專利名稱：：一種具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的化合物組合物的制作方法一種具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的化合物組合物發(fā)明背景I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的化合物組合物及其制備方法。本發(fā)明涉及一種提高哺乳動物體內(nèi)II型酶誘導(dǎo)物和抗氧化酶化學(xué)保護(hù)量的方法。本發(fā)明涉及一種抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成的方法。本發(fā)明還涉及一種從十字花科植物中制備異硫氰酸酯和有機(jī)硒的方法。II.背景流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，富含水果和蔬菜的飲食可降低多種癌癥的發(fā)病率。在眾多紛繁復(fù)雜的植物中，十字花科植物具有非常突出的抗癌作用。這主要是因?yàn)槭只浦参锖写罅康目寡趸镔|(zhì)和某些可以調(diào)節(jié)致癌因子代謝的化合物。已經(jīng)有大量的研究工作證實(shí)十字花科植物中的化學(xué)物質(zhì)，硒、異硫氰酸酯(isothiocyanates)在十字花科植物的抗癌作用占據(jù)主導(dǎo)地位。十字花科植物中廣泛含有硒元素。硒元素是人體生長所必需的，在人和動物體內(nèi)起抗氧化作用，保護(hù)心血管和心肌的健康。硒和金屬有很強(qiáng)的親和力，是一種自然的對抗重金屬的解毒劑，也可降低黃曲霉菌的毒性。此外，硒元素還有保護(hù)視覺器官的健全功能，刺激免疫球蛋白及抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體對疾病的低抗力等。實(shí)驗(yàn)^^明，補(bǔ)充硒有預(yù)防一系列化學(xué)致癌物誘發(fā)腫瘤的作用。硒通過抵抗氧化損傷、抑制轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控癌基周、防止腫瘤蛋白合成、刺激細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)肌體免疫系統(tǒng)(包括細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫)，拮抗化學(xué)致癌物質(zhì)，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)等機(jī)制來抑制腫瘤的發(fā)生。十字花科的植物含有大量的硫代葡萄糖苷，已經(jīng)有1OO多種硫代葡萄糖苷從十字花科植物中發(fā)現(xiàn)。若植物細(xì)胞發(fā)生破損，硫代葡萄糖苷水解酶，即硫代葡萄糖苦酶(myrosinase,thioglucosideglucohydrolase;EC3.2.23.1)被釋放出來，并水解硫代葡萄糖苷，生成硫酸氫鹽、葡萄糖和一系列葡萄糖苷配基，這些配基在經(jīng)過分子內(nèi)的重排形成異硫氰酸酯。異硫氰酸酯的生理功能1、抑制腫瘤的形成大量實(shí)驗(yàn)證明，異硫氰酸酯對食道癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等都有很好的防治效果。2、抗氧化功異硫氰酸酯并不是直接行使功能的抗氧化劑，這是由于異硫氰酸基團(tuán)不可能在生理?xiàng)l件下參與氧化或還原反應(yīng)。然而，越來越多的證據(jù)表明異硫氰酸酯卻可以間接增加動物細(xì)胞的抗氧化能力。3、提高組織的谷胱甘肽水平異硫氰酸酯會激發(fā)位于y-glutamylcysteine合成酶基因5，端上游區(qū)的抗氧化響應(yīng)因子，乂人而促4吏y-glutamylcysteine合成酶的合成。該酶是谷胱甘肽合成中的限速步驟，該酶的增加可以導(dǎo)致機(jī)體合成大量的谷胱甘肽。4、調(diào)節(jié)一幾體酶的組成；異硫氰酸酯可以抑制細(xì)胞合成I型酶(如細(xì)胞色素P450)，誘導(dǎo)細(xì)胞合成II型解毒酶(如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、NAD(P)H-醌還原酶、血紅素氧化酶)，使細(xì)胞免受活性氧的攻擊。目前已報道的方法中，有些在可以使硫代葡萄糖苷酶變性或失活的溫度下處理十字花科的植物，從而大多數(shù)硫代葡萄糖苷無法被水解生成異硫氰酸酯，并通過此方法制作含有硫代葡萄糖苷的制品。在人體內(nèi)硫代葡萄糖苷只有很少的部分可轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲蚯杷狨?。已?jīng)證實(shí)硫代葡萄糖苷不是哺乳動物n型酶的誘導(dǎo)物，而且硫代葡萄糖普可以顯著的誘導(dǎo)I型酶，并產(chǎn)生大量的活性自由基，從而對人體健康造成傷害(參見Perocco等人，MutationResearch,595,(2006),125-136)。有些方法在高溫下將十字花科植物的硫代葡萄糖苷酶變性或失活后，加入外源的硫代葡萄糖苷酶將硫代葡萄糖苷水解生成異硫氰酸酯，卻將十字花科植物中同樣具有高效生物保護(hù)活性的硒棄置不用，不但造成極大的浪費(fèi)，而且必將顯著降低這些制品的療效。因此，在本領(lǐng)域中需要確定將對人體健康造成傷害的硫代葡萄糖苷最大限度的轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲蚯杷狨?，以及去除硫代葡萄糖苷增加異硫氰酸酯的十字花科植物提取物的制備方法，需要確定以十字花科植物制備含硒提取物的方法，也需要確定異硫氰酸酯與有機(jī)硒同時給藥是否產(chǎn)生協(xié)同作用，減少給藥劑量和降低毒副作用，同樣需要確定以十字花科植物制備含硒和異硫氰酸酯的制備方法。此外，高含量的硫代葡萄糖苷會抑制并顯著減少十字花科植物積累有機(jī)竭，同樣高含量的有機(jī)竭會抑制并顯著減少十字花科植物合成硫代葡萄糖芬(Keck和Finley，F(xiàn)oodandChemicalToxicology,44，(2006)695-703)。因此，還需要確定添加外源的硒和/或化學(xué)合成的異硫氰酸酯的化合物組合物的制備方法。發(fā)明要點(diǎn)本發(fā)明的目的是提供富含化學(xué)保護(hù)、防癌、抗癌的化合物組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供含有大量II型酶誘導(dǎo)物和抗氧化酶誘導(dǎo)物而基本上沒有I型酶誘導(dǎo)物的化合物組合物。本發(fā)明還有一個目的是提供含有大量抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成的化合物組合物。這些目的以及其他目的可通過制備具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的組合物來實(shí)現(xiàn)，其中包括治療劑量的異硫氰酸酯和有機(jī)硒。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有大量n型酶誘導(dǎo)物和抗氧化酶誘導(dǎo)物而基本上沒有i型酶謙導(dǎo)物的化合物組合物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種含有大量抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成的化合物組合物。本發(fā)明的實(shí)施例提供了在適當(dāng)?shù)膭┝亢团浔?，異硫氰酸酯和硒共同作用與機(jī)體和腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生協(xié)同的治療和預(yù)防作用。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有大量異硫氰酸酯的化合物組合物?；参锇ㄊ只浦参锏姆N子、芽苗、花、莖、葉和根，或其中任何組織的組合。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有大量異硫氰酸酯十字花科植物提取物的方法，方法包括十字花科植物粉碎后，加水水解，水解可通過內(nèi)源或外源的硫代葡萄糖苷酶來進(jìn)行，并采用無毒溶劑進(jìn)行提取。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯的方法，采用C02超臨界工藝制備異硫氰酸酯提取物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯的方法，將十字花科植物的無毒溶劑提取物經(jīng)硅膠柱除雜、吸附、洗脫，獲得高純度的異硫氰酸酯提取物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯的方法，將十字花科植物的無毒溶劑提取物用水或低濃度乙醇溶液溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、除雜、洗脫，獲得高純度的異硫氰酸酯提取物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯方法，采用分子蒸餾技術(shù)純化，獲得高純度的異硫氰酸酯提取物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供一種從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯的方法，采用ds反相制備柱技術(shù)純化，獲得高純度的異硫氰酸酯提取物。本發(fā)明還有一個實(shí)施例^是供一種含有有才幾石西的化合物組合物?；衔锝M合物的生產(chǎn)是通過制備十字花科植物的提取物來實(shí)現(xiàn)。所用的十字花科植物包括十字花科植物的種子、芽苗、花、莖、葉和根，或其中任何組織的組合。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有有機(jī)硒的十字花科植物提取物的方法。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有有機(jī)硒的十字花科植物提取物中添加天然或化學(xué)合成的異硫氰酸酯化合物組合物及其制備方法。本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供一種含有異硫氰酸酯的十字花科植物提取物中添加有機(jī)硒的化合物組合物及其制備方法。本發(fā)明還有一個實(shí)施例提供了一種制備異硫氰酸酯與HP-(3-環(huán)糊精包合物的方法。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)可從實(shí)例明顯看出。然而，應(yīng)當(dāng)理解表述本發(fā)明較佳實(shí)施方案的詳細(xì)說明和具體實(shí)施例只是用于描述，因?yàn)楦鶕?jù)這些詳細(xì)描述在本發(fā)明的范圍和思路內(nèi)所作的各種變化和改進(jìn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，這種變化或這樣的改進(jìn)并不意味是對本發(fā)明的限制。參考權(quán)利要求書，來確定本發(fā)明的全部范圍。具體實(shí)施例實(shí)施例1含有異硫氰酸酯的十字花科植物提取物的制備將十字花科植物的種子、芽苗、花、莖、葉或根粉碎，加入5倍pH值為7.0的Na2HP04-檸檬酸緩沖液，水解2小時。將得到的水解液，加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯提取液，減壓蒸餾，回收乙酸乙酯后，得到十字花科植物的粗提物。硫代葡萄糖苷在十字花科植物中的含量變化很大，不同品種、不同生長環(huán)境以及同一植株的不同生長階段、同一植抹的不同部位含量都存在差別。以青花菜為例，不同部位的青花菜植物組織經(jīng)乙酸乙酯提取后，萊菔硫烷(sulforaphane,l-異硫氰基-4R-[曱基亞硫?；鵠丁烷)在提取物中的含量見表l。如上所制得的十字花科植物的粗提物中萊菔硫烷的含量采用高效液相色鐠測定。色i普柱為反相C,8柱，流動相為乙腈和水，柱溫為30。C，檢測波長為254nm,流速l.Oml/min,進(jìn)樣量為10jul，采用梯度洗脫，從20°/。的乙腈20min內(nèi)升至100%的乙腈。從表l可以看出異硫氰酸酯在十字花科植物不同部位的含量存在較大差別。表l萊菔硫垸在不同青花菜植物組織提取物中的百分含量(n=3)青花菜植物組織萊菔硫烷在提取物中的百分含量a)種子5.6±0.2芽苗6.5±0.5花2.3±0.8莖0.91±0.03葉0.85±0.06根0.35±0.09實(shí)施例2將實(shí)施例1得到的十字花科植物提取物經(jīng)硅膠除雜，再用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液溶解，經(jīng)硅膠吸附后，再用乙酸乙酯洗去硅膠上吸附的低極性雜質(zhì)，最后用乙醇洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，減壓蒸餾以除去有機(jī)溶劑，得到純化的異硫氰酸酯產(chǎn)品o以青花菜種子為例，稱取100g青花菜種子，研磨成粉末狀，加入500mlpH值為7.Q的Na2HP0廠檸檬酸緩沖液,水解2小時。水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，離心，收集乙酸乙酯，重復(fù)此步驟3次，將三次的乙酸乙酯相混合，經(jīng)5克IOO-200目的硅膠吸附極性雜質(zhì)后，減壓蒸餾濃縮為黃褐色油狀的萊菔硫烷粗產(chǎn)品，含量為15.52°/。。得到的萊菔硫烷粗產(chǎn)品溶解于600ml體積比為8:2的石油醚和乙酸乙酯溶液，經(jīng)30克100-200目的硅膠吸附后，再用100ml乙酸乙酯除雜，最后用300ml乙醇洗脫萊菔硫烷，減壓蒸餾回收乙醇，純度為54.2%。如上所制得的產(chǎn)品中萊菔硫烷的含量釆用實(shí)施例1中的高效液相色鐠測定。實(shí)施例3采用大孔吸附樹脂層析技術(shù)從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯產(chǎn)品將實(shí)施例1得到的十字花科植物提取物用去離子水或10%乙醇水溶液溶解，用等體積的石油醚脫出低極性雜質(zhì)，水相經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后，再用水洗去極性雜質(zhì)，最后用乙醇水溶液洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，減壓蒸餾回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取目標(biāo)產(chǎn)物，減壓蒸餾回收乙酸乙酯，得到純化的異硫氰酸酯產(chǎn)品。以青花菜種子為例，稱取100g青花菜種子，研磨成粉末狀，加入SOOmlpH值為7.M々Na2HP04-檸檬酸緩沖液,水解2小時。水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，離心，收集乙酸乙酯，重復(fù)此步驟3次，將三次的乙酸乙酯相混合，減壓蒸餾濃縮為黃褐色油狀的萊菔石克烷凈且產(chǎn)品，含量為5.52%。；彈到的萊菔好u烷并且產(chǎn)品溶解于1000ml去離子水，用等體積的石油醚脫脫脂3次，脫脂后的水相經(jīng)50mlSP825大孔吸附樹脂吸附后，再用100ml去離子水除雜，最后用600ml65%乙醇水溶液洗脫萊菔硫烷，減壓蒸餾回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取萊菔硫烷3次，減壓蒸餾回收乙酸乙酯，純度為65.2%。如上所制得的產(chǎn)品中萊菔硫烷的含量釆用實(shí)施例1中的高效液相色i普測定。實(shí)施例4采用分子蒸餾技術(shù)從十字花科植物提取物中純化異硫氰酸酯產(chǎn)O將實(shí)施例2或?qū)嵤├?得到的十字花科植物提取物采用分子蒸餾技術(shù)精制，可得到高純度的異硫氰酸酯產(chǎn)品。以青花菜種子為例，經(jīng)實(shí)施例2或?qū)嵤├?得到的萊菔硫烷產(chǎn)品，利用刮膜式短程蒸餾設(shè)備提純?nèi)R菔硫烷工藝條件是進(jìn)料速率250ml/h，操作壓力O.1Pa,蒸餾溫度136。C，攪拌速度130r/min。應(yīng)用刮膜式分子蒸餾設(shè)備對萊菔硫烷粗產(chǎn)品原料進(jìn)行提純，經(jīng)過三級分離操作就可以將原料中的萊菔硫烷的純度提高到85°/。以上。如上所制得的產(chǎn)品中萊菔硫烷的含量采用實(shí)施例l中的高效液相色語測定。實(shí)施例5高純度的異硫氰酸酯產(chǎn)品的制備以青花菜種子為例，取種子100g,烘干，粉碎，脫油后的粉末加80%乙醇室溫攪拌萃取，固液比l:10，萃取2h，分離乙醇萃取液，重復(fù)提取3次，合并乙醇萃取液，回收乙醇，萃取物加水調(diào)濃度為lg生藥/ml,上AB-8大孔吸附樹脂，用60%的乙醇洗脫目標(biāo)硫苷，回收乙醇，加外源的蘿卜種子粗提黑芥子酶0.5g，5倍體積水?dāng)嚢鑜h，室溫水解。水解產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，3(TC減壓回收乙酸乙酯，得粗萊菔硫烷提取物，得率8.33%。裝入C02流體超臨界萃取釜萃取，溫度37。C，壓力20MPa，所得萊菔硫烷提取物含量80.61%。如上所制得的產(chǎn)品中萊菔硫烷的含量采用實(shí)施例1中的高效液相色語測定。實(shí)施例6采用(:18反相制備柱精制異疏氰酸酯產(chǎn)品取實(shí)施例5所得萊菔硫烷1.Og，50ml用10y。甲醇水溶液溶解，經(jīng)O.45lam膜過濾，濾液用ds反相制備柱(30cmx4.5cm)分離，25%甲醇-水系統(tǒng)洗脫，檢測波長254nm，收集含萊菔硫烷的組分，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取三次，減壓回收乙酸乙酯，得720mg萊菔硫烷純品，含量98.21%。如上所制得的產(chǎn)品中萊菔硫烷的含量采用實(shí)施例1中的高效液相色譜測定。實(shí)施例7十字花科植物提取異硫氰酸酯后有機(jī)硒的回收以含硒的青花菜種子為例，經(jīng)實(shí)施例l提取異硫氰酸酯的青花菜種子為原料在pH9的水溶液浸提3次，每次浸提50min,固液比l:10,浸提溫度50。C的條件下，離心合并上清液，用截留分子量5000u的超濾膜超濾，取截留液冷凍干燥，制備得含硒產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量達(dá)83.37%,產(chǎn)品中硒的含量ll.5mg/kg。實(shí)施例8用本發(fā)明化合物組合物制備藥物顆粒劑取按實(shí)施例7制得硒代蛋白質(zhì)4.35kg(含硒元素50.OOmg)，取按實(shí)施例3所得萊菔硫烷提取物76.70g(含萊菔硫烷50.OOg),溶于含食用植物色素的95%的乙醇100-200ml中，將乙醇溶液噴灑在573.50g糊精上，充分混勻,再將含萊菔硫烷提取物的糊精加入到植物有機(jī)硒提取物中，充分?jǐn)嚢柚令伾鶆颍?5%的乙醇制顆粒，晾干，分裝成每袋重5.Og的顆粒劑1000袋。實(shí)施例9用本發(fā)明化合物組合物制備膠嚢劑取按實(shí)施例5制得的萊菔硫烷提取物62.03g(含萊菔硫烷50g),取藥用級硒代蛋氨酸(含量99%)2QG.75mg(含硒元素8Gmg)。將20Q.72mg硒代蛋氨酸加適量食用色素拌勻，用倍比遞增法與237.77g糊精混勻，再將硒代蛋氨酸糊精分次加入62.03g萊菔石危烷中，充分?jǐn)嚢柚令伾鶆颍?5%的乙醇制顆粒，晾干，用2號空心膠嚢，分裝成每粒重O.3g的膠嚢劑1000粒。實(shí)施例IO用本發(fā)明化合物組合物制備HP-P-環(huán)糊精包和物取按實(shí)施例6制得的高純度的萊菔硫烷10g,采用低溫飽和水溶液法按萊菔硫烷HP-p-環(huán)糊精-1:IO的比例進(jìn)行包合。萊菔硫烷溶于乙醇，HP-p-環(huán)糊精制成飽和水溶液，將萊菔硫烷乙醇溶液逐滴加入HP-P-環(huán)糊精飽和水溶液，攪拌2h,靜置，用O.45Mm微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得白色疏松的萊菔硫烷與HP-P-環(huán)糊精包合物，包合率為86%。實(shí)施例ll用本發(fā)明化合物組合物制備凍干粉針取實(shí)施例10法制備的萊菔硫烷與HP-(3-環(huán)糊精包合物580g(含萊菔硫烷50g),取藥用級硒代蛋氨酸(含量99%)62.7mg(含硒元素25.Omg),加注射用水溶解，調(diào)pH5-6,用O.22jam的微孔濾膜過濾，溶液注入西林瓶中，冷凍干燥，封口，制得凍干粉針iooo支。實(shí)施例12謙導(dǎo)11型解毒酶和抗氧化酶活性的比較誘導(dǎo)物活性是衡量化合物誘導(dǎo)n型解毒酶和抗氧化酶活性的能力的量度。在本發(fā)明中，誘導(dǎo)II型解毒酶活性是用鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的醌還原酶(Quinonereductase,QR)活性的生物測定法來測定的，誘導(dǎo)抗氧化酶活性是用鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的硫氧還蛋白酶(Thioredoxinreductase,TR)活性的生物測定法來測定的。鼠肝癌細(xì)胞Hepalclc7培養(yǎng)在一個恒溫的C02(C02濃度5W培養(yǎng)箱中24小時，箱內(nèi)溫度37°C，培養(yǎng)基為加了10%胎牛血清(FCS)、鏈霉素、青霉素的cc-MEM培養(yǎng)基。將本發(fā)明的化合物組合物用O.9%生理鹽水稀釋成所需濃度的樣品加入培養(yǎng)基，再培養(yǎng)細(xì)胞24小時，測定誘導(dǎo)QR和TR的活性(QR活性的測定方法參見Prochaska和Santamaria，Anal.Biochem.169:328-336(1988),TR活性的測定方法參見Holmgren和Bjornstedt,MethodsEnzymol.252,199-208(1995)和Hill等人，Biochem,Biophys.Res.Commun.234,293-295(1997))。表2誘導(dǎo)n型解毒酶和抗氧化酶活性的比較(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注樣品A不含有硒(Se)和萊菔硫烷，樣品B含O.5uM硒(Se)和luM萊菔硫烷(SFN)。從表2中可以看出，誘導(dǎo)醌還原酶(QR)活性和硫氧還蛋白酶(TR)活性是制劑中的Se和異硫氰酸酯(SFN)而獲得的。因此，制劑中的硒和異疏氰酸酯是所必需的。實(shí)施例13抑制人肺腺癌A549細(xì)胞生長并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡將對數(shù)生長期人肺腺癌A549細(xì)胞接種與24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h，吸取上清液，加入擬定濃度的本發(fā)明化合物組合物的培養(yǎng)液，設(shè)實(shí)驗(yàn)對照孔(0.5°/。DMS0+細(xì)胞)。在培養(yǎng)24、48h,更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，曱醛固定，Giemsa染色，鏡下計(jì)數(shù)每孔>50個細(xì)胞以上的集落數(shù)目，計(jì)算集落形成抑制率，抑制率(％)=(1-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)/對照組集落數(shù))xioo%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。采用流式細(xì)胞術(shù)，取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5xl05/ml,接種于24孔培養(yǎng)板中每孔2ml，實(shí)驗(yàn)組分別加入擬定濃度的的本發(fā)明化合物組合物的培養(yǎng)液，對照組加PBS,C02賻箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h,分別收集各組細(xì)胞，(每組細(xì)胞數(shù)〉lx106),力口70。/。的乙醇500ul固定，4'C過夜，PBS洗滌，離心后細(xì)胞沉淀中加入PI染色液O.5ml，上機(jī)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果見表4。從表3、表4的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，本發(fā)明化合物組合物可顯著抑制人肺腺癌A549細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性，且異硫氰酸酯與有機(jī)硒在一定的比例范圍內(nèi)，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。表3本發(fā)明化合物組合物對人腫腺癌A549細(xì)胞集落形成的抑制作用(S±s，n=3)組別抑制率(％)24h48h72h000Se60.0nM5.9215.4421.35SFN6.25uM18.6533.1245.7912.5uM34.2158.8267.4125.0iiM50.3264.1578.3250.0uM62.7374.6985.51SFN6.25uM+Se60nM38.7660.2974.53SFN12.5liM+Se60nM68.3587.92100.0SFN25.0M+Se60nM90.12l()O.0100.0表4發(fā)明化合物組合物對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡率的影響(I±s，n=3)組別凋亡率(％)對照組1.05±0.31實(shí)驗(yàn)組Se60.0nM3.18±1.16SFN12.5uM7.03±1.72SFN25.0uM22.77±4.14SFN50.037.45±4.82SFN12.5+Se60nM18.57±3.07SFN25.0nM+Se6024.19±4.61SFN50.0uM+Se60nM48.73±4.28實(shí)施例14對小鼠S180實(shí)體瘤的抑制作用取昆明小鼠50只(18-22g,雌雄各半)，按移植性腫瘤研究法接種S180實(shí)體型瘤在無菌操作下取瘤塊，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后放入無菌容器內(nèi)加生理鹽水稀釋成l:3的瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為(1~2)xio7/mi，每次抽吸前將細(xì)胞混勻，每只小鼠有前肢腋窩皮下接種O.2tnl(含活細(xì)胞數(shù)lx107)，24h后稱重，隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組10只動物。各組小鼠體重?zé)o顯著差異。模型組給等體積蒸餾水，給藥組用實(shí)施例10制得的萊菔硫烷與PH-(3-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按擬定劑量配制水溶液，灌胃給藥。連續(xù)給藥12天，停藥次日處死動物，稱體重并剝離皮下瘤塊，稱瘤體重量，計(jì)算腫瘤抑制率，瘤重抑制率％=[(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組的平均瘤重]x100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5本發(fā)明化合物組合物對小鼠s^a,肉瘤的作用G±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表5的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，本發(fā)明化合物組合物可明顯抑制移植性腫瘤S180實(shí)體型瘤的生長，并呈劑量依賴性。實(shí)施例15本發(fā)明藥物對人肺腺癌A549肺癌實(shí)體瘤的抑制作用取C57BL/6小鼠50只，接種小鼠人肺腺癌A549肺癌實(shí)體瘤，將人肺腺癌細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇擴(kuò)增，用注射器抽取癌細(xì)胞懸浮液接踵于棵鼠前腋部皮下，每個部位接種O.2ml，(含活細(xì)胞數(shù)lx107)，24h后稱重，隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組10只動物。各組棵鼠體重?zé)o顯著差異。模型組給等體積蒸餾水，給藥組按實(shí)施例IO制得的萊菔硫烷與PH-P-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按擬定劑量配制水溶液，灌胃給藥。連續(xù)給藥12天，停藥次日處死動物，稱體重并剝離皮下瘤塊，稱瘤重量，計(jì)算腫瘤抑制率，瘤重抑制率°/。=[(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組的平均瘤重]x100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。表6本發(fā)明化合物組合物對小鼠人肺腺癌A549實(shí)體瘤的作用(；±s，n=10)組別劑量瘤重(g)抑瘤率(％)模型組N.S1.38±0.45/給藥組SFN75mg/kg0.62±0.1655,07SFN50mg/kg1.02±0.2126.09SFN75mg/kg+Se1.0mg/kg0.38±0.1372.46SFN50mg/kg+Se1.0mg/kg0.76±0.2844.92從表6的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，本發(fā)明化合物組合物可明顯抑制移植性腫瘤人肺腺癌A549肺癌實(shí)體瘤的生長，并呈劑量依賴性。實(shí)施例16對小鼠艾氏腹水癌(EAC)的生命延長作用取昆明小鼠50只(18-22g，雌雄各半)，按腹水瘤移植接種常規(guī)方法接種小鼠艾氏腹水癌(EAC)。取出小鼠接種后第57天的腹水，用生理鹽水稀釋到細(xì)胞數(shù)為lx107/ml,然后給小鼠腹腔常規(guī)接種腹水癌細(xì)胞液。24h后隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組10只動物。各組棵鼠體重?zé)o顯著差異。模型組給等體積蒸餾水，給藥組按實(shí)施例10制得的萊菔硫烷與PH-(3-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按擬定劑量配制水溶液，灌胃給藥或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥12天，停藥，稱體重。而后正常飼養(yǎng)，觀察各組小鼠生存天數(shù)，觀察時間為60天，計(jì)算生命延長率，生命延長率(％)=[(給藥組平均生存天數(shù)-模型組平均生存天數(shù))/模型組的平均生存天數(shù)]xioo%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。從表7的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，本發(fā)明化合物組合物對小鼠艾氏腹水癌呈顯著的生命延長作用，并呈劑量依賴性。(接下頁)表7本發(fā)明化合物組合物對小鼠腹水瘤EAC的作用(S±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例17本發(fā)明藥物對小鼠肝腹水癌(HepA)的生命延長作用取昆明小鼠50只，接種小鼠肝腹水癌(HepA)方法同接種EAC。24h后隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組10只動物。各組小鼠體重?zé)o顯著差異。模型組給等體積蒸餾水，給藥組按實(shí)施例10制得的萊菔硫烷與PH-P-CD包合物以及硒代蛋氨酸，按擬定劑量配制水溶液，灌胃給藥或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥12天，停藥，稱體重。而后正常飼養(yǎng)，觀察各組小鼠生存天數(shù)，觀察時間為60天，計(jì)算生命延長率，生命延長率W)=[(給藥組平均生存天數(shù)-模型組平均生存天數(shù))/模型組的平均生存天數(shù)]xi00%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。從表8的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，本發(fā)明化合物組合物對小鼠肝腹水癌呈顯著的生命延長作用，并呈劑量依賴性。(接下頁)表8本發(fā)明化合物組合物對小鼠腹水肝癌HepA的作用(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.一種具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的化合物組合物，其中包括異石克氰酸酯和有機(jī)硒，其重量比為10100:0.011.0(按硒元素計(jì))。2.權(quán)利要求l的藥物組合，其包括異硫氰酸酯和有機(jī)硒及藥物載體。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的化合物組合物，其中所述的異硫氰酸酯可為萊菔硫烷(sulforaphane)，三芥酸甘油酯(erucin),苯乙基異硫氰酸酉旨(phenethylisothiocyanate)及這些異辟u氰酸酯的結(jié)構(gòu)類似物或4汙生物，包4舌從十字花科植物的種子、芽苗、花、莖、葉、根，或其中任何組織的組合中提取的或化學(xué)合成的。4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的化合物組合物，其中所述的有機(jī)硒，其包括從富代多糖或有機(jī)硒鹽。5.—種提高哺乳動物體內(nèi)II型酶和抗氧化酶化學(xué)保護(hù)量的方法，包括用權(quán)利要求1所述的化合物組合物進(jìn)行有效量的給藥。6.—種抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成的方法，包括用權(quán)利要求1所述的化合物組合物進(jìn)行有效量的給藥。7.從十字花科植物中制備異硫氰酸酯和有機(jī)硒以及制備異硫氰酸酯與HP-P-環(huán)糊精包合物的方法，其包括(1)將十字花科植物粉碎，加水水解，水解可通過內(nèi)源或外源的硫代葡萄糖苷酶(黑芥子酶同工酶)來進(jìn)行。(2)所得水解產(chǎn)物用乙酸乙酯提取，得異硫氰酸酯粗品。(3)所得提取物可用石油醚脫脂。(4)所得提取物可采用硅膠柱層析吸附、除雜、洗脫，得高純度的異硫氰酸酯。(5)所得提取物可采用大孔吸附樹脂吸附、除雜、洗脫，得高純度的異疏氰酸。(6)所得提取物可采用分子蒸餾技術(shù)純化，得到高純度的異硫氰酸酯(7)將十字花科植物的種子、芽苗、花、莖、葉、根，或其中任何組織的組合干燥、粉碎，加甲醇或乙醇萃取，取醇提取液回收醇，得醇萃取物，萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂，用乙醇洗脫硫代葡萄糖普，再加外源性黑芥子酶進(jìn)行水解，繼續(xù)用乙酸乙酯萃取水解產(chǎn)物，再采用超臨界C02流體萃取，萃取物料后得異硫氰酸酯。(8)所得提取物可采用Ci8反相制備柱技術(shù)純化，得到高純度的異硫氰酸酯(9)將上述提取方法提取后的水溶液和殘?jiān)?，離心分離水溶液，殘?jiān)觩H-8-11的堿性溶液浸提3次，合并水溶液和堿提取液，離心，5000u超濾膜超濾，截留液冷凍真空干燥，制得含竭產(chǎn)品。(10)取上述權(quán)利要求(8)制得的高純度異硫氰酸酯按1:10-200比例，采用低溫飽和水溶液法，將異疏氰酸酯溶于乙醇，逐滴攪拌加入HP-0_環(huán)糊精，攪拌1-24h,冷藏，0.45uM濾膜過濾，取濾液冷凍干燥，得異硫氰酸酯與HP-P-環(huán)糊精包合物。8.權(quán)利要求1所述化合物組合物的應(yīng)用，其特征在于所述癌癥包括白血病和實(shí)體瘤。9權(quán)利要求8所述白血病為急性淋巴性白血病，慢性淋巴性白血病，B細(xì)胞白血病，T細(xì)月包白血病。IO權(quán)利要求8所述實(shí)體瘤為肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、陰莖癌、黑色素瘤和腦瘤。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有化學(xué)保護(hù)、癌癥預(yù)防和治療用途的化合物組合物及其制備方法。該組合物包括異硫氰酸酯和有機(jī)硒，其重量比為10～100∶0.01～1.0(按硒元素計(jì))。該組合物可用于提高哺乳動物體內(nèi)II型酶和抗氧化酶化學(xué)保護(hù)量，可用于預(yù)防和治療急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、B細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病、肝癌、肺癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、陰莖癌、黑色素瘤和腦瘤。文檔編號A61P35/00GK101120948SQ20061010928公開日2008年2月13日申請日期2006年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者劉錦梅,偉康,普文英,培李,鑫符申請人:普文英;劉錦梅