專利名稱：：促動力素1受體的制作方法促動力素1受體相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2005年3月24日提交的申請?zhí)?0/665,002和2005年10月28日提交的申請?zhí)?0/731,421的優(yōu)先權(quán)。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明下文所述發(fā)明的研究和開發(fā)并非由聯(lián)邦資助。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具備PK1受體調(diào)節(jié)劑功能的新化合物，特別涉及一類新的有效和選擇性的PK1受體拮抗劑。本發(fā)明還涉及可用作有效和選擇性的哺乳動物PK1受體拮抗劑的新化合物、它們藥學(xué)上可接受的鹽及其藥學(xué)上可接受的組合物，以及用這些拮抗劑作為治療劑治療由PK1受體活性導(dǎo)致的哺乳動物疾病的方法。本發(fā)明還涉及可用于PK1受體生物學(xué)活性的功能分析的生物學(xué)材料，及其在鑒定調(diào)節(jié)PK1受體生物學(xué)活性的化合物中的用途。本發(fā)明還涉及測定促動力素(prokineticin)1受體生物學(xué)活性的方法。具體來講，本發(fā)明涉及鑒定增加或降低促動力素1受體生物學(xué)活性的化合物的方法。發(fā)明背景消化作用包括將食物材料分解成可轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體的個體細(xì)胞并被其利用的分子。這些分子可作為能量來源；它們可提供必需化學(xué)元素，如鈣、氮或鐵；或者它們可以是細(xì)胞需要但不能自身合成的完整分子，如某些氨基酸、脂肪酸和維生素。包括食物原料分解和同化過程以及廢物排出在內(nèi)的消化作用發(fā)生在稱為胃腸(GI)道的從口延伸至肛門的旋繞的長管腔內(nèi)。胃腸道從口腔、口開始，接著包括咽、食道、胃、小腸、大腸和肛門。胃腸道從始至終都具有四層組織(1)粘膜，最內(nèi)層，由柱狀上皮細(xì)胞組成，直接接觸攝入的食物材料，促進(jìn)液體和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，消化和吸收營養(yǎng)，下面的基底膜由結(jié)締組織和薄層平滑肌組成；(2)粘膜下層，最內(nèi)的第二層，由含有少簇神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維的結(jié)締組織以及血管和淋巴管組成；(3)肌層，最內(nèi)的第三層，由兩層分離的紋理走向相對的平滑肌組織組成，兩層之間包含大量夾雜神經(jīng)細(xì)胞簇和神經(jīng)纖維的網(wǎng)狀系統(tǒng)；和(4)漿膜，最外層，由接觸腹膜腔環(huán)境的結(jié)締組織組成。在大部分胃腸道內(nèi)，肌層由兩層走向相對的平滑肌組成，內(nèi)層的細(xì)胞走向與腸道長軸垂直，外層的細(xì)胞走向與腸道長軸平行。這些肌層協(xié)同收縮產(chǎn)生環(huán)樣收縮使食物混合，以及稱為蠕動的波狀移動使食物通過胃腸道。(參見圖29)。在幾個點上，環(huán)肌層變厚成重帶，形成活瓣樣收縮，稱為括約肌，通過舒張和收縮調(diào)節(jié)食物從一處胃腸道到達(dá)另一處。食物原料中營養(yǎng)的分解和同化主要通過胃和小腸活性的高度協(xié)調(diào)完成。神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)都影響胃。期待進(jìn)食和食物出現(xiàn)在口中刺激胃攪動和產(chǎn)生胃液。當(dāng)食物到達(dá)胃時，它的出現(xiàn)引起激素胃泌素從胃的內(nèi)分泌細(xì)胞釋放入血流中。胃泌素作用于胃的細(xì)胞，增加它們的胃液分泌。由于胃液(包括胃蛋白酶、鹽酸)和攪動的作用，食物在胃內(nèi)被轉(zhuǎn)化為半流體塊狀物。當(dāng)食物完全分解時，食物被排空入小腸內(nèi)。所得營養(yǎng)分子接著被吸收入循環(huán)系統(tǒng)中，從中將其轉(zhuǎn)運(yùn)至個體細(xì)胞。小腸含有大量消化液，有的由腸細(xì)胞產(chǎn)生，有的由胰腺和肝產(chǎn)生。其它上皮細(xì)胞，粘膜的杯狀細(xì)胞分泌粘液。小腸的消化活性由激素協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)。除了受激素影響之外，腸道還受自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，包括分泌消化酶和收縮。因此，刺激和抑制和平衡復(fù)雜的相互作用激活消化酶，調(diào)節(jié)化學(xué)環(huán)境和調(diào)整攝入的材料在腸內(nèi)移動。大腸涉及吸收水、鈉及其它電解質(zhì)。它的一些上皮細(xì)胞分泌粘液，潤滑未消化的食物殘渣。乂人體液通過滲透作用或者從沿消化道排列的腺體中分泌大量水進(jìn)入胃和小腸內(nèi)。當(dāng)吸收過程受到干擾和/或粘液腺的分泌增強(qiáng)(如腹瀉)，可導(dǎo)致嚴(yán)重脫水。功能性腸病包括胃腸道器官內(nèi)異常移動和分泌，特征在于腹部不適/疼痛。這些疾病的標(biāo)準(zhǔn)由胃腸病學(xué)家概述于'RomeII標(biāo)準(zhǔn)，(參見4口RomeIIDiagnosticcriteriafortheFunctionalGastrointestinalDisorders,第2版，高級編輯DouglasA.Drossman,M.D.，ManagementServices,McLean,VA(2000》中。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，常見疾病包括但不限于功能性消化不良、腸易激綜合征(IBS)、胃食管反流疾病(GERD)、非糜爛性反流病(NERD)和慢性便秘(包括結(jié)腸無力、原發(fā)性假性腸梗阻)。GERD非常常見，常伴有非心源性胸痛，可用制酸劑和促動力劑治療。IBS特征在于反復(fù)出現(xiàn)便秘和/或腹瀉，可伴隨脹氣/胃脹和月復(fù)部不適/疼痛(Thompson,W.G.和Heaton,K.W.Gastroenterology1980,79,283-288)。IBS疼'痛的出現(xiàn)伴隨排便頻率和/或糞便外形的改變，排便后可緩解。IBS是很常見的疾病，不同嚴(yán)重度地出現(xiàn)在10-15%人群中(Saito,Y.A.;Schoenfeld,P.;詳口Locke,G.R.Am.丄Gastroenterol.2002,97,1910-1915)。這種疼痛可用平滑肌松弛劑和抗抑郁藥治療(Jackson,丄L.;O'Malley,P.G.;Tomkins,G.;Balden,E.;Santoro，丄；和Kroenke，K.;Am.J.Med.2000,108,65-72;Jailwala,丄；Imperiale,T.F.;和Kroenke,K.;Ann.Intern.Med.2000,133:136-147;Akehurst，R.和Kaltenthaler,E.Gut2001,48,272-282;Poy歸d，T.;Regimbeau,C;和Benhamou,Y.;AlimentPharmacol.Ther.2001,75,355-361)。以嚴(yán)重腹竭為主的IBS用阿洛司瓊治療，但以便秘為主的IBS用替加色羅治療。功能性消化不良是上消化道疾病，進(jìn)食后癥狀加重，伴有早飽、惡心和嘔吐。雖然不清楚其病因?qū)W，但是促動力藥可緩解IBS的癥狀。在一些患者中，存在GERD/NERD、功能性消化不良與IBS之間癥狀的重疊。對功能性腸病如IBS的治療方法功效低，有不良反應(yīng)。例如，F(xiàn)DA批準(zhǔn)阿洛司瓊的風(fēng)險處理程序，因為伴隨缺血性結(jié)腸炎的增加。沒有療法可有效緩解功能性腸病的疼痛。除了功能紊亂之外，炎性腸病(IBD)也常見，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。雖然CD可能有遺傳成分，但UC和CD的病因?qū)W都不清楚。UC是彌漫性結(jié)腸粘膜疾病，特征在于炎癥和潰瘍，伴有腹瀉和腹絞痛。粘膜炎癥從直腸區(qū)開始發(fā)展，最終延伸遍及大腸。CD是透壁性炎癥，最常累及末端小腸和結(jié)腸。炎癥可導(dǎo)致各種潰瘍，嚴(yán)重者可引起透壁疤痕形成和慢性炎癥。傳染性和失調(diào)的免疫功能都可促成發(fā)病。IBD的療法包括皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(硫唑噤呤、巰噤呤和甲氨蝶呤)和氨基水楊酸鹽(5-ASA)。這些方法通過模擬皮質(zhì)激素抑制免疫系統(tǒng)，或者作用機(jī)制未明?？诜べ|(zhì)激素伴隨嚴(yán)重不良反應(yīng)，免疫抑制劑和氨基水楊酸鹽只能中度有效。雖然Infliximab(嵌合型單克隆抗肝瘤壞死因子抗體)對CD有效，但其使用伴隨抗體出現(xiàn)，降低其功效。目前沒有治療可針對與腸道炎癥有關(guān)的活動力和分泌異?；蛱弁锤杏X。稱為促動力素1(PK1)和促動力素2(PK2)的半胱氨酸富集蛋白以及具備PK活性的變體、片段和分子已經(jīng)得到筌定。已顯示PK1和PK2可收縮胃腸平滑肌(Li,M.;Bullock，CM.;Knauer,DJ.;Ehlert,FJ.;和Zhou,Q.Y.,Moi.Pharmacol.2001,59,692-698)和抑制進(jìn)食(Negri,L.;Lattanzi,R.;Giannini,E.;DeFelice,ML;Colucci,A.禾口Melchiorri,P.Bnt.J.Pharmacol.2004,142,181-191)。PK1和PK2都作用于PK1和PK2受體，這些相關(guān)PK富半胱氨酸區(qū)的C端有限的結(jié)構(gòu)改變是可以接受的。例如嵌合型PK,其中PK1和PK2的半胱氨酸富集域在兩者間交換且在C端區(qū)含有21個殘基插入的PK2剪接變體保留活性(Bullock,CM;LiJ,D.;Zhou,Q.Y.;Mol.Pharmacol.2004,65(3),582-8)。PK變體與初級感覺神經(jīng)元的受體結(jié)合，導(dǎo)致外周傷害性感受器對熱和才幾才戒刺;敫強(qiáng)烈壽文感(Mollay,C;Weschelberger,C;Mignogna,G.;Negri,L.;Melchiorri,P.;Barra,D.;Kreil,G.;Eur.丄Pharmacol.1999,374,189-196;Negri,L.;Lattanzi,R.;Giannini,E.;Metere,A.;Colucci,M.;Barra，D.;Kreil,G.;Melchiorri,P.;Brit.J.Pharmacol2002，137(8),1147-54)。PK]誘導(dǎo)來自內(nèi)分泌腺的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成膜間斷(fenestration)。PKmRNA的表達(dá)可見于類固醇生成腺、印巢、睪丸、腎上腺和胎盤(LeCouter,丄;Kowalski,J.;Foster,丄;Hass,P.,Zhang,Z.;Dillard-Telm,L.，F(xiàn)rantz，G.，Rangell,L.;DeGuzman,L.;Keller,G.A.;Peale,F.;Gumey,A.;Hillan,K丄；Ferrara,N.Nature2001,412(6850),877-84)。在2002年，PK1受體的鑒定為調(diào)控內(nèi)分泌腺的血管生成提供新的分子基礎(chǔ)(Masuda,Y.;Takatsu,Y.;Terao,Y.;Kumano,S.;Ishibashi，Y.;Suenaga，M.;Abe,M.;Fukusumi,S.;Watanabe,T.;Shintani,Y.;Yamada,T.;Hinuma,S.;lnatomi,N.;Ohtaki，T.;Onda,H.;Fujino,M.;Biochem,Biophys.Res.Commun.2002,293(1),396-402;LeCouter,丄；Lin,R.;Ferrara,N.;ColdSpringHarbSympQuantBiol.2002,67，217-21)。例如，將PKI通過腺病毒傳遞至小鼠睪丸引起有效的血管生成反應(yīng)(LeCouter,J.;Lin,R.;Tejada,M.;Frantz,G.;Peale,F.;Hillan，K丄；Ferrara,N.Pioc.Natl.Acad.SciUSA.2003，100,2685-90)。最近，顯示PKImRNA正常不表達(dá)于結(jié)腸直腸的正常粘膜，但可見于結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中(Goi,T.;Fujioka,M.;Satoh,Y.;Tabata,S.;Koneri,K.;Nagano,H.;Hirono,Y.;Katayama,K.;Hirose，K.禾口Yamaguchi.,CancerRes.2004,64,1906-1910)。因此，PKI受體調(diào)節(jié)劑特別是PKI受體拮抗劑可用于治療和預(yù)防各種哺乳動物疾病，如與舊S和IBD有關(guān)的內(nèi)臟痛。另外，PKI受體調(diào)節(jié)劑特別是PK1受體拮抗劑可用于治療GERD或其它形式的分泌性腹瀉。此外，PKI受體調(diào)節(jié)劑特別是PKI受體拮抗劑可用于治療大腸和生殖器官中的癌癥特異性血管生成因子。WO200236625公開PKI和PK2多核苦酸和多肽及其用途。U.S.2004056842和對應(yīng)的美國專利號6,485，938公開PKI和PK2的肽拮抗劑治療腸道炎癥的用途。該文獻(xiàn)公開拮抗劑包括與PKI和PK2特異性結(jié)合的抗體以及與其中公開的氨基酸序列結(jié)合的受體。WO2004087054公開通過給予促動力素受體拮抗劑改變一種或多種胃酸分泌標(biāo)記物調(diào)節(jié)胃酸或胃蛋白酶原分泌的方法。該文獻(xiàn)公開促動力素受體拮抗劑是改良的促動力素，可用任何包含至少80%氨基酸序列與其中公開的氨基酸序列一致的種類形成。這些文獻(xiàn)都沒有公開或提示PK1受體的小分子調(diào)節(jié)劑。此類調(diào)節(jié)劑的鑒定應(yīng)加速新療法的開發(fā)，用于涉及胃腸蠕動和/或分泌受損或增強(qiáng)的疾病。本發(fā)明一方面提供PK1受體調(diào)節(jié)劑，特別是PK1受體拮抗劑。本發(fā)明的一個目的是提供治療或緩解由PK1受體介導(dǎo)的疾病的方法。另外，本發(fā)明的目的是提供用作PK1受體拮抗劑的含本發(fā)明化合物的有效的藥用組合物。本發(fā)明另一方面是監(jiān)測動物PK1受體生物學(xué)活性的方法。通過以下描述將清楚本發(fā)明的這些及其它方面和優(yōu)點。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有效的PK受體拮抗劑。因此本發(fā)明涉及式(I)化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽A,是氫、芳基、雜芳基、C5-8環(huán)烷基或雜環(huán)基，前提是A,不同于哌吱-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-甲基-哌啶-3-基；其中式(I)其中:不同于氬的A,的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代CV6烷基、羥基(C,J烷基、C"6烷氧基、卣素、硝基、囟代Cw烷基、卣代C"6烷氧基、CV6烷硫基、C^6烷氧基羰基、氨基、Cw烷基氨基、二(Cw烷基)氨基、氰基、羥基、氨基羰基、C^烷基氨基羰基、二(C^烷基)氨基羰基、C卜6烷氧基羰基氨基、Cw烷基羰基、C卜6烷硫基羰基、甲?；V6烷基磺?；^烷基磺?；被被酋；?、c"6烷基氨基磺?；投?C,.6烷基)氨基磺酰基；L,是-(CH2V或-CH2CH2X(CH2)s-，任選被-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、02.6鏈烯基、02.6炔基和卣素；前提是當(dāng)A,是氫時，r大于或等于4;r是整數(shù)l-5;s是整數(shù)1-3;X是O或S;D是-P-A^八2是氫、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的雜芳基或者C3.8環(huán)烷基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ?、A2(不同于氫和苯基)的'取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C卜6烷基、C卜6烷氧基、鹵素、卣代C^烷基、卣代C^烷氧基、芳基(Cw)烷氧基、苯基、C,.6烷硫基、C,.f,烷氧基羰基、氨基、Ck烷基氨基、二(C卜6烷基)氨基、氰基、羥基、硝基、C"6烷基羰基、(^.6烷硫基羰基、氨基羰基、C卜6烷基氨基羰基、二(C"6烷基)氨基羰基、C^烷基羰基氨基和非稠合的C3—6環(huán)烷氧基；前提是至多兩個A2上的取代基是芳基(C"6)烷氧基、苯基或非稠合的C^環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)Ai是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2)2-(其中&是NH)時，A2不同于未被取代的苯基、被芳基(C,.6)烷氧基或苯基取代的苯基、或者在間位被氰基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2);r(其中X,是NH)時，A2不同于被曱氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基且P是-CtV時，八2不同于在間位被三氟甲基或三氟甲氧基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基且P是-(CH2)2-時，A2不同于4-曱氧基-苯基；另外，當(dāng)八2是氬時，P是-(CH2)4—6-,當(dāng)八2不是氫時，P是-(CH2)^或-CH2X2-;W是N或CH;h是選自下列的二價基團(tuán)通過氮原子與式(I)的三嗪環(huán)連接的吡咯烷基或哌啶基，其中所述吡咯烷基或哌啶基在碳原子上被-(CH2)?！?-取代；-1^-;7環(huán)烷基-(012)()—2-,以便當(dāng)C^環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-XXCUHCH^-;-X2-(CH2V4-;-NH^FywC—O)-,前提是至少一個Rb、『或Rd不是氫且m是O;-NHC(=0)-(CH2)M-;和其中X,是-NH-或直接鍵；X2A-CH=CH-;X3是O、S、NH或C=0;『和Ry獨立是H或CM烷基；前提是任何情況下L2的長度都不超過7個原子；Q是-(O^N(Ra)-G;m是O或l;G是-C(-NRb)NR。Rd;Ra和Rd獨立是氫、Cl6坑基、C^鏈烯基或Cw炔基，其中Ra和Rd(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、C,4烷氧基、氟、氨基、Cw烷基氨基、二CM烷基氨基和Cw烷基羰基；或者『和R。與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Rb是氫、C卜6烷基、C2—6鏈烯基、&.6炔基、02-6烷氧基羰基或氰基；或者Rb和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5_8元單環(huán)；『是氫、Cw。烷基、Cw。鏈歸基、Cw()炔基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、氨基、C^烷基氨基、二(Q—6烷基)氨基、C卜6烷基羰基、C,.6烷氧基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中C卜,。烷基、Cw。鏈烯基和C，炔基任選被1-3個獨立選自羥基、C,—6烷氧基、三氟甲基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基或雜芳基的Re取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、6烷氧基、鹵素、氟代C,—6烷基、氟代C^烷氧基、C,.e烷基羰基、C^烷氧基羰基、氨基羰基、C^烷基氨基羰基、二(C，-6烷基)氨基羰基、C卜6烷氧基羰基氨基、甲?；V6烷基磺?；卜6烷基磺?；被被酋；?、Cw烷基氨基磺?；投?C,-6烷基)氨基磺?；?、硝基、甲硫基、羥基和氰基；或者r和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)，環(huán)內(nèi)任選含有卜2個0或S雜原子，所述環(huán)任選被氧代取代；前提是在任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于Ra和Rb、Rb和Re或者IT和Rd之間。還提供通過使含PK1受體的標(biāo)本與一種或多種候選化合物接觸鑒定PK1受體調(diào)節(jié)劑的方法，以及鑒定特異性增加或降低PK1受體活性的化合物的方法。將此類4b合物表征為PK1受體調(diào)節(jié)劑。還提供通過使含PK1受體的標(biāo)本與一種或多種候選化合物接觸筌定PK1受體激動劑的方法，以及鑒定選擇性促進(jìn)PK1受體信號產(chǎn)生的化合物的方法。將此類化合物表征為PK1受體激動劑。還提供通過在PK1存在下使含PK1受體的標(biāo)本與一種或多種候選化合物接觸鑒定PK1受體拮抗劑的方法，以及鑒定選擇性抑制PK1受體信號產(chǎn)生的化合物的方法。將此類化合物表征為PK1受體拮抗劑。本發(fā)明調(diào)節(jié)PK1受體的方法可包括將PKl受體拮抗劑給予能夠產(chǎn)生PK1受體信號的細(xì)胞、組織或動物。還提供刺激哺乳動物蠕動和/或分泌的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的PKl和/或PKl激動劑。附圖簡述圖1顯示PKl配體制劑混合物的MALDI-TOFANALYSIS(基質(zhì)輔助激光解吸分析)。該混合物包含截斷4個C端殘基的產(chǎn)物(MW-9172)和全長PK1配體(MW-9668)。圖2A顯示安裝在Ussing型離子流量腔內(nèi)PKl暴露的大鼠回腸組織中，對PK1肽反應(yīng)的短路電流(Isc)誘導(dǎo)的累積濃度-反應(yīng)曲線。圖2B是圖示，顯示將肽加入安裝在Ussing型離子流量腔的離體上皮組織漿膜側(cè)時，在大鼠回腸粘膜中只得到PKl誘導(dǎo)的Isc反應(yīng)(分泌相關(guān))。將PKl肽加入粘膜組織表面不能誘導(dǎo)Isc改變(數(shù)據(jù)報道為均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差；單因素ANOVA和Neumann-Kuels多重比較檢驗)。圖3顯示在電壓鉗條件下，從安裝在Ussing型離子流量腔的缺乏肌層的大鼠回腸粘膜離體碎片得到的典型短路電流示蹤，其中已經(jīng)以累積方式加入終濃度為10nM(rECsQ)和100nM(最大反應(yīng))的PK肽。該方案通用于PKl肽促分泌作用的研究，用于表征小分子拮抗齊')功效。圖4是圖示，顯示在大鼠回腸粘膜中PKl誘導(dǎo)的Isc反應(yīng)通過釋放內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，不依賴內(nèi)在神經(jīng)活性或者膽堿能毒蕈堿受體的激活。圖5是圖示，顯示與野生型[WT]同胞小鼠相比，外源性PKl肽在PKl受體敲除[KO]小鼠的上皮組織中無法誘導(dǎo)Isc明顯改變。圖6是圖示，顯示PK1在大鼠回腸粘膜中的促分泌作用只依賴于從網(wǎng)狀基底側(cè)向上皮頂端的生電氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的刺激。圖7是圖示，顯示PK1誘導(dǎo)大鼠回腸粘膜中Isc的增加部分依賴于環(huán)氧合酶產(chǎn)生內(nèi)源性前列腺素。圖8是圖示，顯示PKl誘導(dǎo)大鼠回腸粘膜中Isc的增加部分依賴于內(nèi)源性前列腺素的產(chǎn)生，與位于上皮內(nèi)的前列腺素EP4受體作用。圖9A和9B是圖示，證明PKl誘導(dǎo)Isc的增加在PKl受體的小分子拮抗劑即取代的氨基胍JNJ27624675(見下文)(圖9A)和JNJ28480894(見下文)(圖9B)存在下被抑制。2762467528480894圖10是圖示，證明PKl誘導(dǎo)ISC的增加在取代的氨基胍JNJ28611921(見下文)存在下不受抑制，該小分子對PKl受體無活性但結(jié)構(gòu)上與JNJ27624675和JNJ28480894相關(guān)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>圖11是圖示，證明PK1誘導(dǎo)ISC的增加被PK1受體的小分子拮抗劑氨基苯并咪唑JNJ28845557(見下文)抑制。圖12是圖示，證明口月艮PK1(100]ig/kg)刺激液體蓄積在大鼠體內(nèi)小腸中。圖13是圖示，證明腹膜內(nèi)PK1(100嗎/kg)刺激液體蓄積在大鼠體內(nèi)小腸中。圖14是圖示，證明口服PK1(100嗎/kg)增強(qiáng)胭脂紅試驗餐在大鼠體內(nèi)小腸中推進(jìn)。圖15顯示在大鼠胃腸道得到的組織段收縮反應(yīng)，用1乙酰膽堿誘導(dǎo)的收縮標(biāo)化。圖16證明在等長條件下將PK1應(yīng)用于完整的大鼠回腸段可誘導(dǎo)雙相收縮反應(yīng)。圖17A和17B分別是在離體大鼠回腸中PK1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的早期和晚期濃度-反應(yīng)關(guān)系的半對數(shù)圖。N=2。圖18是圖示，證明在無粘膜的大鼠回腸標(biāo)本中缺乏PK1(250nM)誘導(dǎo)的晚期收縮反應(yīng)。圖19是圖示，證明JNJ-28845557拮抗PKl誘導(dǎo)的大鼠回腸縱向平滑肌收縮的早期和晚期成分。圖20A和20B顯示熒光顯微鏡得到的圖像，證明(A)PKl免疫反應(yīng)性可見于大鼠胃粘膜，和(B)在只用AlexaFluor488軛合的二抗但沒用一抗抗PKl抗血清培養(yǎng)的相鄰部分(作為對照)缺乏免疫熒光。圖21A、21B和21C顯示熒光顯微鏡得到的圖像，證明PKl受體免疫反應(yīng)性局限于豚鼠回腸(A)粘膜下叢和(B)腸肌叢神經(jīng)元，但不存在于(C)無一抗對照中。圖22是示意圖，顯示PK1受體mRNA在鼠類DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的表達(dá)水平。圖23是示意圖，顯示分別在丁=0、2、6、24和72小時PK1受體mRNA在鼠類芥子油誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的表達(dá)水平。圖24是示意圖，顯示分別在T=0、2、6、24和72小時PKlmRNA在鼠類芥子油誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的表達(dá)水平。圖25是圖示，顯示PK1和PK1肽受體在各種大鼠組織中的表達(dá)水平。圖26是示意圖，分別顯示PK1受體mRNA在PK1受體敲除小鼠(-/-)和PK1受體野生型小鼠(+/+)中的表達(dá)水平。圖27是示意圖，分別顯示PK1mRNA在PK1受體敲除小鼠(-/-)和PK1受體野生型小鼠(+/+)中的表達(dá)水平。圖28是示意圖，顯示PK1對離子和相關(guān)的水跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。圖29是示意圖，顯示環(huán)狀和縱向肌肉如何交替收縮使食物沿消化道移動。發(fā)明詳述定，否則本文使用的所有專業(yè)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同含義。用于本文時，下列加下劃線的術(shù)語意欲具有下列含義化學(xué)用于本文時，術(shù)語"酰基"指烷基羰基取代基。用于本文時，除非另外注明，否則"烷基"無論是單獨或是作為取代基團(tuán)的部分使用，都指具有1-8個或者該范圍內(nèi)任何數(shù)目碳原子的直鏈和支鏈碳鏈。術(shù)語"烷氣基"指-0烷基取代基，其中烷基如上定義。同樣，術(shù)語"鏈烯基"和"炔基，'指具有2-8個或者該范圍內(nèi)任何數(shù)目碳原子的直鏈和支鏈碳鏈，其中鏈烯基鏈內(nèi)具有至少一個雙鍵，炔基鏈內(nèi)具有至少一個三鍵。烷基和烷氧基鏈可在碳原子上被取代。在多個烷基的取代基如((^.6烷基)2氨基-中，二烷基氨基的C,—6烷基可以相同或不同。術(shù)語"芳基"指6個碳成員的不飽和芳族單環(huán)，或指10-14個碳成員的不飽和芳族多環(huán)。此類芳基環(huán)的實例包括但不限于笨基、萘基或蒽基。本發(fā)明的實施優(yōu)選芳基是苯基和萘基。術(shù)語"芳基烷基"指被芳基取代的烷基(如千基、苯乙基)。同樣，術(shù)語"芳基烷氧基"指被芳基取代的烷氧基(如芐氧基)。當(dāng)術(shù)語"烷基"或"芳基"或者它們的前綴出現(xiàn)在取代基命名中(如芳基烷基、烷基氨基)時，應(yīng)將其理解為包含上文對"烷基"和"芳基"的限定。碳原子的指定數(shù)目(如CVQ)應(yīng)獨立指烷基部分或者烷基作為前綴出現(xiàn)的較大取代基的烷基部分的碳原子數(shù)。對于烷基和烷氧基取代基，碳原子的指定數(shù)目包括具體指定范圍內(nèi)包含的所有獨立成員以及指定范圍之內(nèi)的所有范圍組合。例如&-6烷基將具體包括曱基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基及其亞組合(如C,-2、C,_3、Gi_4、G"5、G2_6、G3_6、G4_6、G5_6、C^-5等)。"CJ'(其中a和b是整數(shù))指含a-b個(包含a和b)碳原子的基團(tuán)。例如C^表示含1、2或3個碳原子的基團(tuán)。術(shù)語"環(huán)烷基"指3-20個碳原子成員(優(yōu)選3-14個碳原子成員)的44和或部分不飽和的單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)。此類環(huán)的實例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或金剛烷基。術(shù)語環(huán)烷基包括與苯環(huán)(苯并稠合環(huán)烷基)、5或6元雜芳環(huán)(包含]個O、S或N，以及任選1個另外的氮)稠合形成雜芳基稠合的環(huán)烷基的環(huán)烷基環(huán)。術(shù)語"卣素，，指氟、氯、溴和碘。以形成穩(wěn)定化合物的方式用多卣素取代取代基。"卣代烷基"指從母體烷基脫除1個氫原子得到的飽和支鏈或直鏈烷基；母體烷基鏈包含1-8個碳原子，一個或多個氫原子被卣素原子取代，直到所有氫原子都被閨素取代。優(yōu)選卣代烷基包括三氟曱基取代的烷基和全氟烷基；更優(yōu)選氟代烷基包括三氟曱基。"卣代烷氣基"指卣代烷基衍生的與氧原子連接的基團(tuán)，該氧原子具有1個開放價用于連接母體結(jié)構(gòu)。術(shù)語"雜芳基"指5或6元芳環(huán)，其中該環(huán)由碳原子組成，具有至少一個雜原子成員。合適的雜原子包括氮、氧或硫。在5元環(huán)的情況下，雜芳環(huán)包含一個氮、氧或硫成員，另外可包含至多3個另外的氮。在6元環(huán)的情況下，雜芳環(huán)可包含1-3個氮原子。在其中6元環(huán)具有3個氮時，最多有兩個氮原子相鄰。術(shù)語雜芳基包括與苯環(huán)(苯并稠合雜芳基)、5或6元雜芳環(huán)(包含1個O、S或N，以及任選1個另外的氮)、5-7元環(huán)烷基環(huán)或5-7元雜環(huán)(如上限定但不存在更多稠環(huán)選擇)稠合的雜芳環(huán)。雜芳基的實例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、嗯唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異嗯唑基、異噻唑基、嗯二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、噠溱基、嘧咬基或吡。秦基；稠合的雜芳基包括吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并嗯唑基、苯并異嗨唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基或喹唑啉基。術(shù)語"雜環(huán)基"指其中1-4個成員是氮的5-10元非芳族環(huán)，或是其中0、1或2個成員是氮且至多2個成員是氧或硫的5-10元非芳族環(huán)；其中，任選該環(huán)包含0、1或2個不飽和鍵。術(shù)語雜環(huán)基包括與苯環(huán)(苯并稠合雜環(huán)基)、5或6元雜芳基環(huán)(包含1個O、S或N，以及任選1個另外的氮)、5-7元環(huán)烷基或環(huán)烯基環(huán)、5_7元雜環(huán)基環(huán)(如上限定但不存在更多稠環(huán)選擇)稠合或者與環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)基環(huán)連接的碳原子稠合形成螺旋部分的雜環(huán)基環(huán)。例如本發(fā)明化合物，形成雜環(huán)基環(huán)的碳原子環(huán)成員是完全飽和的。其它本發(fā)明化合物可具有部分飽和的雜環(huán)基環(huán)。另外，雜環(huán)基包括橋接形成雙環(huán)的雜環(huán)。優(yōu)選部分飽和的雜環(huán)基環(huán)可具有卜2個雙鍵。此類化合物不應(yīng)視為完全芳香性，不能稱為雜芳基化合物。雜環(huán)基的實例包括但不限于吡咯啉基(包括2H-p比咯、2-吡咯啉基或3-吡咯啉基)、吡咯烷基、2-咪唑啉基、咪唑烷基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基和哌。秦基。關(guān)于取代基，術(shù)語"獨立"指當(dāng)存在多于一個此類取代基時，此類取代基相互之間可以相同或不同。因此，碳原子的指定數(shù)目(如CL8)應(yīng)獨立指烷基或環(huán)烷基部分或者指其中烷基作為前綴出現(xiàn)的較大取代基的烷基部分中碳原子的數(shù)目。術(shù)語"氣代"無論是單獨或是作為取代基部分使用，都指與碳或硫原子連接的0=。例如，鄰苯二曱酰亞胺和糖精是具有含氧取代基的化合物實例。在本說明書中，首先描述指定側(cè)鏈的末端部分，接著描述與連接點相鄰的官能度。因此，例如"苯基C^鏈烷基氨基羰基C^烷基"取代基指下式基團(tuán)'一C"鏈垸基生物學(xué)用于本文時，術(shù)語"組合物"意欲包括含特定量特定成分的產(chǎn)物，以及用特定量特定成分組合直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。術(shù)語"PK1受體激動劑"指選擇性激活或增加PK1受體活性的分子。術(shù)語"PK1受體拮抗劑"指選擇性抑制或降低PK1受體活性的化合物。術(shù)語"PK1受體調(diào)節(jié)劑"指增加或降低PK1受體活性的化合物。術(shù)語"主體"用于本文時，指作為治療、觀察或?qū)嶒災(zāi)繕?biāo)的動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。術(shù)語"治療有效量"用于本文時，指活性化合物或藥物在組織系統(tǒng)、動物或人中表現(xiàn)研究者、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)博士或其它臨床醫(yī)生所尋求的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的量，所述反應(yīng)包括受治療疾病或病癥癥狀的緩解。本發(fā)明的實施方案包括式(I)化合物，其中a)A,是氫、芳基、雜芳基或者Cw環(huán)烷基；其中A,(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C"6烷基、羥基(CJ烷基、Cw烷氧基、囟素、硝基、卣代Cw烷基、卣代Cw烷氧基、Cw烷硫基、(^.6烷氧基羰基、氨基、C,—6烷基氨基、二(C,-6烷基)氨基、氰基、羥基、氨基羰基、C,-6烷基氨基羰基、二(C^烷基)氨基羰基、C"6烷氧基羰基氨基、Cw烷基羰基、Cw烷硫基羰基、曱酰基、Cw烷基磺?；?amp;.6烷基磺?；被被酋；?、C^烷基氨基磺?；投?Cw烷基)氨基磺?；?；b)A,是氫、芳基、雜芳基、C5—s環(huán)烷基或雜環(huán)基；前提是A,不同于哌啶-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-曱基-哌啶-3-基；其中A,(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、羥基(C,—6)烷基、C卜6烷氧基、卣素、硝基、卣代C,—6烷基、鹵代C,.e烷氧基、C,—6烷硫基、C^烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、氨基羰基、Cw烷基氨基羰基、二(C^烷基)氨基羰基和Cw烷基羰基；c)A,是氫、芳基、雜芳基、(:5.8環(huán)烷基或者不同于哌啶基的雜環(huán)基；其中A,(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、羥基(C,—6)烷基、C,—6烷氧基、卣素、硝基、鹵代C,.e烷基、卣代Cw烷氧基、C^烷硫基、C"6烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、氨基羰基、CM烷基氨基羰基、二(C^烷基)氨基羰基和C,.6烷基羰基；d)A,是氫、取代的苯基、苯并呋喃基、呋喃基、噻唑基、苯硫基或環(huán)戊基；其中A,(不同于氫)的取代基被任選取代，苯基被l-2個獨立選自下列的取代基取代C卜4烷基、C,一烷氧基、囟素、硝基、鹵代C,一烷基、卣代CM烷氧基、甲硫基、C,—4烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、氨基羰基和CM烷基羰基；e)A,是取代的苯基、苯并呋喃基、噻唑基或苯硫基；其中苯基被以及苯并呋喃基、p塞唑基和笨硫基任選被1-2個獨立選自下列的取代基取代Cm坑基、&.4烷氧基、卣素、硝基、卣代C卜4烷基、鹵代CM烷氧基、甲硫基、氨基、氰基和CM烷基羰基；f)Ai是苯基或苯并呋喃基；其中苯基在對位或間位和對位被l-2個獨立選自乙基、曱氧基、氟、氯、硝基、二氟曱氧基和曱硫基的取代基取代；g)L,是-(CH2)r匿,任選被l-3個獨立選自C"6烷基、(:2.6鏈烯基、C2-6炔基和面素的取代基取代；前提是當(dāng)A,是氬時，r大于或等于4;h)L,是-(CH2)。任選被選自C,-,烷基、02^鏈烯基和(^2.4炔基的取代基取代，前提是當(dāng)A,不同于氫時，r是l-3;或者當(dāng)A,是氫時，r大于或等于4;i)L,是任選被選自甲基和烯丙基的取代基取代的-(CHA-，前提是當(dāng)A,不同于氬時r是1-3;j)^是被甲基或烯丙基任選取代的-CH2-;k)八2是氬、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的雜芳基或C3_8環(huán)烷基；其中苯基在間位或?qū)ξ灰约鞍?(不同于氬和苯基)的取代基任選被卜3個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、&-6烷氧基、卣素、卣代Cw烷基、卣代C,-6烷氧基、芳基(C,J烷氧基、苯基、C,-6烷硫基、C,—6烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、硝基、氨基羰基、cv6烷基羰基氨基和非稠合的&.6環(huán)烷氧基；前提是不超過兩個八2上的取代基是芳基(C,—6)烷氧基、苯基或非稠合的C^環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2)2-(其中X,是NH)時，A2不同于未被取代的苯基、被芳基((^.6)烷氧基或苯基取代的苯基或者在間位被氰基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的笨基且L2是-X,(CH2V(其中X,是NH)時，八2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-笨基且P是-CH2-時，八2不同于在間位被三氟曱基或三氟甲氧基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基且P是-((:4)2-時，A2不同于4-曱氧基-苯基；另夕卜，當(dāng)A2是氫時，P是-(CH2)4-6-，當(dāng)A2不同于氫時，P是-(CH2),.2-■^-CH2X2-;1)A2是苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的雜芳基或者非稠合的C^環(huán)烷基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ唬约安煌诒交腁2取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、C^烷氧基、卣素、卣代C^6烷基、鹵代Cw烷氧基、C,—6烷硫基、C^烷氧基羰基、氨基、羥基、硝基、氨基羰基、C,、6烷基羰基氨基和非稠合的C;6環(huán)烷氧基；前提是不超過兩個A2上的取代基是非稠合的C3.6環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2)2-(其中X,是NH)時，A2不同于未被取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2V(其中乂1是>^)時，八2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基時，八2不同于在間位被三氟曱基或三氟曱氧基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基且P是-(CHA-時，A2不同于4-甲氧基-苯基；m)A2是苯基、呋喃基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ唬约安煌诒交陌?取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—4烷基、CM烷氧基、面素、卣代Cw烷氧基、C，.3烷硫基、羥基、氨基、氨基漿基、C,.;烷基羰基氨基和非稠合的Cw環(huán)烷氧基；前提是不超過兩個A2上的取代基是非稠合的(:3.6環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是《,((^2)2-(其中X,是NH)時，八2不同于未被取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2)r(其中X,是NH)時，八2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基時，A2不同于在間位被三氟曱氧基取代的苯基；n)As是苯基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中苯基在間位或?qū)ξ?，以及不同于苯基的?取代基任選被1-2個獨立選自下列的取代基取代甲基、乙基、曱氧基、乙氧基、異丙氧基、三氟曱氧基、二氟曱氧基、羥基、氨基羰基和曱基羰基氨基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2)r(其中X,是NH)時，八2不同于未被取代的苯基；進(jìn)一步前提是當(dāng)八1是未被取代的苯基且乙2是《1((3^)3-(其中X,是NH)時，八2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3，4-二氯-苯基時，A2不同于在間位被三氟曱氧基取代的苯基；o)八2是在對位被選自曱氧基、乙氧基、異丙氧基、二氟甲氧基、羥基和氨基羰基的取代基取代的苯基；或者八2是被曱氧基取代的吡啶-3-基或吡啶-4-基；p)P是-CHr;q)l^是選自下列的二價基團(tuán)-^1-。5-7環(huán)烷基-(0^)().2-;前提是當(dāng)Cw環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-乂|-0:2.6烷基-;-X2-(CH2)0-4-;-X,-(CH2)2rXr(CH2)2-3-;-NH(CH2V4C(=0)-，前提是至少一個Rb、『或Rd不是氫且m是O;-NHC(=0)-(CH2)M-;和其中X,是-NH-或直接鍵；X2A-CH=CH-;Xg是0、S、NH或C=0;Rx和Ry獨立是H或CM坑基；前提是在任何情況下L2長度都不超過7個原子；r)L^是選自下列的二價基團(tuán)-NH-C5-6環(huán)烷基-(CH2)。—2-;前提是當(dāng)(35.6環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-1^:2-6烷基-;和-NH-(R，R-CH(CH3)CH(CH3》-;s)L2是選自下列的二價基團(tuán)-NH-環(huán)己基-(CH2V2-,Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；畫NH-C^烷基-;和-NH-(R，R-CH(CH3)CH(CH3》-;t)L2是選自下列的二價基團(tuán)-NH-環(huán)己基-(CH2V2-，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-NHCH2CH2-;和-NH-(R,R-CH(CH3)CH(CH3》-;u)m是0;v)『和Rd獨立是氫或Cw烷基，其中CV6烷基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、C卜4烷氧基、氟、氨基、&.4烷基氨基、二&_4烷基氨基和CM烷基羰基；或者『和IT與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；W)『和Rd獨立是氫或Cw烷基，其中C,.,烷基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、C,—4烷氧基、氟、氨基、Cw烷基氨基、二CM烷基氨基和CM烷基羰基；或者Ra和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；X)Ra和Rd獨立是氫、曱基或乙基；或者『和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；y)Ra和Rd獨立是氫、曱基或乙基；z)Rb是氫、C,—6烷基、(:2.6烷氧基羰基或氰基；或者Rb和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；aa)Rb是氫或CM烷基；或者Rb和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；bb)Rb是氫；CC)『是氫、CV,。烷基、C^。鏈烯基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、氨基、芳基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中Cw。烷基任選被1-2個獨立選自C,—4烷氧基、三氟甲基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基或雜芳基的Re取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C^烷基、CVe烷氧基、卣素、氟代C^烷基、氟代C,—6烷氧基、Cw烷基羰基、Cw烷氧基羰基、硝基、曱硫基、羥基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成環(huán)內(nèi)任選含有1-2個O或S雜原子的5-8元單環(huán)，所述環(huán)任選被氧代取代；dd)『是氫、C^6烷基、(32.6鏈烯基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、雜環(huán)基、芳基羰基、苯基或雜芳基；其中(^.6烷基任選被1-2個獨立選自C,.3烷氧基、三氟曱基、苯基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基、苯基或雜芳基的『取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、Cw烷氧基、囟素、氟代Cw烷基、氟代Cw烷氧基、Cw烷基羰基、C卜6烷氧基羰基、硝基、曱硫基、羥基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)，所述環(huán)任選被氧代取代；ee)R^是氫、Cl6坑基、02_6鏈烯基、C3.7環(huán)烷基、雜環(huán)基、苯基羰基、苯基或雜芳基；其中Q—6烷基任選被卜2個獨立選自Cw烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氫呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或雜芳基的『取代基任選被1-2個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、Cw烷氧基、氯、氟、溴、氟代C,.3烷氧基、硝基、曱硫基、輕基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)；ff)『是氫、C^烷基、C^鏈烯基、環(huán)己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯基或吡啶基；其中C卜4烷基任選被l-2個獨立選自C,.3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氫呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或雜芳基的Re取代基任選被1-2個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、Cb6烷氧基、氯、氟、溴、氟代C"3烷氧基、硝基、甲硫基、羥基和氰基；或者Re和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)；gg)『是氫、Cm坑基、C2—4鏈烯基、環(huán)己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1,3]間二氧雜環(huán)戊烯基或吡啶基；其中Cm坑基任選被1-2個獨立選自曱氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氫呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或雜芳基的Re取代基任選被1-2個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、C,.3烷氧基、氯、氟、溴、三氟曱氧基、硝基、羥基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5_6元單環(huán)；前提是任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于『和Rb、Rb和Rc或Re和Rd之間;以及上文a)-gg)的組合。本發(fā)明一方面涉及含式(Ia)化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽的組合物A,是氫、芳基、雜芳基、(:5-8環(huán)烷基或雜環(huán)基，前提是A,不同于哌吱-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-曱基-哌啶-3-基；其中A,(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,.6烷基、羥基(C,—6)烷基、C"6烷氧基、鹵素、硝基、鹵代CVe烷基、鹵代C,.e烷氧基、C卜6烷硫基、CV6烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、氨基羰基、Cw烷基氨基羰基、二(CV6烷基)氨基羰基和C^烷基羰基;式(Ia)其中:L,是任選被1-3個獨立選自C,.s烷基、C^鏈烯基、C2—6炔基和鹵素的取代基取代的-(CHA-;前提是當(dāng)A,是氫時，r大于或等于4;r是整數(shù)1-5;八2是氫、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的雜芳基或者C3—8環(huán)烷基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ?，以及?(不同于氬和苯基)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C"6烷基、C^烷氧基、鹵素、鹵代C,—6烷基、鹵代C,—6烷氧基、芳基(C^)烷氧基、苯基、Cw烷硫基、CV6烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、硝基、氨基羰基、c卜6烷基羰基氨基和非稠合的(:3.6環(huán)烷氧基；前提是至多兩個A2上的取代基是芳基(C"6)烷氧基、苯基或非稠合的<33.6環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-乂1((3^12)2-(其中Xi是NH)時，A2不同于未被取代的苯基、被芳基(CV6)烷氧基或苯基取代的苯基、或者在間位被氰基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH2V(其中X,是NH)時，八2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3，4-二氯-苯基且P是-CH2-時，A2不同于在間位被三氟甲基或三氟甲氧基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-苯基且P是-(CH》2-時，A2不同于4-曱氧基-苯基；另外，當(dāng)八2是氫時,？是-((^12)4.6-,當(dāng)A2不同于氫時，P是-(CH2)L2-W是N或CH;L^是選自下列的二價基團(tuán)-NH-C5—7環(huán)烷基-(CH2)0.2-,前提是當(dāng)Cw環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-X廣C2-6坑基-;-X2-(CH2)0-4-;-NH(CH2)MC(0)-，前提是至少一個Rb、Re或Rd不是氫且m是0;-NHC(=OHCH2V4-;和其中X,是-NH-或直接鍵；X2是-CH-CH-;Xg是O、S、NH或C=0;Rx和Ry獨立是H或。卜4坑基；前提是任何情況下L2的長度都不超過7個原子；m是0或1;G是-C(-NRb)NRCRd;Ra和Rd獨立是氫或C"6烷基，其中C"6烷基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、CM烷氧基、氟、氨基、C,—4烷基氨基、二C卜4烷基氨基和C,—4烷基羰基；或者Ra和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Rb是氫、Cw烷基、C^烷氧基羰基或氰基；或者Rb和『與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Re是氫、CwQ烷基、Cw()鏈烯基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、氨基、芳基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中C,.,o烷基任選被1-2個獨立選自C,—4烷氧基、三氟甲基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基或雜芳基的Re取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、Cw烷氧基、鹵素、氟代C^烷基、氟代C^烷氧基、C,—6烷基羰基、(^6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羥基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)，環(huán)內(nèi)任選含有1-2個O或S雜原子，所述環(huán)任選被氧代取代；前提是在任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于Ra和Rb、Rb和Rc或者Re和Rd之間。本發(fā)明另一方面涉及式Ia化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽，其中A,是氫、芳基、雜芳基、(35.8環(huán)烷基或不同于哌啶基的雜環(huán)基；其中A,(不同于氫)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代&-6烷基、羥基(Cw)烷基、Ci—6烷氧基、卣素、硝基、囟代d.6烷基、卣代Cw烷氧基、Cw烷硫基、C"6烷氧基羰基、氨基、氰基、羥基、氨基羰基、C,—6烷基氨基羰基、二(Cw烷基)氨基羰基和CV6烷基羰基；L,是任選被選自C,4烷基、C2—4鏈烯基和C^炔基的取代基取代的-(CH2V;前提是當(dāng)A,不同于氳時，r是l-3;或者當(dāng)A，是氫時，r是4或5;A2是苯基、呋喃基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ弧⒁约癆2(不同于苯基)的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C^烷基、Cw烷氧基、卣素、鹵代C,.3烷氧基、C,.3烷硫基、羥基、氨基、氨基羰基、C,_3烷基羰基氨基和非稠合的C3.6環(huán)烷氧基；前提是至多兩個A2上的取代基是非稠合的C3.6環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH丄-(其中X,是NH)時，八2不同于未被取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是-X,(CH》3-(其中X,是NH)時，、不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-笨基時，A2不同于在間位被三氟曱氧基取代的苯基；P是畫CH2-;W是N或CH;L2是選自下列的二價基團(tuán)-NH-C5.6環(huán)烷基-(0^2)。.2-，前提是當(dāng)C5—6環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-NH-C2-6烷基-;和-NH-(R,R-CH(CH3)CH(CH3))-;m是0或1;G是國C(-NRb)NRCRd;『和R"蟲立是氫或Cw烷基，其中Cw烷基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、C卜4烷氧基、氟、氨基、C,—4烷基氨基、二CM烷基氨基和CM烷基羰基；或者Ra和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Rb是氫或C卜4烷基；或者Rb和ir與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Re是氫、C,—6烷基、(:2-6一逸烯基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、雜環(huán)基、芳基羰基、苯基或雜芳基；其中C,—6烷基任選被1-2個獨立選自Cw烷氧基、三氟曱基、苯基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基、苯基或雜芳基的W取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,-6烷基、C,—6烷氧基、卣素、氟代C,.s烷基、氟代Cw烷氧基、C,，6烷基羰基、C,-6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羥基和氰基；或者Re和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)，所述環(huán)任選被氧代取代；前提是在任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于Ra和Rb、Rb和R?；蛘摺汉蚏d之間。本發(fā)明另一方面涉及式la化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽，其中A,是取代的苯基、苯并呋喃基、噻唑基或苯硫基；其中苯基被以及苯并呋喃基、噻唑基和苯石?；芜x被1-2個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、C,—4烷氧基、卣素、硝基、卣代Cw烷基、鹵代C"烷氧基、甲硫基、氨基、氰基和C^烷基羰基；L,是任選被選自甲基和烯丙基的取代基取代的-(CH2V,r是l-3;A2是苯基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中苯基任選在間位或?qū)ξ灰约癆2(不同于苯基)的取代基任選被l-2個獨立選自曱基、乙基、曱氧基、乙氧基、異丙氧基、三氟曱氧基、二氟甲氧基、羥基、氨基羰基和曱基羰基氨基的取代基取代；前提是當(dāng)A,是3，4-二氯-苯基時，A2不同于在間位被三氟曱氧基取代的苯基；P是-CIV;W是N或CH;L2是選自下列的二價基團(tuán)->-環(huán)己基-((^12)。.2-,Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-NH-C2—5烷基-;和-NH-(R,R-CH(CH3)CH(CH3))-;m是0;G是-C(-NRb)NRCRd;Ra和Rd獨立是氫、甲基或乙基；或者Ra和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Rb是氫；Re是氫、C卜6烷基、C^鏈烯基、C^環(huán)烷基、雜環(huán)基、苯基羰基、苯基或雜芳基；其中Cw烷基任選被l-2個獨立選自C卜3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氫呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或雜芳基的Re取代基任選被l-2個獨立選自下列的取代基取代C^烷基、Cw烷氧基、氯、氟、溴、氟代Cw烷氧基、硝基、曱硫基、羥基和氰基；或者Re和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)；前提是在任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于Ra和Rb、Rb和Re或者Re和Rd之間。本發(fā)明另一方面涉及式Ia化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽，其中A,是苯基或苯并呋喃基；其中苯基在4-位或3和4-位被1-2個獨立選自下列的取代基取代乙基、甲氧基、氟、氯、硝基、二氟甲氧基和曱硫基；L,是被甲基和烯丙基任選取代的-012-;A2是在對位被選自甲氧基、乙氧基、異丙氧基、二氟曱氧基、羥基和氨基羰基的取代基取代的苯基；或者A2是被曱氧基取代的他"定-3-基或吡啶-4-基；P是-CtV;W是N或CH;!^是選自下列的二價基團(tuán)-NH-環(huán)己基-(CH2)?！?-，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；-NHCH2CH2--'和-NH-(R,R-CH(CH3)CH(CH3))-;m是0;G是-C(-NRb)NITRd;Ra和Rd獨立是氫、甲基或乙基；Rb是氫；PT是氫、CV,烷基、(:2.4鏈烯基、環(huán)己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1,3]間二氧雜環(huán)戊烯基或吡啶基；其中C,—4烷基任選被l-2個獨立選自C,.3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氫呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或雜芳基的Re取代基任選被1-2個獨立選自C,—6烷基、&.6烷氧基、氯、氟、溴、氟代Cw烷氧基、硝基、甲硫基、羥基和氰基的取代基取代；或者Re和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)。本發(fā)明另一方面涉及表1的式(I)化合物，其中APL,、D、W、k和Q如本發(fā)明定義。表1化合物號DWL2Q1苯基-CH2--012-(4-氟-笨基)N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH22苯基-CH2--(^2-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基)3苯基-CH2--(^2-(4-曱基羧基-N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2苯基)4苯基-(CH2)2-碼-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)H_(CH2).r一CH2-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)6吹喃--CH2--(^2-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH22-基基)7苯基-CH2--CHr(3-三氟甲基-N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2苯基)8苯基-CH2--CH2-(4-叔丁基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)9笨基-CH2--CH2-(4-硝基-苯基)N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH210苯基-CH2--CH2-(4-甲氣基-苯N-NH(CH2)2--ONHC(=NH)NH:基)11苯基-CH2--CH2-吡咬-4-基N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH212苯基-CH2--CH2-(4-乙氣基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)13苯基-CH2--CHr(4-二氟甲氧N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基-苯基)14苯基-CH2--CH2-(4-正丁基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基)15苯基-CH2--CH2-(4-三氟甲基-N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2苯基)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>化合物號A,3,4-二氯-苯基3，4-二氯-苯基4-氯-苯基282930DwL2Q3132333435363738394-曱氧基-苯基3，4-二氯-苯基4-氟-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯國苯基3,4國二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3-氯-苯基2-.CH2-(4陽曱氣基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=N-CN)NH2基)-CH2-.CH2-(4-乙氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基)-CH2--<:^-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--<:^-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--(:&國(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)4--NHC(=NH)NH2基)-CH2--(CH2)r(4-甲氧基-N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2苯基)-CH2--(^2-(4曙正丙基-笨N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2-—CH2-(4國異丙基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--CH2-(4-環(huán)戊基氧基N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2-苯基)-CH2-.CH2-(4-甲硫基-笨N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2-.CH2-(4-乙基-苯基)N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2-CHr-CH2-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>化合物號A'DWL25253545556575859606162633,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3，4-二氯-苯基4-氯-苯基3，4-二氯-笨基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3'4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯-CH2--012-(3-乙氧基-苯N-NH(CH2)2-基)Q-NHC(=NH)NH2-CH2-.CH2-(4-乙氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH-乙基)基-CH2--(^2-(4陽曱氧基-笨N-NH(CH2)2--NHC(-NH)NH-丙基)基-CH2--CH2-(4-甲氡基-苯N吡咯烷-l-基3-NHC(=NH)NH2基)-CH2--0&-(4-曱氧基-苯基)-CH2--CH2-(3-二氟曱氧基-苯基)N-反式(1R，2R)-環(huán)己基-N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2-NHC(=NH)NH2-CH2--CH2-(4-曱氧基-笨N-NH(CH2)2--NHC一NH)NH(異基)丙基)-CH2--CH2-(4-曱氧基-笨N-NH(CH2)2--N(乙基)基)C—NH)NH2-CH2-.CH2-(4-甲氧基-笨N-NH(CH2)2-2-亞氨基-咪唑烷-基)l-基-CH2-.CH2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(-NH)NH(正基)丁基)-CH2--(2}^-(4-甲氣基-笨N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(環(huán)基)己基)-CH2--(^2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(千基)基)化合物號A,DWL2Q64656667686970717273743，4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3，4-二氯隱苯基3,4國二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3,4-二氯-苯基3，4-二氯-苯基-CH2--(^2-(4-甲氣基陽苯N-NH(CH2)2--NHC(-NH)NH(四基)氫呋喃-2-基曱基)-CH2--(^2-(4曙曱氡基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(苯基)基乙基)-CH2--(:^12-(4-曱氡基陽苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(呔基)喃-2-基甲基)-CH2--<:^-(4陽甲氡基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(2-基)曱氣基-乙基)-CH2-.CH2-(4-甲氣基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2基)-CH2--(CH2)6-HN-NH(CH2)3--NHC(=NH)NH2-CH2--0"12-(4國曱氡基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(烯基)丙基)-CH2-—CH2-(4-曱氡基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(苯基)基)-CH2--<:}12-(4-曱氡基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(4-基)甲氧基-苯基)-CH2-.CH2-(4-甲氡基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(4-基)氯-苯基)-CH2-.CH2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(4-基)三氟甲基-苯基)化合物號757677A,3,4-二氯-苯基3,4隱二氯-苯基呋喻-3-基78苯硫-2-基79808182838485864-甲氧基-苯基4國二氟甲氧基-笨基苯基4-曱氧基-苯基4-氯-苯基4-曱氧基-苯基4-曱氧基-苯基4-甲氧基-苯基L,D-CHr-CH2-(4-曱氧基-笨基)-CH2--012-(4-曱氧基-苯基)-CH2--12-(4-甲氧基-苯基)-CH2--CH2-(4-甲氧基-苯基)WL2QN-NH(CH2)2--NHC(-NH)NH("比啶-3-基)N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(4-甲基羰基-苯基)N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2R,S-混合-(^2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2物-基)CH(CH3)--CH2--〔1"[2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--CH2隱(4-曱氣基-苯C-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)R,S-混合-CHr(4-曱氧基-笨N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2物-CH(烯基)丙基)-R，S-混合.CH2-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2物-CH(烯基)丙基)--CHr.CH2-(4-曱氧基-苯C-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2-.CH2-(6-曱氧基"比啶-3-基)-CH2-—CH2-(4-甲氧基-環(huán)己基)N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH244<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>化合物號a,基dwl2q100013-甲氧基羰基-苯基4-羧基-苯基1023,4-二氯-苯基1034-氟-苯基1044-氟-苯基1054-氟-苯基1064-氟-苯基1074-氟-苯基1084-氟-苯基1094-叔丁氧基-苯基1104-羥基-苯基-ch2--(^2-(4-曱氧基-苯基)-chr《142-(4-曱氧基-苯基)-ch2-—CH2-(4-甲氧基-苯基)-ch2--0^2-(4-甲氧基-苯基)n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh2n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh2nnh(ch2)c(me)2-n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh2-nhc(=nh)nh(4-溴-苯基)-ch2-隱CH2隱(4-曱氧基-苯n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh基)(p比啶-2-基)-ch2--(:&-(4-曱氧基-苯n-nh(ch2)r-nhc(=nh)nh基)(吡啶-2-基-乙基)-ch2-—qv(4-甲氣基-苯n-nh(ch2)2基)-nhc(=nh)nh(4-乙氧基羰基-苯基)-ch2-.CH2-(4國甲氧基-苯n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh基)(2,4-二氟-苯基)-ch2--042-(4-甲氣基-苯n-nh(ch2)r-nhc(=nh)nh基)(正癸基)-ch2--av(4-甲氧基-苯基)-chr-012-(4-曱氣基-苯基)n-nh(ch2)2--nhc(=nh)nh2n-nh(ch2)r-nhc(=nh)nh2112113化合物號A,Tn~~2-氯-遂唑-4-基苯并呋喃-2-基3,4-二氯-苯基1144-氟隱苯基1154-氟-苯基1164-氟-苯基1174陽氟-笨基1184-氟-苯基1194-氟-苯基1204-氟-苯基214-氟-苯基1224-氯-苯基123叔丁基DWL2-CH2--(^2-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)2-基)Q-NHC(=NH)NH2-CHr-CH2-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--(:&-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)r-基)N(Me)C(=NH)NH2-CHr_0"[2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2基)-CH2--0^2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2基)NHC(=NH)NH(CH2CF3)-NHC(=NH)NH(3-甲氣基丙基)-CH2--(^2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)r-NHCeNH)哌啶-基)l-基-CH2-.CH2國(4-甲氣基-笨N-NH(CH2)2--NHC(-NH)N(Me)基)苯基-CH2--CH2-(4-甲氧基-笨N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(2-基)氟-苯基)-CH2-.CH2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH(4-基)氟-苯基)-CHr-0^2國(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH(4-基)曱基-苯基)-CH2-.CH2-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)2--NHC(-NH)NH(叔基)丁基)-CH2--<:^12-(4-氨基-苯基)N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2-CH2--(:&-(4-曱氣基陽苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)化合物號A,"T^~環(huán)戊基1254-氨基-苯基1264-氟-苯基1274-氟-苯基1284-氟-苯基1294-氯-苯基1304國氯-苯基1314-氟-笨基1324-氟-苯基1334-氟-苯基1344-氟-笨基1354-氟-苯基1364-氟-苯基DWL2-CH2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2-基)Q-NHC(=NH)NH2-CH2--CH2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2基)-CH2--(^2-(4-曱氧基-苯基)-CHr-012-(4-曱氣基-苯基)N-NH(CH2)2N-NH(CH2)2-NHC(:NH)NH(金剛烷-2-基)-NHC(=NH)NH(4-三氟曱氧基-苯基)-CH2--(:&國(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2-國NHC(-NH)NH(4誦基)羥基-苯基)-CH2--(^2-苯基N-NH(CH2)r-NHC(=NH)NH2-CH2-.CH2-呔。南國3-基N-NH(CH2)2--NHC(=NH)NH2-CHr—CH2-(4-甲氡基-笨N1，4-環(huán)己基-NHC(=NH)NH2基)-CH2--012-(4國曱氣基-苯N--NHC(=NC(=0)0-基)NHCH2C(=0)叔丁基)NH2-CH2-.CH2-(4-甲氧基-苯N-NH(CH2)2基)-CH2--(^2-(4-曱氧基-苯N-NH(CH2)2基)-CH2--042-(4-曱氣基-苯N-NH(CH2)2基)-CH2--CH2-(4-曱氧基-苯N-NH((S)-基)CHMe)2--NHC(=NH)NH(2-甲硫基-苯基)NHC(=NH)NH(C(=0)苯基)-NHC一NH)NH(嘧啶-2-基)-NHC(=NH)NH2<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>本發(fā)明化合物還可以藥學(xué)上可接受的鹽形式存在。用作藥物時，本發(fā)明化合物的鹽指無毒性"藥學(xué)上可接受的鹽"(參考InternationalJ.Pharm.，1986,33，201-217;丄Pharm.Sci.,1997(Jan)，66,1，1)。然而，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它鹽制備本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。典型有機(jī)或無機(jī)酸包括但不限于鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、枸櫞酸、苯曱酸、杏仁酸、甲磺酸、羥乙磺酸、苯磧酸、草酸、樸酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己烷磺酸、水楊酸、糖孝青酸或三氟乙酸。典型有機(jī)或無機(jī)堿包括但不限于堿性或陽離子鹽如節(jié)星、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普魯卡因、鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅。本發(fā)明的范圍包括本發(fā)明化合物的前藥。一般來講，此類前藥將是化合物的功能衍生物，在體內(nèi)很容易轉(zhuǎn)化為所需化合物。因此，在本發(fā)明的治療方法中，術(shù)語"給藥"應(yīng)包括用具體公開的化合物或者沒有具體公開但給予患者后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為特定化合物的化合物治療各種所述疾病。選擇和制備合適的前藥衍生物的常規(guī)方法描述于如"DesignofProdrugs"H.Bundgaard編輯，Elsevier,1985。當(dāng)本發(fā)明化合物具有至少一個手性中心時，它們可能因此作為對映體存在。當(dāng)化合物具有兩個或多個手性中心時，它們可另外作為非對映體存在。應(yīng)理解所有此類異構(gòu)體及其混合物都涵蓋在本發(fā)明范圍之內(nèi)。而且，一些化合物的晶形可存在多晶型，這也包括在本發(fā)明之內(nèi)。另外，一些化合物可與水(即水合物)或常用有機(jī)溶劑形成溶劑合物，此類溶劑合物意欲涵蓋在本發(fā)明范圍之內(nèi)。當(dāng)制備本發(fā)明化合物的過程產(chǎn)生立體異構(gòu)體混合物時，可用常規(guī)方法如制備層析分離這些異構(gòu)體。可將化合物制備成外消旋形式，過標(biāo)準(zhǔn)方法將化合物拆分成它們的組分對映體，如通過用旋光活性酸如(-)-二-對曱苯酰基-d-酒石酸和/或(+)-二-對曱苯?；?l-酒石酸形成鹽形成非對映體對，接著分步結(jié)晶，得到游離堿。還可通過形成非對映體酯或酰胺，接著層析分離和除去手性助劑拆分化合物?；蛘?，可用手性HPLC柱拆分化合物。在制備本發(fā)明化合物的任何過程中，可能必須和/或需要保護(hù)任何關(guān)注的分子上的敏感或反應(yīng)基團(tuán)。這可通過常規(guī)保護(hù)基團(tuán)的方法完成,長口4葛述于ProtectiveGroupsinOrganicChemistry,編4專丄F.W.McOmie,PlenumPress,1973;和T.W.Greene&P.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,1991。保護(hù)基團(tuán)可在方便的后續(xù)階段用本領(lǐng)域已知的方法脫除。即使可以單獨給予本發(fā)明化合物(包括其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的溶劑合物)，但它們通常與根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥用和獸醫(yī)實踐選擇的藥用載體、賦形劑或稀釋劑混合給藥。因此，本發(fā)明涉及含有式(I)化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥用和獸醫(yī)組合物。例如，在本發(fā)明的藥用和獸醫(yī)組合物中，本發(fā)明化合物可與任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、涂層劑和/或增溶劑混合?；衔锏钠瑒┗蚰z嚢劑可按需一次給予一個或兩個或多個。還可能給予化合物的持續(xù)釋放制劑。給藥，或者它們可采用洗劑、溶液、霜劑、軟膏劑或樸粉劑形式局部應(yīng)用。經(jīng)皮給藥的備選方法是用皮膚貼劑。例如可將它們加入由聚乙二醇或液狀石蠟的水性乳劑組成的霜劑中。還可將它們以1-10%重量的濃度加入由需要的穩(wěn)定劑和防腐劑以及白蠟或白軟石蠟基質(zhì)組成的軟膏劑中。在一些應(yīng)用時，優(yōu)選組合物以含賦形劑如淀粉或乳糖的片劑形式，或者以膠嚢劑或胚珠(單獨或與賦形劑混合)形式，或者以含矯味劑或著色劑的酏劑、溶液或混懸液形式口服給藥。組合物(以及單獨化合物)還可胃腸外例如海綿竇內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。在這種情況下，組合物將包含合適的載體或稀釋劑。胃腸外給藥時，最好用無菌水溶液形式的組合物，可包含其它物質(zhì)如足量鹽或單糖使溶液與血液等滲?？谇换蛏嘞陆o藥時，可給予片劑或錠劑形式組合物，可用常規(guī)方法配制。再例如，含有一種或多種本文描述的本發(fā)明化合物作為活性成分的藥用和獸醫(yī)組合物可通過使一種或多種化合物與藥用載體根據(jù)常規(guī)制藥配料方法均勻混合制備。根據(jù)所需給藥途徑(如口服、胃腸外)可使用各種形式的載體。因此對于液體口服制劑如混懸液、酏劑和:容液，合適的載體和添加劑包括水、二醇、油、醇、《斧p木劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑等；對于固體口服制劑，如散劑、膠嚢劑和片劑，合適的載體和添加劑包括淀粉、糖、稀釋劑、?；瘎?、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。固體口服制劑還可用如糖的物質(zhì)包衣或者腸溶包衣，以調(diào)節(jié)主要吸收部位。對于胃腸外給藥，載體將通常由無菌水及其它可加入以增加溶解度或防腐作用的成分組成。注射用混懸液或溶液還可用水載體連同適當(dāng)添加劑一起制備。最好本發(fā)明化合物可以單次日劑量給藥，或者可將總的日劑量分成每天2、3或4次分劑量給藥。而且，本發(fā)明化合物可采用鼻內(nèi)形式通過局部使用合適的鼻內(nèi)溶媒、或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的透皮貼劑給藥。當(dāng)然，為了以透皮給藥系統(tǒng)形式給藥，在劑量方案過程中給予的劑量將是連續(xù)而不是間斷的。對于一般(70kg)人而言，本化合物或其藥用組合物使用的治療有效量包含的劑量范圍每天從約0.001mg至約1,000mg,特別是從約0.1mg至約500mg，或更特別從約1mg至約250mg活性成分。對于口服給藥，優(yōu)選提供片劑形式的藥用組合物包含O.Ol、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克活性成分，根據(jù)癥狀調(diào)節(jié)給予受治療主體的劑量。治療有效量將根據(jù)所需效果而不同。因此，很容易確定將給予的最佳劑量，根據(jù)所用具體化合物、給藥方式、制劑強(qiáng)度以及疾病的進(jìn)展度而不同。另外，包括主體年齡、體重、飲食和給藥時間在內(nèi)的與具體受治療主體有關(guān)的因素，都需要將劑量調(diào)節(jié)至適當(dāng)治療水平。因此以上劑量只是一般情況下的例子。當(dāng)然，在個別情況下可能出現(xiàn)更高或更低劑量，這都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。當(dāng)需要在有需要的主體中將本發(fā)明化合物用作促動力素受體拮抗劑時，都可按照上述組合物和劑量方案或者通過本領(lǐng)域已建立的那些組合物和劑量方案給予本發(fā)明化合物。本發(fā)明還提供藥用或獸醫(yī)包裝或試劑盒，包括一個或多個裝滿一種或多種本發(fā)明的藥用和獸醫(yī)組合物成分的容器。任選附隨此類容器的是管理藥物或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)給出的標(biāo)識，該標(biāo)識表示得到機(jī)構(gòu)^t比準(zhǔn)制造、使用或銷售用于人體給藥。作為PK1受體的拮抗劑，式(I)化合物可用于治療或預(yù)防哺乳動物疾病或病癥的方法，其中通過拮抗一種或多種PK1受體的活性治療該疾病或病癥。此類方法包4舌給予需要這樣治療或預(yù)防的哺乳動物治療有效量的式(I)化合物、鹽或溶劑合物。式(I)化合物可用于預(yù)防或治療胃腸道(GI)疾病、胃腸道和生殖器官癌癥以及疼痛的方法。本發(fā)明范圍內(nèi)胃腸道疾病的實例包括但不限于腸易激綜合征(IBS,包括以腹瑪為主，以及交替性腹瀉/便秘形式的IBS)、炎性腸病(IBD,包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)和GERD以及由病原體引起的分泌性腸紊亂。本發(fā)明范圍內(nèi)癌癥的實例包括但不限于睪丸癌、卵巢癌、Leydig細(xì)胞癌和小腸或大腸癌。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的疼痛實例是但不限于常見于IBS和IBD的痛覺過敏。雖然本發(fā)明包括含一種或多種式(I)化合物的組合物，但本發(fā)明也包括含有用于制備式(I)化合物的中間體的組合物。本發(fā)明化合物的典型IUPAC命名用ACD/LABSSOFTWAREIndexNameProVersion4.5命名軟件程序產(chǎn)生，該程序由AdvancedChemistryDevelopment,Inc.,Toronto,Ontario,Canada提供。以下是用于本說明書特別是流程和實施例中的縮寫Cpd或Cmpd=化合物d=天DIAD=偶氮二曱酸二異丙酯DIPEA或DIEA-二異丙基乙胺DMEM=Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基DMF=N,N-二甲基甲酰胺DMSO=二曱基亞砜EtOAc=乙酸乙酯EtOH=乙醇h=小時M=摩爾MeCN=乙腈MeOH-甲醇min=分鐘NaOMe=甲醇鈉PyBOP=六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基-三-耽咯烷基-轔rt/RT=室溫THF=四氮呋喃TFA=三氟乙酸通用流程本發(fā)明的典型化合物可根據(jù)下文描述然后用流程舉例說明的通用合成法合成。已知用于以下流程的原料和試劑可市售獲得或者用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。既然流程是舉例說明，所以本發(fā)明不應(yīng)^L為受限于表達(dá)的化學(xué)反應(yīng)和條件。流程A說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中1^2不同于-NHC—0)-(CH2)m-和-X2-(CH2)o-4-，L2的X,是NH?？稍跇O性溶劑如曱醇中用甲基化試劑如曱基碘4吏式Al化合物曱基化，得到式A2化合物。可在過量叔胺如二異丙基乙胺存在下使式A2化合物與適當(dāng)取代的異氰酸酯如N-氯羰基異氰酸酯縮合，得到式A3三。秦。可通過技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)方法，用式A4化合物將式A3化合物烷基化，其中LG,是離去基團(tuán)。例如，當(dāng)LG,是羥基時，可在非醇類極性溶劑如THF或二氯甲烷中在三苯膦存在下，用偶合劑如DIAD使化合物A4與化合物A3偶合?；蛘?，LG,可以是卣化物、曱苯磺酸酯等，以便LG,被化合物A3的氨基部分置換，得到式A5化合物。式A5化合物可用式A6化合物(其中X,是NH且m是O)進(jìn)一步親核取代加工，得到式A7化合物。技術(shù)人員清楚當(dāng)L2不對稱時，可能需要氮保護(hù)基團(tuán)避免竟?fàn)幏磻?yīng)。可通過用式A8的活性脒(其中流程A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>LG2是離去基團(tuán)，如面化物、醇化物、咪唑或吡唑、活性醇化物等)處理式A7化合物的末端胺插接式(I)的G-取代基，得到其中m是0的式(I)化合物IA?；蛘?，當(dāng)m=l時，可通過用式A9化合物處理式A7化合物加入氧基胍取代基，形成其中m是1的式(I)化合物(I)A。流程B說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中L2是-NHC^O)-(CH2)M-?？赏ㄟ^用氨或其它氨源如氫氧化銨處理，將式A5化合物轉(zhuǎn)化為其對應(yīng)的胺，得到式B1化合物。可通過常規(guī)化學(xué)方法用式B2化合物將化合物Bl的氨基?；渲蠰G3是離去基團(tuán)，如當(dāng)B2是?；葧r為卣化物，當(dāng)B2是羧酸時為羥基，當(dāng)B2是酐時為羧酸烷基酯，或者當(dāng)B2是?；溥驎r為咪唑?；蛘撸珺2可以是活性酯等。式B2化合物的K取代基是本文限定的離去基團(tuán)LG,,或者K是用適當(dāng)?shù)陌被Ｗo(hù)基團(tuán)(PG)保護(hù)的R、取代的氨基。流程B<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>，11k=lg,時用H2nr"取代為了制備式B4化合物，可將式B3化合物用技術(shù)人員已知的試劑和方法進(jìn)行N-脫保護(hù)(當(dāng)K是-NRa(PG)時)，或者可用胺H2NRa(當(dāng)K是LG,時)進(jìn)行親核置換。然后將所得式B4的胺用式A8的活性脒處理，得到式(I)的化合物(I)B。流程C描述本發(fā)明化合物的通用合成，其中L2的X,是直接鍵?？蓪⑹紺l化合物與式C2異氰酸酯縮合，得到式C3化合物，加熱后得到式C4的三,?？蓪⑹紺4化合物的氨基用式C5烷化劑適當(dāng)取代，得到式C6化合物。用本文描述的方法將G-取代基插接入式C6化合物中，得到式(I)的化合物(I)C。流程c<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>流程D說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中W是CH,L2不同f-NHC(=0)-(CH2)M-，k的X,是NH。通過加熱使式Dl化合物與式D2化合物縮合，其中LG2如本文限定，形成式D3化合物。然后可將式D3化合物用磷酰氯、PCls等處理和加熱，得到式D4化合物?？赏ㄟ^常規(guī)烷基化方法用式C5化合物插接-P-A2?？蛇M(jìn)一步加工式D5化合物，用胺A6(當(dāng)X,是NH時)進(jìn)行氯化物的親核置換，得到式D6化合物?？捎帽疚拿枋龅幕瘜W(xué)方法再加工，得到式(I)的化合物(I)D。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>流程E說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中W是CH且L^是-NHC(=0)-(CH2)M-。可將式D5化合物用氨或其它氨源如氫氧化銨處理，得到對應(yīng)的式El氨基化合物。用式B2化合物將氨基?；?，用本文描述的方法再加工成式(I)的化合物(I)E。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>流程F說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中W是CH，L2的X,是直接鍵，L2是任何包含X,的基團(tuán)?？稍诘图壨榇即嬖谙?，用堿性條件使式F1化合物與式F2化合物縮合，形成式F3化合物。可將式F3化合物與式F4的脲縮合，形成式F5的環(huán)狀化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>可通過技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)方法用烷化劑C5使式F5化合物烷基化，制備式F6化合物。用胺H2NRa親核置換LG,得到式F7化合物，可用本文描述的方法進(jìn)一步加工將G-取代基包含在內(nèi)，得到式(I)的化合物(I)F。流程G說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中W是N且k是-X2-(CH2)Q-4-?？蓪⑹紾l化合物用堿處理然后用式A4化合物烷基化,得到式G2化合物。在堿性水溶液如氬氧化物存在下，用過氧化氬處理式G2化合物，得到式G3的雙酰氨基化合物，然后使其與式G4化合物縮合，形成式G5的三。秦化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>通過使用技術(shù)人員已知的常規(guī)試劑和方法，可將式G5化合物的羧基還原成對應(yīng)的醇，接著氧化為式G6的醛?？赏ㄟ^偶合化學(xué)法或標(biāo)準(zhǔn)烷基化化學(xué)法用式C5化合物取代仲氨基，得到式G7化合物?；衔锏娜┎糠挚蓞⑴c與式G8化合物(其中PG如前限定)的Wittig烯化反應(yīng)，得到式G9化合物，其中L2包括鏈蟑基X2。后來脫除氨基保護(hù)基團(tuán)，接著脒基化，得到式(I)的化合物(I)G。流程H說明本發(fā)明化合物的通用合成，其中W是CH且1^是-X2-(CH2V4-。可使式HI化合物與O-烷基化的異脲縮合，得到式H2的環(huán)狀化合物?？蓪酚糜袡C(jī)金屬堿去質(zhì)子，接著用式A4化合物處理，插接式(I)的-L,A,取代基。將烷基化化合物H2進(jìn)行O-脫甲基得到式H3化合物。通過常規(guī)氧化化學(xué)法，可將H3的甲基取代基轉(zhuǎn)化為其對應(yīng)的醛，得到式H4化合物。用流程G描述將化合物G7轉(zhuǎn)化為式(I)G化合物的合成步驟可將醛加工成其中L2是-X2-(CH2V4-的式(I)化合物。流程H<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>H4具體實施例按照以下各實施例和反應(yīng)順序制備代表本發(fā)明的具體化合物；描述反應(yīng)順序的實施例和流程圖只用于例證，幫助理解本發(fā)明，無物用作后續(xù)實施例的中間體，以制備另外的本發(fā)明化合物。未試圖優(yōu)化任何反應(yīng)得到的產(chǎn)率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚如何通過常規(guī)改變反應(yīng)時間、溫度、溶劑和/或試劑增加此類產(chǎn)率。試劑市售獲得。氫原子的核磁共振(NMR)譜在BrukerAM-360TMS以下的百萬分率表示。質(zhì)i普(MS)用電噴射法在MicromassPlatformLC光譜儀或AgilentLC光譜儀上測定。微波加速反應(yīng)用CEMDiscover或PersonalChemistrySmithSynthesizer微波儀器進(jìn)行?？捎肵射線晶體學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法將立體異構(gòu)化合物表征為外消旋混合物或其單獨的非對映體和對映體。除非另有標(biāo)明，否則用于實施例的材料很容易從供應(yīng)商獲得或者用化學(xué)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。除非另有標(biāo)明，否則實施例之間變化的取代基是氫。實施例1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>N-{2-15-(4-乙基-芐基)-1-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氬-[1，3，51三嗪-2-基氨基1-乙基}-胍(化合物46)A.l-(4-甲氧基-節(jié)基)-6-甲基硫烷基-lH-l，3，5j三喚-2,4-二酮(化合物lc)。向MeOH(40mL)中的(4-曱氧基-千基)硫脲(2.00g,10.1mmol)內(nèi)加入甲基碘(0.64mL,10.]i畫ol)。在室溫下將反應(yīng)物攪拌24小時。將反應(yīng)混合物濃縮，得到2.00g粗化合物(lb),不需再純化即可用于下一步。B.向二氯甲烷(40mL)中的化合物lb(3.6g,17.1mmol)內(nèi)加入過量二異丙基乙胺(6.61g,51.3mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0'C。滴加一部分N-氯羰基異氰酸酯(1.78g，17.1mmol)。讓反應(yīng)混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝亍?4小時后，加入水，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯提取。分離各相，將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將甲醇加入粗產(chǎn)物內(nèi)，將固體真空過濾收集，得到化合物lc(1.5g)。！HNMR(DMSO-d6)52.45(3H,s),3.73(3H,s),4.98(2H，s),6.89-6.92(2H,d,J=8.5Hz),7.22-7.25(2H,d,J=8.5Hz),11.58(1H,s)。C.3-(4-乙基-千基)-l-(4-甲氧基-千基)-6-甲基硫烷基-lH-[l，3，5三溱-2，4-二酮(化合物ld)。向四氮呔喃中的化合物lc(0.1g,0.35mmol)內(nèi)加入4-乙基千醇(0.049g,0.35mmol)、三苯膦(0.19g0,71mmol)和偶氮二曱酸二異丙酯(0.087g,0.43mmol)。在室溫下將反應(yīng)物攪拌64小時。使反應(yīng)混合物吸收在乙酸乙酯中，用水洗滌，分離各相。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。將所得材料用ISCO自動化系統(tǒng)用正相層析純化，得到化合物ld(0.14g)，為白色固體。D.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-(4-乙基-芐基)-l-(4-甲氧基-千基)-lH-|1，3，51三嗪-2,4-二酮(化合物le)。向曱苯中的l-(4-甲氧基-千基)-6-甲基硫烷基-lH-[l,3,5]三漆-2，4-二酮(0.14g,0.33mmol)內(nèi)加入過量乙二胺(O.IOg,1.76mmol)。在1l(TC下將反應(yīng)混合物加熱18小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用水稀釋，用乙酸乙酯提取。分離各相，將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾和濃縮。所得化合物le(0.11g)不需再純化即可用于下一步。E.N-(2-l5-(4-乙基-節(jié)基)-l-(4-甲氧基-節(jié)基)-4，6-二氧代-l,4，5，6-四氯-|1,3，5|三溱-2-基氨基卜乙基}-胍(化合物46)。向化合物le(0.11g,0.26mmol)在乙腈(4mL)中的混合物內(nèi)加入過量二異丙胺(0.069g,0.53mmol)和1H-葉匕哇-l-羧脒(carboxamidine)鹽酸鹽化合物lf(0.039g,0.26mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌18小時。/人反應(yīng)混合物中沉淀出白色固體，過濾收集，得到標(biāo)題化合物46(通過HPLC純度為98%,0.0119g)。'HNMR(DMSO-A)51,01-1,04(3H't，7.5Hz〉,2.41-2.47(2H,q,J-7,夠,3,26-3.16(4H，m),3.61(3H,s)'4.75(2H,s)，4,93(2H，s),6.77-6.79(2H，d,/-8.64Hz;)，7.00-7.12(6H,m),7.55(1H,m),8,06(1H,m).使用實施例1的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物39,45,77,78，79,80,82,83,109,111,112,123,124,131,136,137,145和146。買施例2^{2-[5-(4-氟-千基)-1-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氫-11，3，5]三噪-2-基氨基卜乙基}-胍(化合物n)A.((4-氟千基)氨基)羰基)carbamimidothioicacid甲基酯(化合物2a)。使硫酸S-甲基異硫脲輸(IO.Og,35.9mmol)溶于8:2:1MeOH/H20/THF中，用3NNaOH(12mL,35.9mmol)處理混合物。然后將溶液冷卻至(TC，用30分鐘滴加4-氟千基異氰酸酯(5.43g,35.9mmol)。將反應(yīng)物攪拌過夜，逐漸溫?zé)嶂潦覝?。然后將混合物用飽和NH4C1水溶液洗滌，用二氯曱烷提取。將合并的有機(jī)相用Na2S04干燥，過濾和減壓濃縮。所得殘留物用Isco快速柱(20y。EtOAc-100%EtOAc/庚烷)純化，得到化合物2a(4.1g),為白色粉末狀物。B.5-(甲硫基)-3，7-二氧代-1-(4-氟千基)-2-氧雜-4，6，8-三氮雜壬-4-烯-9-酸甲基酯(化合物2b)。用三乙胺(3,08mL,22.1mmol)處理化合物2a(4.1g,17.0mmol)的二氯曱烷溶液，將混合物冷卻至-10。C。用1,3NNaOHH20/MeOH/THF0°C'r上ONH夂ASMe-義GI八OMeNEt3,CH2CI2-10'C-r.t.FO、N、N、Me2b、0MaNaOMa/MeOHMaCN,加熱""ORPPhj,DIAD,THFH2NNH2甲苯，加熱、,C^N人NNH2MeCN,D舊A,o人入MeO,J2eMeO'HN丫叫NHNaOMa/MaOH、義/。。O22o人.2o=s=oM一215分鐘通過加液漏斗滴加氯曱酸曱酯(2.62mL,34.0mmol),將反應(yīng)物攪拌4小時，逐漸溫?zé)嶂潦覝?。然后將溶液用飽和NH4C1水溶液洗滌，用二氯曱烷提取。將合并的有機(jī)相用Na2SC^干燥，過濾和濃縮。所得殘留物用Isco快速柱(5。/。MeOH)純化，得到化合物2b(3.63g)，為白色固體。C.;3-(4-氟-芐基)-6-甲基硫烷基-lH-ll，3，5I三嗪-2，4-二酮(化合物2c)。使化合物2b(3.63g，12.1mmol)溶于MeOH(100mL)中，用NaOMe/MeOH(4.6M,2.90mL,13.3mmol)處理溶液，在室溫下將反應(yīng)物攪拌1小時。加入NaOMe后形成白色沉淀物。將反應(yīng)混合物用INHC1(50mL)稀釋，過濾收集所得沉淀物。在160。C下用二甲苯將固體減壓干燥，得到化合物2c(3.6g),為其HC1鹽。D.孓(4-氟-千基)-l-(4-甲氧基-千基)-6-甲基硫烷基-lH-ll，3，51三溱-2，4-二酮(化合物2d)。使化合物2c(500mg,1.65mmol)溶于THF中，用4-甲氧基千醇(227mg,1.65mmol)、三苯膦(866mg,3.30mmol)和偶氮二曱酸二異丙酯(334mg,1.65mmol)處理。在室溫下將反應(yīng)物攪拌過夜。用HPLC檢測反應(yīng)物后，使溶液分配在水和乙酸乙酯之間。將合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾和還原。將粗混合物用Isco快速柱(20%乙酸乙酯-100%乙酸乙酯/庚烷,40分鐘)純化，得到390mg化合物2d,為白色固體。'HNMR(DMSO,d6)53.29(s，3H),3.74(s，3H)，4.93(s,2H),5.03(s,2H),6.89-6.92(d,2H,J=8.62)，7.12-7.36(m,4H),7.38-7.41(m,2H)。E.4-13-(3，4-二氯-芐基)-6-甲基硫烷基-2，4-二氧代-3,4-二氫-211-[1，3，51三嗪-l-基甲基卜苯甲酰胺(化合物2d)。使化合物2c(二氯節(jié)基)(200mg，0.56mmol)溶于MeCN中，用二異丙基乙胺(0.196mL，1.13mmol)和4-氯甲基千基氯(96mg，0.56mmol)處理。將反應(yīng)混合物加熱至8CTC，攪拌過夜。將反應(yīng)混合物用飽和NH4C1水溶液洗滌，用乙酸乙酯提取。將合并的有機(jī)提取物用Na2S04干燥，過濾和濃縮。所得粗混合物用Isco快速柱(20%-100%EtOAc/庚烷，40分鐘)純化，得到70mg化合物2d,為白色粉末狀物。F.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-(4-氟-千基)-1-(4-曱氧基-千基)-111-1,3，51三溱-2，4-二酮(化合物2e)。用乙二胺(302mg,5.03nimol)處理化合物2d(390mg,1.01mmol)的甲苯(8mL)溶液。將反應(yīng)物加熱至90。C,攪拌過夜。使混合物分配在水和乙酸乙酯之間。將合并的有機(jī)層用Na2S04干燥，過濾和還原。還原得到390mg化合物2e,為粗混合物。該粗化合物不需另外純化即可用于進(jìn)一步合成。G.N-(2-l5-(4-氟-節(jié)基)-l-(4-曱氧基-節(jié)基)-4，6-二氧代-l，4，5，6誦四氫-[1,3，51三噪-2-基氨基卜乙基}-胍(化合物17)。使化合物2e的粗混合物(390mg,0.98誦ol)溶于乙腈(IOmL)中，用吡唑-1-羧脒鹽酸鹽(143mg，0.98mmol)和二異丙基乙胺(0.340mL,1.95mmol)處理。在室溫下讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行過夜。檢查反應(yīng)混合物顯示已形成白色沉淀物，將沉淀物收集和真空過濾干燥?！娇涔腆w收集，得到307mg化合物17,為白色粉末狀物。M+(ES+)=442.3.'HNMR(DMSO,似33.33(m,4H),3.73(s,3H),4.89(s,2H),5.04(s,2H),6.89—6,91(d,2H,8.66他),7.10-7.16(t,2H,/=8.91Hz),7.21-7.24(d,2H,/=8.63Hz),7.32-7.36(dd，2H'J=2.90,5.57Hz),7,66(s,1H),8.19(s,1H).使用實施例2的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物1,2,3，4，5,6,7,8，9,11,12,13,14,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25,25,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38，40,41,50,51,52,57,68，69,85,86,87,129,130,142,144和147。化合物51:4-3-(3，4-二氯節(jié)基)-6-(2-胍基乙基氨基)-2，4-二氧代-3，4-二氫-2H-l，3，51三,-l-基-甲基l-苯甲酰胺5(DMSO'勾3.30-3.37(m,4H),4.90(s,2H),5.10(s,1H),7.27—7.32(m,3H),7,51-7.61(m,2H),7.83(d,2H,>/=9.7Hz),7.94(s,1H)，8,08(t,1H,/=3.7Hz).買施例3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>A.l-芐基-嘧啶-2,4，6-三酮(化合物3a)。使N-千基脲(500mg,3.33mmol)溶于乙醇(8mL)中，用丙二酸二乙酯(640mg,4.0mmol)和NaOEt/ElOH(1.29mL,3.1M,4.0mmol)處理混合物。然后在微波條件下在14(TC使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。真空還原溶液，將殘留物用乙醇研磨。將所需化合物真空過濾收集，得到化合物3a(500mg),為白色粉末狀物。'HNMR(DMSO,d6)53.69(s,2H),4.87(s，2H),7.21-7.31(m,5H)，11.41(s,1H)。B.6-氯-3-千基尿嘧啶(化合物3b)。使化合物3a(500mg,2.29mmol)溶于三氯氧化磷(3.5mL,22.9mmol)中，謹(jǐn)慎地用水(0.103mL，5.7mmol)處理反應(yīng)混合物。將溶液加熱至60°C，攪拌過夜。然后濃縮反應(yīng)混合物，將殘留物倒在2NNaOH(15mL)上。將粗材料真空過濾收集，用乙醇再結(jié)晶純化，得到化合物3b(60mg)，為白色粉末狀物。將第二部分300mg粗化合物3b再結(jié)晶回收，不需再純化用于下一反應(yīng)。'HNMR(MeOD,d4).55.04(s，2H),5.87(s,1H)，7.25-7.38(m,5H)。C.l-(4-甲氧基節(jié)基)-6-氯-3-千基尿嘧啶(化合物3c)。將化合物3b(60mg,0.25mmol)在THF中的攪拌溶液用4-曱氧基千醇(35mg,0.25mmol)、三苯膦(133mg,0.51mmol)和偶氮曱酸二異丙酯(51mg,0.25mmol)處理。在室溫下將反應(yīng)物攪拌過夜。將混合物用水洗滌，用乙酸乙酯提取。將合并的有機(jī)提取物用Na2S04干燥，過濾和濃縮。所得殘留物用Isco快速柱層析(20%EtOAc-100EtOAc/庚烷，40min)純化，得到化合物3c(60mg)，為白色粉末狀物。M+(ES+)=356.9。D.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-芐基-1-(4-曱氧基節(jié)基)-尿嘧啶(化合物3d)。使化合物3c(60mg,0.17mmol)溶于乙醇(3mL)中，用乙二胺(51mg，0.84mmol)處理反應(yīng)混合物。在微波反應(yīng)器中用功率最大條件使溶液在140'C下運(yùn)行20分鐘。將溶液用水洗滌，用乙酸乙酯提取。將合并的有機(jī)相用Na2S04干燥，過濾和濃縮，得到粗化合物3d(35mg),為黃色油狀物。粗混合物不需再純化即可用于下一反應(yīng)。E.^{2-11-千基-3-(4-甲氧基-千基)-2,6-二氧代-1，2,3，6-四氫-嘧啶-4-基氨基l-乙基卜胍(化合物81)。按照實施例2步驟G的描述制備標(biāo)題化合物。將粗材料用反相制備HPLC純化，得到標(biāo)題化合物(8.2mg),為其TFA鹽。M+(ES+)=422.9.&NMR(MeOD'rf4).<J3.19-3.24(m,4H),3.67(s,3H)'4.77(s,1H),4.99(s:2H)，5.03(s,2H),6.77-6.80(d,2H，J-8,79Hz),7.01-7.04(d,2H,J=8.75Hz)'7.12-7.25(m,5H).使用實施例3的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物84?；衔?4:N-(2-[l,3-雙-(4-曱氧基-節(jié)基)-2,6-二氧代-l,2,3，6-四氫-嘧啶-4-基氨基]-乙基}-胍(DMSO,A)J3.25—3.27(m,2H),3.35—3.37(m,2H),3.74(s,3H),3.75(s,3H),4.83(s,1H),4.90(s,2H),5.15(s'2H),6.81一6.89(m,4H),7.14-7.24(ra,4H)'7.70(s,1H).實施例4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>A.l-(4-氟-苯基)-2-甲基-異硫脲(化合物4b)。向(4-氟-苯基)-硫脲(18.7mg,0.11mmol)的曱醇(0.25mL)溶液內(nèi)加入碘曱烷(8mL,0.13mmol)。在25°C下將混合物攪拌16小時，然后濃縮為殘留物，得到粗化合物4b。C.N-(2-[5-(4-氟-千基H-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氫-ll，3，51三嗪-2-基氨基j-乙基卜N'-(4-氟-苯基)-胍(化合物127)。向化合物4b的乙醇溶液(0.5mL)內(nèi)加入化合物2e(40mg,0.10薩ol)。在微波反應(yīng)器中將混合物在16(TC照射15分鐘，然后濃縮。使所得殘留物溶于二甲基亞砜中，用反相層析純化，得到標(biāo)題化合物119(18.3mg，0.024mmol)，為其TFA鹽。lH顧R(甲醇-似37.42(m,2H),7,24-7.12(m,6H)'7.00(m'2H),6.89(m,2H),5.06(s,2H),5.01(s,2H)'3.75(s,3H)，3.56(m,2H),3.43(m,2H);HRMSm/z(M+H)+計算值536.2222,實測值536.2227。使用實施例4的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物44,53'54,58,61,62,63，64,65,66，67,70'71,72,73,74,75，76,88'89,90，91'92，103'104,105、106,107,108,U4,115,116,117,118,120,121,126,127,128'133,134'135'138,139,和140.化合物58:N-(2-15-(3，4-二氯-芐基)-l-(4-曱氧基-芐基)-4，6-二氧代-1，4，5,6-四氫-11，3，51三溱-2-基氨基1-乙基}-]\，-異丙基-胍。(甲醇-^):□7.56(s,1H),7.45(d,出'/=8.3Hz),7.35(d,1H,/=8.3Hz),7.22(d，2H,/-8.3Hz),6,89(d,2H,/=8.4Hz),5.12(s,2H)，5.01(s,2H)，3.77(s,3H),3.68(in,1H),3,57(t,2H,/-6,3Hz),3,41(t,2H,6.3Hz),1.17(d,6H,J=6.5Hz);H應(yīng)S齡(M+H廣計算值534.1787，實測值534.1792?；衔?0:N-(4-氰基-苯基)-N'-(2-5-(4-氟-節(jié)基)-l-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4,5，6-四氫-[l，3，5j三溱-2-基氨基卜乙基卜胍。'HNMR(甲醇-rf4):□7.74(d,2H,/-8.7Hz)'7.44(m,2H)'7.35(d,2H,/==8.3Hz),7.21(d,2H,8.6Hz),7.01(t,2H，/-8,8Hz),6.88(d,2H，/=8,8Hz)，5,11(s,2H),5.02(s,2H)，3,75(s,3H),3,61(t,2H,/=6.3Hz)'3.51(m,2H);HRMS一(M+H)+計算值543.2268,實測值543.2273?；衔?04:1\-{2-5-(4-氟-芐基)-1-(4-甲氧基-爺基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氫-ll，3，51三嗪-2-基氨基l-乙基卜N'-吡啶-2-基-胍。'H畫R(DMSO-J6):010.90(br,1H),9.78(br,1H),8,65(br,2H),8.17(d,1H,/=5.4Hz),8.07(m'1H),7.87(t'1H,-7,8Hz),7.33(邁,2H〉,7,13(m,4H)'7,05(d,1H，J=8,2他)'6.78(d,2H,8.7Hz),4.98(s,2H),4,86(s,2H),3.67(s,3H),3.54(m,2H),3,36(br,2H);HRMSm/z(M+H)+計算值519.2268,實測值519.2253?；衔飈l8:N-(2-l5-(4-氟-芐基)-l-(4-甲氧基-芐基)-4，^二氧代-1，4，5，6-四氫-[l，3，5j三漆-2-基氨基l-乙基卜N'-(2-氟-苯基)-胍。'HNMR(甲醇-rf》:□7,47-7.37(m,3H),7,31(t,1H,/=7,8Hz),7.23(m，2H),7.18(d,2H,/=8.6Hz),7.01(t,2H,/=8.8他)，6.89(d,2H,8.8Hz),5.06(s,2H),5.01(s,2H)'3.76(s,3H),3.56(t,2H,/=6.3Hz)，3,45(t,2H,/-6,3Hz);HRMS,n/c(M-卜H)+計算值536.2222，實測值536.2227?；衔?34:N-苯甲?；?N'-(2-[5-(4-氟-芐基)-l-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-1，4,5，6-四氫-[1，3，5|三嚷-2-基氨基卜乙基}-胍。'H薩R(甲醇-□7.93(d,2H,/=8.2他),7.70(t,1H,/=7.5Hz),7.57(t,2H,/=7.5Hz),7.41(m,2H),7.16(d,2H'/=8,7Hz),6,97(t'2H,J=8.7Hz),6.85(d,2H,J-8.7他)，5.08(s，2H),4.99(s,2H)，3.70(s,3H),3.66(t,2H,/-6,2Hz),3.55(t,2H,/-6.2Hz);HRMSm/z(M+H)+計算值546.2265,實測值546.2259。實施例5N-(2-15-千基-H4-甲氧基-芳基H，6-二氧代-l,4，5，6-四氫-ll，3，51三嗪-2-基氨基卜乙基}-氧基胍(化合物27)H2M0—NH乂'2HCIGS2C03,DMSO加熱O一NH5aA.用實施例1步驟C描述的方法制備化合物5a，但用苯曱醇代替4-乙基千醇。B.向DMSO(1mL)中的3-芐基-l-(4-甲氧基-芐基)-6-甲基硫烷基-lH-[l,3,5]三嗪-2,4-二酮5a(0.056g,0.15mmol)內(nèi)加入N-(2-氨基-乙基)-氧基胍二鹽酸鹽(0.058g,0.30mmol》Cs2C03(0.098nig,0.30mmol)。在70°C下將反應(yīng)混合物加熱5小時，冷卻至室溫。再加入N-(2-氨基-乙基)-氧基胍二鹽酸鹽(0.058g,0.30mmol)和Cs2C03(0.098mg,0.30mmol),在40°C下將所得漿狀物攪拌16小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，裝在lgC-18SPE柱體上，用CH3CN洗脫。將洗脫液濃縮，所得殘留物用梯度為90:10(乙腈:水，含0.1%TFA)至90:10(乙腈:水，含0.1%TFA)的反相液相層析純化，得到標(biāo)題化合物27(通過HPLC純度為99%，0.0289g)。'HNMR(,德SO/CDCl3)53.65-3.73(2H,m)'3.78(3H's),3.96-4.04(2H，m〉,5,01(2H，s)，5.10(2H,s)，6.85(2H,d,/=8.7Hz),7.21-7.40(7H.ni),7.74(4H,bs);7.89(1H,m)11.58(1H,bs);C2lH26N704的HRMSm/z計算值440.2046(M十H),實測值440.2030。使用實施例5的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物10。實施例64-4-(2-胍基-乙基氨基)-3-(4-甲氧基-千基)-2，6-二氧代-3,6-二氬-2H-ll，3，51三,-l-基甲基j-苯曱酸(化合物101)A.按照實施例1描述的方法制備化合物6a，但用4-羥基曱基-苯曱酸曱酯代替4-乙基千醇。B.4-4-(2-胍基-乙基氨基)-3-(4-甲氧基-芐基)-2，6-二氧代-3,6-二氫-2H-ll，3，5j三溱-l-基甲基卜苯曱酸(化合物101)。在室溫下將化合物6a(20mg,0.028mmol)和氬氧化鋰(6mg,0.014mmol)在5mLMeOH和1mLH20中的混合物攪拌過夜。之后加入另外6mg氫氧化鋰，將混合物再攪拌18小時。接著將混合物濃縮，用HPLC純化。得到標(biāo)題化合物101(10mg,0.014mmol),為其TFA鹽。4j)53.26(m,2H),3,40(m，2H),3.68(s'3H)，4.97(s'2H),5.02(s,2H),6.79-6.82(d,2H,/=8,7Hz),7,06-7.09(d,2H，/=8,7Hz)，7,35-7.38(d,2H,/=8.2Hz)'7.86-7.88(d,2H,/=8,3Hz).實施例7N-(2-[5-(4-羥基-千基)-l-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氬-11，3,51三溱-2-基氨基卜乙基卜胍(化合物110)A.按照實施例1描述的方法制備化合物7a，但用(4-叔丁氧基-苯基)-曱醇代替4-乙基千醇。B.N-口-[5-(4-羥基-節(jié)基)-l-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氫-[1，3，51三嗪-2-基氨基1-乙基}-胍(化合物110)。使粗化合物7a(假定約0.24mmol)溶于CH3CN中。向混合物內(nèi)加入3mLTFA。在室溫下將所得混合物攪拌過夜。將混合物濃縮，用HPLC純化，得到標(biāo)題化合物110(31mg,0.046mmol)，為其TFA鹽。H畫R(DMSO-NMR(DMSO-^)51.25-1.28(m,1H),3.28-2,31(m'2H),3.31-3.36(m'2H),3.73(s,3H),4.78(s,2H)'4.98(s,2H),6.65-6.68(d,2H,/=8,4Hz),6.89-6.91(d,2H,J=8.7Hz),7.11-7.14(d,2H,/=8,6Hz),7.52-7.54(d,2H,J-5.5Hz)'7.99(m,1H),實施例81\國{2-1-(4-甲氧基-千基)-5-(4-硝基-節(jié)基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氫-[1，3，5三溱-2-基氨基1-乙基}-胍(化合物95)D舊A。zNMeGN,加熱1cH2NNH2甲苯，90。C02MHN,HCIIfD舊A,CH3CNCpd95A.l-(4-甲氧基-千基)-6-甲基硫烷基-3-(4-硝基-節(jié)基)-lH-l，3,51三嗪-2，4-二酮(化合物9a)。使化合物lc(200mg,0.73mmol)溶于CH3CN中，用4-硝基千基溴(168mg,0.86讓ol)和80mL(0.73n扁l)二異丙基乙胺處理。將所得混合物加熱至87°C,攪拌過夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氬鈉溶液洗滌。將有機(jī)相用MgS04干燥，過濾和濃縮。用快速層析純化殘留物，得到化合物8a(44g,0.36mmol)。B.6-(2-氨基-乙基氨基)-1-(4-甲氧基-千基)-3-(4-硝基-千基)-111-11，3，51三,-2，4-二酮(化合物9b)。向10mL甲苯中的化合物8a(80mg，0.19mmol)內(nèi)加入過量乙二胺(64mL,0.95mmol)。將所得混合物加熱至90。C26小時。使混合物吸收在乙酸乙酯中，用水洗滌。將有機(jī)層分離，用MgS04干燥和濃縮。粗產(chǎn)物8b(79mg,0.18mmol,97%產(chǎn)率)不需再純化即可用于下一步。C.]\-{2-|1-(4-甲氧基-千基)-5-(4-硝基-千基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氫-ll，3，5j三噪-2-基氨基l-乙基)-胍(化合物95)。在室溫下將化合物8b(51mg,0.12mmol)、1H-吡唑-l-羧脒鹽酸鹽(18mg,0.]2mmol)和二異丙基乙胺(26pL，0.36mmol)在10mL乙腈中的混合物攪拌幾天。將所得混合物濃縮，用液相層析純化。得到呈白色粉末狀物的標(biāo)題化合物95(17mg,0.036mmol),為TFA鹽。!HNMR(DMSO-d6)53.65-3.71(m,4H),3.85(s,3H),5.30(bm，4H),6.99-7.02(m,2H),7.26-7.30(m,2H),7.54-7.60(m,2H),8.02-8.20(bs,1H),8.25(m，2H)。使用實施例8的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物42,43,47,55,56,59,94,97,98,99,100，102和113。實施例9N曙(2-l5-(4-氨基-千基)-l-(4-曱氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5,6-四氫.1，3，51三溱-2-基氨基j-乙基卜胍(化合物125)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>將粗化合物95(39mg,0.083mmol)和氯化錫(n)二水合物(94mg,0.42mmol)在20mLEtOH中的混合物加熱回流24小時。將溶液濃縮，殘留物用HPLC純化，得到標(biāo)題化合物125(6.5mg,0.015mmol),為其TFA鹽。NMR(DMSCWtf)S3.30(m'4H),3.73(s,3H),4.80(s,2H)，4.98(s,2H),6.56-6.78(m,2H),6.88-6.91(d，2H，J-8.6Hz),7.13-7.20(m,4H),7.43-7.47(m,1H)'7.92-7.99(m,1H).使用實施例9的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物96。實施例103-(3,4-二氯-千基)-6-[2-(2-亞氨基-咪唑烷-l-基)-乙基Ml-l-(4-甲氧基-芐基)-川-|1，3，51三嗪-2，4-二酮(化合物60)A.按照實施例1步驟C描述的方法制備化合物10a,但用(3,4-二氯-苯基)-曱醇代替4-乙基千醇。B.6-|2-(2-氨基-乙基氨基)-乙基氨基1-3-(3，4-二氯-芐基)-1-(4-甲氧基-卡基)-lH-ll，3，5j三喚-2，4-二酮(化合物10b)。向曱苯(6mL)中的化合物10a(0.400g,0.968mmol)內(nèi)加入2,2'-二氨基二乙胺(0.300g,2.9mmol)，在ll(TC下將反應(yīng)混合物加熱4小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，然后加入水。將混合物用乙酸乙酯提取，用硫酸鈉干燥，過濾和濃縮，得到化合物10b(0.46g),不需再純化即可用于下一反應(yīng)。C.3-(3,4-二氯-千基)-6-2-(2-亞氨基-咪唑烷-1-基)-乙基氨基卜l-(4-甲氧基-芐基)-111-|1，3，51三嗪-2，4-二酮(化合物60)。向苯(2mL)中的化合物10b(0.100g,0.203mmol)內(nèi)加入溴化氰(0.022g,0.203mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌2.5小時。使反應(yīng)混合物濃縮，然后溶于乙腈和甲醇混合物中。將混合物用反相層析純化，得到標(biāo)題化合物60(0.017g)。NMR(DMSOO83.28-3.59(8H,m),3.66(3H,s),4.83(2H's),4,92(2H,s),6,81-6.84(2H,d,J=8,7Hz)'7.09-7,12(2H,d,8.7Hz),7.19-7.22(1H,d，J=8,3Hz),7,46(lH,s),7.51-7-54(1H,d，J=8.3Hz)'7.86-7,95(3H,實施例11N-(2-[l-(4-羥基-節(jié)基)-5-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氫-11,3，51三嗓-2-基氨基1-乙基}-胍(化合物143)o雨氣.,XX義人v叫HO.A.按照實施例2描述的方法制備化合物lla(50mg,0.09mniol)，但在步驟D用[4-(叔丁基-二甲基-曱硅烷基氧基)-苯基]-甲醇代替4-曱氧基芐醇。B.使化合物lla懸浮于THF(2mL)中，用氟化四丁銨一水合物(24mg,0.09mmol)處理反應(yīng)混合物。在室溫下將溶液攪拌過夜。然后在氮氣下濃縮混合物，殘留物用反相制備HPLC純化，得到標(biāo)題化合物143(3.8mg)，為白色固體。M+(ES+)=440.1;'HNMR(MeOD,□3.32(m,2H),3.50(t,2H,J=7.08Hz),3.78(s,3H),4.99(s,2H),5.03(s，2H),6.77(d，2H,/=8,58Hz)，6.85(d,2H,/=8.71Hz)'7.07(d,2H,y=8.(52Hz)'7.36(d,2H,/=8.67Hz).實施例12N-{2-1-(4-氨基-千基)-5-(4-氯-千基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氬-|1,3，51三,-2-基氨基1-乙基}-胍(化合物122)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage78</formula>A.按照實施例2描述的方法制備化合物12a(50mg,0.09mmol),但在步驟D用(4-羥基曱基-苯基)-氨基曱酸叔丁酯代替4-甲氧基千醇。B.使化合物12a(70mg,0.129mmol)懸浮于二氯甲烷(3mL)中,用三氟乙酸(0.5mL)處理溶液。在室溫下將反應(yīng)物攪拌過夜。在氮氣下濃縮混合物，將殘留物用反相制備HPLC純化，得到標(biāo)題化合物122(35.9mg),為白色固體。M+(ES+〉=443.1;'HNMR(DMSO'A).<53.18-3,25(m,2H),3.28-3.31(m,2H),4.76(s,2H),4.82(s'2H),4.88(s,2H)，6.75(d,2H,/=8.25Hz)，7.02(d,2H,/=8.38Hz),7.22—7.32(m,4H),7.53(d,2H,/=4.02Hz),7.95(ra,1H).實j包例131\-{2-15-(3，4-二氯-芐基)-1-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6國四氫-|1，3，51三溱-2-基氨基卜乙基}-]\，-氰基-胍(化合物28)A.按照實施例1描述的方法制備化合物13a,但在步驟D用3,4-二氯苯曱醇代替4-乙基千醇。B.向化合物13a(0.050g,0.11mmol)在異丙醇(lmL)中的混合物內(nèi)加入三乙胺(0.0nmL,0.12mmol)和N-氰基carbonimidate二苯基酯(0.029g,0.12mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌2小時，然后真空濃縮。使所得殘留物懸浮于EtOH(0.75mL)中，加入NH4OH(0.25mL,14.8N(aq))。在50°C下將反應(yīng)混合物攪拌16小時，真空濃縮，所得殘留物用梯度為卯:IO(水:乙腈，含0.1%TFA)至卯:IO(乙腈:水，含0.1%TFA)的反相液相層析純化，得到標(biāo)題化合物28(通過HPLC純度為99%,0細(xì)7g);C22H23C12N803的HRMSm/z計算值517.1270(M+H)，實測值517.1281。使用實施例13的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適試劑、原料和純化方法，制備下列本發(fā)明化合物化合物143。實》fe例14A.1，5-二氫-2-(曱硫基)-4H-咪唑-4-酮一氫碘化物(化合物15b)。向化合物14a(420mg,3.6mmol)的EtOH(5mL)溶液內(nèi)加入石與曱烷(0.268mL,4.3mmol)。在25°C下將混合物攪拌16小時，然后濃縮成殘留物，得到化合物14b,不需再純化即可用于下一反應(yīng)。B.3-(3，4-二氯-芐基)-1-(4-甲氧基-千基)-6-2-(5-氧代-4，5-二氫-lH-咪唑-2-基氨基)-乙基氨基-lH-[l，^S]三嗪-2，4-二酮4(化合物52)。向化合物14b(0.0373mg,0.14mmol)的乙醇(0.75mL)溶液內(nèi)加入化合物13a(50mg,0.13mmol)。將混合物在160。C照射(口波)15分鐘，濃縮，所得殘留物用梯度為90:10(水:乙腈，含O.l。/。TFA)至90:10(乙腈:水，含0.1。/QTFA)的反相液相層析純化，得到標(biāo)題化合物48(通過HPLC純度為89%,0.0025g)。C23H24C12N704的HRMSm/z計算值532.1267(M+H),實測值532.1257。實施例153-(3，4-二氯-千基)-6-[2-(4，5-二氫-111-咪唑-2-基氨基)-乙基氨基卜l-(4-甲氧基-芐基)-lH-l，3，5j三嗪-2，4-二酮(化合物49)向化合物15a(0.054mg，0.22mmol)的乙醇(lmL)溶液內(nèi)加入化合物13a(50mg,0.1mmol)。將混合物在微波反應(yīng)器中160。C照射15分鐘，濃縮，所得殘留物用梯度為90:10(水:乙腈，含O.l%TFA)至90:]0(乙腈:水，含0.1%TFA)的反相液相層析純化，得到標(biāo)題化合物49(通過HPLC純度為93%,0.0082g)。C23H26C12N703的HRMSm/z計算值518.1474(M+H)，實測值518.1479。實施例16N-{2-[5-(4-氟-千基)-1-(4-甲氧基-千基)-4,6-二氧代-1，4，5，6-四氫-[1,3，51三嗪-2-基氨基1-乙基)-N，-氨基-胍(化合物93)向化合物16a(0.061mg,0.22mmol)的乙醇(lmL)溶液內(nèi)加入化合物2e(50mg,0.13mmol)。將混合物在微波反應(yīng)器中160。C照射15分鐘，濃縮，所得殘留物用梯度為90:10(水:乙腈，含0.1%TFA)至90:o10(乙腈:水,含0.1%TFA)的反相液相層析純化，得到標(biāo)題化合物93(通過HPLC純度為99%,0.018g)。'H麵R(CDC1》□3,22-3.73(2H,m)，3.38-3.55(2H,m),3.75(2H,t,/=5.8Hz),3.77(3H,s)'5,01(2H,s),5，07(2H,s),5.44-4.86(2H,bs),6,83(2H,d，/=8.7Hz),6.90-7.03(2H,m),7.16(2H,d,/==8.7Hz),7.48-7.36(2H,m).C21H26FN803的HRMSm/z計算值457.2112(M+H)，實測值457.2101。實施例17N-{2-[5-(4-氟-千基)-1-(4-甲氧基-千基)-4，6-二氧代-l，4，5，6-四氫-11，3，5I三噪-2-基氨基卜乙?；種'-boc-胍(化合物132)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>A.15-(4-氟-芐基)-1-(4-曱氧基-千基)-4，6-二氧代-1,4，5，6-四氫-11，3，51三嗓-2-基氨基卜乙酸(化合物17a)。向化合物2d(0.10g,0.26mmol)的乙醇(lmL)溶液內(nèi)加入甘氨酸(0.056g,0.75mmol)和DIEA(0.143mL,0.82mmol)。將混合物在微波反應(yīng)器中15(TC照射30分鐘,然后冷卻至室溫。再加入甘氨酸(0.056g,0.75mmol)和DIEA(0.143mL,0.82mmol),將所得混合物在150。C照射(口波)30分鐘,冷卻至室溫和濃縮，所得殘留物用梯度為90:10(水:乙腈，含0.1%TFA)至90:10(乙腈:水,含0.1%TFA)的反相液相層析純化，得到化合物17a(通過HPLC純度為99%，0.058g)。C2。H20FN4O5的MSm/z計算值415.1(M+H)，實測值415.1。B.N-(2-[5-(4-氟-千基)-l-(4-甲氧基-節(jié)基)-4，6-二氧代-l,4，5,6-四氬-[1，3，51三噪-2-基氨基1-乙酰基}-1\，-1)(^-胍(化合物132)。向化合物17a(0.025g,0.047mmol)、D正A(0.032mL,0.18mmol)和monobocguanidine(0.015g,0.091mmol)的DMF(0.40mL)溶液內(nèi)力口入PyBop(0.047g，0.091mmol)。在室溫下將混合物攪拌16小時，用水(3mL)猝滅，所得溶液用4x1mLEtOAc提取。將合并的有機(jī)層用Na2S04干燥和濃縮，所得殘留物用梯度為50:50(EtOAc:庚烷，含0.1。/。Et3N)至EtOAc(含0.1%Et,N)的硅膠正相快速層析純化，得到標(biāo)題化合物132(通過HPLC純度為85%,0.0263g)。)H應(yīng)R(CDCW□"6(9H,s)'3.79(3H,s),4.05(2H,s),5,07(4H,s),6.90(2H,d,/=8.7Hz),6,98(2H,at,J-6'7IIz),7,30(2H,d,</=8.7Hz)，7.50(2H,dd,/=8.7and8.卿'8,61(1H,bs);C26H31FN706的MSm/z計算值556.2320(M+H)，實測值556.2341。生物學(xué)實施例生物學(xué)實施例1促動力素-1的表達(dá)、離析和純化將重組N-端FLAG-標(biāo)記的人PK1(序列-CCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF)表達(dá)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中。在含10y。FBS、20mMHEPES、丙酮酸鈉、青霉素和鏈霉素(各50昭/ml)和G418(400mg/L)的DMEM選擇性高糖培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,Califoraia)中，使HEK293細(xì)胞生長至100%融合。用兩周時間每隔一天都用新鮮培養(yǎng)基裝滿用于培養(yǎng)HEK293細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基。將含PK1肽的培養(yǎng)基收集，用500mL0.2|tim孔徑濾器(ComingIncorporated,Corning,NY)濾過。^)奪濾液jli存在4。C濾液并瓦內(nèi)。在4°C使含PK1肽的培養(yǎng)基依靠重力流動通過M2瓊脂糖柱(SigmaChemical，St.Louis,MO)進(jìn)行純化。培養(yǎng)基通過后，將瓊脂糖柱用無菌1xPBS(pH7.4)洗滌，直至在OD280nm不再檢測到蛋白。然后將柱用pH2.8的0.1M甘氨酸-HC1溶液洗脫。通過將洗脫材料收集入含1MTnspH8的管內(nèi)將其立即中和。用OD280鑒定和匯集峰餾分。在室溫下將匯集的餾分用4單位/mLFlag表位進(jìn)行腸激酶裂解過夜。除去腸激酶，將樣品等份貯存在-80。C。以上純化后PK1配體的質(zhì)譜分析結(jié)果用MaldiTOF-MS和LC-Electrospray-MassSpectralAnalysis分析樣品。所需蛋白序列AVITGACERDVQCGAGTCCAJSLWLRGL固CTPLGREGEECHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF計算的平均分子量=9667.4。MALDI-TOFANALYSIS樣品制備4姿照反相ZipTip,2002MilliporeCorporation的j吏用指南用C4ZipTip除去蛋白樣品溶液(10)iL)的鹽分。質(zhì)譜分析用MicromassTOFSpecE質(zhì)譜儀測定分子量。用MassLynx軟件3.4進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。在0-80,000Da質(zhì)量范圍獲得MALDI正離子質(zhì)譜。將原MS數(shù)據(jù)減去基線，用Masslynx軟件弄平，與參考標(biāo)準(zhǔn)得到的質(zhì)量相比。用Agilent反褶積軟件計算洗脫成分的質(zhì)量。結(jié)果質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示存在所需蛋白(分子量=9667)以及質(zhì)語響應(yīng)大致同樣豐富的測定分子量為9172的其他相關(guān)成分。在測量誤差范圍內(nèi)，該質(zhì)量與下文標(biāo)明丟失最后4個C端殘基的可能的截斷產(chǎn)物一致。提出的其他蛋白成分序列HPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLK計算的平均分子量=9178.8。沒有檢測到其它相關(guān)的蛋白成分。所有測定的質(zhì)量準(zhǔn)確度都接近0.1%。生物學(xué)實施例2功能測定在熒光成像讀板器(FLIPR)上篩選PK1拮抗劑的方法在測定前24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)基(含高糖和L-谷氨酰胺，10%FBS，1%青霉素/鏈霉素，1%丙酮酸鈉，20mMHEPES，Zeocin200mg/L的DMEM)中，將100fiL1.3xlo6/m表達(dá)HEK293GPR73(PK1受體)的細(xì)胞置于96孔聚右旋賴氨酸包被板(Costar)中，培養(yǎng)在37°C和5%032下。進(jìn)行測定當(dāng)天，除去培養(yǎng)基，將200^L預(yù)先用200mL測定緩沖液[HBSSw/Ca2+—Mg2—w/o酚紅，20mMHEPES,0.1%BSA,10mL丙磺雀予(710mg丙磺舒在5mL1NNaOH中，然后向其內(nèi)加入5mL含20mMHEPES的HBSS)]懸浮的5xCalciumPlusDye(MolecularDevices)加入96孔板的各孔內(nèi)。將板在37。C和5%0)2避光培養(yǎng)30分鐘。取出板，讓其避光達(dá)到室溫15分鐘。然后在FLIPR上測定。簡而言之讀取基線1分鐘，加入化合物(25pL)，培養(yǎng)4分鐘15秒，加入預(yù)先確定ECs。終濃度的PK1配體制劑(25^L)，對熒光計數(shù)1分鐘45秒。將只有緩沖液加入細(xì)胞時讀取的相對熒光量描述為基線。所有孔都減去基線。對照的百分?jǐn)?shù)計算如下(孔值-基線/最大值-基線)x100。抑制百分?jǐn)?shù)為100-對照值百分?jǐn)?shù)。將IC5o定義為指定化合物抑制50%最大信號需要的量，由用于本測定的PK1制劑的濃度產(chǎn)生。IQq但用GmphPadPrism計算。表2包括實施例2描述的PK1功能測定產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。生物學(xué)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>化合物Ca，多動ICsoOiM)Ca2+移動抑制％諸nM實測MS計算MS730,039100602.1602.12740.1381O0636.1636.15750.036101569.2569.16760.2393610.1610.17770.78981413.9414.19780.389429,8430.17790.071101467.9柳,24800.071簡489.7490.20810.45284422.9423.2182O.柳84柳.8494.25830.98880497.7498.20840.04299452,9453,23850.05196455.2455.22863.2661459.9460,2787>1038456.9457,17884.7459555.2555.28899.0746569.3569.30900.031,0.043100，100543.2543,23W0.054101563.2563,22920,0497562.2562.22930.22792457,2457,21944.860468.7469.19950.08496柳.7469.1996>1043438.9439.22970.31886448.8449.2198>1034448.8449.21990.79473481.8482.221008.8248481,8482.22101>1033468.9468.2088<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>*數(shù)值代表多次試驗測定的數(shù)值范圍。生物學(xué)實施例3A-3E在哺乳動物中PK1對分泌和腸粘膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的作用生物學(xué)實施例3A在哺乳動物中PK1對分泌和腸粘膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的作用方法學(xué)。將回盲連接處近端2cm的點開始延伸至最近端10cm的完整厚度的回腸段新鮮切除，置于Krebs-Ringer碳酸氫鹽(KRB)溶液中，將塑料桿輕輕插入完整腸段內(nèi)清空其中內(nèi)容物。用手術(shù)刀片后脊沿著整個腸系膜邊緣修整回腸段，用平頭鑷小心地除去包括腸肌叢在內(nèi)的完整肌層。用剩余的肌肉剝除、粘膜-粘膜下層組織制備三片長約1.5cm的矩形組織片，小心地切下，避開Peyer's'淋巴結(jié)。將含完整粘膜下神經(jīng)節(jié)的各組織片釘在丙埽酸安裝盒半體之間的矩形門(粘膜暴露的總橫斷面積=0.50cm"上，該盒插在改良Ussing型流量月空的組織;谷貝i器(PhysiologicInstruments,Inc.,SanDiego,CA)之間。關(guān)于用Ussing腔經(jīng)上皮測量的討論，參見MartinJ.Hug,Transep他elialMeasurementsUsingtheUssingChamber,TheEuropeanWorkingGrouponCFTRExpression(2002)。將各組織的頂端(即粘膜)和底端(即漿膜)表面用6ml維持在36。C的氧合KRB溶液浸浴。一旦固定后，讓組織平衡0.5-1小時，然后進(jìn)行電場刺激，加入促分泌劑或藥物。KRB溶液包含(mM)120NaCl、6KCl、1.2MgCl2、1.2NaH2P04、14.4NaHC03、2.5CaCl》11.5葡萄糖或11.5甘露醇。將KRB溶液繼續(xù)用95%02:5%(:02吹氣并維持在pH7.3。各腔配備一對測定跨組織透壁電壓差(PD)的飽和KCl-瓊脂橋，和一對與自動電壓鉗裝置(VCCMC6型或VCCMC8型，PhysiologicInstruments,Inc.,SanDiego,CA)連才妄的Ag-AgCl諒月旨電極，補(bǔ)償PD傳感橋之間的;:容液電阻和在0mV鉗夾時跨組織透壁電壓差(PD)的測定偏差。通過用脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的雙極脈沖測定改變1mVPD需要的電流計算(以mS)組織電導(dǎo)(G)。連續(xù)測定凈離子主動轉(zhuǎn)運(yùn)的指標(biāo)即短路電流(Isc,mA)。組織電導(dǎo)(Gt,mS)是對被動離子流屏障作用的指標(biāo)，用各組織的Isc改變和經(jīng)上皮電壓差計算。獲得記錄各組織短路電流(Isc)和G的基線并繼續(xù)記錄15分鐘，然后開始實驗方案。用電腦數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)(PowerLab8SP,ADInstmments,Inc.,ColoradoSprings,CO)連續(xù)測定和i己錄刺〖敫的Isc改變。通過用電子刺激器(S-48,Grass-Telefactor,Astro-Med,Inc.,WestWarwick,RI)輸出的電場刺激(80V,0.5ms，10Hz,5s)得到神經(jīng)誘導(dǎo)的Isc改變，該電子刺激器通過直接接觸各組織對極的粘膜表面的鋁箔電極連接。將藥物和促分泌劑常規(guī)加入基底側(cè)貯器中。加入基底側(cè)后連續(xù)記錄激動劑或促分泌劑對ISC的作用。通過累積、分步地添加預(yù)定增加量的激動劑或促分泌劑構(gòu)成濃度-反應(yīng)曲線，加入的量為對前一較低濃度的峰Isc反應(yīng)的量或其附近。lOJO分鐘暴露期后接著用特異性激動劑或促分泌劑誘導(dǎo)，評估拮抗劑或抑制劑對分泌的作用。統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)值都以均數(shù)+/-SE表示。將用Ussing流量型腔獲得的電生理數(shù)據(jù)標(biāo)化為組織表面積，用每cn^表示。將刺激前基線值與指定刺激物或促分泌劑誘導(dǎo)的最大反應(yīng)(AIsc)之間的絕對差確定為刺激的離子轉(zhuǎn)運(yùn)改變。用PRISM(GraphPadSoftware,Inc)中電腦計算的曲線擬合功能，從7點累積濃度-反應(yīng)曲線試驗得到PK1對上皮分泌的刺激作用的估計EC5。。用非配對雙側(cè)Student'st;險驗確定任何兩組如對照與實驗組織之間的統(tǒng)計顯著性。用ANOVA聯(lián)合posthocNeuman-Keuls多重比較檢馬全確定多組之間的顯著性差異。P<0.05:枧為有統(tǒng)計顯著性。結(jié)果概述。將對指定濃度PK1的峰ISC反應(yīng)與最初基線(未刺激的)Isc值相比得到的差值記錄為Isc的改變，以測定的微安(卩iA)△lsc表示，用安裝在Ussmg型腔內(nèi)的組織表面積(cn^)校正。反應(yīng)曲線的EC^值按照生物學(xué)實施例3A的描述計算?；A(chǔ)Isc是35.2十/-2.4nA/cm2,組織電導(dǎo)(G)是33.7+/-0.9mS/cm2(n=79片組織,來自34只大鼠)。將單劑量PK1給予浸浴基底側(cè)組織表面的Krebs溶液之后，2-4分鐘內(nèi)Isc逐漸增加至峰值，然后在10-15分鐘內(nèi)降回基線。PK1誘導(dǎo)的Isc增加呈濃度依賴性，累積濃度-反應(yīng)研究測定EC5()約為8.2nM。PK1誘導(dǎo)反應(yīng)的最大反應(yīng)出現(xiàn)在100nM;與基線相比，100nMPK1誘導(dǎo)Isc增加28.7+/-2.9^A/cm2(n=42片組織，來自29只大鼠)，10nMPK1誘導(dǎo)增加13.5+/-2.pA/cm2(n=33片組織，來自22只大鼠)。所有后續(xù)研究都使用濃度10nM和100nM。在任何研究中PK1對G都沒有明顯作用。圖4顯示在神經(jīng)傳導(dǎo)毒素河豚毒素(TTX)存在下或者用抗膽堿藥阿托品阻斷腸粘膜細(xì)胞上的毒蕈堿受體之后，都沒有阻斷PK1的促分泌作用。這表明其作用不依賴組織的內(nèi)在神經(jīng)活性。PK1誘導(dǎo)的Isc增加需要存在內(nèi)源性PK1受體，因為將外源性PK1肽加入PK1受體敲除小鼠的回腸粘膜組織引起的Isc與野生型同種小鼠相比無顯著差異。(參見圖5)。生物學(xué)實施例3B在大鼠回腸中PK1誘導(dǎo)腸道分泌增加的作用機(jī)制方法學(xué)。用于這些研究的Ussing型離子流量腔的基本方法與上文詳細(xì)描述的相同，對實驗方案作以下修改。為了確定PK1對上皮促分泌作用的作用機(jī)制，用三種單獨的方法廢除跨上皮的生電氯離子或碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運(yùn)。第一種方法包括加入基底側(cè)Na+-K+-2C11A同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑布美他尼(500^M)，石皮壞驅(qū)動液體和電解質(zhì)分泌入腸道的從基底側(cè)向頂端方向的凈生電cr離子流。第二種方法包括更換用于維持Ussing腔內(nèi)活組織的生理緩沖液中的所有氯離子，用等摩爾羥乙基磺酸鹽和乙酸鹽代替上文所列標(biāo)準(zhǔn)KRB配方的鹽酸鹽，從而帶入無氯KRB溶液。第三種方法包括更換生理緩沖液中的所有碳酸氫根離子，用等摩爾哌。秦-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES)代替碳酸氫鹽從而帶入無碳酸氬才艮的KRB溶液，加入1mM細(xì)胞內(nèi)碳酸酐酶阻滯劑乙酰唑胺，預(yù)防腸細(xì)胞產(chǎn)生碳酸氫根。結(jié)果概述。用布美他尼和無Cl-的Krebs溶液阻斷基底側(cè)Na+-K+-2Cr協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體，用試驗測定PK1誘導(dǎo)Isc增加的離子基礎(chǔ)。(參見圖6)。根據(jù)成功用于其它類似離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究報道選擇布美他尼的濃度(500^M)。將布美他尼加入漿膜浴液之后，顯示基線Isc降低(-7.1+/-8.6|LiA/cm2,n=5);但是，這與只接受DMSO溶媒的組織(6.6+/-4.0pA/cm、n-4)相比無顯著差異。另外，布美他尼沒有顯著改變基線G;然而，布美他尼使PK1誘導(dǎo)的Isc增加明顯減弱>90%。在無Cl-的Krebs溶液中，力口入PK1后漿膜的反應(yīng)也減少>90%;但是，含乙酰唑胺的無碳酸氬根KRB溶液對PK1的Isc反應(yīng)沒有影響，提示它不影響碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)。生物學(xué)實施例3C在大鼠回腸中PK1刺激的腸道分泌部分依賴作用于上皮EP4受體的內(nèi)源性前列腺素類的合成方法學(xué)。用于這些研究的Ussing型離子流量腔的基本方法與上文詳細(xì)描述的相同，對實驗方案作以下修改。已經(jīng)顯示包含在腸道內(nèi)的許多不同的肽和神經(jīng)肽部分通過刺激內(nèi)源性前列腺素產(chǎn)生發(fā)揮它們的促分泌作用。為了闡明內(nèi)源性前列腺素合成在PK1刺激大鼠回腸的Isc反應(yīng)中的潛在作用，用預(yù)處理的大鼠回腸粘膜進(jìn)行實驗，所述粘膜用加入非選擇性環(huán)氧合酶(COX)抑制劑吡羅昔康(10nM)、選擇性COX隱l同工酶抑制劑FR122047(10mM)和選擇性COX-2同工酶抑制劑美洛昔康(IOpM)的漿膜處理。(參見圖7)。在確定內(nèi)源性產(chǎn)生的前列腺素是否作用于特異性受體亞型的后續(xù)實驗中，將組織用加入選擇性前列腺素受體拮抗劑EP4(AH23848,30^M)和血栓烷受體TP(GR32191B,1^M)的漿膜預(yù)處理，以確定涉及PK1驅(qū)動前列腺素刺激的Isc反應(yīng)的假定信號機(jī)制。結(jié)果概述。結(jié)果提示大鼠回腸中PK1介導(dǎo)的分泌部分依賴于COX合成內(nèi)源性前列腺素。根據(jù)使用選擇性COX同工酶抑制劑的實驗，結(jié)果表明可誘導(dǎo)的COX-2同工酶不涉及PK1刺激的前列腺素的產(chǎn)生。后續(xù)實驗的結(jié)果提示由PK1暴露信號通過激活前列腺素EP4受體亞型刺激的內(nèi)源性前列腺素優(yōu)先局限于大鼠腸上皮。生物學(xué)實施例3D在大鼠回腸中小分子PK1受體拮抗劑有效抑制PK1和霍亂毒素刺激的腸分泌方法學(xué)。用于這些研究的Ussing型離子流量腔的基本方法與上文詳細(xì)描述的相同，對實驗方案作以下修改。在30-45分鐘平衡期之后，通過將組織對側(cè)極端上的箔電極與電子矩形脈沖刺激器的極化絕緣輸出信號接觸相連，對基線穩(wěn)定的組織進(jìn)行一連串電場刺激(EFS;80V,0.5ms,10Hz,5s)。用對兩種連續(xù)EFS的反應(yīng)計算組織存活率和每只大鼠的具體組織以及大鼠之間反應(yīng)的可比性。在間隔期測定組織電導(dǎo)，為用歐姆定律從脈沖發(fā)生器用1mV波幅雙極脈沖誘導(dǎo)的短暫短路電流反應(yīng)的波幅的改變。研究每只大鼠的3-4片組織。如下將指定動物的組織分組和分配1片對照組織只接受溶媒，接著以累積方式將兩種連續(xù)劑量的PK1配體加入組織基底面；剩余2-3片來自同一動物的組織暴露于指定PK1受體拮抗劑(如1只大鼠的3-4片組織對照、拮抗劑p拮抗劑2、拮抗劑3)。將待測化合物以1jiM終濃度加入基底組織側(cè)貯器內(nèi)，培養(yǎng)15分鐘后用PK1肽刺激。在這次15分鐘暴露期結(jié)束時，將PK1配體以10和100nM以累積方式加入各組織，以表征待測化合物的抑制作用。在本實驗結(jié)論中，再用EFS計算組織存活率和反應(yīng)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示于圖9-11。結(jié)果概述。只用PK1拮抗劑預(yù)處理的組織沒有檢測到對基線Isc和組織電導(dǎo)(G)的作用。圖9-11所示結(jié)果表明在已被細(xì)胞測定鑒定為公認(rèn)PK1受體拮抗劑的兩種不同系列小分子支架(即氨基胍和氨基苯并咪唑(分別是圖9A和9B以及圖ll))存在下，成功抑制離體大鼠回腸粘膜中PK1誘導(dǎo)Isc的增加。在兩種試驗系列的各化合物中，觀察到兩種遞增累積濃度PK1誘導(dǎo)Isc反應(yīng)的抑制作用表現(xiàn)明顯可克服的拮抗作用。雖然氨基胍JNJ28611921不能抑制對PK1的Isc反應(yīng)；然而，已顯示該化合物對PK1受體缺乏明顯活性。這些數(shù)據(jù)提示通過小分子抑制劑調(diào)節(jié)PK1對腸上皮的促分泌作用，可有效實現(xiàn)選擇性功能性阻斷PK1受體。生物學(xué)實施例3EPK1刺激大鼠體內(nèi)小腸中液體的腸匯集和聚集方法學(xué)。用重量分析實驗測定大鼠小腸中PK1肽的體內(nèi)促分泌作用。用兩種不同給藥途徑評估PK1肽對大鼠完整腸道內(nèi)液體的腸匯集和聚集的刺激作用。在兩個單獨的實驗中將未禁食的大鼠隨機(jī)分成兩個實驗組(每組11=10)。在第一個實驗中，對每只大鼠給予含100昭/kg劑量PKl肽或緩沖溶媒的口服巨丸劑(1.5ml)6%胭脂紅染料/0.5%甲基纖維素wt/vo1。(參見圖12)。在第二個實驗中，對大鼠腹膜內(nèi)注射(i.p)PK1肽(IOOitig/kg)或緩沖溶媒，接著立即胃內(nèi)給予6%胭脂紅染料/0.5。/o曱基纖維素試驗餐(1.5ml)。(參見圖13)。30分鐘后，用100%二氧化碳吸入麻醉然后用頸推脫位法迅速處死大鼠，切除從幽門至回盲連接處的整段小腸。測量小腸全長，然后等分成三段，用4-0號絲線環(huán)結(jié)扎、隔離和分離各段，預(yù)防管腔內(nèi)容物漏出。將各段(近端、中部和遠(yuǎn)端)完整稱重近似至毫克，小心地縱向切開，輕輕地用吸收紙片吸干，清空其液體內(nèi)容物，然后再稱重。注意不要再分配或取出任何固體或半固體管腔內(nèi)容物。將完整和清空腸段重量之間的差異計算為液體內(nèi)容物凈重，近似至毫克，標(biāo)化為克腸段組織濕重。結(jié)果概述。結(jié)果證明PK1肽刺激大鼠體內(nèi)小腸中液體腸匯集和聚集。一般來講，這種作用涉及小腸所有三個區(qū)域；然而，這種作用在更遠(yuǎn)端(即中和遠(yuǎn)段)區(qū)域最明顯。這些數(shù)據(jù)與作為證據(jù)表明用安裝在Ussing型離子流量腔中進(jìn)行離體研究的大鼠回腸粘膜離體標(biāo)本得到PK1肽的促分泌作用一致。生物學(xué)實施例4A-4CPK1對胃腸道平滑肌的作用生物學(xué)實施例4APK1刺激口服試驗餐在大鼠體內(nèi)小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)方法學(xué)。小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過口服祠管給予大鼠總體積為1.5ml的巨丸劑，含6。/。胭脂紅染料/0.5o/。曱基纖維素(wt/vol)溶液以及PK1(100嗎/kg)或溶媒。30分鐘后，迅速用100%二氧化碳吸入麻醉，接著用頸推脫位法處死。小心地切除每只大鼠的整段小腸，先從回盲連接處開始向后至胃幽門，直至已經(jīng)切除完整的全部小腸。將切除的小腸沿直尺邊排列，以厘米測量小腸全長?？梢婋僦t染料面的前緣，也測量胭脂紅經(jīng)過的距離，計算為小腸總切除長度的百分?jǐn)?shù)。將轉(zhuǎn)運(yùn)以30分鐘內(nèi)胭脂紅染料經(jīng)過的腸道總長度的百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果顯示于圖14。結(jié)果概述。結(jié)果表明與溶媒處理的對照相比，用PK1口服處理的大鼠明顯加速胭脂紅試驗餐的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，PK1顯然對受處理大鼠上胃腸道的推進(jìn)動力具有刺激作用。生物學(xué)實施例4BPK1刺激離體大鼠體外小腸的收縮性用"myobath"裝置，在體外研究PK1對鼠類離體胃腸(G1)組織段的作用。這種器官浴裝置用于在存在或缺乏化合物的情況下測定應(yīng)用PK1后胃腸平滑肌收縮活性的改變，所述化合物在PK1R體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中阻斷PK1受體(PK1R)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離Ca"的增加。方法。通過CO窒息處死鼠類(小鼠、大鼠和豚鼠)并放血。切除包括胃、十二指腸、空腸、回腸、近端結(jié)腸和末端結(jié)腸在內(nèi)的動物胃腸組織段并固定，為完整腸,爻(即15mm長筒狀腸段)或沿縱向肌軸走向的扁條(2.5mmxl5mm)。在一些實驗中扁條沿環(huán)狀肌軸走向。使用兩種類型縱向排列的扁條標(biāo)本a)由全部腸壁組成的標(biāo)本和b)已經(jīng)切去粘膜和粘膜下層，只由肌層(包括腸肌叢和漿膜)組成的標(biāo)本。將各組織標(biāo)本安裝在配備固態(tài)應(yīng)變式力量傳感器的支架上，該傳感器與標(biāo)本一端連接，將標(biāo)本浸在維持35。C用95%02/5%CC^吹氣的Krebs-Ringers緩沖液(KRB,等滲碳酸氫鹽緩沖液，pH7.4)中。拉長組織，使靜息負(fù)荷為0.5-1.0gm(根據(jù)標(biāo)本而定)，在這些條件下平衡1小時，每15分鐘更換一次新鮮KRB浴液。每次實驗開始都將乙酰膽堿(ACh,1iliM)加入各浴中，以產(chǎn)生收縮反應(yīng)；洗去ACh后，將PK1單獨或者在加入PK1R拮抗劑之后加入各浴中。將在這些條件下對PK1的反應(yīng)與同一組織標(biāo)本對ACh的反應(yīng)相比，將收縮(或舒張)計算為對ACh反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)。已報道PK1對豚鼠胃腸平滑肌的作用(Schweitz,Pacaud等，1999;Lai,Liu等，2003)。因為PK1及可被它激活的受體(PK1R和PK2R)在大鼠胃腸道各處的表達(dá)不同，所以該肽對大鼠離體腸和結(jié)腸段的作用是具有特征的。PK1(100nM)誘導(dǎo)腸組織(中段十二指腸、空腸和末端回腸)縱向收縮，但相同濃度PK1誘導(dǎo)近端和末端結(jié)腸縱向舒張。(參見圖6)。結(jié)果提示對PK1的最大收縮反應(yīng)來自回腸組織；因此用回腸段進(jìn)行進(jìn)一步實驗。第一個研究使用完整腸段，稍后的實驗則以離體回腸肌層組成的標(biāo)本為基礎(chǔ)。PK-1誘導(dǎo)完整回腸標(biāo)本的雙相收縮將PK1用于離體大鼠回腸誘導(dǎo)雙相反應(yīng)，由早期短暫收縮和晚期強(qiáng)直性收縮組成。(參見圖15)。蛋白的應(yīng)用在箭頭處出現(xiàn)，在記錄期間保持與標(biāo)本接觸。測定早相和晚相達(dá)到峰收縮的時間分別為6.4分鐘和53.8分鐘。測定的早相和晚相收縮反應(yīng)都呈濃度依賴性。(參見圖17A和17B)。測定早期和晚期收縮反應(yīng)的EC^分別為87.8和72.4nM。為了確定回腸平滑肌的明顯收縮是否由腸平滑肌上的受體直接介導(dǎo)，將河豚毒素(TTX,O.UiM)和阿托品(lpM)力a入器官浴中。通過加入TTX后完全抑制電場刺激(EFS)誘導(dǎo)的收縮，證實其阻斷由腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)介導(dǎo)的收縮的功效。通過加入TTX和阿托品后使用乙酰膽堿，檢驗阿托品阻斷由正好位于回腸平滑肌上的毒蕈石咸受體介導(dǎo)的收縮的功效。TTX和阿托品減弱PK1誘導(dǎo)的早期而不是晚期收縮反應(yīng)。這些結(jié)果提示PK1對回腸縱肌緩慢發(fā)展、持久的收縮作用既不是神經(jīng)介導(dǎo)也非膽^S咸能。其它體內(nèi)結(jié)果(見上文)已經(jīng)證實PKl對大鼠回腸強(qiáng)有力的分泌作用，因此通過測定PKl對無粘膜回腸標(biāo)本的作用，檢驗粘膜受體的刺激釋放一種或多種收縮腸平滑肌的物質(zhì)的設(shè)想。切除回腸粘膜抑制由PKl誘導(dǎo)的緩慢發(fā)展、"晚期"收縮反應(yīng)。(參見圖18)。小分子拮抗劑減弱PKl的刺激作用在本系統(tǒng)中檢驗PK1R的小分子拮抗劑抑制PK介導(dǎo)胃腸平滑肌收縮的能力。結(jié)果的實例如圖19顯示，其中可見JNJ-28845557對PKl誘導(dǎo)大鼠回腸縱向平滑肌的收縮具有濃度依賴性抑制作用。雖然早期和晚期反應(yīng)都被拮抗；然而，與對晚期反應(yīng)的作用相比，化合物更有能力和有效抑制早期反應(yīng)。生物學(xué)實施例4CPK1和PK1受體在鼠類胃腸道組織中的免疫細(xì)胞化學(xué)定位已經(jīng)證明將PK1給予大鼠可刺激液體分泌入腸腔內(nèi)，增加標(biāo)記物在胃腸(GI)道內(nèi)向下的轉(zhuǎn)運(yùn)率；而且，已經(jīng)顯示將PKl應(yīng)用于鼠類(大鼠、小鼠和豚鼠)離體腸段刺激胃腸上皮分泌Cl-離子，導(dǎo)致胃腸平滑肌區(qū)域特異性地收縮或舒張。外源性PKl的這些作用被PKl受體(PK1R)的小分子量拮抗劑抑制。用一系列免疫細(xì)胞化學(xué)實驗確定PK1肽在胃腸道的分布及其在PKIR的作用位點。方法。在家兔中產(chǎn)生抗人PKl肽氨基酸序列CSMDLKNINF和抗大鼠PK1R氨基酸序列DFFSARDGSGAETSP的抗體。用C02窒息處死鼠類，接著采集組織近端胃、遠(yuǎn)端胃、十二指腸、空腸、回腸、近端結(jié)腸和末端結(jié)腸。將組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，浸在4。/。多聚曱醛(w/v)/0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4,室溫)中1-4小時固定。進(jìn)行兩類實驗在第一種系列的實驗中，將完整腸段低溫保護(hù)，接著在4°C浸在30。/。蔗糖(w/v)PBS中固定過^^，然后包埋在OCT(TissueTek)中，-20°C貯存。將OCT包埋的組織片(10-12〖un)用冷凍切片機(jī)切開，融裱在載玻片(VWR"Plus"涂層)上。用PBS沖洗玻片除去切片的OCT，將切片培養(yǎng)在含1%牛血清白蛋白(部分IV,w/v)和0.4%TritonX-100(v/v)的4。/。無免疫性山羊血清(v/v)PBS中阻斷非特異性結(jié)合。應(yīng)用一抗過夜(室溫)，用PBS洗去，然后用熒光分子(AlexaFluor488,MolecularProbes,EugeneOR)4厄合的二抗4小時(室溫)。在第二種系列的實驗中，沿腸系膜邊緣縱向打開小腸和結(jié)腸段，將腸道釘成扁片，粘膜朝上，底部是硅橡膠彈性體平皿(Sylgard,DowCorning,MidlandMI),然后固定(如上文)。固定后，切割扁平的腸賴二得到薄片，全層鋪片由帶附著的腸肌叢(LMMP)或粘膜下層(含粘膜下叢(SMP))的縱向肌組成。將全層鋪片免疫染色(如上文)，然后裝在玻璃載玻片上。用含甘油的抗衰減封固劑(VectaShield,VectorLaboratories,Budingarae,CA)將蓋玻片安裝在切片和全層鋪片上，用落射熒光顯微鏡檢測組織。結(jié)果顯示于圖20和21。結(jié)果。在胃腸組織中檢測到PKl免疫反應(yīng)性(IR)。PKl-IR在胃粘膜中特別明顯(圖20)。PKR1-IR可見于粘膜下(圖21A)和腸肌層(圖21B)神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元。免疫反應(yīng)性似乎呈特異性，因為省略一抗可導(dǎo)致熒光幾乎全部消失。(參見圖21B和21C)。這些數(shù)據(jù)提示腸道是PKl的來源，該肽的受體局限于腸神經(jīng)元。因此，PKl的促分泌和促蠕動作用可部分通過腸神經(jīng)元途徑介導(dǎo)。PKl和PK1受體在鼠類DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的表達(dá)在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中第7天末端結(jié)腸中PKl受體的mRNA沒有增加。(參見圖22)。芥子油誘導(dǎo)的鼠類結(jié)腸炎單次結(jié)腸內(nèi)給予芥子油后2小時，末端結(jié)腸中PK1R的mRNA小量但統(tǒng)計學(xué)上顯著地增加。(參見圖23)。用6小時恢復(fù)至對照水平。這提示PK1R可能在結(jié)腸對芥子油的快速反應(yīng)中發(fā)揮作用。結(jié)腸內(nèi)給予芥子油后6小時，末端結(jié)腸中PK1的mRNA大量、統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。用24小時恢復(fù)至對照水平，提示PK1可能在結(jié)腸對芥子油的快速反應(yīng)中發(fā)揮作用。(參見圖24)。正常大鼠胃腸組織PK1RmRNA最高水平在回腸(肌肉和粘膜)，最低水平在十二指腸和胃，中度水平在末端結(jié)腸(標(biāo)記鹽水的泳道)、空腸和肝。(參見圖25)。在末端結(jié)腸中TNBS誘導(dǎo)后3天末端結(jié)腸的PK1RmRNA水平不變(標(biāo)記TNBS的泳道)。同樣，當(dāng)安裝在Ussing腔并用溶媒(標(biāo)記UC對照的泳道)或霍亂毒素(UC霍亂毒素)處理時，末端結(jié)腸中PK1RmRNA水平不變。PK1mRNA最高水平可見于胃，最低水平可見于十二指腸、空腸和肝，中度水平可見于回腸(肌肉和粘膜)和結(jié)腸。這些數(shù)據(jù)表明胃腸道既產(chǎn)生PK1R也產(chǎn)生PK1，mRNA的穩(wěn)態(tài)水平存在區(qū)域差異。胃內(nèi)高水平PK1提示胃可能產(chǎn)生大量PK1，然后可用于其余胃腸道?；啬c內(nèi)存在配體和受體的mRNA提示可發(fā)生局部旁分泌相互作用的可能性。PK1R敲除小鼠PK1R敲除小鼠(-A)在回腸不表達(dá)PK1RmRNA,但野生型小鼠(+Z+)表達(dá)PKlRmRNA。(參見圖26)。在KO小鼠的回腸中PKlmRNA小量但統(tǒng)計學(xué)上顯著減少。(參見圖27)。這些數(shù)據(jù)證實PK1R基因KO的保真度，提示喪失PK1R可輕微降低回腸中PK1的穩(wěn)態(tài)水平。RNA分離(QiagenRneasy96Plate)RNA購自供應(yīng)商，組織取自室內(nèi)動物模型。將組織樣品貯存在-80。C或4°C的RNALater(Qiagen,ValenciaCA)中待測。除去RNALater,用qiazol(Qiagen)以及不4秀鋼組織研磨珠(4.0mm〉'昆^^求凈由7^-MontrealBiotech,MontrealQueVR替。用RetscliMM300勻漿器(Qiagen)使樣品均勻。加入氯仿和離心后，將水相收集，用70%乙醇混合，倒入QiagenRneasy96Plate的過濾柱中。按照制造商指示最終將樣品在無RNase的水中洗脫。然后按照DnaseFreeDnaseTreatmentKit(Ambion,AustinTX)的制造商指示處理RNA標(biāo)本的DNase。用紫外分光光度法評估RNA量。用TotalNanoRNAEukaryotes方法4企測樣品,通過2100BioanalyzerInstrument(AgilentTechnologies,PaloAltoCA)評估RNA完整性。LiCl沉淀對于DSS處理的樣品，用以下方法。該方法改良自Cathala等(1983)。使RNA標(biāo)本與溶于無RNase水中的無RNase氯化鋰貯備溶液(LiCl,Ambion)混合，得到終濃度為2.5MLiCl。將該混合物在-20。C培養(yǎng)30分鐘，然后在室溫下進(jìn)行。當(dāng)樣品已經(jīng)融化時，將其在4。C以18000rcf離心15分鐘。吸出液體，將片狀沉淀物用lml冰凍700/。乙醇洗滌。再一次將樣品在4°C以18000rcf自轉(zhuǎn)15分鐘。再次洗滌和自轉(zhuǎn)樣品，然后風(fēng)干約15分鐘。使片狀沉淀物再懸浮于無RNase的水中。然后用光密度讀數(shù)計算RNA量，每個樣品讀取3次。TaqManRealTimeRT-PCR將HighCapacitycDNAArchiveKit(AppliedBiosystems,FosterCityCA)以1(v/v)加入先稀釋至250ng/ul的每個RNA樣品內(nèi)。在37。C將混合物培養(yǎng)2小時。然后將樣品以15.625x的系數(shù)稀釋，以便可以每孔5ul將8ng/ulcDNA裝入384孔光學(xué)讀板器內(nèi)。引物/探針由2xRT-PCRMasterMix(AppliedBiosystems)組成，+，7ul該;容液加入各孔內(nèi)，然后用7900FastRealTimePCRSystem(AppliedBiosystems)4企測該4反。Taqman引物/探針是購自AppliedBiosystems的商品。用每種測試探針檢測樣品3次。雖然以上說明書指出了本發(fā)明的原理，出于例證目的提供了實施例，但應(yīng)理解本發(fā)明的實施包括本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的所有常規(guī)變更、改編和/或修飾。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)腸上皮功能的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)PK1受體活性。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述腸上皮功能是粘膜離子分泌。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述粘膜離子分泌是Cl-離子轉(zhuǎn)運(yùn)。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸上皮功能是液體轉(zhuǎn)運(yùn)。5.權(quán)利要求1的方法，其中通過抑制所述PK1受體抑制所述腸上皮功能。6.權(quán)利要求1的方法，其中通過激活所述PK1受體激活所述腸上皮功能。7.—種鑒定PK1受體調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括使含PK1受體的標(biāo)本與一種或多種候選化合物接觸，鑒定調(diào)節(jié)所述PK1受體活性的化合物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述標(biāo)本是腸粘膜標(biāo)本。9.權(quán)利要求7的方法，其中測定所述化合物調(diào)節(jié)PK1受體信號傳導(dǎo)的能力。10.權(quán)利要求9的方法，其中通過監(jiān)測短路電流(Isc)測定PK1受體信號傳導(dǎo)。11.權(quán)利要求9的方法，其中通過監(jiān)測Cl-離子轉(zhuǎn)運(yùn)測定PK1受體信號傳導(dǎo)。12.—種鑒定調(diào)節(jié)PK1受體活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將待測化合物緩沖液應(yīng)用于回腸粘膜；b)測定PKl受體的活性；c)重復(fù)步驟a)和b)，但省略緩沖液中的待測化合物；和d)將步驟b)與步驟c)得到的結(jié)果相比。13.權(quán)利要求12的方法，其中通過測定cr離子轉(zhuǎn)運(yùn)確定所述活性。14.權(quán)利要求12的方法，其中通過測定短路電流(Isc)確定所述活性。15.—種鑒定降低PK1受體活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將待測化合物緩沖液應(yīng)用于回腸粘膜；b)將PKl或其功能同等物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；c)測定PKl受體的活性；d)重復(fù)步驟a)、b)和c),但省略緩沖液中的待測化合物；和e)將步驟c)與步驟d)得到的結(jié)果相比。16.—種PK1受體活性的功能測定法，所述功能測定法包括測定短路電流(Isc)的步驟。17.—種PK1受體活性的功能測定法，所述功能測定法包括測定cr離子轉(zhuǎn)運(yùn)的步驟。18.—種減輕和/或治療有需要的哺乳動物腸道炎癥的方法，所述方法包括給予哺乳動物PK1拮抗劑，其中腸道炎癥被減輕。19.一種減輕和/或治療有需要的哺乳動物腸道炎癥的方法，所述方法包括給予哺乳動物PK1拮抗劑，其中腸道炎癥被減輕，其中拮抗劑是式(I)化合物及其對映體、非對映體、互變異構(gòu)體、溶劑合物和藥學(xué)上可接受的鹽式(I)其中:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>A,是氫、芳基、雜芳基、&.8環(huán)烷基或雜環(huán)基，前提是A,不同于哌啶-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-曱基-哌啶J-基；其中不同于氫的A,的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C,—6烷基、羥基(C,—6)烷基、q—6烷氧基、鹵素、硝基、鹵代C,—6烷基、鹵代Cw烷氧基、C,.e烷硫基、Cw烷氧基羰基、氨基、CV6烷基氨基、二(C,—6烷基)氨基、氰基、羥基、氨基羰基、C,—6烷基氨基羰基、二(C^6烷基)氨基羰基、C^烷氧基羰基氨基、C^烷基羰基、C"6烷硫基羰基、曱?；?、C^烷基磺?；卜6烷基磺?；被被酋；,.6烷基氨基磺?；投?C"6烷基)氨基磺酰基；L,是-(CH2),-或-CH2CH2X(CH2)。任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C^烷基、C^鏈烯基、C2—6炔基和卣素；前提是當(dāng)A,是氫時，r大于或等于4;r是整數(shù)l-5;s是整數(shù)l-3;X是O或S;D是-P-八2;八2是氫、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的雜芳基或者C3.8環(huán)烷基；其中苯基任選在間位或?qū)ξ弧⒉煌跉浜捅交陌?的取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代C"6烷基、C卜6烷氧基、鹵素、鹵代C^烷基、鹵代C,—6烷氧基、芳基(CV6)烷氧基、苯基、C"6烷硫基、Cb6烷氧基羰基、氨基、C,—6烷基氨基、二(C"6烷基)氨基、氰基、羥基、硝基、C"6烷基羰基、Cw烷硫基羰基、氨基羰基、C"6烷基氨基羰基、二(Cw烷基)氨基羰基、Cw烷基羰基氨基和非稠合的C3.6環(huán)烷氧基；前提是至多兩個A2上的取代基是芳基(C,—6)烷氧基、苯基或非稠合的C3—6環(huán)烷氧基；前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L2是其中X1是NH的-X1(CH2)2-時，A2不同于未被取代的苯基、被芳基(C^)烷氧基或苯基取代的苯基、或者在間位被氰基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是未被取代的苯基且L^是其中X,是NH的-Xi(CH》3-時，A2不同于被甲氧基取代的苯基；前提是當(dāng)A,是3,4-二氯-笨基且P是-CtV時，八2不同于在間位被三氟曱基或三氟甲氧基取代的苯基；進(jìn)一步的前提是當(dāng)A,是3，4-二氯-苯基且P是-(CH》2-時，A2不同于4-曱氧基-苯基；另夕卜，當(dāng)A2是氫時,P是-(CH2)4—6-,當(dāng)A2不同于氳時，P是-(CH2)w或-CH2X2-;W是N或CH;L2是選自下列的二價基團(tuán)通過氮原子與式(I)的三嗪環(huán)連接的吡咯烷基或哌啶基，其中所述吡咯烷基或哌啶基在碳原子上被-(CH》?！?-取代；-NH-C5-7環(huán)烷基-((^2)0.2-，條件是當(dāng)C5—7環(huán)烷基是環(huán)己基時，Q在相對于-NH-位置的2-或順式-4-位連接；■XrC^坑基-;KCHA—3-X2偶),-3-;-X2-(CH2)0—4-;-xi(CH2)2-3-X3-(CH2)2-3-;-NH(CH2)MC(=0)-，前提是至少一個Rb、『或Rd不是氫且m是0;-NHC(=0)-(CH2)M-;和-X,CH(Rx)畫(C踐y)卜5-;其中X,是-NH-或直接鍵；X2是-CH-CH-;Xg是0、S、NH或C-O;Rx和Ry獨立是H或CM烷基；前提是任何情況下L2的長度都不超過7個原子；Q是-(O)mN(Ra)-G;m是0或1;G是-C(-NRb)NRCRd;Ra和Rd獨立是氫、C^烷基、(:2.6鏈烯基或C3，6炔基，其中不同于氫的『和Rd的取代基任選^皮1-3個獨立選自下列的取代基取代羥基、Cm坑氣基、氟、氨基、cm烷基氨基、二c—4烷基氨基和cm烷基羰基；或者Ra和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Rb是氫、C"6烷基、c2—6鏈烯基、c3-6炔基、02-6烷氧基羰基或氰基；或者Rb和Re與它們連接的原子結(jié)合一起形成被氧代任選取代的5-8元單環(huán)；Re是氫、C,.,。烷基、C謁鏈烯基、Cw。炔基、Cw環(huán)烷基、金剛烷基、氨基、CV6烷基氨基、二(Cw烷基)氨基、C,—6烷基羰基、C,.6烷氧基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；其中C,.,。烷基、C^。鏈烯基和C^。炔基任選被1-3個獨立選自羥基、C,.e烷氧基、三氟曱基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基取代；其中任何含芳基或雜芳基的『取代基任選被1-3個獨立選自下列的取代基取代Cw烷基、C,—6烷氧基、鹵素、氟代C卜6烷基、氟代C"6烷氧基、CV6烷基羰基、&.6烷氧基羰基、氨基羰基、Cw烷基氨基羰基、二(<^.6烷基)氨基羰基、C,—6烷氧基羰基氨基、曱?；^烷基磺?；?、c^烷基磺?；被?、氨基磺?；?、c^烷基氨基磺酰基和二(Cw烷基)氨基磺?；⑾趸?、曱硫基、輕基和氰基；或者『和Rd與它們連接的原子結(jié)合一起形成5-8元單環(huán)，環(huán)內(nèi)任選含有1-2個O或S雜原子，所述環(huán)j壬選被氧代取代；前提是在任何情況下，只有一個環(huán)任選存在于Ra和Rb、Rb和Rc或者Re和Rd之間。20.權(quán)利要求19的方法，其中炎癥是慢性的。21.權(quán)利要求19的方法，其中炎癥是散發(fā)性的。22.權(quán)利要求19的方法，其中炎癥是腸易激綜合征的癥狀。23.權(quán)利要求19的方法，其中炎癥是炎性腸病的癥狀。24.權(quán)利要求23的方法，其中炎性腸病是潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。25.—種刺激腸腔內(nèi)液體分泌的方法，所述方法包括給予PK1。26.—種刺激腸腔內(nèi)液體分泌的方法，所述方法包括給予PK1受體激動劑。27.—種抑制腸腔內(nèi)液體分泌的方法，所述方法包括給予PK1拮抗劑。28.—種刺激腸道推進(jìn)的方法，所述方法包括給予PK1。29.—種刺激腸道推進(jìn)的方法，所述方法包括給予PK1受體激動劑。30.—種抑制腸道推進(jìn)的方法，所述方法包括給予PK1拮抗劑。31.—種刺激COX的方法，所述方法包括給予PK1。32.—種刺激COX的方法，所述方法包括給予PK1受體激動劑。33.—種抑制COX的方法，所述方法包括給予PK1受體拮抗劑。全文摘要本發(fā)明涉及具備PK1受體調(diào)節(jié)劑功能的化合物，特別是一類有效和選擇性的PK1受體拮抗劑?；衔锟捎米鞑溉閯游颬K1受體的有效和選擇性拮抗劑，可用作由PK1受體活性導(dǎo)致的哺乳動物疾病的治療劑。文檔編號A61P1/04GK101252934SQ200680017645公開日2008年8月27日申請日期2006年3月15日優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日發(fā)明者J·M·帕爾默,J·R·馬布斯,P·J·霍恩比,P·R·瓦德,S·M·普羅蒂申請人:詹森藥業(yè)有限公司