的生物體內(nèi)。接觸也可以例如通過轉(zhuǎn)化含有耙蛋白的細胞的過程實現(xiàn)，所述細胞例如分離的細胞、在細胞培養(yǎng)物中、單細胞微生物或多細胞生物體內(nèi)部的一個或多個細胞。轉(zhuǎn)化是指干擾子分子通過通常己知的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化方法(例如通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、電穿孔、微注射、病毒方法、陽離子脂質(zhì)體應(yīng)用(參見例如Feigner,P.L.etal.(1987),尸rac.A^/.爿cadSc/84,7413)、可商購的陽離子脂配制物例如Tfk50(Promega)或Lipofectamin2000(LifeTechnologies)、顆粒轟擊等等)被導(dǎo)入宿主(例如細胞)內(nèi)部。干擾子分子可由重組載體(例如質(zhì)粒、黏端質(zhì)粒、病毒載體)編碼并可在宿主內(nèi)合成。在另一個實施方案中，干擾子分子可通過載體介導(dǎo)的輸送(例如通過脂質(zhì)體載體或納米顆?；蛲ㄟ^注射)被導(dǎo)入細胞內(nèi)。在另一個替代實施方案中，干擾子分子可通過介導(dǎo)細胞穿入(或細胞轉(zhuǎn)位)的序列進入細胞。在這種情況中，干擾子分子通過重組或合成附著細胞穿入序列被進一步修飾。因此，干擾子分子(例如多肽)可進一步與一種序列融合或化學(xué)偶聯(lián)，所述序列促進所述融合或化學(xué)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入原核或真核細胞內(nèi)。促進蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的，包括但不限于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ProteinTransductionDomains)。優(yōu)選地，所述序列選自由HIVTAT蛋白、聚精氨酸序列、穿膜肽(penetratin)和pep-l組成的一組。其他一些常用的可穿入細胞的肽(天然的和人造的肽)公開于JoliotA.andProchiantzA.(2004)MifMreCeZ/5/o/.6(3)189-193。在一個特定的實施方案中，干擾子基本上由氨基酸組成。在一些實施方案中，干擾子分子的A部分和B部分的序列衍生自相同的靶蛋白。在其他實施方案中，干擾子是嵌合分子，所述嵌合分子是指A部分和B部分的序列衍生自不同蛋白質(zhì)，例如A部分衍生自一種蛋白質(zhì)而B部分的至少一個聚集區(qū)衍生自靶蛋白。"多肽"是指一種多聚體，其中單體是氨基酸并且通過肽鍵連接到一起，也稱為肽。當(dāng)所述氨基酸是0C-氨基酸時，可以使用L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體。另外，也包括非天然氨基酸，例如p-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明。用于干擾子的全部或部分氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。另外，其他模擬肽(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明。我們在本文中特別參考并并入模擬肽作為蛋白-蛋白相互作用的拮抗物的開發(fā)和應(yīng)用的綜述(SillerudLOandLarsonRS(2005)Owr尸rafe/"尸e聲Sc/.6(2):151-69)。另外，也可以將D-氨基酸加入到肽序列中以穩(wěn)定轉(zhuǎn)角特征(特別是在甘氨酸的情況下)。在另一種方法中，a-、(3-、y-或S-轉(zhuǎn)角模擬物(例如a-、p-、y-或S-二肽)可用于模擬肽中的結(jié)構(gòu)基序和轉(zhuǎn)角特征并同時提供蛋白水解穩(wěn)定性和增強其他性質(zhì)例如構(gòu)象穩(wěn)定性和溶解性。從靶蛋白中分離自締合區(qū)自締合序列通常是疏水的，但這并不是全部情況。例如，酵母朊病毒的自締合區(qū)是相當(dāng)極性的。事實上，衍生自多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸區(qū)域的交叉P-聚集當(dāng)(l)它具有高度疏水性，(2)它具有很好的p-折疊傾向，(3)它具有低凈電荷和(4)它暴露于溶劑時即可起始。因此，自締合蛋白質(zhì)區(qū)域("片段"是"區(qū)域"的一個等價術(shù)語)在折疊狀態(tài)下通常被隱藏并且不暴露于溶劑。這被實驗中發(fā)現(xiàn)的在許多球狀蛋白中，聚集發(fā)生在重折疊期間或在顯著傾向于變性或部分折疊狀態(tài)的條件下(即在高濃度或作為去穩(wěn)定條件或突變的結(jié)果)所確證?；谶@些發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出了能夠預(yù)測蛋白質(zhì)中的自締合區(qū)("P-聚集序列或片段"是等價術(shù)語)的計算機程序。一種這樣的算法，TANGO，是基于一種考慮上述三個物理化學(xué)參數(shù)并且考慮不同結(jié)構(gòu)構(gòu)象(卩-轉(zhuǎn)角、a-螺旋、p-折疊聚集體)和折疊狀態(tài)之間的競爭的統(tǒng)計力學(xué)算法(Femandez-Escamilla,AMetal(2004)tv"/.5/o/ec/2"o/.22，1302-1306,特別是第1305和1306頁上的"Methods"部分通過參考特別并入本文，以及同一篇文獻中關(guān)于所述方法的進一步的詳細內(nèi)容的"SupplementaryNotes1and2"和用于校正和測試TANGO算法的數(shù)據(jù)組)。因此，靶蛋白內(nèi)的自締合區(qū)可通過計算機程序例如TANGO獲得。自締合區(qū)經(jīng)常隱藏在耙蛋白的核心內(nèi)部1通過相應(yīng)于耙蛋白穩(wěn)定性的能量障礙而將肽遮蓋起來以避免分子間締合"。在其正常環(huán)境中(例如細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì))，靶蛋白得到幫助蛋白質(zhì)保持其功能性的單體形式的分子伴侶的幫助12。TANGO算法使用的模型s被設(shè)計為預(yù)測肽和蛋白質(zhì)中的j3-聚集，并由包含無規(guī)巻曲和天然構(gòu)象以及其他主要構(gòu)象狀態(tài)(即(3-轉(zhuǎn)角、a-螺旋和(3-聚集體)的相空間(phase-space)組成。根據(jù)玻爾茲曼分布(Boltzmanndistribution),肽的每一個片段都可以擁有這些狀態(tài)中的每一個。因此，為了預(yù)測肽的自締合區(qū)，TANGO簡單地計算相空間的配分函數(shù)(partitionfunction)。為了估算特定氨基酸序列的聚集傾向，作出下述假設(shè)(i)在一個有序P-折疊聚集體中，主要二級結(jié)構(gòu)是p-鏈，(ii)參與聚集過程的區(qū)域被完全隱藏，因此付出全部溶劑化代價和收獲、全部熵并使其H鍵勢能最優(yōu)化(即在聚集體中形成的H鍵數(shù)目與受體補償?shù)墓w基團的數(shù)目相關(guān)。過量的供體或受體保持不飽和狀態(tài))，(iii)在所選擇的窗口中的互補電荷建立有利靜電相互作用，并且所述窗口內(nèi)和窗口外的肽的整體凈電荷不利于聚集。TANGO可以在國際互聯(lián)網(wǎng)http:〃tango.embl.de/上得到。zyggregator算法是另一個實例(PawarAP"a/(2005)JMo/.所o/.350，379-392)。這些算法通過將給定氨基酸序列的聚集傾向分值與從一組相似長度的序列中計算得到的平均傾向進行比較而識別易于聚集的序列。在本發(fā)明中，我們估計在一個靶蛋白中鑒定為TANGO分值為5%的自締合區(qū)相應(yīng)于體外聚集可能性為95%6。我們己經(jīng)計算出了與疾病不相關(guān)的得自人蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)的85%具有至少一個TANGO分值高于實驗確定的5%門檻的區(qū)域。這顯示盡管超過85%的人類蛋白質(zhì)含有至少一個單一自締合區(qū)，但是由于蛋白質(zhì)的正常穩(wěn)定性和來自分子伴侶系統(tǒng)的幫助，聚集被阻止。本發(fā)明從靶蛋白中分離這些自締合區(qū)用于制備用于特異性誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集的干擾子分子。干擾子分子的B部分包含至少1個聚集區(qū)并且至少一個聚集區(qū)衍生自靶蛋白。可以通過將多于一個的靶蛋白聚集區(qū)摻入干擾子分子的B部分而控制蛋白質(zhì)干擾的強度(蛋白質(zhì)干擾的強度例如是當(dāng)靶蛋白或含有靶蛋白的細胞與一種特異性干擾子分子接觸時所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能喪失的％)。事實上，衍生自耙蛋白的具有低TANGO分值(典型地在5。/。至20。/。之間)的聚集區(qū)可以在干擾子的B部分內(nèi)重復(fù)至2、3、4或更多個聚集區(qū)。作為另一個實施方案，衍生自同一蛋白質(zhì)的具有低TANGO分值的l、2、3或4或更多個聚集區(qū)可以摻入干擾子的B部分內(nèi)。作為另一個實施方案，1、2、3、4或更多個合成聚集區(qū)(因此不是衍生自靶蛋白)可以與衍生自靶蛋白的l、2、3、4、或更多個聚集區(qū)組合至B部分內(nèi)以增強具有低TANGO分值的的耙蛋白的下調(diào)。因此在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種能夠聚集靶蛋白的非天然存在的分子。在一個特定實施方案中，所述非天然分子在性質(zhì)上類似蛋白質(zhì)(proteinaceous)。類似蛋白質(zhì)是指所述分子含有L-氨基酸或D-氨基酸或混和有L-和D-氨基酸或含有天然氨基酸和擬肽的組合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，所述分子包含分離自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，所述分子包含分離自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，從而所述自締合區(qū)與其所在的溶劑直接接觸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，所述分子由分離自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)組成，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，所述分子由分離自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)組成，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，從而所述自締合區(qū)與其所在的溶劑直接接觸。在一個特定實施方案中，所述成分例如是肽、瓊脂糖珠、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。在另一個特定實施方案中，所述非天然存在的分子包含至少兩個自締合區(qū)，其中至少一個自締合區(qū)衍生自耙蛋白。換句話說，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一個阻止B部分聚集的區(qū)域，例如肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)或瓊脂糖珠，和ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成，并且其中所述區(qū)域分離自所述功能將被干擾的蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭。另外換句話說，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一個阻止B部分聚集的區(qū)域，例如肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分包含至少一個由至少3個相鄰氨基酸組成的自締合區(qū)，并且其中至少一個自締合區(qū)分離自所述功能將被干擾的蛋白質(zhì)，并且其中所述區(qū)域分離自來自能夠溶于水的所述蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，并且其中B部分與所述分子和所述蛋白質(zhì)所在的環(huán)境直接接觸。另外換句話說，本發(fā)明提供了一種非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一個阻止B部分聚集的區(qū)域，例如肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分由至少一個由至少3個相鄰氨基酸組成的自締合區(qū)組成，并且其中所述至少一個自締合區(qū)分離自所述功能將被干擾的蛋白質(zhì)，并且其中所述區(qū)域衍生自來自能夠溶于水的所述蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，并且其中B部分與所述分子和所述蛋白質(zhì)所在的環(huán)境直接接觸。術(shù)語"分離自(或衍生自)來自能夠溶于水的所述蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域"是指自締合區(qū)是分離自蛋白質(zhì)的一個可溶結(jié)構(gòu)域的相鄰氨基酸序列。也指衍生自跨膜區(qū)的自締合區(qū)或衍生自信號序列的自締合區(qū)被特別地排除在這些實施方案中的這些干擾子分子產(chǎn)物的權(quán)利要求范圍內(nèi)之外。在本發(fā)明中，干擾子分子的至少一個自締合區(qū)(即干擾子分子的B部分)與所述干擾子分子所在的環(huán)境(即溶劑、細胞質(zhì))"直接接觸"。這一點的重要性將被進一步闡明。在球狀蛋白質(zhì)中，自締合區(qū)(也稱為"聚集成核區(qū)")通常隱藏在所述球狀蛋白質(zhì)的疏水核內(nèi)并從而通過穩(wěn)定天然狀態(tài)的協(xié)同相互作用的致密網(wǎng)絡(luò)與溶劑隔離。因此，在正常環(huán)境下，在所述自締合區(qū)和環(huán)境(例如溶劑)之間沒有"直接接觸"。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)去折疊時(例如當(dāng)其在核糖體上合成時或通過突變、溫度、pH改變或失去特異性分子伴侶而被去穩(wěn)定從而有利于去折疊狀態(tài)時)，它才會將其自締合區(qū)暴露于環(huán)境。自締合區(qū)通常隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部(以阻止聚集)，在非天然干擾子分子中，所述自締合區(qū)被分離并且通過將所述區(qū)域與阻止聚集的成分(即干擾子分子的A部分)連接而暴露于環(huán)境。另外換句話說，非天然的干擾子分子不會折疊為球形結(jié)構(gòu)，因此非天然干擾子分子內(nèi)的至少一個自締合區(qū)(即B部分)與所述干擾子分子所在的溶劑直接接觸。因此，"直接接觸"是指與"隱藏的并且與......隔離"相反的意思。在一個特定實施方案中，包含衍生自可溶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)的干擾子分子是多肽。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明提供了含有編碼這些干擾子分子的多核苷酸的載體。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的干擾子分子被用作藥物。干擾子分子的治療應(yīng)用蛋白質(zhì)負責(zé)從大量酶促反應(yīng)、信號傳導(dǎo)到提供結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)的生物活性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、含量或活性的改變是許多疾病的根本原因。許多藥物通過特異性干擾一個或有限幾個蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。本發(fā)明提供了一種開發(fā)能夠特異性干擾選定的靶蛋白的一類新的化合物的方法。這些新化合物命名為干擾子。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了非天然存在的分子作為藥物的應(yīng)用，所述分子包含衍生自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了非天然存在的分子作為藥物的應(yīng)用，所述分子包含衍生自能夠溶于水的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的至少一個自締合區(qū)，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，從而所述自締合區(qū)與所述分子所在的溶劑直接接觸。另外換句話說，本發(fā)明提供了非天然存在的干擾子分子作為藥物的應(yīng)用，所述干擾子分子包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一個阻止B部分聚集的區(qū)域，例如肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域包含衍生自靶蛋白的至少3個相鄰氨基酸，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭。另外換句話說，本發(fā)明提供了非天然存在的干擾子分子作為藥物的應(yīng)用，所述干擾子分子包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一個阻止B部分聚集的區(qū)域，例如肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域包含衍生自耙蛋白的至少3個相鄰氨基酸，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，并且其中B部分與所述干擾子分子所在的溶劑直接接觸。所述干擾子分子可用于治療疾病和/或用于制造治療與至少一個靶蛋白例如癌基因蛋白的異常表達相關(guān)的疾病例如癌癥的藥物，術(shù)語"異常表達"是指例如在癌癥情況下癌基因蛋白的(過)表達，也包括顯性失活(dominantnegative)蛋白的表達、特定蛋白質(zhì)的不希望的定位或特定蛋白質(zhì)的剪接變體(splicevariant)、特定蛋白質(zhì)的特定剪接變體的不希望的表達、突變蛋白的更高活性或特定蛋白質(zhì)的更高活性。在一個特定實施方案中，"異常表達"是指不需要地存在翻譯后修飾的蛋白質(zhì)或是指不希望地存在非翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。翻譯后修飾改變被修飾的氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)，因此它們具有改變給定的能夠用于特異性地靶定具有最強聚集傾向的形式的多肽片段的聚集傾向的潛力。因此，如果一種翻譯后修飾顯著降低自締合區(qū)的聚集傾向，那么使用未修飾的蛋白質(zhì)將會使干擾最有效。相反，在增加自締合區(qū)的聚集傾向的翻譯后修飾的情況下，使用修飾的蛋白質(zhì)將會使干擾最有效。僅基于親水性，推測例如磷酸化和糖基化修飾將會降低聚集傾向，而脂附著將會增加聚集傾向。本發(fā)明的干擾子分子所針對的靶蛋白可以與病原性疾病相關(guān)。例如，蛋白質(zhì)可以是病原體相關(guān)蛋白例如病毒蛋白、腫瘤相關(guān)蛋白、或自身免疫疾病相關(guān)蛋白。一方面，本發(fā)明描述了一種治療處于不需要的細胞增殖的危險中或患有不需要的細胞增殖(例如惡性或非惡性細胞增殖)的對象的方法。所述方法包括提供干擾子分子例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子，其中所述干擾子分子能夠干擾(抑制)促進不需要的細胞增殖的蛋白質(zhì)的功能和/或存在，并且將所述干擾子給予對象，優(yōu)選人類對象，從而治療所述對象。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白質(zhì)是生長因子或生長因子受體、激酶(例如蛋白質(zhì)酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸激酶)、銜接子(adaptor)蛋白、來自G蛋白偶聯(lián)受體超家族的蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾PDGF-P蛋白的生物學(xué)功能，并因此可用于治療具有特征為不需要的PDGF-卩表達的病癥(例如睪丸癌和肺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子抑制(敲低)Erb-B蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的Erb-B表達的病癥(例如乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子抑制Src蛋白的功能(或等價地"干擾其功能")(或干擾其存在)，并因此可用于治療具有特征為不需要的Src表達的病癥(例如結(jié)腸癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子抑制CRK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的CRK表達的病癥(例如結(jié)腸癌和肺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子干擾GRB2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的GRB2表達的病癥(例如鱗狀細胞癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾RAS基因的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的RAS表達的病癥(例如胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌、以及慢性白血病)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾MEEK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的MEEK表達的病癥(例如鱗狀細胞癌、黑素瘤或慢性白血病)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾JNK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的JNK表達的病癥(例如胰腺癌或乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾RAF蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的RAP表達的病癥(例如肺癌或白血病)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾Erk1/2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的Erkl/2表達的病癥(例如肺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾PCNA(p21)蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的PCNA表達的病癥(例如肺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾MYB蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的MYB表達的病癥(例如結(jié)腸癌或慢性骨髓性白血病)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾c-MYC蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的c-MYC表達的病癥(例如伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)或成神經(jīng)細胞瘤)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾JUN蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的JUN表達的病癥(例如卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾FOS蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的FOS表達的病癥(例如皮膚癌或前列腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子抑制BCL-2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的BCL-2表達的病癥(例如肺癌或前列腺癌或非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma))或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾細胞周期蛋白D的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的細胞周期蛋白D表達的病癥(例如食道癌和結(jié)腸癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾VEGF蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的VEGF表達的病癥(例如食道癌、結(jié)腸癌或病理性血管發(fā)生)或處于此病癥危險中的對象。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾EGFR蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的EGFR表達的病癥(例如乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾細胞周期蛋白A的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的細胞周期蛋白A表達的病癥(例如肺癌和宮頸癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾細胞周期蛋白E的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的細胞周期蛋白E表達的病癥(例如肺癌和乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾WNT-1蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的WNT-1表達的病癥(例如基底細胞癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾p-聯(lián)蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的f3-聯(lián)蛋白表達的病癥(例如腺癌或肝細胞癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾c-MET蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的c-MET表達的病癥(例如肝細胞癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾蛋白激酶C(PKC)的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的PKC表達的病癥(例如乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干猶NFk-B蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的NFk-B表達的病癥(例如乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾STAT3蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的STAT3表達的病癥(例如前列腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾存活蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的存活蛋白表達的病癥(例如宮頸癌或胰腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾Her2/Neu蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的Her2/Neu表達的病癥(例如乳腺癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾拓撲異構(gòu)酶I的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的拓撲異構(gòu)酶I表達的病癥(例如卵巢癌和結(jié)腸癌)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾拓撲異構(gòu)酶IIa的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的拓撲異構(gòu)酶II表達的病癥(例如乳腺癌和結(jié)腸癌)或處于此病癥危險中的對象。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療處于疾病或病癥的危險中或患有疾病或病癥的對象例如人的方法，所述疾病或病癥可受益于血管發(fā)生抑制，例如癌癥。所述方法包括提供干擾子分子例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的千擾子分子，其中所述干擾子分子能夠抑制介導(dǎo)血管發(fā)生的蛋白質(zhì)(或干擾其功能)，并且將所述干擾子分子給予對象，從而治療所述對象。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾av-整聯(lián)蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的av-整聯(lián)蛋白表達的病癥(例如腦腫瘤或源自上皮的腫瘤)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾Flt-l受體蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的Flt-l受體表達的病癥(例如癌癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或處于此病癥危險中的對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾微管蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治療具有特征為不需要的微管蛋白表達的病癥(例如癌癥和視網(wǎng)膜新血管形成)或處于此病癥危險中的對象。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療被病毒感染或處于與病毒感染相關(guān)的疾病或病癥的危險中或患有與病毒感染相關(guān)的疾病或病癥的對象的方法。所述方法包括提供干擾子分子例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子分子，其中所述干擾子分子與一種病毒蛋白或介導(dǎo)病毒功能(例如侵入或生長)的細胞蛋白同源或可以使其靜默，并且將所述干擾子分子給予對象，優(yōu)選人類對象，從而治療所述對象。同樣本發(fā)明提供了將干擾子用于制造藥物以治療被病毒感染的患者的方法，所述病毒包括人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、鼻病毒、西尼羅病毒、蜱傳腦炎病毒、麻疹病毒(MV)、或脊髓灰質(zhì)炎病毒。另一方面，本發(fā)明描述了治療被病原體感染的對象的方法，所述病原體例如細菌性、阿米巴性、寄生蟲性、或真菌性病原體。所述方法包括提供干擾子分子，例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子分子，其中所述干擾子分子能夠干擾衍生自所述病原體的病原體蛋白的功能，并且將所述干擾子分子給予對象，優(yōu)選人類對象，從而治療所述對象。來自病原體的靶蛋白可以是參與生長、細胞壁合成、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄、能量代謝(例如三羧酸循環(huán))或毒素生產(chǎn)的蛋白。因此，本發(fā)明提供了用于治療被例如惡性瘧原蟲(/7oswo(^'m附y(tǒng)^/c^(3rMm)、浪蕩分枝桿菌(A^coZ"c&n'w;ww/cenaTW)、結(jié)核分枝桿菌(聊coZacteW謂d^ercw/o^)、麻風(fēng)分枝桿菌(鄉(xiāng)co6a"en'訓(xùn)/e/nae)、金黃色葡萄球菌(Sto;7/2jv/ococciwawews)、月巿炎鏈球菌(5"fr印tococcuspweMmom'ae)、化膿鏈球菌(5^e/tococcws/73/ogewes)、月市炎衣原體(C7A2附^^'"/wewmom'ae)、或月市炎支原體(鄉(xiāng)co//osmap"ewmowz'ae)感染的患者的方法。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療處于疾病或病癥的危險中或患有疾病或病癥的對象例如人的方法，所述疾病或病癥的特征在于不需要的免疫應(yīng)答，例如炎性疾病或病癥，或者自身免疫疾病或病癥。所述方法包括提供干擾子分子例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子分子，其中所述干擾子分子能夠抑制(下調(diào))介導(dǎo)不需要的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的功能和/或存在，并且將所述干擾子分子給予對象，從而治療所述對象。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病癥是缺血或再灌注損傷，例如與急性心肌梗塞、不穩(wěn)定性絞痛、體外循環(huán)、手術(shù)干預(yù)(例如血管成形術(shù)如經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù))、對移植的器官和組織(例如移植的心臟或血管組織)的應(yīng)答、或血栓溶解相關(guān)的缺血再灌注或損傷。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病癥是再狹窄，例如與手術(shù)干預(yù)(例如血管成形術(shù)如經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù))相關(guān)的再狹窄。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病癥是炎性腸病例如克羅恩病(Crohn，sDisease)或潰瘍性結(jié)腸炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病癥是與感染或損傷相關(guān)的炎癥。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病癥是哮喘、狼瘡、多發(fā)性硬化、糖尿病例如II型糖尿病、關(guān)節(jié)炎例如類風(fēng)濕性或銀屑病關(guān)節(jié)炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾整聯(lián)蛋白或其共配體例如VLA4、VCAM、ICAM的功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾選擇蛋白或其共配體例如P-選擇蛋白、E-選擇蛋白(ELAM)、L-選擇蛋白、或P-選擇蛋白糖蛋白-(PSGLl)的功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾補體系統(tǒng)的成分例如C3、C5、C3aR、C5aR、C3轉(zhuǎn)變酶、C5轉(zhuǎn)變酶的功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾趨化因子或其受體例如TNF國a、IL-la、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11或CCR3的功能。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療處于急性疼痛或慢性疼痛的危險中或患有急性疼痛或慢性疼痛的對象例如人的方法。所述方法包括提供干擾子分子，例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子分子，其中所述干擾子分子能夠干擾介導(dǎo)疼痛發(fā)展的蛋白質(zhì)，并且將所述干擾子分子給予對象，從而治療所述對象。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾離子通道的成分的功能。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子干擾神經(jīng)遞質(zhì)受體或配體的功能。另一方面，本發(fā)明描述了一種治療處于神經(jīng)疾病或病癥的危險中或患有神經(jīng)疾病或病癥的對象例如人的方法。所述方法包括提供干擾子分子，例如具有本文所描述的結(jié)構(gòu)的干擾子分子，其中所述干擾子分子能夠干擾介導(dǎo)神經(jīng)疾病或病癥的蛋白質(zhì)，并且將所述干擾子分子給予對象，從而治療所述對象。在一個特定實施方案中，所述可被治療的疾病(或病癥)包括阿爾茨海默病(在這種情況下所述干擾子分子干擾導(dǎo)致APP加工的分泌酶(例如參與T"分泌酶復(fù)合物的蛋白質(zhì)(例如早老蛋白1或2、Aphl蛋白、呆蛋白、BACE1或BACE2))的功能。所述干擾子抑制APP加工并阻止不可溶的淀粉狀蛋白P的形成。同樣的策略可以用于阻止和/或治療其他神經(jīng)退行性疾病例如亨廷頓病(Huntington'sdisease)、脊髓小腦萎縮癥(例如SCA1、SCA2、SCA3(Machado-Jos印h病)、SCA7或SCA8)。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)或制造藥物或藥物組合物的方法，所述藥物或藥物組合物包含至少一個干擾子分子并進一步將所述干擾子分子與藥物可接受的載體混和。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述干擾子分子是多肽，并可以合成制備或作為重組蛋白質(zhì)制備。所述重組蛋白質(zhì)可以使用重組表達系統(tǒng)包括細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或轉(zhuǎn)基因動物或植物制造。所述重組蛋白質(zhì)可以通過任何常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法純化至接近均一和/或與添加劑混和。給予含有干擾子分子的藥物組合物可以通過口服、吸入、透皮或非胃腸道方式(包括靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、和皮下)給予進行。活性化合物可以單獨給予或優(yōu)選地配制為藥物組合物。一單位劑量通常含有0.01至500mg，例如0.01至50mg、或0.01至10mg、或0.05至2mg化合物或其藥物學(xué)可接受的鹽。單位劑量通常每天一次或多于一次給予，例如每天2、3、或4次，更常見地每天1至3次，因此總每日劑量通常在0.0001至10mg/kg范圍內(nèi)；因此用于70kg體重的成年人的合適的總每日劑量是0.01至700mg，例如0.01至100mg、或0.01至10mg或更常見地0.05至10mg。優(yōu)選地所述化合物或其藥物學(xué)可接受的鹽以單位劑量組合物的形式給予，例如單位劑量口服、非胃腸道、透皮或吸入組合物。這些組合物通過混和制備，并適于口服、吸入、透皮或非胃腸道給予，并因此可以是片劑、膠囊、口服液體制備物、粉末、顆粒劑、錠劑、可復(fù)水的粉末、可注射和可灌注的溶液或混懸劑或栓劑或氣霧劑形式。用于口服給藥的片劑和膠囊通常以單位劑量存在，并含有常規(guī)賦形劑例如粘合劑、填充劑、稀釋劑、成片劑(tablettingagent)、潤滑劑、崩解劑、著色劑、矯味劑、和潤濕劑。片劑可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法加上包衣。合適的填充劑包括纖維素、甘露醇、乳糖及其他相似物質(zhì)。合適的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物例如羧甲基淀粉鈉。合適的潤滑劑包括例如硬脂酸鎂。合適的藥物學(xué)可接受的潤濕劑包括十二烷基硫酸鈉。這些固體口服組合物可通過混和、填充、壓片或類似的常規(guī)方法制備。重復(fù)混和操作可用于將活性劑遍布那些使用大量填充劑的組合物中。當(dāng)然，這些操作是本領(lǐng)域常規(guī)的?？诜后w制備物可以是例如水溶液或油狀混懸液、溶液、乳液、糖漿、或酏劑的形式，或可以是用于在使用之前用水或其他合適的載體復(fù)水的干燥產(chǎn)物。這些液體制備物可以含有常規(guī)添加劑例如混懸劑如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑如卵磷脂、失水山梨醇單油酸酯、或阿拉伯樹膠；非水性載體(可包括食用油)如杏仁油、分餾的椰子油、油酯如甘油酯、丙二醇、或乙醇；防腐劑如甲基或丙基對羥基苯甲酸或山梨酸，以及如果希望，常規(guī)矯味劑或著色劑。口服配制物也包括常規(guī)緩釋配制物，如具有腸溶包衣的片劑或顆粒劑。優(yōu)選地，用于吸入的組合物以吸入劑(snuff)或氣霧劑或用于噴霧器的溶液或用于吹入的微細粉末的形式對呼吸道單獨給藥或與惰性載體例如乳糖組合給藥。在這種情況下，活性化合物的顆粒適當(dāng)?shù)刂睆叫∮?0微米，優(yōu)選地小于10微米，例如在1至5微米之間如在2至5微米之間。或者，可以使用有包衣的納米顆粒，顆粒大小在30至500nm之間。有利的吸入劑量在0.05至2mg之間，例如0.05至0.5mg、0.1至lmg或0.5至2mg。對于非胃腸道給藥，液體單位劑型制備為含有本發(fā)明的化合物和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，活性化合物可以是混懸的或溶解的。非胃腸道溶液通常通過將所述化合物溶解于載體中制備，并在注入合適的小瓶或安瓿并封口之前過濾除菌。有利地，佐劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也溶解在所述載體中。為了增加穩(wěn)定性，所述組合物可以在注入小瓶后冷凍并在真空下除去水。非胃腸道混懸劑基本上以相同的方式制備，不同之處是所述化合物混懸在載體中而不是被溶解，并且在混懸于無菌載體之前通過暴露于環(huán)氧乙烷除菌。有利地，所述組合物包含表面活性劑或潤濕劑以促進活性化合物的均一分布。當(dāng)合適時，可以包含小量的支氣管擴張劑例如擬交感胺類如異丙腎上腺素、異丁子香酚(isoetharine)、沙丁胺醇、去氧腎上腺素和麻黃素，也可以包含黃嘌呤衍生物如茶堿和氨茶堿，以及糖皮質(zhì)激素如強的松龍和腎上腺興奮劑如ACTH。作為通常實踐，所述組合物通常會帶有用于藥物治療相關(guān)方面的手寫的或印刷的指導(dǎo)。在一個優(yōu)選的實施方案中，干擾子分子進一步包含一個蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)結(jié)構(gòu)域。己經(jīng)顯示稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)的一系列小蛋白結(jié)構(gòu)域有效地并且不依賴轉(zhuǎn)運蛋白或特異性受體而穿越生物膜，并且促進肽和蛋白質(zhì)輸送進入細胞。例如人免疫缺陷病毒(HIV-1)的TAT蛋白能夠在體內(nèi)輸送生物活性蛋白。相似地，觸角足同源結(jié)構(gòu)域的第三個a-螺旋和單純皰疹病毒的VP22蛋白促進共價連接的肽或蛋白質(zhì)輸送進入細胞(綜述FordKG"a/(2001)Ge"e7T^8,l-4)。基于短兩性肽載體Pep-l的蛋白質(zhì)輸送對于各種肽和蛋白質(zhì)以完全生物活性形式輸送進入幾個細胞系是有效的，而不需要之前的化學(xué)共價偶聯(lián)(MorrisMC"a/,(2001)A^.仏oto^"o/.19,1173-1176)。VP22嵌合蛋白從初級轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞擴散至周圍細胞的能力可以促進基因治療方法(ZenderL"(2002)Owc^Ce"e7%"9，489-496)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知促進蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的序列，包括但不限于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述序列選自包括HIVTAT蛋白、聚精氨酸序列、穿膜肽和pep-l的一組。其他經(jīng)常使用的可穿透細胞的肽(天然的和人造肽)公開于JoliotA.andProchiantzA.(2004)iVaft^eCe//5/o/.6(3)189-193。藥物組合物的另一方面是應(yīng)用編碼干擾子分子的核苷酸序列。在使用編碼干擾子分子的核酸序列的情況下，所述藥物優(yōu)選地傾向于在基因療法治療中將所述核酸輸送進入細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量的輸送方法。優(yōu)選地，給予核酸以用于體內(nèi)或回體(e:cWw)基因治療用途。非病毒載體輸送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸核酸、和與輸送載體如脂質(zhì)體復(fù)合的核酸。病毒載體輸送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，所述病毒在輸送至細胞之后具有游離的或整合的基因組。核酸的非病毒輸送方法包括脂轉(zhuǎn)染、微注射、生物射彈、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂:核酸綴合物、裸DNA、人工病毒顆粒、和活性物質(zhì)(agent)增強的DNA攝取。脂轉(zhuǎn)染描述于例如USPat.No,5,049,386、USPatNo.4,946,787和USPat.No.4，897，355，脂轉(zhuǎn)染試劑已有商業(yè)出售(例如TransfectamW和LipofectinTM)。適于多核苷酸的有效的受體識別的脂轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂類包括Flegner,WO91/17424,WO91/16024所述的那些。輸送可以至細胞(回體給予)或靶組織(體內(nèi)給予)。脂:核酸復(fù)合物包括靶定的脂質(zhì)體如免疫脂復(fù)合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如Crystal,1995;Blaese"a/"1995;Behr，1994;Remy"a/.，1994;GaoandHuang1995;U.S.Pat,Nos.4，186，183，4，217，344，4,235,871,4，261，975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，和4,946,787)。使用基于RNA或DNA病毒的系統(tǒng)以輸送核酸利用了已有高度進展的方法以將病毒靶向體內(nèi)特定細胞并將病毒有效載荷運輸至細胞核。病毒載體可以直接給予患者(體內(nèi))或者可以用于在體外處理細胞，然后被修飾的細胞被給予患者(回體)。用于輸送核酸的常規(guī)的基于病毒的系統(tǒng)包括但不限于用于基因轉(zhuǎn)移的反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰疹病毒載體。病毒載體是現(xiàn)有最有效的和最通用的在靶細胞和組織內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。使用反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺伴隨病毒基因轉(zhuǎn)移方法使整合進宿主基因組成為可能，經(jīng)常導(dǎo)致被插入的轉(zhuǎn)基因的長期表達。另外，已經(jīng)在很多不同細胞類型和靶組織中觀察到了高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在優(yōu)選核酸短暫表達的情況下，可以使用基于腺病毒的系統(tǒng)，包括復(fù)制缺陷的腺病毒載體?；谙俨《镜妮d體在許多細胞類型中具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且不需要細胞分裂。使用這些載體，已經(jīng)獲得了高滴度和水平的表達。這種載體可以在相對簡單的系統(tǒng)中大量生產(chǎn)。腺伴隨病毒("AAV")載體，包括重組腺伴隨病毒載體，也用于用靶核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，例如在核酸和肽的體外生產(chǎn)中，以及用于體內(nèi)和回體基因治療方法(參見例如U.S.PatentNo.4,797,368;WO93/24641;Kotin，1994;重組AAV載體的構(gòu)建描述于許多文獻，包括U.S.Pat.No.5,173,414;Hermonat&Muzyczka,1984;Samulski"a/.，1989)。基因治療載體可以通過給予各個患者而體內(nèi)輸送，典型地通過全身給予(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、或顱內(nèi)灌注)或局部給予進行。在特定實施方案中，本發(fā)明還預(yù)想了使用水動力基因治療方法。水動力基因治療公開于US6627616(MinisCorporation,Madison)，并包括血管內(nèi)輸送編碼干擾子的非病毒核酸，從而血管通透性通過例如使用在所述血管內(nèi)部增加的壓力或通過共給予增加血管通透性的化合物例如罌粟堿而提咼?；蛘撸梢詫⑤d體回體輸送至細胞，例如外植自個體患者的細胞(例如淋巴細胞、骨髓象、組織切片)或全能供體造血干細胞，之后將所述細胞重移植進患者體內(nèi)，通常在選擇已整合所述載體的細胞之后進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于診斷、研究、或用于基因治療的回體細胞轉(zhuǎn)染(例如通過將轉(zhuǎn)染的細胞再注入宿主生物體)。在一個優(yōu)選的實施方案中，細胞從目標(biāo)生物體中分離，用核酸(基因或cDNA)轉(zhuǎn)染，并再注入回所述目標(biāo)生物體(例如患者)內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適于回體轉(zhuǎn)染的各種細胞類型(參見例如Freshney"a/"1994以及本文引用的用于討論如何分離并培養(yǎng)來自患者的細胞的參考文獻)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)干擾的方法可用于確定能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)干擾的細胞或生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的功能。所述細胞可以是原核細胞或可以是真核細胞或可以是細胞系例如植物細胞或動物細胞如哺乳動物細胞例如胚胎細胞、多能干細胞、腫瘤細胞例如畸胎癌細胞或病毒感染的細胞。所述生物體優(yōu)選真核生物體，例如植物或動物如哺乳動物，特別是人。本發(fā)明的干擾子分子所針對的靶蛋白可以與一種病原性疾病相關(guān)。例如，所述蛋白可以是病原體相關(guān)蛋白，例如病毒蛋白、腫瘤相關(guān)蛋白或自身免疫疾病相關(guān)蛋白。靶蛋白也可以是在重組細胞或遺傳學(xué)被改變的生物體內(nèi)表達的異源基因。通過抑制這種蛋白的功能，可以獲得在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域或在藥物或獸藥領(lǐng)域中有價值的信息和治療利益。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法被用于具有靶蛋白特異性敲除表型的真核細胞或真核非人生物體，所述表型包括至少一種內(nèi)源靶蛋白的至少部分缺陷表達，其中所述細胞或生物體與至少一種能夠抑制至少一種內(nèi)源靶蛋白的功能的干擾子分子接觸，或與編碼至少一種能夠干擾至少一種內(nèi)源蛋白質(zhì)的功能和/或存在的干擾子分子的載體接觸。應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明也允許由于干擾子分子的特異性導(dǎo)致的幾種不同內(nèi)源蛋白質(zhì)的靶特異性敲除。細胞或非人生物體，特別是人細胞或非人哺乳動物的蛋白質(zhì)特異性敲除可用于分析方法，例如用于復(fù)雜生理過程的功能和/或表型分析，例如蛋白質(zhì)組分析。例如人們可以在培養(yǎng)的細胞中制備推測為可變剪接過程的調(diào)節(jié)蛋白的人蛋白的敲除表型。在這些蛋白質(zhì)中特別是SR剪接因子家族成員，例如ASF/SF2、SC35、SRp20、SRp40或SRp55。進一步地，可以分析SR蛋白質(zhì)對預(yù)先確定為可變剪接基因例如CD44的mRNA分布(profile)的影響。使用本文描述的基于蛋白質(zhì)的敲除技術(shù)，可以在靶細胞或靶組織內(nèi)抑制內(nèi)源靶蛋白的表達。內(nèi)源蛋白可以被編碼靶蛋白或所述靶蛋白的變體或突變形式的外源靶核苷酸例如基因或cDNA互補，所述靶核苷酸可以任選地與編碼可檢測的肽或多肽例如親和標(biāo)簽，特別是多親和標(biāo)簽的另外的核酸序列融合。所述靶蛋白的變體或突變形式與內(nèi)源靶蛋白的不同之處在于它們由于單一或多個氨基酸的氨基酸取代、插入和/或缺失而與所述內(nèi)源蛋白不同。所述變體或突變形式可具有與內(nèi)源靶蛋白相同的生物學(xué)活性。另一方面，所述變體或突變的靶蛋白也可具有與所述內(nèi)源靶蛋白的生物學(xué)活性不同的生物學(xué)活性，例如部分缺失的活性、完全缺失的活性、提高的活性等等?；パa可通過在耙細胞內(nèi)共表達由外源核酸編碼的多肽和用于敲除內(nèi)源蛋白的干擾子分子實現(xiàn)，所述多肽例如包含靶蛋白和親和標(biāo)簽的融合蛋白。這種共表達可通過使用表達由外源核酸編碼的多肽和干擾子分子的合適的表達載體實現(xiàn)，所述多肽例如標(biāo)簽修飾的靶蛋白，或通過使用表達載體的組合實現(xiàn)，或者干擾子分子可從細胞外接觸靶細胞。在靶細胞內(nèi)從頭合成的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物包含外源蛋白例如被修飾的融合蛋白。為了避免干擾子分子抑制外源蛋白的功能，外源蛋白在選擇為用于設(shè)計干擾子分子的聚集區(qū)必須具有足夠的氨基酸區(qū)別。或者，內(nèi)源靶蛋白可以由來自其他物種的相應(yīng)蛋白互補，或者內(nèi)源耙蛋白可以由所述耙蛋白的一種剪接形式互補。與使用敲除的細胞相比，敲除一種內(nèi)源蛋白并用突變的(例如部分缺失的)外源靶拯救的組合具有優(yōu)勢。另外，這種方法特別適于識別耙蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。在另外一個優(yōu)選的實施方案中，進行例如至少兩種細胞或生物體的基因表達分布(profile)和域蛋白質(zhì)組和域表型特征的比較。這些生物體選自(i)不具有靶蛋白抑制的對照細胞或?qū)φ丈矬w，(ii)具有靶蛋白抑制的細胞或生物體，(iii)具有靶蛋白抑制并且具有由編碼所述耙蛋白的外源耙核酸進行的靶蛋白互補的細胞或生物體。本發(fā)明的方法也適于用于鑒定藥用物質(zhì)和/或描述藥用物質(zhì)的性質(zhì)的方法，例如從測試物質(zhì)的集合中鑒定新的藥用物質(zhì)和/或描述已知藥用物質(zhì)的作用機理和/或副作用的性質(zhì)。因此，本發(fā)明還涉及用于鑒定作用于至少一種耙蛋白的藥用物質(zhì)和/或描述其性質(zhì)的系統(tǒng)，包括(a)能夠表達至少一種編碼所述靶蛋白的內(nèi)源耙基因的的真核細胞或真核非人生物體，(b)至少一種能夠抑制所述至少一種內(nèi)源靶基因的表達的干擾子分子，和(c)一種測試物質(zhì)或測試物質(zhì)的集合，其中所述測試物質(zhì)或所述集合的藥學(xué)性質(zhì)有待鑒定和/或其性質(zhì)有待描述。另夕卜，上述系統(tǒng)優(yōu)選地包括(d)至少一種編碼靶蛋白或耙蛋白的變體或突變形式或剪接形式的外源靶核酸，其中所述外源耙蛋白與內(nèi)源耙蛋白在聚集區(qū)的氨基酸水平上不同，從而所述外源靶蛋白的功能與內(nèi)源蛋白的表達相比被干擾子分子基本上較少地抑制。另外，本發(fā)明還包括含有干擾子分子的細胞和生物體。生物體可以是例如攜帶編碼干擾子的遺傳信息的轉(zhuǎn)基因植物。這種轉(zhuǎn)基因植物在一個優(yōu)選的實施方案中是被靜默的植物(即其中特定靶蛋白由于特異性干擾子存在于所述植物的細胞或器官的亞集合中或存在于全部細胞和器官中而被下調(diào))。含有干擾子的細胞可以通過將所述細胞與特定干擾子分子接觸或?qū)⑺黾毎锰囟ǜ蓴_子分子電穿孔而產(chǎn)生。在一個特定實施方案中，含有干擾子的細胞通過轉(zhuǎn)染(或轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生，其中所述干擾子由重組表達載體例如質(zhì)粒或病毒載體編碼。分離分離及檢測在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括將所述樣品與包含所述蛋白質(zhì)中的至少一個自締合區(qū)的非天然存在的分子接觸，并從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括將所述樣品與包含從所述蛋白質(zhì)中分離的至少一個自締合區(qū)的非天然存在的分子接觸，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，并從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括將所述樣品與包含從所述蛋白質(zhì)中分離的至少一個自締合區(qū)的非天然存在的分子接觸，其中所述自締合區(qū)與阻止所述自締合區(qū)聚集的成分融合，從而所述自締合區(qū)與所述與所述成分融合的自締合區(qū)和所述蛋白質(zhì)所在的溶劑直接接觸，并從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。換句話說，本發(fā)明提供了一種用于從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括-將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成，并且其中所述區(qū)域分離自所述蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，以及-從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。另外換句話說，本發(fā)明提供了一種用于從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括-將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分包含至少一個自締合區(qū)，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成，并且其中所述區(qū)域分離自所述蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，并且其中B部分與所述分子和蛋白質(zhì)所在的環(huán)境直接接觸，以及-從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。另外換句話說，本發(fā)明提供了一種用于從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括-將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分由至少一個自締合區(qū)組成，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成并且其中所述區(qū)域分離自所述蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，并且其中B部分與所述分子和蛋白質(zhì)所在的環(huán)境直接接觸，以及-從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。另外換句話說，本發(fā)明提供了一種用于從樣品中分離蛋白質(zhì)的方法，包括-將所述蛋白質(zhì)與包含A部分和B部分的非天然存在的分子接觸，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或瓊脂糖珠，和ii)B部分由至少一個自締合區(qū)組成，其中所述區(qū)域由至少3個相鄰氨基酸組成并且其中所述區(qū)域分離自所述蛋白質(zhì)，并且其中A部分和B部分之間任選地存在一個接頭，以及-從所述樣品中分離得到共聚集的分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。分離在進一步的實施方案中，用于分離至少一種蛋白質(zhì)的方法進一步包括從樣品中分離至少一種蛋白質(zhì)。從樣品中分離至少一種蛋白質(zhì)的一個應(yīng)用是從樣品中除去(或除盡)高度冗余的蛋白質(zhì)。事實上，蛋白質(zhì)靶的發(fā)現(xiàn)和確認的一個主要挑戰(zhàn)是如何特異性地分解復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品(例如血漿、尿液、腦脊液)并測定痕量靶。冗余蛋白質(zhì)經(jīng)常比小量蛋白質(zhì)濃度高6-10個數(shù)量級。因此，必須除去高度冗余的蛋白質(zhì)以檢測并測定有藥學(xué)重要性的痕量蛋白質(zhì)。由于清蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、轉(zhuǎn)鐵蛋白和觸珠蛋白組成了人血清中全部蛋白含量的大約90%,因此急需診斷工具以迅速除盡這些不需要的冗余蛋白質(zhì)并顯露出較少量的低分子量蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物。本領(lǐng)域已經(jīng)使用了幾種方法l)免疫球蛋白G(IgG)作為親和試劑以捕獲并分離冗余蛋白靶，2)卵黃免疫球蛋白(IgY)是分離自免疫的鳥類卵黃的類IgG抗體，3)預(yù)分級分離被用于將蛋白質(zhì)混和物分離為不同的級分以除去原始混和物中的特定蛋白質(zhì)，和4)A蛋白和G蛋白是細菌細胞壁蛋白，具有針對IgG抗體的特異性，因此A蛋白和G蛋白親和樹脂可除去IgG，和5)IgG-和IgY-微珠用于蛋白質(zhì)檢測。檢測在另一個特定實施方案中，用于分離至少一種蛋白質(zhì)的方法進一步包括在所述分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物中檢測至少一種蛋白質(zhì)。檢測可以通過分離千擾子分子-靶蛋白復(fù)合物進行，所述分離通過例如電泳、柱層析、過濾、靜電吸引、磁性或順磁吸引、質(zhì)譜等等實現(xiàn)。最廣泛應(yīng)用的生物檢測技術(shù)基于抗體的應(yīng)用。抗體基于形狀和物理化學(xué)性質(zhì)識別并結(jié)合其他分子。抗體高度適于在蛋白質(zhì)的復(fù)雜混和物中檢測小量靶蛋白。本發(fā)明顯示使用干擾子分子(B部分具有針對至少一個特定蛋白質(zhì)的特異性和識別性)可以替代使用抗體(作為識別元件)以于靶蛋白的特異性捕獲。事實上，干擾子分子可用于典型地使用抗體的大量實際應(yīng)用中。僅指出其中一些可預(yù)見應(yīng)用于診斷、微量分析、法醫(yī)學(xué)及病原體的特異性檢測中。對于本發(fā)明的檢測及分離應(yīng)用，優(yōu)選干擾子分子的B部分與本文中稱為A部分的載體結(jié)合。載體可以是平坦表面例如塑料或硝酸纖維素或色譜柱，但是優(yōu)選珠例如微球珠。針對作為干擾子分子的A部分的各種類型的珠和微球體的普遍討論描述于US6682940的第9頁和第10頁，并且通過參考特別并入本文。在一個特定實施方案中，干擾子分子的A部分是碳水化合物類型的載體，例如硝酸纖維素或瓊脂糖。B部分可以用交聯(lián)劑如戊二醛共價結(jié)合至所述碳水化合物載體。在另一個特定實施方案中，A部分是支持物例如纖維素、玻璃或合成多聚體。A部分和B部分之間的共價附著可通過B部分的氨基酸殘基和A部分上的疊氮化物、碳二亞胺、異氰酸鹽或其他化學(xué)衍生物實現(xiàn)。在另一個特定實施方案中，A部分是多孔硅烷化玻璃微珠。B部分可通過其肽氨基(通過Schiff反應(yīng)后用硼氫化鈉還原)至通過化學(xué)連接至硅原子的環(huán)氧基丙基硅烷(glycidoxypropylsikne)基團的高碘酸鹽氧化形成的醛基而共價鍵合至A部分(這種偶聯(lián)描述于SportsmanandWilson(1980)Anal.Chem.52,2013-2018)。在一個特定實施方案中，載體A部分被與A部分交聯(lián)的類蛋白質(zhì)膜包被(參見US4478946的權(quán)利要求1-50和涉及載體的實施例)。在另一個特定實施方案中，A部分是熒光珠例如熒光乳膠顆粒。專利US4550017,特別是其中第4頁，描述了可用于制造熒光珠的熒光化合物。在另一個特定實施方案中，A部分改變大小并還可以含有或充滿熒光染料。由于珠的不同大小和染料，可以在單一反應(yīng)中檢測和定量多個蛋白質(zhì)。用于開發(fā)這種珠的方法描述于US6159748。在另一個特定實施方案中，A部分(珠)和B部分之間的偶聯(lián)通過聚蘇氨酸、聚絲氨酸、葡聚糖或聚乙二醇進行。US6399317的實施例6、7、8和9闡明了這種偶聯(lián)可以如何進行。在另一個特定實施方案中，A部分是磁性珠。磁性珠、磁性珠和蛋白質(zhì)物質(zhì)之間的偶聯(lián)及其應(yīng)用描述于申請US6489092的第8頁。定義除非另外定義，本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有相同于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管與本文描述的任何方法和材料相似或等價的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的方法和材料。為本發(fā)明的目的，下面定義下列術(shù)語。本文所用冠詞"一種"是指一個或多于一個的本文所說的語法上的賓語。例如"一種靶蛋白"是指一個靶蛋白或多于一個耙蛋白。如本文所用，術(shù)語"大約"是指量、水平、數(shù)值、尺寸、大小、或數(shù)量相比參考量、水平、數(shù)值、尺寸、大小、或數(shù)量改變多至30%,優(yōu)選地多至20%，更優(yōu)選地多至10%。"雙官能交聯(lián)試劑"是指含有兩個反應(yīng)基團的試劑，從而所述試劑具有將兩個元件例如干擾子分子的A部分和B部分共價連接的能力。交聯(lián)試劑中的反應(yīng)基團典型地屬于包括琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺和卣乙酰胺如碘乙酰胺官能團的類型。在本說明書中，除非上下文另外需要，否則術(shù)語"包含"應(yīng)理解為意味著包括闡明的步驟或元素或一組步驟或元素，而不是排除任何其他步驟或元素或一組步驟或元素。"表達載體"或"重組載體"是指任何能夠指導(dǎo)由所述載體編碼的干擾子分子的合成的自主遺傳元件。"衍生物"是指已經(jīng)通過修飾例如通過與其他化學(xué)成分綴合或復(fù)合(例如聚乙二醇化)或通過本領(lǐng)域理解的翻譯后修飾技術(shù)而衍生自基本序列的干擾子分子。術(shù)語"衍生物"也將對親代序列進行的改變包括在其范圍內(nèi)，所述改變包括形成功能性等價分子的添加或缺失。"有效量"在調(diào)節(jié)活性或治療或阻止一種疾病的上下文中是指將該量的干擾子分子以單一劑量或作為一系列劑量的一部分給予需要這種調(diào)節(jié)、治療或預(yù)防的個體，所述量有效調(diào)節(jié)該效應(yīng)或用于治療或預(yù)防該種疾病。所述有效量根據(jù)接受治療的個體的健康和身體條件、接受治療的個體的分類學(xué)組別、組合物的配方、醫(yī)療狀態(tài)的評估、以及其他相關(guān)因素變化。期望所述量落入可通過常規(guī)試驗確定的相對寬的范圍。"分離的"是指一種物質(zhì)，其基本上不含有在其天然狀態(tài)通常伴隨其的成分。例如，如本文所用，"分離的多肽"是指從在天然存在的狀態(tài)下位于其側(cè)翼的序列中純化出來的多肽，例如從正常情況下與其相鄰的序列中被轉(zhuǎn)移出來的自締合序列。自締合序列(任選地與阻止聚集的成分偶聯(lián))可通過氨基酸化學(xué)合成產(chǎn)生或可通過重組生產(chǎn)產(chǎn)生。如本文所用，術(shù)語"寡核苷酸"是指由通過磷酸二酯鍵連接的多個核苷酸單位(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相關(guān)結(jié)構(gòu)變體或合成的類似物)組成的多聚體(或其相關(guān)結(jié)構(gòu)變體或合成的類似物)。寡核苷酸典型地長度較短，通常從大約10至30個核苷酸，但是本術(shù)語可以指任何長度的分子，盡管術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"典型地用于大的寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。本術(shù)語典型地指長度大于30個核苷酸的寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語"重組多核苷酸"是指在體外通過將核酸操作為在自然界通常找不到的形式而形成的多核苷酸。例如重組多核苷酸可以以表達載體的形式存在。通常，這些表達載體包含與核苷酸序列可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸。"可操縱地連接"是指轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸相對于編碼多肽的多核苷酸處于所述多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并且所述多肽被翻譯的位置。術(shù)語"對象"或"個體"或"患者"，在本文中可互換使用，是指希望治療或預(yù)防的任何對象，特別是脊椎動物對象，甚至更特別地是哺乳動物對象。落入本發(fā)明范圍的合適的脊椎動物包括但不限于靈長類、禽類、魚類、爬蟲類、家畜(例如綿羊、奶牛、馬、驢、豬)、實驗室動物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、寵物(例如貓、狗)和捕獲的野生動物(例如狐貍、鹿、澳洲野狗)。然而，應(yīng)當(dāng)理解上述術(shù)語不意味著存在癥狀。"藥物學(xué)可接受的載體"是指可安全地用于對患者局部或全身給藥的固體或液體填充劑、稀釋劑或成膠囊物質(zhì)。"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中互換使用，是指氨基酸殘基多聚體及其變體或合成的類似物。因此，這些術(shù)語可用于其中一或多個氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸多聚體，例如相應(yīng)天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物，以及用于天然存在的氨基酸多聚體。"重組多肽"是指使用重組技術(shù)即通過重組的或合成的多核苷酸表達制造的多肽。當(dāng)嵌合多肽或其生物活性部分被重組產(chǎn)生時，其還優(yōu)選地基本上不含有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制備物體積的小于大約20%、更優(yōu)選地小于大約10%，以及最優(yōu)選地小于大約5%。如本文所用，術(shù)語"序列同一性"是指序列在一個對比窗內(nèi)一個一個核苷酸基礎(chǔ)上或一個一個氨基酸基礎(chǔ)上的相同性程度。因此，"序列同一性百分比"通過在一個對比窗內(nèi)對比兩個被最佳排列的序列、確定在兩個序列里出現(xiàn)相同核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如e.g.、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數(shù)目而計算得到匹配位置的數(shù)目、用匹配位置的數(shù)目除以對比窗內(nèi)位置總數(shù)(即窗口大小)、并將結(jié)果乘以100得到序列同一性百分比而計算得到。根據(jù)本發(fā)明的目的，"序列同一性"應(yīng)理解為意思是由DNASIS計算機程序(windows使用Version2.5;可得自HitachiSoftwareengineeringCo.,Ltd.,SouthSanFrancisco,Calif"USA)使用如在軟件隨附的參考手冊中所用的標(biāo)準(zhǔn)默認值計算得到的"匹配百分比"。"相似性"是指相同的或組成型保守取代的氨基酸的數(shù)目百分比。相似性可使用序列對比程序例如GAP(Deverauxetal.1984,NucleicAcidsResearch12,387-395)確定。通過這種方式，與本文引用的序列具有相似或基本上不同的長度的序列可通過在對比排列內(nèi)部插入間隔(gap)而對比，所述間隔例如通過GAP使用的對比算法確定。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指生物體例如細菌、酵母或植物的基因型通過引入外源或內(nèi)源核酸而改變。用于轉(zhuǎn)化的載體包括質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒和其他動物病毒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)等等。"載體"是指多核苷酸分子，優(yōu)選地衍生自例如質(zhì)粒、噬菌體、酵母或病毒的DNA分子，其中可插入或克隆多核苷酸。載體優(yōu)選地含有一或多個獨特的限制位點并能夠在已知的宿主細胞中自主復(fù)制，所述宿主細胞包括靶細胞或組織或其前體細胞或組織，或可整合己知宿主的基因組從而被克隆的序列可以復(fù)制。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即載體作為其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的染色體外實體存在，例如線性或閉環(huán)質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體(minichromosome)、或人工染色體。載體可以包含用于保證自我復(fù)制的任何工具?；蛘?，載體可以是當(dāng)導(dǎo)入細胞內(nèi)部時整合進基因組并與其整合進的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以包括單一載體或質(zhì)粒、共同含有導(dǎo)入宿主細胞基因組的總DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒、或轉(zhuǎn)座子。載體的選擇典型地基于所述載體與導(dǎo)入所述載體的宿主細胞的兼容性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體優(yōu)選地是病毒或病毒衍生的載體，其在動物，優(yōu)選哺乳動物細胞中可操縱地發(fā)揮功能。載體也可包含選擇標(biāo)記例如可用于選擇合適的轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所述抗性基因的實例，包括產(chǎn)生抗生素卡那霉素和G418(Geneticin⑧)抗性的nptll基因和產(chǎn)生抗生素潮霉素B抗性的hph基因。除非另外定義，本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有相同于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管與本文描述的任何方法和材料相似或等價的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，下文描述了有用的方法和材料。所述材料、方法和實施例僅僅是為了說明目的而不是為了起到限制作用。本發(fā)明其他特征和優(yōu)點可以從詳細的說明書和權(quán)利要求書中明顯地得到。實施例1.設(shè)計合成肽干擾子分子我們構(gòu)建了一種干擾子分子，其中B部分由三個合成的自締合區(qū)組成，由兩個氨基酸的短接頭連接所述自締合區(qū)(STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE)。所述三個自締合區(qū)是具有強烈聚集傾向的六肽，所述干擾子分子的設(shè)計參見圖1。注在本發(fā)明文中全部氨基酸序列均從氨基末端開始列出，向羧基末端部分方向讀，因此，"STLIVL"讀作"NH2-STLIVL-COOH")。合成干擾子分子的B部分在N末端與阻止聚集的成分(A部分)融合，并使所述自締合區(qū)與環(huán)境直接接觸(這里是大腸桿菌(￡.co/z')的細胞質(zhì))。(圖1描述了所述合成干擾子設(shè)計的結(jié)構(gòu))。所述成分是NusA蛋白，其經(jīng)常用作重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的增溶標(biāo)簽13。得到的合成干,擾子分子(A-B結(jié)構(gòu))可以在大腸桿菌中以重組方式制備并純化。我們已經(jīng)示出了所述合成干擾子分子(不含有任何特異性針對特定大腸桿菌蛋白的特異性自締合區(qū))的過表達并不阻止細菌生長。因此，用pETM60質(zhì)粒(GStier，EMBL惠贈)中的所述合成干擾子構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌細胞。在所述質(zhì)粒中干擾子受到嵌合T7啟動子的控制(參見"材料和方法"部分)。重組子生長至0.6OD，干擾子在37。C加入0.5pMIPTG3小時的條件下表達，并將細菌懸浮液鋪板在瓊脂平板上。在37。C溫育12h后檢查所述平板，顯示大量細菌生長。下一步，將柔軟的接頭序列("KPGAAKG"-圖1中示為"接頭")偶聯(lián)至合成干擾子構(gòu)建體的COOH末端以使衍生自靶蛋白的自締合序列融合。2.原核生物中的蛋白質(zhì)干擾在本實施例中選擇下調(diào)大腸桿菌蛋白質(zhì)，對所述蛋白質(zhì)進行功能性蛋白質(zhì)干擾產(chǎn)生可選擇的特征。得自大腸桿菌蛋白質(zhì)組的靶蛋白用細胞質(zhì)定位和具有合適的高TANGO分值的聚集區(qū)的存在進行選擇。由于可以使用具有可控組成的生長培養(yǎng)基方便地測試針對單一氨基酸的條件營養(yǎng)缺陷體，我們選擇了四種參與異亮氨酸(UniProt15entry:ILVI—ECOLI)、甲硫氨酸(UniProt15entries:METE—ECOLI和METK—ECOLI)和亮氮酸(UniProt15entry:LEUl一ECOLI)合成的候選酶。所述四個靶蛋白的基于TANGO預(yù)測分值的自締合序列是ILVI—ECOLI:"GVVLVTSG"，TANGO分值44，METE一ECOLI:"LLLTTYF，，TANGO分值32，METK—ECOLI:""LTLLV",TANGO分值20，LEU1—ECOLI:"LAFIG"，TANGO分值15。實施例1的合成干擾子分子的遺傳信息與編碼所述四個生物合成酶的各個自締合區(qū)的DNA序列融合得到四個特異性干擾子分子。為了示出體內(nèi)蛋白質(zhì)干擾(其基本上是所述特異性干擾子(針對一種生物合成酶)和所述生物合成酶本身共聚集)，我們進行了如下操作。用含有各個干擾子構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在豐富培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期開始，此時用IPTG(異丙基-j3-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)干擾子蛋白表達。在37°C進行蛋白質(zhì)表達，收獲細胞，用鹽溶液漂洗細胞以除去過量的IPTG和豐富培養(yǎng)基，并在含有補充了二十種天然存在的氨基酸的基本M9培養(yǎng)基(稱為M9完全培養(yǎng)基)和含有除了測試的營養(yǎng)缺陷體所針對的那種氨基酸之外的全部氨基酸的基本M9培養(yǎng)基(稱為M9選擇培養(yǎng)基)的瓊脂平板上鋪板。結(jié)果顯示對于四種耙酶中的三種，可以實現(xiàn)完全功能性敲除，即發(fā)現(xiàn)在M9完全培養(yǎng)基上形成菌落的細菌在M9選擇瓊脂平板上不能形成菌落。干擾子構(gòu)建體的表達及其主要存在于細胞裂解物的不溶解部分的事實通過western印跡確定。對于這里測試的四種酶，在其對共聚集方法的靈敏度和其基于TANGO算法預(yù)測的聚集傾向之間觀察到了明顯的相關(guān)性，進一步確定了TANGO預(yù)測的質(zhì)量及其在功能性細胞環(huán)境中的相關(guān)性。具有最高TANGO分值的ILVI蛋白在不存在任何IPTG的情況下幾乎完全被來自T7啟動子的滲漏表達所敲除，并且一小時的誘導(dǎo)過表達導(dǎo)致完全的功能性敲除。METE和METK酶顯示中等TANGO分值，沒有受到干擾子僅一個小時的過表達的影響。但是在IPTG誘導(dǎo)三小時后，功能完全喪失，檢測不到任何菌落形成。LEU1酶具有最弱的聚集分值，這種情況下的過表達僅對其活性產(chǎn)生最輕微的下調(diào)。值得注意的是，靶定的酶的功能性敲除是可逆的。當(dāng)將加入了高水平過表達的干擾子物質(zhì)的細胞在LB瓊脂上鋪板時，它們顯示正常的菌落生長。當(dāng)這些菌落復(fù)制至M9選擇培養(yǎng)基時，又一次觀察到正常生長。這提示在菌落生長過程中失去了聚集物，重新將細胞網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)正常。3.包含具有低自締合分值的自締合區(qū)的靶的蛋白質(zhì)干擾自締合區(qū)通常兩側(cè)是或含有帶電荷的殘基例如R、K、D和E以及P禾口G(所謂的守門(gatekeeper)氨基酸殘基)(參見Rousseau,Serrano&Schymkowitz(2006)HowEvolutionaryPressureAgainstProteinAggregationShapedChaperoneSpecificity,JMolBiol，doi:10.1016/j.jmb.2005.11.035)。這些守門殘基降低與其相關(guān)的序列的自締合傾向。為了使干擾子分子的B部分的靈敏度最優(yōu)化以與給定的靶蛋白共聚集，可以突變靶蛋白的被包含進所述干擾子的B部分的自締合區(qū)以使上述殘基被促進聚集的殘基例如L、V、I、F、W、Y取代，也可以包含進其他可以增加所述自締合區(qū)的自締合傾向的殘基。包含進所述干擾子分子的B部分的(衍生自靶蛋白的)被突變的自締合區(qū)與所述靶蛋白的自締合區(qū)具有至少60%、優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%及最優(yōu)選地至少90%的序列同源性。另外，一些氨基酸在聚集方面是中性的，用有利于聚集的氨基酸取代這些氨基酸也會增加一個區(qū)域的自締合傾向(例如S、T、C以及Q、N、H、M可以被易于聚集的殘基例如L、V、I、F、W、Y取代)。這些優(yōu)化的干擾子分子提高了具有預(yù)測的低聚合分值的靶的蛋白質(zhì)干擾。在實施例2中，我們示出了大腸桿菌的LEU1酶的蛋白質(zhì)干擾是效率較低的。在這個實施例中，我們優(yōu)化了特異性針對LEU1酶的干擾子分子。LEU1中被確定的自締合區(qū)是"LAFIG"。該序列側(cè)翼是守門殘基"...DYDLEALAFIGKQQEE..."，因此為了通過突變增強靶序列，我們使用了如下基于簡并pcr的策略設(shè)計互補引物，使得所述引物在被突變的密碼子的每一側(cè)具有20-25bp的重疊以使得所述引物與模板有效退火。通過在引物合成期間摻入等摩爾比例的四種堿基而引入簡并密碼子(所謂NNS密碼子)。用此簡并引物通過使用QuickchangePCR方案獲得含有所述側(cè)翼位置的20個點突變的文庫。所述文庫在ToplO細胞(Invitrogen)中擴增，并使用miniPrep試劑盒(Qiagen)純化質(zhì)粒DNA。為了測試敲除效率是否提高，將針對LEU1靶的突變體干擾子(如實施例2所述進行設(shè)計)轉(zhuǎn)化進BL21細胞(Invitrogen)中并在LB瓊脂平板上鋪板。在每孔含有0.2mLLB+抗生素的96孔平板上，挑起單個菌落接種每一個孔。將所述平板在37。C溫育直至達到OD為0.6，此時在37。C加入0.5pMIPTG3小時誘導(dǎo)突變體干擾子表達。每孔中的成分除了1外全部鋪板在含有除亮氨酸外全部氨基酸的選擇基本培養(yǎng)基上。對于在選擇平板上顯示不同等級的受損生長的菌落，加入TempliPhi試劑(GEHealthScience)用于DNA擴增，并將平板轉(zhuǎn)移至測序設(shè)備。序列信息為我們提供了優(yōu)化的LEU1突變干擾子分子的全部譜系。4.干擾子分子用于從血清中除盡免疫球蛋白G在這個去除實驗中，選擇瓊脂糖珠作為與衍生自靶蛋白的自締合區(qū)通過氨基活性化學(xué)連接融合的成分(A部分)。所述瓊脂糖材料可商購，例如得自GEhealthcare的NHS-活化的Sepharose4FastFlow。人免疫球蛋白G具有兩個可用作自締合區(qū)的強tango區(qū)，(I)IIVAVVIATAVAAIVAAVVALIY和II)LTVLLLLASA)。由于肽的價格與氨基酸長度成正比，因此將肽設(shè)計為含有來自第一個靶區(qū)域的IO個氨基酸部分。所述耙序列(自締合區(qū))之前是接頭序列ADPRGAAEGA，并且用未保護的末端進行合成以保留活性N末端氨基。所設(shè)計的序列是a)ADPRGAAEGAIIVAWIATA、b)ADPRGAAEGAVVIATAVAAI、c)ADPRGAAEGAIVAAVVALIY(a)、b)和c)含有衍生自強tango區(qū)I的十肽)、和d)ADPRGAAEGALTVLLLLASA(包含tango區(qū)11)。為了除盡，將10ml血清與lmg固定化的肽在25、30、37和45°C溫育1小時。通過離心收集瓊脂糖珠并除去血清，在PBS緩沖液中漂洗瓊脂糖珠以除去殘留的雜質(zhì)。接下來將珠轉(zhuǎn)移至SDS緩沖液并在95°C溫育IO分鐘并充分渦旋混和。用SDS-PAGE檢測IgG。靶的身份使用質(zhì)譜確定。5.干擾子分子用于檢測設(shè)計干擾子分子用于特異性檢測3個可商購的重組蛋白質(zhì)(來自豬心臟的檸檬酸合酶(Roche)、來自大腸桿菌的J3-半乳糖苷酶(Sigma)和來自腸膜明串珠菌(丄eMco"o"ocmese"feraWe"的葡糖-6-磷酸脫氫酶(Sigma))。為此，在第一步中，從下列靶蛋白中用TANGO算法確定自締合區(qū)a)檸檬酸合酶(CISY—PIG):"ALFWLLVT"(TANGO分值60)，b)卩-半乳糖苷酶(BGAL—ECOLI):"AVIIWSLGN"(TANGO分值30)和"ALAVVLQ"(TANGO分值42)，和c)葡糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD—LEUME):"AFVDAISAVYTA"(TANGO分值41)。在下一步中，將生物素(biotine)通過氨基末端偶聯(lián)至4個不同的自締合區(qū)，產(chǎn)生4個不同干擾子分子i)生物素-ALFWLLVT，特異性針對檸檬酸合酶，ii)生物素-AVIIWSLGN和生物素-ALAWLQ，特異性針對p-半乳糖苷酶和iii)生物素-AFVDAISAVYTA，特異性針對葡糖-6-磷酸脫氫酶。生物素化的肽從JerinePeptideTechnologies獲得。注意干擾子設(shè)計生物素-自締合區(qū)相應(yīng)于A-B結(jié)構(gòu)，其中生物素(A部分)阻止自締合區(qū)(B部分)聚集并使得所述自締合區(qū)與所述生物素-自締合區(qū)所在的溶劑(PBST)直接接觸。個體點印跡通過將0.3mg的每一種靶蛋白點在硝酸纖維素膜上、接下來風(fēng)干并在1%BSA-PBST(含有0.1%Tween-20的PBS)中過夜溫育以封閉非特異性結(jié)合位點而制備。將所述膜浸在生物素化的檢測肽的10mM溶液中并在室溫搖動3小時。在用緩沖液漂洗之后，通過將生物素成分使用鏈霉抗生物素-HRP(辣根過氧化物酶，Pierce)顯影并使用CCD成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光檢測確認肽與蛋白質(zhì)的結(jié)合。6.針對鼠VEGF的干擾子分子用于治療病原性視網(wǎng)膜血管發(fā)生視網(wǎng)膜新血管形成是世界上致盲的一個主要原因，病原性視網(wǎng)膜血管發(fā)生是在疾病例如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變和衰老相關(guān)的黃斑變性中導(dǎo)致視力下降的一個最終的常見途徑。已知血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是病原性血管發(fā)生的發(fā)展過程中一個關(guān)鍵參與者。我們研究了針對VEGF的干擾子分子在兩個鼠誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中的效果。在第一個模型中，新生小鼠(具有不成熟的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng))暴露于高氧環(huán)境，引起為視網(wǎng)膜供氧的發(fā)育中的血管管腔閉合。當(dāng)所述小鼠接下來回到正常氧環(huán)境時，位于閉合血管末端的視網(wǎng)膜供血不足，誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生，并最終引起可重復(fù)的并且可定量的視網(wǎng)膜新血管形成(所述模型詳細描述于PierceEAetal(1995)Proc.Natl.Acad.Sci,92(3)905-9，參見第905頁"experimentalprocedures"-mousemodel)。簡而言之，將7日齡(P7)小鼠幼崽及照顧其的母鼠在特別設(shè)計的氧氣腔中置于高氧環(huán)境(75%氧氣)5天，不打開籠子。在P12，將所述動物返回室內(nèi)空氣中直至P17，此時評估視網(wǎng)膜的最大新血管應(yīng)答。在P12，半數(shù)動物用針對VEGF的千擾子分子處理，半數(shù)不處理。接受處理的半數(shù)小鼠通過玻璃體內(nèi)注射方式接受VEGF千擾子，而接受處理的組的另一半通過眼周注射方式接受VEGF干擾子(所述眼周或玻璃體內(nèi)注射如ShenJetal(2006)GeneTherapy,提前在線發(fā)表于9月29日中所描述的進行)。針對鼠VEGF165同種型的不同干擾子分子在1-100pg/ml濃度范圍使用。a)REAG孔LSWVHWTLALLLYLHH-GGEERAG;這個干擾子分子具有干擾子分子的A-B-A，結(jié)構(gòu)。衍生自鼠VEGF165(下劃線部分)的自締合區(qū)側(cè)翼是增溶區(qū)A(REAG和GGEERAG)，或換句話說A區(qū)和A，區(qū)阻止所述自締合區(qū)(干擾子分子的B部分)的聚集。b)STVnE-GGAG-NHVTLS-GGAGO-FLLSWVHWTLALLLYLHH-G￡i^G;這個干擾子分子具有干擾子分子的B-A結(jié)構(gòu)。增溶的A部分(GERAG)以斜體顯示。B部分具有下述結(jié)構(gòu)STVIIE(=合成的自締合區(qū))-GGAG(=接頭)-NHVTLS(-合成的自締合區(qū))-GGAGQ(=接頭)-FLLSWVHWTLALLLYLHHG(-衍生自鼠VEGF165的自締合區(qū))。c)STVIIE-GGAG孔LSWVHWTLALLLYLHH-G五iMG;這個干擾子分子具有干擾子分子的B-A結(jié)構(gòu)。增溶的A部分(GERAG)以斜體顯示。B部分具有下述結(jié)構(gòu)STVIIE(-合成的自締合區(qū))-GGAG(=自締合區(qū)之間的接頭)-FLLSWVHWTLALLLYLHHG(-衍生自鼠VEGF165的自締合區(qū))。在P17，通過左心室對被麻醉的小鼠灌注lml含有50mg2\106分子量熒光素-葡聚糖的磷酸鹽緩沖鹽水。取下眼睛并在4%多聚甲醛中固定3小時(右眼)或24小時(左眼)。對于右眼，除去晶狀體并切開周圍視網(wǎng)膜以用甘油-明膠進行平面封片。被平面封片的視網(wǎng)膜通過熒光顯微鏡分析。左眼包埋在石蠟中，與視神經(jīng)平行對角膜沿矢狀線切割制備6pm連續(xù)切片，并用蘇木精-伊紅染色。增殖性新血管應(yīng)答通過計數(shù)在染色的矢狀橫截切片上的新血管(-細血管叢(tuft))數(shù)目和從視網(wǎng)膜內(nèi)界膜延伸進玻璃體的內(nèi)皮細胞數(shù)目定量。使用熒光素-葡聚糖灌注的血管造影計數(shù)與所述計數(shù)方法結(jié)合使用以迅速篩選視網(wǎng)膜或作為一種替代分級系統(tǒng)用于定量評價。在第二個模型中，視網(wǎng)膜新血管形成通過視網(wǎng)膜內(nèi)激光誘導(dǎo)的靜脈血栓被實驗?zāi)M。所述模型描述于SaitoYetal(1997)Curr.EyeRes.16(1):26-33。Chi-ChunLaietal(2005)ActaOphtalmologicaScandinavica83:590-594在591-592頁的"materialsandmethods"部分描述了所述模型可被定量。VEGF干擾子分子的應(yīng)用如本文前述進行。7.人細胞系中的蛋白質(zhì)干擾細胞凋亡的調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)或抑制)可容易地在細胞系統(tǒng)中監(jiān)控。已知星形孢菌素(staurosporin)以p53依賴性方式誘導(dǎo)凋亡。因此，p53的下調(diào)或增強p53的功能的蛋白質(zhì)(例如ASPP1)的下調(diào)抑制動物(例如人)細胞系中星形孢菌素誘導(dǎo)的凋亡?；趯嵤├?中描述的合成干擾子分子的設(shè)計構(gòu)建編碼干擾子分子的重組表達載體，不同之處是A部分(NusA蛋白)被改變?yōu)榫G色熒光蛋白(GFP)并且啟動子是組成型哺乳動物啟動子例如肌動蛋白或CMV啟動子。p53的自締合區(qū)是ILTIITLE(tango分值為72)，這個序列被另外包含進合成干擾子的B部分，形成具有針對p53的特異性的干擾子分子。ASPPl的自締合區(qū)是MILTVFLSN(tango分值為63)，這個序列被另外包含進合成干擾子的B部分，形成具有針對ASPPl的特異性的干擾子分子。培養(yǎng)HeLa細胞并用所述重組載體轉(zhuǎn)染。GFP(A部分)使得可以觀察干擾子分子的過表達。向轉(zhuǎn)染的和非轉(zhuǎn)染的對照細胞中加入1^M星形孢菌素誘導(dǎo)不同的凋亡應(yīng)答。8.斑馬魚中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的蛋白質(zhì)干擾開發(fā)出了針對斑馬魚VEGF的干擾子分子。分泌的VEGF的特異性失活(通過聚集進行)之后可以是斑馬魚胚胎中血管發(fā)育的干擾。第一步，斑馬魚VEGF蛋白中的自締合區(qū)用TANGO算法確定。具有最高TANGO分值的聚集區(qū)是NH2-FLAALLHLSA-COOH?；谶@個自締合序列，我們開發(fā)了四種合成的干擾子分子干擾子A:NH，-RLFLAALLRFLAALLHLSAR-CQOH干擾子B:NH,畫RFLAALLHLSARLFLAALLR-COOH干擾子C:NH，-RYLAILAGIRLFLAALLR-COOH干擾子D:NH，誦RYLAILAGIRFLAALLHLSAR-COOH干擾子E(NH2-EALWYLIQLAGR-COOH)作為對照序列，衍生自這個46高TANGO區(qū)外的一段序列。注意干擾子A、B和D包含完整的TANGO區(qū)，而干擾子C僅包含所述TANGO區(qū)的一部分。衍生自所述TANGO區(qū)的序列添加了下劃線。將這些干擾子分子以不同濃度加入到轉(zhuǎn)基因rg(^7.AGF尸/7斑馬魚胚胎的培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)基因rg(^7z五GF戶/斑馬魚在其內(nèi)皮細胞中表達增強的綠色熒光蛋白(GFP)，所述魚描述于LawsonNDandWeinsteinBM(2002)Dev.Bz'o/.248,307-318，由斑馬魚國際資源中心(ZebrafishInternationalResourceCenter(UniversityofOregon))提供，并如斑馬魚書籍a(chǎn)guideforthelaboratoryuseofzebrafish(Z)am'oren.o)，Univ.OregonPress,Eugene,1994中所描述的飼養(yǎng)。受精之后20小時(hourspostfertilization,hpf)的去絨毛膜(Dechorionated)的胚胎被置于24孔板中(10個胚胎/孔)并暴露于不同濃度的所選擇的干擾子分子(起始濃度50pM)中24小時。在28和48hpf(受精后小時)使用共聚焦成像分析活胚胎。所述共聚焦成像使用Zeiss激光掃描顯微鏡LSM510進行。盡管監(jiān)控不同血管結(jié)構(gòu)的發(fā)育，我們特別關(guān)注了(i)背主動脈(DA)、后主靜脈(PCV)的結(jié)構(gòu)，(ii)軀干后區(qū)肌節(jié)間血管(intersomiticvessel,ISV)的萌發(fā)和脈管叢(PV)的形成。劑量依賴性實驗的總結(jié)示于表l。很明顯干擾子A和C在發(fā)育中的斑馬魚幼蟲中誘導(dǎo)明顯的血管缺陷。令人吃驚的事實是干擾子分子被斑馬魚幼蟲透過皮膚攝取，所以不需要注射所述干擾子。干擾子B和D需要在較低濃度給予，以能夠監(jiān)控特定血管缺陷。9.酵母酉良酒酵母CSflcc/2aw仿vc&scergv!'w'。e)中的蛋白質(zhì)干擾我們用酵母Um3酶的敲低示出了蛋白質(zhì)干擾在真核細胞中起作用，因為Ura3蛋白的耙定失活(通過聚集)給出容易觀察的結(jié)果。釀酒酵母的Ura3酶是參與尿嘧啶生物合成途徑的必需的酶。因此，釀酒酵母缺乏URA3基因的突變體不能在不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，但是可以通過向培養(yǎng)基中加入尿嘧啶使生長恢復(fù)。第一步，用TANGO算法確定Um3蛋白中的自締合區(qū)。具有最好的TANGO分值的自締合區(qū)(或聚集區(qū))是NH2-VIGFIAQ-COOH(TANGO分值74)。用這個肽序列產(chǎn)生干擾子表達構(gòu)建體。為了將編碼這個肽的自締合序列與合成干擾子構(gòu)建體(參見實施例1)在讀框中克隆在一起，我們使用了下列兩個寡核苷酸-URA3aggregatorFor:5，CCI￡I^AATGAAAGAAATTTTGGCTGTAG3，，禾口URA3aggregatorRev:5，CCGTCGACTOAGCTTGAGCAATAAAGCCGATAACGCCAGCAGCGCCCGGTTTAGCAGC3'。下劃線部分示出了^al和限制位點。NusA蛋白的起始密碼子以粗體注明。終止密碼子以斜體示出，編碼七個Um3氨基酸的序列以粗體示出。作為用于PCR的模板，我們使用了含有與合成干擾子/接頭構(gòu)建體(參見實施例l)偶聯(lián)的NusA蛋白的pETM60質(zhì)粒(惠贈自G.Stier，EMBL)。這個載體含有T7啟動子，產(chǎn)生卡那霉素抗性并提供六組氨酸N末端表達標(biāo)簽。將得到的PCR產(chǎn)物利用Wal和^ZI限制位點亞克隆在pBEVY/GT載體(MillerCA3rd,MartinatMAandHymanLE(1988)M/c/ezci仏26:3577-3583)中。在這個載體中，"NusA-合成干擾子-接頭-Ura3自締合序列"表達盒處于釀酒酵母GAL1/10啟動子的控制之下。這個載體的選擇標(biāo)記是7T2P7基因。將序列已證實的并具有或不具有編碼所述七個Ura3氨基酸(衍生自自締合區(qū))的DNA的構(gòu)建體通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入釀酒酵母PVD2株，基于印7互補進行選擇。所述PVD2株衍生自W303-1A株(ThomasBJandRothsteinR.(1989)Ce//56,619-630)，但是PVD2株用///W和的野生型等位基因轉(zhuǎn)化。所述PVD2株仍舊是亮氨酸(i^K/2)、色氨酸(77^7>和腺嘌呤(力￡^"營養(yǎng)缺陷型。在SDglu-Trp培養(yǎng)基(含有2%葡萄糖但是不含有色氨酸的基本酵母培養(yǎng)基)上選擇轉(zhuǎn)化子。將菌落重涂在新鮮SDglu-Trp平板上以獲取單菌落。在液體SDglu-Trp培養(yǎng)基中過夜生長兩個獨立菌落。接下來將培養(yǎng)基的OD咖調(diào)整至1，并將5微升10倍系列稀釋液點在SDglu-Ura-Trp(含有2%葡萄糖但是不含有尿嘧啶和色氨酸的SD培養(yǎng)基)或SDgal-Ura-Trp(含有2%半乳糖但是不含有尿嘧啶和色氨酸的SD培養(yǎng)基)平板上。此實驗結(jié)果示于圖2。這個實驗重復(fù)了三次得到相似結(jié)果?？蛰d體pBEVY/GT或僅表達NusA-合成干擾子構(gòu)建體(不含有ura3的自締合序列)的載體的表達在不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上不顯示任何生長抑制。然而，NusA-合成干擾子-Ura3締合區(qū)構(gòu)建體的表達在不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上強烈抑制生長(當(dāng)向生長培養(yǎng)基中加入尿嘧啶時，沒有生長缺陷)，顯示內(nèi)源Um3蛋白被蛋白質(zhì)干擾特異性失活。10.酵母白色假絲酵母(Om^fofl/6/ca""中的蛋白質(zhì)干擾白色假絲酵母造成人類真菌感染的40%。這種共生物擁有許多致病因素。除了粘附于所有類型塑料的能力(重癥監(jiān)護室的一個主要問題)或產(chǎn)生酯酶和蛋白酶之外，其被最廣泛研究的是形成各種形態(tài)的能力，因為這是主要致病因素之一。很多轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)從酵母樣細胞到菌絲或假菌絲的轉(zhuǎn)變。需要其他轉(zhuǎn)錄因子以保持細胞處于酵母樣形式。這種菌絲形成的抑制物的一個實例是Tupl。作為白色假絲酵母中蛋白質(zhì)干擾的一個實例，我們將所述Tupl蛋白用作一個靶。Tupl的生物學(xué)功能的下調(diào)應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)菌絲形成。第一步，用TANGO算法確定Tupl蛋白中的自締合區(qū)。具有最高TANGO分值(TANGO分值30)的自締合區(qū)(或聚集區(qū))是NH2-VISVAVSL-COOH。將這個肽用于產(chǎn)生干擾子表達構(gòu)建體。為了將編碼這個肽的自締合序列與實施例1的合成干擾子構(gòu)建體在讀框中克隆在一起，我們使用了下列兩個寡核苷酸TUP1aggregatorFor:5，ATTGTACAAATATCCGTATGTGCCTGACTACGCAATGGCTCAGTGGCAGAAC3，，和TUPlaggregatorRev:5，GCGCTAGC7T4AGCTAGGGATACAGCGACTGAGATGACGCCAGCAGCGCCCGGTTTA3，。下劃線部分示出了BwGI和A7zel限制位點。終止密碼子以斜體示出，編碼靶肽的逆向序列以粗體示出。我們將含有NusA-合成干擾子構(gòu)建體(來自實施例l)的pETM60質(zhì)粒用作PCR模板。將得到的PCR產(chǎn)物利用和A%el限制位點亞克隆在pPCKl-GFP質(zhì)粒((BarelleCJ,MansonCL，MacCallumDM，OddsF，GowNAR,BrownAJP.Yeast21:333-340，2004)中。在這個載體中，干擾子構(gòu)建體與載體上的GFP基因在讀框中克隆在一起，得到的干擾子表達盒"GFP-合成干擾子-接頭-"Tupl自締合序列"處于尸Oa啟動子的控制之下。在此構(gòu)建體中，綠色熒光蛋白(GFP)被NusA取代并且GFP發(fā)揮干擾子分子的A部分的作用。戶CO啟動子在含有酪蛋白氨基酸的培養(yǎng)基中被強烈誘導(dǎo)，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中被抑制(LeukerCE,SonnebomA,DelbruckS，ErnstJF.Gene192:235-240，1997)。接下來將序列被證實的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進白色假絲酵母株CAI4中(FonziWA,IrwinMYGenetics134:717-728，1993)。在SDglu-ura培養(yǎng)基(含有2%葡萄糖但是不含有尿嘧啶的基本酵母培養(yǎng)基)上選擇轉(zhuǎn)化子。在含有葡萄糖的基本培養(yǎng)基上過夜生長轉(zhuǎn)化子，稀釋細胞以獲得大約20個細胞/100微升，將此體積鋪板在SDglu-ura或SD酪蛋白氨基酸-ura瓊脂平板上。生長4天和6天后記錄菌落形態(tài)(參見圖3)。如圖3所示，在含有酪蛋白氨基酸的培養(yǎng)基中發(fā)生Tupl的下調(diào)，并且在菌落邊緣明顯可見菌絲形成。在對照轉(zhuǎn)化子((不含有干擾子表達盒的pPCKl-GFP質(zhì)粒))中和含有葡萄糖的培養(yǎng)基上沒有發(fā)現(xiàn)菌絲形成。這個例子顯示內(nèi)源Tupl被蛋白質(zhì)干擾特異性失活。11.蛋白質(zhì)千擾在植物中的應(yīng)用我們通過使用用幾種GFP-融合基因(所述基因示于表2)轉(zhuǎn)化的BY2細胞在煙草BY2細胞中顯示了蛋白質(zhì)干擾。擬南芥04ra6Wo戸/s^z/Z"朋)基因及它們相應(yīng)的被識別的自締合區(qū)和tango分值列表示于表2。針對表2的每一個靶的特異性干擾子分子基于實施例1中所描述的合成干擾子分子設(shè)計，不同之處是NusA蛋白被紅色熒光蛋白(RedFluorescentProtein,RFP)取代，并且B部分另外含有表2中所示靶的特異性自締合區(qū)。將編碼所述特異性干擾子分子的構(gòu)建體導(dǎo)入合適的載體中以使用GatewayTM技術(shù)(InVitrogenLifeTechnologies)進行過表達。為此開發(fā)一組Gateway相容性二元載體用于植物轉(zhuǎn)化。pK7WGD2載體用于過表達，其中基因被置于p35S啟動子的控制之下。三元載體系統(tǒng)被用于植物細胞轉(zhuǎn)化。pBBRlMCS-5.virGN54D載體被用作三元載體。通過電轉(zhuǎn)化將二元載體導(dǎo)入已經(jīng)含有三元載體的根瘤土壤桿菌04gro6a"en'Mw^me/adews)LBA4404菌株中。在用特定構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之前建立新鮮的BY-2培養(yǎng)物。用1:10接種5日齡BY-2并生長三天(28。C,130rpm，黑暗)。在BY-2轉(zhuǎn)化前兩天建立用pK7WGD2-GUS(對照載體)、pK7WGD2-干擾子1(例如特異性針對aurora1)、pK7WGD2-干擾子2(例如特異性針對aurom2)等等轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌液體培養(yǎng)物。將來自固體培養(yǎng)基的一滿環(huán)細菌接種于5ml含有抗生素(利福平、艮他霉素、鏈霉素和壯觀霉素)的液體LB培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物生長兩天(28。C,130rpm)。BY-2的轉(zhuǎn)化在空的培養(yǎng)皿(04,6cm)中用共培養(yǎng)(cocultivation)的方法進行。將三日齡BY-2(3ml)用移液管移入平板中并加入50或200nl細菌懸浮液。輕輕混和平板并在超凈工作臺上在黑暗中靜置三天。在共培養(yǎng)后將細胞鋪板在含有選擇性(50jag/ml卡那霉素、500^ig/ml萬古霉素和50(Hig/ml羧芐青霉素以殺死多余的細菌)的固體BY-2培養(yǎng)基上。將平板用Millipore膠帶封好，在黑暗中于28。C培養(yǎng)大約兩周，之后可以看見愈傷組織。通過在熒光顯微鏡下檢查GFP、RFP及GFP和RFP的共定位顯示蛋白質(zhì)干擾的效率(這里是GFP構(gòu)建體和RFP構(gòu)建體之間的聚集)。涉及實施例1和2的材料和方法構(gòu)建體、細胞和培養(yǎng)基干擾子分子被克隆進pETM60載體(惠贈自G.Stier,EMBL)中。這個載體處于RNA聚合酶T7控制下(所述T7RNA聚合酶處于來自大腸桿菌lac操縱子的調(diào)節(jié)元件控制下)，產(chǎn)生卡那霉素抗性并提供六組氨酸N末端表達標(biāo)簽，之后是NusA。使用編碼干擾子B部分的序列的一系列重疊寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生"合成基因"。這個基因通過Ncol禾卩BamHl限制位點連接進pETM60。千擾子基因通過對干擾子B部分進行PCR產(chǎn)生，使用長的反編碼寡核苷酸以在C末端包含柔軟接頭和蛋白質(zhì)特異性自締合區(qū)(餌)的序列。這些通過Ncol和BamHl限制位點連接進pETM60。所有寡核苷酸購自Sigma-Genosys，所有限制酶購自Fermentas，連接使用購自Roche的QuickLigationKit進行。內(nèi)部制備化學(xué)感受態(tài)BL21(DE3)細胞并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案轉(zhuǎn)化。制備標(biāo)準(zhǔn)LB-瓊脂平板，所有瓊脂平板含有50pg/mL卡那霉素。通過向標(biāo)準(zhǔn)M9培養(yǎng)基中補充全部20種氨基酸(50Mg/mL)和核苷酸腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤(20pg/mL)制備M9完全平板。M9選擇平板與M9完全平板除了一種氨基酸之外完全相同。為了控制在貯存中可能發(fā)生的氨基酸降解，平板在使用前一天制備。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案制備LB，含有50pg/mL卡那霉素。所有氨基酸購自Sigma，卡那霉素和IPTG購自Duchefa。方案BL21(DE3)細胞用表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，在添加了卡那霉素的LB-瓊脂上鋪板并在37。C溫育過夜。使用單菌落接種添加了卡那霉素的10mlLB并在37。C搖動生長過夜。之后一天用這個培養(yǎng)物以1:100接種添加了卡那霉素的10mlLB并生長至OD600為0.6。之后將培養(yǎng)物分為兩份，向一份培養(yǎng)物中加入IPTG(50^M)以誘導(dǎo)干擾子表達，并將兩份培養(yǎng)物在37。C進一步溫育希望的表達時間。之后通過離心收集細胞并用鹽溶液(0.85%w/vNaCl)(通過重懸和離心)漂洗兩次。之后將細胞在鹽溶液中重懸使最終OD600為0.05，并將200pL這種細胞懸浮液在瓊脂平板上鋪板。瓊脂平板在37。C溫育過夜，之后一天記錄菌落生長。如果需要，用無菌牙簽將菌落挑至新鮮瓊脂平板上。表<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表2:衍生自擬南芥的蛋白質(zhì)、識別出的自締合區(qū)及相應(yīng)tango分值參考文獻1.Dobson，C.M.Protein誦misfoldingdiseases:Gettingoutofshape.iVafwe418,729-730(2002)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