專利名稱：抑制?；o酶a膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑制?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶能力的 組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及用于抑制?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的組合物，包括作為活性成分的黑胡椒(P^wm'gwmL.)提取 物，從提取物中分離的化合物，或者其藥學上可接受的鹽。技術(shù)背景
血管疾病的發(fā)生主要是由于高血脂癥。在所有引起死亡的疾 病中，血管疾病名列前茅。因此，需要治療和預防血管疾病的藥品。
根據(jù)Heider's的研究，己知機體需要外源性膽固醇和內(nèi)源性 膽固醇，外源性膽固醇可通過食物的攝取來供應，而內(nèi)源性膽固醇在 肝臟中合成。(Heider J.G. 1986. Agents which inhibit cholesterol esterification in the intestine and their potential value in the treatment of hypercholesterolaemia.， J.R. Prous Science pulishers, 423-438)。然而，過 多地攝食甘油三酯和膽固醇導致高血脂癥的發(fā)生，高血脂癥是以血液 中甘油三酯和膽固醇的過高水平為特征的病癥，并且已知是動脈硬化 發(fā)生的主要原因。這些疾病或病癥主要是由于在脂蛋白形成、轉(zhuǎn)運、 和/或降解過程中脂蛋白的異常代謝引起的。流行病學研究表明，大多 數(shù)的缺血性心臟病主要是由于冠狀動脈硬化引起的，并且血清膽固醇 水平的升高是在其發(fā)病和發(fā)展中起重要作用的因子。Goldstein等和 Komai的報道教導了降低血清膽固醇水平的方法，即通過抑制小腸中 膽固醇的吸收和肝臟中膽固醇的生物合成并且促進膽汁酸的分泌而進 《亍的。(Goldstein J丄.and S.M. Brown 1990. Regulation of the mevalonate pathway: A^we 33 425-430, Komai T. and Y. Tsujita 1994. Hepatocyte selectivity of HMG-CoA reductase inhibitors: Z)iV c&尸， 7:279-288)。作為目前可用的用于降低血清膽固醇水平的藥品的例子是普伐他汀和辛伐他汀，分別由日本的Daiichi Sankyo和美國的Merk制 造，普伐他汀和辛伐他汀都是從Compactin經(jīng)過生物學修飾而來，抑 制肝臟中膽固醇的生物合成，這兩種藥品占據(jù)了市場的最大份額并有 最高的普及率。這些藥品的醫(yī)學機理基于它們對3-羥基-3-甲基戊二酰 輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutary Co-A reductase)抑制作用， 此還原酶參與了肝臟中膽固醇生物合成的中間步驟。Grunler，s的研究 揭示長期使用HMG輔酶A還原酶抑制劑對輔酶Q、多萜醇、血紅 素A、法尼基化的蛋白質(zhì)(farnesylated protein)和膽固醇衍生物，如 類固醇激素、維生素D、膽汁酸、脂蛋白等的產(chǎn)生具有負面作用，此 類物質(zhì)對機體是必不可少的，其必須在甲羥戊酸形成之后由膽固醇生 物合成的旁路產(chǎn)生(Grimier J" J. Ericsson and G. Dalloner 1994. Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol, dolichol， ubiquinone and prenylated proteins: 5z'oc/ 'm. 5鄉(xiāng)/2"， ylcto 1212， 259-277)。根據(jù)Will's的研究，長期使用HMG輔酶A還原酶抑制劑導 致輔酶Q的生物合成降低——輔酶Q在心臟功能和免疫功能中具有重 要作用，從而該抑制劑對患有動脈硬化或心臟病的病人具有危險的后 果(Willis R.A.， K" Folkers， J丄.Tucker, C.Q.Ye， L. J. Xia, and H. Tamagawa. 1990. Lovastatin decreases coenzyme Q levels in rats: iVoc. A^z" jcad Scz'. L^4' 87,8928-8930)。
目前可用的用于高血脂癥的醫(yī)療試劑或者是肝臟中膽固醇 生物合成的抑制劑，或者是陰離子交換劑，這種試劑與膽汁酸相關(guān)， 因而抑制大腸中膽固醇的重吸收。這兩類醫(yī)療試劑都在臨床上應用， 但是需要一種新的治療高血脂癥的藥品，此種藥品能夠無限制使用并 且具有可靠的治療機理，有很小或者沒有副作用。Sliskovic報道ACAT抑制劑對于高血脂癥的預防和治療是有效的(Sliskovic D.R. and A. D. White 1991. Therapeutic potential of AC AT inhibitors as lipid lowering and antiatherosclerotic agents : 7>ew/s z."尸/wrwaco/. 5W. 12:194-199)。尤其 是，ACAT抑制劑的發(fā)展受到很大的關(guān)注，ACAT抑制劑被評價為一種 高血脂癥的治療劑，其直接涉及針對動脈硬化發(fā)生的新的預防機理。 ACAT是一種酶，已知與膽固醇的?；饔糜嘘P(guān)，因而參與了小腸中 膽固醇的吸收、肝臟中VLDL (極低密度脂蛋白)的合成和酯化膽固醇的累積。
許多大學研究所和商業(yè)的研究所，如藥劑公司的那些研究 所，已經(jīng)研究了高血脂癥的治療劑，它們中的一些已經(jīng)成功開發(fā)出有 效的治療劑。然而，在多數(shù)情況下，研究側(cè)重于ACAT抑制劑的開發(fā)， 即作為安全的可靠的用于預防高血脂癥的下一代藥劑的開發(fā)。迄今為 止，大多數(shù)研究的ACAT抑制劑是基于尿素、酰胺或酚類的合成化學 品，如在Warner Lambert、輝瑞(Pfizer)、 Yamanouchi等公司所開發(fā) 的那些化學品(Matsuda K. 1994. ACAT inhibitors as antiatherosclerosis agent: compounds and mechanisms. 14， John Wiley & Son, Inc., 271-305)。為了開發(fā)具有新結(jié)構(gòu)的ACAT抑制劑前體，應用微生物材 料進行了廣泛的研究。以日本Kitasato研究所(Kitasato Institute)對 purpactin的結(jié)構(gòu)鑒定的成功為起點(Tomoda H.， H. Nishida, R. Masuma, J. Cao, S. Okuda and S. Omura 1991. Purpactins, new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by 尸ew/"7z.ww /w/ wragew扁I. production, isolation and phico-chemical and biological properties: / ^加'Wo"cs 44:136-143)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種新的微生物ACAT 抑制劑，包括日本Daiichi Sankyo開發(fā)的Epi-cohliquinone A (日本專 利，公幵出版屋編號Hei 4-334383， 1992)，東京農(nóng)業(yè)技術(shù)大學(Tokyo University of A griculture and Technology)開發(fā)的acaterin (Naganuma S., K Sakai， K. Hasumi and A. Endo 1992. Acaterin, a novel inhibitor of acyl畫CoA: cholesterol acyltransferase produced bys/ . A92: / 顛砲/cs 45:1216-1221)，長蠕孢醇(Park J.K., K, Hasumi and AEndo1993. Inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase by Helminthoporol and its related compounds: J! v4"版c^/cs 46:1303-1305)， 土紅鐮孢菌素(Lateritin ) (Hasumi K.， C. shinohara， T. Iwanaga and A. Endo 1993. Lateritin, A new inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by G766ere/Za /afen."wm IFO 7188: /^wf/fofof/cs 46:1782-1787), gypsetin (Shinohara C., K. Hasumi, Y. Takei and A. Endo1994. Gypsetin, a new inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by iVa朋/zz/a gy/wetz var. incurvata IFO 9228., I. Fermentation, isolation physico-chemical properties and biological activity: / J欣'Z7/0,/cs 47:163-167),日本Kitasato研究所開發(fā)的恩鐮孢菌素(ennitins )(Nishida H., X.H Huang, R. Musuma， Y. K. Kim and S. Omura 1992. Newcyclodepsipeptides, enniatins D. E. and F produced by Fwsor/"w sp. FO-1305: / 爿w"6/o"cs 45:1207-1214), glisoprenins ( Tomoda， H. X.H， Huang, H. Nishida, R Masuma， Y. K. Kim and S. Omura 1992. Glisoprenins, new inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by G/Zoc/acZ/wm sp., I. Production. Isolation and phsico-chemical and biological properties: /爿w碗o"os， 45:1202-1206)， pyripyropenes (Omura S., H. Tomoda， Y K. Kim and H. Nishida 1993. Pyripyropenes, highly potent inhibitors of acyi-CoA: cholesterol acyltransferase produced by y^/ ergz7/ws/Mwzga^^: J! Jw".6/o&.oy 46:1168-1169; Kim Y,K， H Tomoda, H. Nishida, T. Sunazuka， R. Obata， S. Omura 1994. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by ^4spergz7/ws /ww/gafM&， II. Structure elucidation of pyripyropenes A， B， C and D: / 47:1540162)， terpendols ( Huang X.H， H. Tomada， H. Nishida, R， Masuma and S. Omura 1995. Novel ACAT inhibitors produced by J/6op/zoma 3^ma"os/ /eww.s,.y4w"6/o"c^ 48:1-4)， 日本Kyowa Hakko 開發(fā)的AS醫(yī)183(Kuroda K., M. Yoshida， Y. Uosaki, K. Ando， I. Kawamoto, E. Oishi， H. Onuma, K. Yamada and Y. Matsuda 1993. AS-183， a novel inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by Scecto^on.ww sp. SPC-15549: ^""W加^ 46:1196-1202) ， AS-186 (Kuroda K., Y. Morishita, Y. Saito， Y. Ikuina, K. Ando， I. Kawamoto and Y. Matsuda 1994. AS-186, New inhibitor of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase from Pem.Cwm os尸mw/ on., KYI635: / y4油.6/o"'cs 47:16-22)，韓國生物科學和生物技術(shù)研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)開發(fā)的GERI-BP-001 (Jeong T, S.， S. U. Kim， K. H Son, B. M Kwon， Y. K. Kim， M. U. Choi and S. H. Bok 1995. GERI-BP001 compounds, New inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by /^/ erg77/ws /Mm/g"fws F37: / y4w"6/o"cs 48:751-756)， GERI-BP-002 ( Kim， Y. K， H. W. Lee， K. H Son, B, M Kwon， T. S Jeong， D. H Lee, J H Shin, Y W. Seo， S. U. Kim， S. H, Bok 1996. GERI-BP002-A， Novel inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase produced by A/ erg/〃w/訓/gato F93: / /i油'6/o"'cs 49:31-36)，以及輝瑞 (Pfizer)開發(fā)的avasimibe，這些抑制劑都吸引了廣泛的注意力 (Heinonen TM.， 2002. Acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase inhibition: potential atherosclerosis therapy or springboard for otherdiscoveries : Op/" /"ves"g Z)rwgs. 11.1519-1527)。
導向本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人對天然存在的具有抑制 ACAT活性的材料進行了深入細致的徹底地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從黑胡椒m'gram丄.)中分離的酰胺基化合物，包括retrofractamide A、 胡椒殺蟲胺(pipercide)、 piperrolein B、 piperchabamide D禾口墻草堿 (pdlitorin)，具有抑制ACAT的有效活性并且對于預防和治療高膽固醇 血癥血管疾病，例如高膽固醇血癥、高血脂癥、動脈硬化等是有效的。發(fā)明內(nèi)容[OO"因此，本發(fā)明目的是提供具有抑制?；o酶A:膽固醇?；?轉(zhuǎn)移酶活性的藥物組合物，包括從黑胡椒提取的提取物，選自 retrofractamide A、 古月椒殺蟲月安、piperrolein B 、 piperchabamide D、 i嗇 草堿的化合物和其組合，或者其藥學上可接受的鹽。
本發(fā)明的另一個目的是提供從黑胡椒中制備具有抑制?；?輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的提取物的方法。
本發(fā)明進一步的目的是提供從提取物中分離具有抑制?；?輔酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酰胺基化合物的方法。附圖簡述


圖1顯示化學式1所代表的化合物的波譜數(shù)據(jù)，包括H-畫R (CDC13， 500.13MHz)， C-畫R (CDC13， 125.75 MHz)和 FAB隱Mass。
圖2顯示化學式2所代表的化合物的波譜數(shù)據(jù)，包括H-畫R (CDC13， 500.13MHz)， C-NMR (CDC13， 125.75 MHz)和 FAB畫Mass。
圖3顯示化學式3所代表的化合物的波譜數(shù)據(jù)，包括 H-NMR (CDC13， 500.13MHz)， C-NMR (CDC13， 125.75 MHz)和 FAB-Mass。
圖4顯示化學式4所代表的化合物的波譜數(shù)據(jù)，包括 H-NMR (CDC13， 500.13MHz)， C匿NMR (CDC13, 125.75 MHz)和 FAB-Mass 。
圖5顯示化學式5所代表的化合物的波譜數(shù)據(jù)，包括 H-NMR (CDC13， 500.13MHz)， C-固R (CDC1" 125.75 MHz)禾口 FAB-Mass 。
圖6顯示化學式1至化學式5的化合物的。/。ACAT抑制。
圖7顯示在HepG2細胞中，化學式1至化學式5的化合 物對ACAT的抑制活性。本發(fā)明最佳實施方式
按照實施方式，本發(fā)明涉及具有抑制?；o酶A:膽固醇酰 基轉(zhuǎn)移酶活性的黑胡椒提取物和包含此提取物的組合物。
按照另外一個實施方式，本發(fā)明涉及具有抑制?；o酶A: 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的組合物，包括選自retrofractamideA、胡椒殺 蟲胺、piperroleinB、 piperchabamide D、 墻草堿的化合物和其組合， 或者其藥學上可接受的鹽。retrofractamideA、胡椒殺蟲胺、piperrolein B、 piperchabamide D和墻草堿是優(yōu)選地天然存在的材料，是從黑胡椒 中提取的?？蛇x地，這些化合物可以是合成的材料。
所獲得的關(guān)于黑胡椒提取物對酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移 酶(ACAT)具有抑制活性的知識引導本發(fā)明的發(fā)明人去尋找提取物中 的活性成分。為了實現(xiàn)這個目的，將黑胡椒溶解在有機溶劑，如醇類 中得到粗提物，得到粗提物，在水和各種有機溶劑中分餾粗提物。發(fā) 現(xiàn)所有餾分都顯示出ACAT抑制活性，其中氯仿餾分中抑制活性最高。 應用各種層析分離活性化合物。通過電子轟擊質(zhì)譜(electron impact mass spectrometry)、 氫核磁共振波譜術(shù)(hydrogen nuclear magnetic resonance spectrometry)禾卩碳核磁共振波譜術(shù)(carbon nuclear magnetic resonance spectrometry)對這些化合物的結(jié)構(gòu)和化學特性進行分析。
分析結(jié)果揭示了這些活性化合物d七學式1的retrofractamide A、化學式2的胡椒殺蟲胺、化學式3的pipeiroldn B、化學式4的 piperchabamide D和化學式5的墻草堿。在本發(fā)明之前已經(jīng)發(fā)表的文獻 中，任何地方都沒有提及這些化合物的ACAT抑制活性。[化學式1]
?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)是一種膜內(nèi)在蛋 白質(zhì)，催化由膽固醇和脂肪?；o酶A形成膽固醇酯。
術(shù)語"?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制"或者 相應的短語，如此處所用的，意即導致膽固醇酯形成的酶反應被阻斷 或者變得低效。ACAT催化的反應對腸內(nèi)膽固醇的吸收、載脂蛋白B (apoB)的合成和分泌以及細胞內(nèi)膽固醇的貯存是必需的。因此，ACAT 抑制導致腸內(nèi)來自食物的膽固醇的吸收和肝臟內(nèi)VLDL的吸收的中 斷，因而降低了血清中的膽固醇水平。
自從發(fā)現(xiàn)ACAT與膽固醇的血清水平有直接關(guān)系，ACAT作 為膽固醇相關(guān)疾病的治療靶標而被研究?；谶@樣的事實選擇性ACAT抑制導致膽固醇的血清水平降低，可以給予在腦、心臟和周邊血 管中發(fā)生的血管疾病以有效的治療。例如，ACAT活性的抑制在預防和 治療高膽固醇血癥(Raal FJ et al., Atherosclerosis. 2003 Dec; 171(2):273-279)、高脂血癥(KusunokiJ"ArteriosclerThromb Vase Biol. 2000 Jan; 20(1)171-178)、動脈粥樣硬化(HeinonenTM, Curr Atheroscler Rep.2002 Jan;4(l):65-70)、動脈硬化(Heinonen TM.， Expert Opin Investig Drugs.2002 Nov; 11 (11): 1519-1527 )、冠狀動脈硬化(Meynier A.， Br J Nutr. 2002 May; 87(5):447-458)、和主動脈瘤(Hiatt WR et al.， Vase Med. 2004 Nov; 9(4):271-277)中有用。此外，發(fā)現(xiàn)ACTC參與阿爾茨海默氏病 (Alzheimer's disease)相關(guān)淀粉樣斑塊的產(chǎn)生，因而可以用ACAT抑 制劑治療這種疾病(Hutter隱Paier B et al.， Neuron. 2004 Oct 14; 44(2):227-238; Puglielli L et al.， J Mol Neurosci， 2004; 24(1 ):93-96)。因 此，ACAT的選擇性抑制劑可被用于上述疾病及其癥狀或并發(fā)癥的預防 和治療。
此處所用的術(shù)語疾病的"預防"表示通過施用本發(fā)明的組合 物，限制或者延緩疾病發(fā)生的所有行動。此處所用的術(shù)語疾病的"治療" 表示通過施用本發(fā)明的組合物，使疾病狀況轉(zhuǎn)向或變向更好的或者有 利的狀態(tài)的所有行動。
根據(jù)本發(fā)明，用在組合物的活性組分中的化合物可以從生物 體中分離，并且優(yōu)選地從黑胡椒中分離。天然的、雜交的或突變植物 的各種組織，如根、莖、花、果實等以及植物的組織培養(yǎng)物可被用于 制備化合物。它們也可以通過應用本領(lǐng)域人員已知的方法合成。
此處所用的術(shù)語"藥學上可接受的鹽"意指來自藥理學上的 或生理學上可接受的無機酸、有機酸和堿的鹽。在本發(fā)明中適合的酸 的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、 磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、醋酸、 檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、2-萘磺酸(naphtalene-2-sulfonic acid)、苯磺酸等。源自適合的堿的鹽的例子是堿金屬例如鈉的鹽，堿 土金屬的鹽如鎂鹽和銨鹽。
在另外一種實施方式中，本發(fā)明提供了從黑胡椒中獲得提取 物的方法和從提取物中分離特定化合物的方法。
應用水、有機溶劑或者其混合物可以得到黑胡椒的提取物。 優(yōu)選地，將黑胡椒干燥預定的時間并且粉碎之后，可用提取方法提取。有用的提取方法的例子包括，但不局限于冷沉淀、熱萃取、超聲波提取、和冷萃取。只要是最低程度地破壞活性成分，可以使用任何提取方法?？梢酝ㄟ^如下方法制備具有抑制ACAT活性的化合物從提取物中獲得高活性組分，并且從該活性組分中通過如色譜方法分離具有抑制ACAT活性的化合物。
因此，可以使用下述方法制備化合物，該方法包括從黑胡 椒中將所述化合物萃取到介質(zhì)如水、有機溶劑或者其混合物中；用非 極性有機溶劑分餾萃取物；通過色譜方法純化非極性有機溶劑中的內(nèi) 含物。
在粉碎植物的萃取中有用的有機溶劑的例子包括..甲醇、乙 醇、異丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸 丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲基亞楓(DMSO)、 1，3-丁二醇、丙二醇和其混合物，優(yōu)選醇類并且更優(yōu)選低級醇如甲醇或 乙醇。
為了從黑胡椒的初級提取物中獲得高活性的組分，應用水和 有機溶劑。在有機溶劑中，優(yōu)選非極性有機溶劑。特別優(yōu)選的是正己 烷、醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或其混合物。在本發(fā)明的一個例 子中，在正己烷、氯仿、乙酸乙酯和水中獲得各自的組分。在它們中， 發(fā)現(xiàn)氯仿組分具有最高活性(89%)，水相組分活性最低(15%)。
非極性溶劑組分，也就是，溶解在非極性溶劑中的內(nèi)容物， 進行一次或多次的色譜以分離活性成分。各種色譜柱和展開劑可以被 合適地使用。
在一個例子中，具有化學式1至5結(jié)構(gòu)的化合物被分離。將 三份重的甲醇倒入到粉末狀的黑胡椒中并使其在室溫下靜置七天，隨 后通過過濾和在真空中千燥以濃縮它們。由此獲得的粗提物用正己烷、 氯仿、乙酸乙酯或者水分餾。在真空中濃縮各自的組分并且進行色譜 分離4次。按順序進行硅膠柱色譜(濃縮梯度正己烷乙酸乙酯 =50/1 0/100)，反相柱色譜(ODS膠，使用甲醇)，低壓液相色譜(LPLC; LKB，使用甲醇)和高效液相色譜(HPLC; YMCJ，sphere ODS H-80(250X20mm)，以獲得總共5種純的化合物。
通過電子轟擊質(zhì)譜、氫核磁共振波譜、碳核磁共振波譜等的 分析揭示了純化的化合物是酰胺類化合物，經(jīng)鑒定為化學式1的 ractamideRetrof A、化學式2的胡椒殺蟲胺、化學式3的piperoleinB、 化學式4的piperchabamide D和化學式5的墻草堿。發(fā)現(xiàn)對應于化學式 1至5的所有化合物具有抑制ACAT的活性，己確定的各自的ICso是 24.5、 3.7 、 87.5、 11.5 、 40.4//M。具體而言，化學式2的胡椒殺蟲胺 的抑制活性是obovatol的抑制活性的12倍。
根據(jù)上面所描述的基礎(chǔ)上，具有抑制ACAT的有效活性的化 學式1-5的化合物，對于腦血管、心血管和周邊血管疾病的預防和治療 在治療上是有用的。此外，化合物顯示出對于阿爾茨海默氏病的有效 的預防和治療活性。本發(fā)明的組合物包括非合成的、天然存在的活性 化合物，因而本發(fā)明的組合物是安全的并且可以長期施用而幾乎沒有 毒性或者副作用。對于患有腦血管、心血管和周邊血管疾病的哺乳動 物如母牛、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗等以及人類，本發(fā) 明的組合物也是有效的。
因此，按照另一種實施方式，本發(fā)明提供了對于血管疾病防 治和治療有效的藥物組合物，包括取自黑胡椒的提取物、化學式1至5 的化合物中的至少一種，或者至少一種其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明，用于防治和治療血管疾病的藥物組合物包括活 性成分，該活性成分選自總量為基于組合物總重量的0.1至50wt。/。的化 合物。該組合物進一步包括添加劑，其經(jīng)常被用于改善風味、口味、 外觀和其他非藥用性能。此外，該組合物可進一步包括有機或無機添 加劑，添加劑選自微生素B" B2、 B6、 C禾nE、煙酸、肉堿(carnitin)、 甜菜堿(betain)、葉酸、泛酸、生物素、鋅、鐵、鈣、鉻、鎂和其組 合。本發(fā)明的組合物可以單獨使用或者與預先存在的、治療有效的材 料聯(lián)合使用。
該組合物包括藥學上可接受的載體，可以配制成人和哺乳動 物口服或者非口服的劑型。
根據(jù)本發(fā)明，稀釋劑或者便利劑(expedients),如填充劑、 增稠劑、粘結(jié)劑、潤濕劑、分解劑和表面活性劑通常被用于組合物的配制。口服劑型的固體制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒和膠囊。用 本發(fā)明的組合物與至少一種便利劑，如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠結(jié)合制備這些固體制劑。除了便利劑(expedients),可以使用潤滑 劑如鎂、硬脂酸、滑石粉等?？诜囊后w制劑包括懸浮液、內(nèi)部溶液 (internal solution)、乳液和糖漿。在這些液體制劑中，可以包括各種 便利劑，如潤濕劑、甜味劑和防腐劑以及簡單的稀釋劑如水和液體石 蠟。非口服劑型的制劑以無菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍 干劑和栓劑為典型。對于非水溶液和懸浮液，可以使用植物油如丙二 醇、聚乙二醇和橄欖油或注射用酯如油酸乙酯。
組合物可以以單位劑量(單個劑量)或多劑量的形式如在密 封的安瓿和小瓶中提供，或者以凍干的形式貯存，其只需在施用前， 向其加入無菌液體載體，如注射用水。原位注射液或懸浮液可被制備 成為無菌粉末、顆?；蚱瑒?。
按照本發(fā)明進一步的實施方式，所提供的是防治和治療血管 疾病的方法，包括給患者施用組合物，該組合物含有作為活性成分的 至少一種選自化學式1至5的化合物或者至少一種其鹽。
如此處所用的術(shù)語"患者"意指患有疾病的哺乳動物，當向其 施用本發(fā)明的ACAT抑制組合物時，所述疾病能夠減輕。為了有效地 防治或治療血管疾病，如高膽固醇血癥、高血脂癥、動脈粥樣硬化、 動脈硬化、冠狀動脈硬化和主動脈瘤，可以向需要的患者施用組合物， 該組合物包括來自黑胡椒的提取物或者至少一種選自化學式1至5的 化合物。因而該組合物可以與預先存在的治療試劑聯(lián)合施用。
此處所用的術(shù)語"施用(給藥，administration)"意即應用合 適的方法將預定的物質(zhì)導入病人。只要預定的物質(zhì)達到靶組織，可以 采用任何施用途徑，不論是口服或非口服。此外，本發(fā)明的組合物可 以在裝置的輔助下施用，所述裝置使得活性成分容易地到達靶細胞。
本發(fā)明的組合物以藥學有效量施用。
此處所用的術(shù)語"藥學上的有效量"意即在治療過程中，足以 產(chǎn)生最優(yōu)受益/危險比例的藥物量。這個比例取決于醫(yī)療領(lǐng)域中各種已 知的因素，包括患者的性別和年齡、疾病的種類和嚴重性、藥物活性、 敏感性、給藥時間、給藥途徑、流量比、給藥間隔時間、共同施用的藥物和其它因素。本發(fā)明的組合物可以單獨施用或者與其他治療聯(lián)合 施用。本發(fā)明的組合物與其他治療的共同施用可以同時進行或者按順 序進行。單劑量或多劑量施用是可能的。以足以獲得最大治療效果而 無副作用的最低可能劑量使用組合物是非常重要的。優(yōu)選地，對于口服，本發(fā)明的化合物的藥學上的有效量范圍是每劑量在1至10mg/kg 之間，而對于靜脈注射，本發(fā)明的化合物的藥學上的有效量是每劑量 的范圍在1至5mg/kg之間。
仍然在進一歩的實施方式中，本發(fā)明提供了健康食物，其包 括從黑胡椒提取的提取物或者從提取物分離的組分。以及在本發(fā)明的 組合物中，從黑胡椒中提取的提取物或從提取物中分離的組分可被用 在能夠方便攝取的健康食物中，因此可在正常時間預防血管疾病和阿 爾茨海默氏病。
健康食品可以應用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法制備，并且可 以以片劑、顆粒、粉劑、飲料等形式制備。
鑒于下面的實施例可以更好的理解本發(fā)明，該實施例被闡述 以用于舉例說明本發(fā)明，但不是解釋為限制本發(fā)明。實施例l:酶抑制劑的分離與純化
黑胡椒(Z^w L.)購自位于韓國Daejeon的一個市場，在經(jīng)過水洗和陰涼處干燥后，用帶有刀片的粉碎機粉碎成粉末。 向5 kg的黑胡椒粉末中加入3份重量的甲醇，并且使溶液在室溫下靜 置7天，然后過濾。濾液在真空中干燥，產(chǎn)生粗制的濃縮提取物。將 粗制的濃縮提取物溶解在正己垸、氯仿、乙酸乙酯和水中以分離和純 化活性材料。檢測粗提物各個組分的ACAT抑制活性。為了檢測，干 燥每個組分的一部分從而得到密度為lmg/ml的測試樣品。經(jīng)檢測， ACAT抑制活性在正己烷組分中是25。/。，在氯仿組分中是89%，在乙 酸乙酯組分中是55%，在水組分中是15%。在真空中濃縮具有最高 ACAT抑制活性的所有氯仿組分(157.7g)，并且加到硅膠柱色譜上，用 由正己烷乙酸乙酯=50/1 0/100組成的一步梯度洗脫系統(tǒng)洗脫，產(chǎn)生 活性組分。匯集含有最高ACAT抑制活性的一些組分，用50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%甲醇作為洗脫液，在ODS膠上通過反相柱色譜純化。組分4和組分5的ACAT抑制活性比其它組分更高，用75% 和80%甲醇分別以6 mi/min和8 m'l/min的流速，通過低壓液相色譜 (LKB)進一步純化。這樣獲得的組分中，發(fā)現(xiàn)組分4的第3號和組 分5的第2號和第4號的ACAT抑制活性比其它組分編號的ACAT抑 制活性高，進一步經(jīng)過高效液相色譜(YMC J'sphere ODS H-80 (250 X20mm))純化，用75%和80%甲醇以4 ml/min和6 ml/min的流速洗 脫，從組分3的第3號中產(chǎn)生一種純的活性化合物和從組分5的第2 號和第4號中產(chǎn)生4種純的活性化合物。在組分4的第3號洗脫開始 后35min，組分5的第2號洗脫開始后31min，和組分5的第4號洗脫 開始后43min、 45min和53min，使用254腦和210nm的紫外線光進 行ACAT抑制劑的檢測。實施例2:活性成分的結(jié)構(gòu)測定
從黑胡椒提取的化合物1至5的理化特性如下.-
化合物1(1) 形式白色粉末(2) 實驗式和分子量C2QH25N03， 327(3) 電子轟擊質(zhì)譜(70eV): m/z (rel. int) =360[M+Na]+(4) H-NMR波譜[300MHz,氯仿-<13， S(ppm)]:7.19(lH, dd， 《/=15, 15.3 Hz, H-3), 6.87 (lH，brs,h-2，)， 6.73 (lH,m，H-5，和6，)，6.30(1H, d， /=15.3 Hz， H陽9 ), 6.17 (1H， dd, /=9.9， 15.3 Hz， H-4), 6.10 (1H， m， H-5), 5.98 (1H, m， H-8)， 5.93 ( 2H， s， H-7，)， 5.77 (1H， d， Hz, H-2), 5.59 (NH, br s), 3.16 (2H, t, /=6.6 Hz, H隱l"), 2.30 (4H, m, H-6和7)， 1.79 (1H, m， H-2,，)， 0.93禾B 0.91 (3H， s， H-3,，禾Q 4")(5) C-NMR波譜[75MHz，氯仿-(13， 5(ppm)]: 21.10(q,C-3"和 4"), 28.59(d， C-2"), 32.15(t， C-7)， 32.81 (t， C-6)， 46,90 (t， C-2，，),100.92 (t, C-7'), 105.39 (d, C畫2，)， 108.20 (d， C-5')， 120.36 (d， C-6,)， 122.23 (d, C-2)， 127.66 (d， C-8), 128.77 ( d， C-4)， 130.15 (d， C-9)， 132,04 (s， C-l，)， 140.94 (d， C-3)， 141.69 (d， C-5)， 146.71 (s, C隱3，)， 147.91 (s, C-4')， 166.27 (s，C-l)
化合物2(1)形式白色粉末(2) 實驗式和分子量C22H29N03， 355(3) 電子轟擊質(zhì)譜(70eV): m/z (reUnt) =354[M-H]+(4) H-NMR波譜[300MHz,氯仿-d3，5(ppm)]:7.19(lH， dd，戶14.4， 14,7 Hz， H-3), 6.88 (1H， br s，H-2')， 6.74 ( 1H， m, H-5， ) ， 6.73 (1H, br s， H畫5， )， 6.28 (1H, d， 《/=15.6 Hz， H畫ll)， 6.13 (1H， dd，聲15.3,15.3 Hz, H-4), 6.05 (1H，d， 《/=15 Hz, H畫5)， 6.02 ( 1H， d, Hz H-10), 5.92 (2H， s， H-7')， 5.75 (1H， d， /=15.3 Hz,h-2)， 5.56 (NH， br s)， 3.16 (2H， t, /=6.6 Hz，h=l")， 2.17 (4H, m, H-6和9)， 1.79(1H， m， H-2")， 1.46 (4H， m， H-7 和8)， 0.93禾]0.91 (3H，s，H-3"禾卩4")(5) C-NMR波譜[75MHz，氯仿-山，5(ppm)]: 20.09(q, C-3"禾口 4"), 28.27(t， C-7)， 28.60(d, C-2")， 28.90 (t， C-8)， 32.64 (t， C-9),32.75 (t, C-6)， 46.89 (d， C-l，，), 100.88 (t， C-7')， 105.35 (d， C-2'), 108.18 (d， C-5，)， 120.20 (d， C-6')， 121.89 ( d， C-2), 128.38 (d， C-4)， 128.92 (d， C-10), 129.52 (d， C-ll), 132.32 (s， C-l，)， 141.12 (d， C-3)， 142.69 (d, C-5), 146.55 (s，C-4，)， 147.90 (s，C-3'), 166.31 (s，C-l)
化合物3(1) 形式無色油(2) 實驗式和分子量C21H29N03， 343(3) 電子轟擊質(zhì)譜(70eV): m/z (reUnt) =366[M+Na]+(4) H畫NMR波譜[300MHz，氯仿誦4， S(ppm)]: 6.88 (1H， br s， H-2，)，6.74 (lH，m，H-5， )， 6.73 (1H, br s, H-6， )， 6.27 (1H， d，《/=15.3 Hz， H-9)， 6.03 (1H, dt， J-15.9，6.9 Hz, H-8), 5.92 (2H，s， H-7，)， 5.75 (1H， d, 7=15.3 Hz， H-2)， 3.54 (2H， t， 《/=5.4 Hz, H=l")， 3.38 (2H， t， J=5.5 Hz，H=5，，)， 2.30 (2H, t， /=7,5 Hz, H=2)， 2.16 (2H, q, /=6.6 Hz， H=7), 1.61 (4H, m， H-2"禾Q 4")， 1.54(4H， m， H-4和3"), 1.45 (2H， m, H-6)， 1.35 (4H, m， H-3和5)(5) C-NMR波譜[75MHz，氯仿-d3， S(ppm)]: 24.57(t, C-3"), 25.37(t, C-4")， 25,56(t, C-4), 26.55 (t， C國2), 28.95 (t, C-5), 29.24 (t， C-6), 29.34 (t, C-3)， 32.80 (t， C-7)， 33.39 (t， C畫2), 42.54 (t, C-l，，)， 46.67 (t, C-5")， 100.85 ( t， C-7,)， 105.34 (d, C-2，), 108.15 (d， C-5，)， 120.14 (d， C-6'), 129.27 (d， C-8)， 129.30 (d， C畫9), 132.42 (s， C-l，)， 146.48 (s，C-3'), 147.87 (s，C-4,), 171.37 (s，C-l)
化合物4(2)形式白色粉末(2) 實驗式和分子量C22H31N03， 357(3) 電子轟擊質(zhì)譜(70eV): m/z (rel. int) =380[M+Na]+(4) H-畫R波譜[300MHz，氯仿-(13， S(ppm)]:6，89 (1H br s, H-2，)，6.83(lH,dt,戶15.3，7.5Hz，H-3)，6.75 (lH,m,H-5， )，6.74(1H,br s， H畫6， )， 6.28 (1H， d， /=15.9 Hz， H-ll), 6.03 (1H， dt， 《/=15.3， 7.5 Hz, H-10), 5.93 (2H, s， H國7，)， 5.75 (1H， d, J=15.3 Hz， H-2), 5.43 (NH br s) 3.14 (2H, t， 7=6 Hz，H-l"), 2.17 (4H, m， H-4和9)， 1.80 (1H， m， H-2"), 1,44 (4H， m， H-5禾卩8), 1.33 (4H， m， H-6禾Q H-7), 0.93禾卩0.91 (3H， s， H陽3"禾Q H畫4")(5) C-NMR波譜[75MHz，氯仿-山，5(ppm)]: 20.11(q, C-3"和 4")， 28.19(t， C-5)， 28.59(d， C-2")， 28.93 (t， C-6)， 29.02 (t， C-7)，29.30 (t， C-8)， 31.97 (t， C-4)， 32.84 (t， C-9) ,46.81 (t， C-l") ,100.89 (t， C-7，)， 105.37 (d， C-2,)， 108.20 (d， C畫5')， 120.18 (d， C-6')， 123.60 ( d, C陽2), 129.32(d， C-10和C-11)， 132.45 (s, C-l，), 144.69 (d, C匿3)， 146.53 (s，C陽4'), 147.91 (s,C-3'), 166.06 (s，C-l)
化合物5 (3)形式黃色粉末(2) 實驗式和分子量C14H25NO， 223(3) 電子轟擊質(zhì)譜(70eV): m/z (rel. int) =222[M-H]+(4) H隱NMR波譜[300MHz，氯仿-d3， 5(ppm)]: 7.17 (1H， dd, 7=14.7， 14.7Hz,H-3), 6.08 (1H, m， H-4和H-5) , 5.76 (1H， d,/=14.7 Hz, H-2)， 5.67 (NH br s)， 3.15 (2H， t， 《/=6.6 Hz, H-l")， 2.13 (2H， m， H-6), 1.88 (1H， m， H隱2"), 1.40 (2H， m， H-7)， 1.29 (4H, m， H國8和H-9)， 0.92和0.90 (3H, s, H畫3"和H-4"), 0.87 (3H， s， H-10)(5) C-NMR波譜[75MHz，氯仿畫(13， 5(ppm)]: 13.96 (q, C-10), 20.09 (q， C-3"和C-4"), 22.43 (t， C-9)， 28.44 (t， C-7), 28.59(d， C-2'), 31.32 (t， C-8), 32.87 (t， C-6)， ，46.89 (t， C-l，) ，121.76 (t， C-2) ，128,18 (t， C匿4)， 141,19 (d， C-3), 143,10 (d, C-5)， 166.40 (s, C-l)
化合物1被完全地分離和純化為無色結(jié)晶狀粉末，其 [M+Na]+為m/z 350。通過高分辨率的FAB-MS測量，預測化合物1具 有實驗式C2QH25N03 。在紫外光譜中，在260nm檢測到最大吸收并且 吸收肩峰在295 305nm，這說明在化合物的結(jié)構(gòu)中有共軛酰胺二烯 (dienamide)的存在。進行NMR以確定化合物的結(jié)構(gòu)。在'H-NMR 波譜波譜中，發(fā)現(xiàn)一個亞甲二氧基質(zhì)子(methylendioxy proton, 5.93, s) 并且檢測到9個烯烴質(zhì)子在S5.7 7.3， -NH-的質(zhì)子(brs)在5 5.59， 兩個亞甲基質(zhì)子在S 2.30，連接到-NH-的1個亞甲基質(zhì)子在S 3.15， 1 個次甲基質(zhì)子在S1.79，和甲基質(zhì)子在S0.93和5 0.91。從這些質(zhì)子， 能夠推斷出異丁基基團的存在(圖1、 2和3)。上面得到的數(shù)據(jù)與含有 酰胺鍵的ractamideRetrof A的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)非常相似。通過與公開發(fā)表 的數(shù)據(jù)對比與分析(Park, I. K" Lee， S.G.， Shin， S. C.， Park, J. D. and Ahn， Y. J. 2002. Larvicidal activity of isobutylamides identified in i^er m'gr畫 fruits against three mosquito species: J"々Wc Food C72ewt 50, 1866-1870)， 化合物1被確定為retrofractamide A。
化合物2被完全地分離和純化為無色結(jié)晶狀粉末，其 [M+Na]+為m/z 354。通過高分辨的FAB-MS測量，預測化合物2具有 實驗式(32211291^03。與化合物1的情況類似，紫外波譜表明化合物結(jié)構(gòu) 中共軛酰胺二烯存在的可能性。除了在5 1.46發(fā)現(xiàn)兩個亞甲基質(zhì)子之 外，化合物2的iH-NMR波譜數(shù)據(jù)與化合物1的數(shù)據(jù)相似。兩者合起 來，上面獲得的數(shù)據(jù)與具有酰胺鍵的胡椒殺蟲胺的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)非常相似。 通過與公開發(fā)表的數(shù)據(jù)對比與分析(Park, I. K.， Lee， S.G.， Shin， S. C.， Park, J. D. and Ahn, Y. J. 2002. Larvicidal activity of isobutylamides identified in ~er w'gr, fruits against three mosquito species: / Xgn.c F00t/C/2ew 50, 1866-1870)，化合物2被確定為胡椒殺蟲胺。
化合物3被完全地分離和純化為無色結(jié)晶狀油，其[M+Na]" 為m/z 366。通過高分辨FAB-MS測定，預測化合物3具有實驗式 C21H29N03 。在紫外光譜中，在260nm檢測到最大吸收，這說明在化 合物的結(jié)構(gòu)中有酰胺二烯的存在。進行NMR以確定化合物的結(jié)構(gòu)。在 'H-NMR波譜中，發(fā)現(xiàn)一個亞甲二氧基質(zhì)子(5.93， s)并且檢測到9 個烯烴質(zhì)子在5 6.0~7.0，結(jié)合-N-的亞甲基質(zhì)子(br s)在5 3.54和5 3.38，兩個亞甲基質(zhì)子在S 2.30和S 2.15， 14個亞甲基質(zhì)子在S 1.31~1.67 (圖 2、 3和4)。上面獲得的數(shù)據(jù)與具有哌啶的piperroleinB的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)非常相似。通過與公幵發(fā)表的數(shù)據(jù)對比與分析(Kiuchi，F(xiàn).，Nakamura，N., Tusda， Y" Kondo, K. and Yshimura， H. 1988. Studies on crude drugs effective on visceral larva migrans. IV. isolation and identification of larvicidal principles in pepper: C7/em /V2arm 5w〃 36(7)， 2452-2465), 4七合 物3被確定為piperroleinB。
化合物4被完全地分離和純化為無色結(jié)晶狀粉末，其 [M+Na]+為m/z 380。通過高分辨FAB-MS測定，預測化合物4具有實 驗式C22H;nN03 。在紫外光譜中，在260nm檢測到最大吸收并且吸收 肩峰在295 305nm，這說明在化合物的結(jié)構(gòu)中有共軛酰胺二烯的存在。 進行NMR以確定化合物的結(jié)構(gòu)。在'H-NMR波譜中，發(fā)現(xiàn)一個亞甲 二氧基質(zhì)子(5.93， s)并且分別在5 5.7~7.3和5 1.30-1.50檢測到7個 烯烴質(zhì)子和4個亞甲基質(zhì)子(圖2、 3和4)。上面獲得的數(shù)據(jù)與具有異 丁基和酰胺鍵的piperchabamideD的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)非常相似。通過與公開發(fā) 表的數(shù)據(jù)對比與分析(Morikawa, T., Matsuda, H.， Yamaguchi， I.， Pongpiriyadacha, Y. and Yishikawa, M. 2004. New amides and gastro protective constituents from the fruit of尸j^er c/7a6a:尸/a她A/ed 70, 152-159)，化合物4被確定為piperchabamideD。
化合物5被完全地分離和純化為黃色結(jié)晶狀粉末，其 [M+Na]+為m/z 222。通過高分辨FAB-MS測量，預測化合物5具有實 驗式d4H2sNO。在紫外光譜中，在260nm檢測到最大吸收并且吸收肩 峰在295~305nm，這說明在化合物的結(jié)構(gòu)中有共軛酰胺二烯的存在。 進行NMR以確定化合物的結(jié)構(gòu)。在^-NMR波譜中，檢測到4個烯 烴質(zhì)子在55.7 7.3， -NH-的質(zhì)子(brs)在S5.67， l個亞甲基質(zhì)子在5 3.15和5 2.13中的每一個，3個亞甲基質(zhì)子在5 1.20~1.45， 1個次甲基 質(zhì)子在S 1.88和3個甲基質(zhì)子在S 0.87、 S0.90和S 0.92?；谏厦娅@ 得的數(shù)據(jù)，預測化合物5是墻草堿，其具有異丁基基團但不含有亞甲 基二羥基芐基基團。通過與公開發(fā)表的數(shù)據(jù)對比與分析(Park， I. K., Lee， S.G" Shin， S. C., Park, J. D. and Ahn, Y. J. 2002. Larvicidal activity of isobutylamides identified in P^ er m'gr畫fruits against three mosquito species: /如.c Fooc/C7zem 50， 1866-1870),化合物5被確定為墻草堿。實施例3: ACAT來源的制備從雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)中移取肝臟，將 肝臟用微粒體緩沖液(microsome buffer) A (0.25M蔗糖，ImMEDTA, 0.01MTris-HCl,pH7.4)洗滌，用剪刀細分，用Teflon-玻璃勻漿機勻漿 化。將勻漿液在14， OOOxg離心15min，所產(chǎn)生的上清進一步在100， OOOxg離心l小時。將如此獲得的沉淀溶解在微粒體緩沖液B (0.25M 蔗糖，0.01MTris-HCl,pH7.4)中，然后在100， OOOxg離心l小時，分 離含有ACAT的微粒體。為了得到酶源的一致的蛋白質(zhì)濃度，將沉淀 在適量的微粒體緩沖液B中溶解，以BSA(牛血清白蛋白)作為標準， 通過Lowry方法測定蛋白濃度。此后，將所獲得的酶源用微粒體緩沖 液B稀釋為10mg/ml的蛋白質(zhì)濃度，等份分裝在lml小瓶中，保存在 -701直到使用。
實施4: ACAT活性的檢測用Kim，s方法加以修改(Kim Y. K， H. W. Lee， K. H Son， B. M Kwon, T. S Jeong, D.H. Lee， J. H. Shin, Y.W.Seo， S. U. Kim， and S.H. Bok 1996. GERI-BP002-A, Novel inhibitors of acyl-CoA: cholesterol acyltransfemse produced by ApergZ/Ziw /畫/ga加F93: J. Antibiotics 49:31-36)，以[l-"C]油?；?輔酶A作為底物，檢測ACAT活性。通過 混合10.0pl樣品、4.0pl大鼠肝臟微粒體酶、20.0(il檢測緩沖液
， 15.0|il的40 mg/ml BSA (不含必需月旨 肪酸)，2.0(1l的20mg/ml膽固醇，和41.0(il蒸餾水，制備反應溶液。 反應液在37。C預反應20 min。向此酶反應液加入8.0nl [1-14(3]油酰基-輔酶A (0.05pCi，終濃度10nM)，酶反應在37。C進行25min，用lml 異丙醇-庚垸(4: lv/v)終止反應。加入0.6ml庚垸和0.4ml稀釋五倍 的檢測緩沖液之后，進行離心以分離有機溶劑。將lOOpl上清與3ml Lipoluma閃爍混合物(cocktail)混合均勻，用液體閃爍計數(shù)器測定放射 性。抑制ACAT的活性定量為在待測樣品存在時檢測到的放射 標記的底物和酶之間反應產(chǎn)物的放射性，根據(jù)下面的方程1計算活性抑制百分比。 [方程1]
0/o活性抑制-100X[l-CPM (T)國CPM (C2) /CPM (Cl) -CPM (B)]
CPM (T):樣品和酶共同存在時檢測到的CPM CPM (Cl):沒有樣品，僅有酶存在時檢測到的CPM CPM (C2):沒有酶，僅有樣品存在時檢測到的CPM CPM (B):樣品和酶都不存在時檢測到的CPM。
空白樣品在0。C反應。作為陽性對照，當obovatol針對ACAT 的ICso值被測定為44pM時，化學式1至5的酰胺類化合物的ICso值 分別為24.5、 3.7、 87.5、 11.5和40.4pM，這表明抑制活性是劑量依賴 型的方式(圖6和圖7)。 ACAT抑制劑具有阻斷小腸中膽固醇吸收的功能，因此， 降低膽固醇的血清水平，阻礙肝臟中VLDL的合成，由此降低血清LDL 膽固醇，并且抑制膽固醇的?；磻懝檀嫉孽；瘜τ谠谑芮忠u 的損傷處動脈硬化的發(fā)生是必不可少的，所以ACAT抑制劑能被用做 預防和治療高膽固醇水平相關(guān)的血管疾病如高血脂癥、動脈硬化等的 有效藥物。實施例5:片劑的制備
胡椒殺蟲胺-lg
乳糖-7g
結(jié)晶纖維素-1.5g 硬脂酸鎂-0.5 g 共計-10g將上述成分充分混合并且用直接壓片的方法制備成片劑。 每片重100mg，含有10mg活性成分。實施例6:粉劑的制備 胡椒殺蟲胺-lg 玉米淀粉-5g 羧基纖維素-4g共計-10g
充分混合這些成分，產(chǎn)生的粉末然后被包裹進軟膠囊中，每個膠
囊的量是100mg。 工業(yè)適用性如迄今為止所描述的，retrofractamideA、胡椒殺蟲胺、piperrolein B、piperchabamide D、墻草堿和其藥學上可接受的鹽有效地抑制ACAT， 因此能夠單獨或聯(lián)合用于血管疾病如高血脂癥、血管硬化等的預防和 治療。此外，從黑胡椒中提取的提取物或者從提取物中分離的組分顯示 了如上所述的相同的抑制活性，因為盡管未被純化，提取物或組分包 含所有的活性成分。因此，提取物能有效地用在具有抑制ACAT活性 的藥劑組合物中以及用在對于預防血管疾病有用的健康食品中。
權(quán)利要求
1.一利具有抑制酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的組合物，包括從黑胡椒(Piper nigrum L.)中提取的提取物或者其非極性有機溶劑組分。
2. 權(quán)利要求1中所限定的組合物，其中從黑胡椒中提取的所述提 取物用水、有機溶劑或其混合物制備。
3. 權(quán)利要求2中所限定的組合物，其中所述有機溶劑選自甲醇、 乙醇、異丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己垸、醚、氯仿、乙酸乙酯、乙 酸丁酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲基亞楓(DMSO)、 1，3-丁二醇、丙二醇和其組合。
4. 權(quán)利要求3中所限定的組合物，其中所述有機溶劑選自甲醇、 乙醇、異丙醇、丁醇和其組合。
5. 權(quán)利要求1中所限定的組合物，其中所述非極性溶劑組分通過 將所述提取物溶解在非極性溶劑中而制備，該非極性溶劑選自正己烷、 醚、二氯甲垸、氯仿、乙酸乙酯和其組合。
6. —種從黑胡椒中制備具有抑制?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 活性的提取物的方法，包括通過冷沉淀或熱萃取從黑胡椒中提取活性 物質(zhì)到水、有機溶劑或者其混合物中。
7. 權(quán)利要求6中所限定的方法，進一步包括在溶劑中分餾所述提 取物，所述溶劑選自己垸、醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和其組合。
8. —種用于預防和治療血管疾病和阿爾茨海默氏病的藥物組合 物，包括權(quán)利要求1至5中的一項所述的組合物。
9. 一種健康輔助組合物，包括權(quán)利要求1至5中的一項所述的組合物。
10. —種具有抑制?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的組合物，包括由下列化學式1至5所代表的化合物中的至少一種化合物，或者其藥學上可接受的鹽中的至少一種 化學式l
11.權(quán)利要求10中所限定的組合物，其中所述組合物用于預防和治療血管疾病。
12. 權(quán)利要求ll中所限定的組合物，其中所述血管疾病是心血管 疾病或者外周血管疾病。
13. 權(quán)利要求12中所限定的組合物，其中所述心血管疾病或者所 述外周血管疾病選自高膽固醇血癥、高血脂癥、動脈粥樣硬化、動脈 硬化、冠狀動脈硬化、動脈瘤和其組合。
14. 權(quán)利要求IO中所限定的組合物，其中所述組合物用于預防和 治療阿爾茨海默氏病。
15. —種用于分離權(quán)利要求10中化學式1至5所代表的化合物 中的一種的方法，包括a) 在水、有機溶劑或者其混合物中制備黑胡椒提取物；b) 在水或者非極性有機溶劑中分餾所述提取物；和c) 從所述餾分中分離和純化所述化合物。
16. 權(quán)利要求15中所限定的方法，其中用在步驟a)中的有機溶 劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、正己垸、醚、氯仿、 乙酸乙酯、醋酸丁酯、二氯甲烷、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲 基亞楓(DMSO)、 1，3-丁二醇、丙二醇和其組合。
17. 權(quán)利要求16中所限定的方法，其中所述有機溶劑選自甲醇、 乙醇、異丙醇、丁醇或其混合物。
18. 權(quán)利要求15中所限定的方法，其中用在步驟b)中的所述非 極性有機溶劑選自己烷、醚、二氯甲垸、氯仿、乙酸乙酯或其混合物。
19. 權(quán)利要求15中所限定的方法，其中所述非極性有機溶劑是氯 仿或乙酸乙酯。
20. 權(quán)利要求15中所限定的方法，其中步驟 c)通過色譜進行。
全文摘要
此處公開的是具有抑制?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的組合物，其包括retrofractamide A、胡椒殺蟲胺、piperrolein B、piperchabamideD、墻草堿或者其組合，或者其藥學上可接受的鹽。該組合物對于預防和治療血管疾病，如高血脂癥、動脈硬化等是有效的。
文檔編號A61K31/357GK101242828SQ200680029690
公開日2008年8月13日 申請日期2006年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者崔正昊, 權(quán)五億, 李炫宣, 李勝雄, 董美叔, 鄭美然, 金永國, 魯文喆 申請人:韓國生命工學研究院