專利名稱：由聚肽－b－聚四氫呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)自組裝體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一類由聚四氫呋喃為中心嵌段的聚醚聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)自組裝體的方法。
背景技術(shù)：
所謂自組裝就是在沒有人為干預(yù)的條件下體系自動(dòng)將各組件組織成圖案或結(jié)構(gòu)的過程，從而獲得具有特殊功能的材料與器件。有機(jī)合成高分子的自組裝是當(dāng)前納米科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一。相對(duì)于小分子表面活性劑而言，兩親性嵌段共聚物具有臨界膠束濃度低、分子結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性強(qiáng)等一系列優(yōu)點(diǎn)，因而其自組裝行為格外引人關(guān)注。近年來，人們?cè)趯?duì)溶液中兩親性聚合物自組裝行為進(jìn)行大量基礎(chǔ)研究的同時(shí)，也在不斷尋求將其用于藥物控釋，基因轉(zhuǎn)染治療，疾病診斷，納米反應(yīng)器，化學(xué)污染物回收處理，以及食品及化妝品等行業(yè)(Prog.Polym.Sci.2003，281107；Prog.Polym.Sci.2005，30691)。
化學(xué)合成聚氨基酸或聚肽化合物具有與天然蛋白質(zhì)或多肽相似的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，顯示出與細(xì)胞和組織良好的生物相容性；同時(shí)由于聚肽主鏈上存在大量肽鍵，在機(jī)體內(nèi)極易受到酶的作用，從而能降解生成無毒的小肽或氨基酸產(chǎn)物，能夠被機(jī)體吸收和代謝，因而具有優(yōu)良的生物降解性和安全性。由于聚氨基酸具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其自組裝體在不同外界環(huán)境刺激下可以表現(xiàn)出不同的形態(tài)與功能。因此，含有多肽組分的自組裝體的制備與應(yīng)用愈來愈受到人們的青睞。林嘉平等(Macromo.Rapid.Commun，2004，251241)用三乙胺引發(fā)γ-芐基-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐制備了均聚(γ-芐基-L-谷氨酸)，然后通過酯交換反應(yīng)將親水性嵌段聚乙二醇接枝在均聚肽鏈上，并研究了其自組裝行為。Jeong等(Polymer，2003，44583)制備了兩親性可生物降解的聚天冬氨酸-g-聚己內(nèi)酯共聚物，并制備出相應(yīng)的聚合物膠束。這些兩親性聚肽嵌段共聚物呈現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性、可降解性，以及自組裝性質(zhì)，預(yù)示著它們?cè)谏镝t(yī)用材料領(lǐng)域中將有著廣泛的用途。
含有聚肽的兩親性嵌段共聚物，根據(jù)化學(xué)組成和所處溶液環(huán)境的不同，可以自組裝成納米及微米級(jí)囊泡、膠束、線、帶等不同形態(tài)的自組裝體(J.Am.Chem.Soc.，2005，12712423)。聚肽的自組裝行為為開發(fā)新型藥物載體提供了巨大的發(fā)展空間，能夠賦予藥物可控釋、靶向輸送、不溶性藥物吸收率大大提高等諸多優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)脫除保護(hù)基處理后的聚肽更是提供了大量可供進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)基團(tuán)，如氨基，羧基，羥基等，在這些基團(tuán)上接枝上像紫杉醇，阿霉素等抗癌藥物可制成大分子前體藥物，不僅能夠大大降低抗癌藥物的毒性，而且還可提高藥物在腫瘤部位的蓄積濃度，明顯改善藥物的治療效果(Angew.Chem.Int.Ed，2006，451198)。另外，聚賴氨酸及其共聚物等在基因轉(zhuǎn)染中扮演著高分子載體的作用，通過與外源性基因復(fù)合形成納米顆粒，通過細(xì)胞壁的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)而發(fā)揮治療作用，在治療與遺傳有關(guān)的疑難病癥以及癌癥治療方面將發(fā)揮重要作用。合成聚肽材料作為藥物控釋和基因轉(zhuǎn)染載體材料，已成為目前合成生物醫(yī)用高分子研究領(lǐng)域的重要方向(Nature Review Drug Discovery，2005，4581)。
囊泡是由兩親分子所構(gòu)成的一種有序結(jié)構(gòu)，具有由密閉雙分子層所形成的球形或橢球形的單室或多室結(jié)構(gòu)。由于它在生命體中可以自發(fā)形成，所以這種有序體有著獨(dú)特的生理性質(zhì)和超分子結(jié)構(gòu)，如它有一個(gè)水溶性的內(nèi)核，其密閉層非常類似于細(xì)胞膜，因而可以用來進(jìn)行細(xì)胞膜的生物模擬。囊泡特殊的雙層膜結(jié)構(gòu)也使其成為理想的體內(nèi)藥物載體(CN1475205，2004)，其既可以攜帶水溶性藥物，將藥物包封在微水相內(nèi)，同時(shí)也可以攜帶油溶性或難溶性藥物，將藥物增溶在雙層膜內(nèi)。與膠束、微乳液等體系相比，囊泡作為藥物載體還具有藥物負(fù)載量大、結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、尺寸和藥物滲透率易調(diào)等優(yōu)點(diǎn)(Science，2002，297967)。另外囊泡在診斷試劑(CN101775，1988)和食品與化妝品行業(yè)(日用化學(xué)工業(yè)，1998，28(5)8；CN1308624，2001)中也顯示出良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的目的在于通過ABA型聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物的自組裝作用制備得到一種尺寸可調(diào)、pH值穩(wěn)定的納米及微米級(jí)自組裝體。該組裝體一般為囊泡結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在提供一種由ABA型聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)自組裝體的方法。具體制備步驟如下a)以無水四氫呋喃為溶劑，將保護(hù)基保護(hù)的氨基酸及其衍生物與三光氣反應(yīng)生成相應(yīng)的NCA，然后產(chǎn)物用無水石油醚沉淀，過濾，干燥。
b)以無水N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷、四氫呋喃等為溶劑，在無水、無氧條件下以端氨基聚四氫呋喃為大分子引發(fā)劑引發(fā)相應(yīng)氨基酸的NCA開環(huán)聚合形成ABA型聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，再用相應(yīng)的沉淀劑沉淀出產(chǎn)物，然后真空干燥。通過調(diào)節(jié)端氨基聚四氫呋喃大分子引發(fā)劑的分子量及其與不同氨基酸NCA的摩爾投料比，可以得到不同分子量、不同組成的三嵌段共聚物。
c)根據(jù)b)中合成的三嵌段共聚物的不同，采取相應(yīng)的脫保護(hù)基方法，制得相應(yīng)的三嵌段共聚物。
d)把由c)制得的三嵌段共聚物在攪拌條件下，溶于不同pH值和鹽濃度的水中，或者是先溶解于有機(jī)溶劑中，然后在不同pH值和鹽濃度的水溶液中進(jìn)行透析，最終制得納米及微米級(jí)自組裝體。
上述制備方法中，不同氨基酸及其衍生物首先通過重結(jié)晶得到純度符合聚合要求的原料。
上述制備方法中，不同氨基酸NCA的制備，溫度一般可控制在25℃～65℃反應(yīng)，時(shí)間為0.5～6小時(shí)。
上述制備方法中，不同氨基酸NCA分別用無水乙酸乙酯/無水石油醚重結(jié)晶多次，熔點(diǎn)與文獻(xiàn)值相符，元素分析實(shí)測(cè)值與理論值相差小于3‰。真空條件下保存待用。
上述制備方法中，端氨基聚四氫呋喃大分子引發(fā)劑在60℃～140℃下真空干燥2～12小時(shí)，然后降至室溫。
上述制備方法中，端氨基聚四氫呋喃引發(fā)NCA開環(huán)聚合反應(yīng)時(shí)間為48～96小時(shí)，反應(yīng)溫度范圍20℃～60℃。
上述制備方法中，沉淀劑的選擇可以是甲醇、乙醚或者水。沉淀出的ABA型聚肽b-聚四氫呋喃-b-聚肽嵌段共聚物，然后在20℃～60℃下真空干燥24小時(shí)，得最終產(chǎn)物。
上述制備方法中，脫保護(hù)基的方法對(duì)于聚肽嵌段為谷氨酸，天門冬氨酸及其衍生物的聚合物來說，可以是酸解、堿解或者是催化加氫。對(duì)于聚肽嵌段為賴氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，精氨酸及其衍生物的聚合物來說可以是酸解或者堿解。保護(hù)基脫除率大于95％。
上述制備方法中，最終所制得的自組裝體一般具有囊泡結(jié)構(gòu)。通過控制不同的嵌段組成和選取自組裝的環(huán)境，制得的自組裝體尺寸在1nm～500μm可調(diào)。
下面的實(shí)施方式舉例，可以使相關(guān)人員更加深入的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1聚(L-賴氨酸)-b-聚四氫呋喃-b-聚(L-賴氨酸)(PLL-PTHF-PLL)自組裝體的制備首先將0.13mmol端氨基聚四氫呋喃(數(shù)均分子量為1100g/mol)加到燒瓶中，在120℃下真空干燥2小時(shí)，自然冷卻至室溫，然后加入20mlN，N-二甲基甲酰胺溶解。然后在無水、惰性氣體保護(hù)下，使干燥后的端氨基聚四氫呋喃與溶于40ml N，N-二甲基甲酰胺中的7.8mmolγ-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(BZL-Lys NCA)混合。在室溫下，連續(xù)攪拌反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液緩慢滴加到過量的無水乙醚中，有白色沉淀生成，過濾，洗滌，40℃下真空干燥24h，得到聚(ε-芐氧羰基-L-賴氨酸)30-b-聚四氫呋喃-b-聚(ε-芐氧羰基-L-賴氨酸)30(PZLL30-PTHF-PZLL30)。將0.2g PZLL30-PTHF-PZLL30溶于2ml三氟乙酸中，加入0.75ml 33％的HBr的乙酸溶液，室溫下攪拌一個(gè)小時(shí)。將所得溶液加入到無水乙醚中，得到淡黃色固體。過濾后，用無水甲醇溶解濾出物，再用乙醚沉淀。得到的產(chǎn)物用去離子水透析三天后，冷凍干燥，得到脫除保護(hù)基的嵌段共聚物PLL30-PTHF-PLL30。利用類似的方法，調(diào)節(jié)投料比例，可以制備出不同嵌段長(zhǎng)度的共聚物，結(jié)果如表1所示。
表1 合成PZLL-PTHF-PZLL的分析表征結(jié)果 表1中M/I指單體BZL-Lys NCA與端氨基聚四氫呋喃的摩爾比；產(chǎn)率為聚合物重量與端氨基聚四氫呋喃和BZL-Lys NCA單體投料總重量之比；DP(PZLL)為由1H-NMR測(cè)定得到的聚(ε-芐氧羰基-L-賴氨酸)嵌段的聚合度； 為由1H-NMR測(cè)定得到的PZLL-PTHF-PZLL三嵌段聚合物的數(shù)均分子量； 由1H-NMR測(cè)定得到的脫除保護(hù)基后PLL-PTHF-PLL三嵌段聚合物的數(shù)均分子量。
將得到的三嵌段共聚物溶于1000倍的蒸餾水中，室溫下劇烈攪拌48hr，得到含有自組裝體的溶液。經(jīng)仔細(xì)制樣后在透射電鏡下觀察為半徑20～25nm的空心球結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2聚(L-谷氨酸)-b-聚四氫呋喃-b-聚(L-谷氨酸)(PLGA-PTHF-PLGA)自組裝體的制備首先將0.15mmol端氨基聚四氫呋喃(數(shù)均分子量為1100g/mol)加到燒瓶中，在120℃真空干燥2小時(shí)，自然冷卻至室溫，然后加入20mlN，N-二甲基甲酰胺溶解。然后在無水、惰性氣體保護(hù)下，使之與3.0mmol的γ-芐基-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(BLG-NCA)的40ml N，N-二甲基甲酰胺溶液混合。在室溫下，連續(xù)攪拌反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液緩慢滴加到過量的無水甲醇中，有白色沉淀生成，過濾，洗滌，40℃下真空干燥24h，得到聚(γ-芐基-L-谷氨酸)8-b-聚四氫呋喃-b-聚(γ-芐基-L-谷氨酸)8(PBLG8-PTHF-PBLG8)。將1.0gPBLG8-PTHF-PBLG8溶于30ml DMF∶THF＝1∶1的混合溶劑中，然后將50mg Pd/C和15mL甲醇的懸濁液加入上述溶液中。劇烈攪拌下，通氫氣鼓泡3天。然后過濾除去Pd/C粉末，將溶液倒入過量的乙醚中，所得沉淀物在40℃下真空干燥24h，得三嵌段共聚物PLGA8-PTHF-PLGA8。利用類似的方法，調(diào)節(jié)投料比例，可以制備不同嵌段長(zhǎng)度的共聚物PLGA-PTHF-PLGA，結(jié)果如表2所示。
表2 合成PLGA-PTHF-PLGA的分析表征結(jié)果 上表中M/I指單體BLG-NCA與端氨基聚四氫呋喃的摩爾比；產(chǎn)率為聚合物重量與端氨基聚四氫呋喃和BLG-NCA單體投料總重量之比；DP(PBLG)為由1H-NMR測(cè)定得到的聚(γ-芐基-L-谷氨酸)的聚合度； 為由1H-NMR測(cè)定得到的PBLG-PTHF-PBLG三嵌段聚合物的數(shù)均分子量； 由1H-NMR測(cè)定得到的脫除保護(hù)基后PLGA-PTHF-PLGA三嵌段聚合物的數(shù)均分子量。
將0.5g三嵌段共聚物溶于100ml DMF中，配成5mg/ml的溶液.在劇烈攪拌下以10～15s/滴的速度緩慢加入約相當(dāng)于原溶液25％的H2O，繼續(xù)攪拌24h，然后一次性加入約25ml H2O，將溶液加入透析袋(透析袋的截留分子量為1000)，用蒸餾水透析48hr，得含有自組裝體的溶液。
權(quán)利要求
1.一種由ABA型聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)自組裝體的方法，此方法包括(a)共聚物中間嵌段部分為低玻璃化溫度的疏水性聚四氫呋喃。(b)共聚物兩端的嵌段部分為聚肽均聚物。該嵌段是由端氨基聚四氫呋喃作為大分子引發(fā)劑引發(fā)由保護(hù)基保護(hù)的氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐(NCA)進(jìn)行開環(huán)聚合，然后再經(jīng)過脫除保護(hù)基反應(yīng)后得到的?？梢酝ㄟ^NCA與引發(fā)劑摩爾投料比變化來控制該嵌段的分子量或嵌段長(zhǎng)度。(c)將該聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物溶解于不同pH和鹽濃度的水溶液中，通過自組裝相互作用即可得到不同粒徑的納米及微米級(jí)自組裝體。該自組裝體可用于藥物控釋，基因轉(zhuǎn)染治療，診斷試劑，納米反應(yīng)器，化學(xué)污染物回收處理，食品及化妝品等行業(yè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中所述的端氨基聚四氫呋喃的分子量范圍從800至10,000可變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中聚肽嵌段可由保護(hù)基保護(hù)的氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐通過開環(huán)聚合及脫除保護(hù)基反應(yīng)制備得到。而氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐可由各種保護(hù)基保護(hù)的氨基酸及其衍生物與三光氣反應(yīng)制備得到，所涉及到的氨基酸及其衍生物包括有賴氨酸(Lys)及其衍生物，如ε-芐氧羰基賴氨酸，ε-叔丁氧羰基賴氨酸，ε-芴甲氧羰基賴氨酸，ε-三氟乙?；嚢彼岬?；谷氨酸(Glu)及其衍生物，如γ-芐基谷氨酸酯，γ-甲基谷氨酸酯，γ-乙基谷氨酸酯等；還包括有天門冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)及其衍生物等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中該共聚物中聚肽嵌段的分子量范圍從1000至50,000可變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，在制備過程中其保護(hù)基的脫除方法隨所用單體的不同而變化，包括酸解、堿解、催化加氫等方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的由聚肽-b-聚四氫呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)自組裝體的方法包括直接將三嵌段共聚物溶解于不同pH值或不同鹽濃度水溶液，或者是先溶解于有機(jī)溶劑中，然后在不同pH值和鹽濃度的水溶液中進(jìn)行透析。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的自組裝體可以存在于不同pH值的水溶液中。其中水溶液中氫離子的濃度范圍是0～30mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的自組裝體可以存在于不同濃度的鹽溶液中。其中的鹽是可在水中電離為化合價(jià)為+1～+3的金屬離子和化合價(jià)為-3～-1的陰離子所組成。鹽的濃度為0～30mol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的自組裝體在溶劑去除之后，仍可以以干態(tài)形式存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的自組裝體一般為尺寸1nm～500μm的中空囊泡，該囊泡的囊泡壁內(nèi)外兩層由聚肽嵌段組成，中間層由聚四氫呋喃嵌段構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明是一種由ABA型聚肽－b－聚四氫呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物制備納米及微米級(jí)組裝體的方法。本發(fā)明中所用的三嵌段共聚物是以端氨基聚四氫呋喃為引發(fā)劑引發(fā)由保護(hù)基保護(hù)的氨基酸與三光氣生成的α－氨基酸－N－羧基內(nèi)酸酐(NCA)進(jìn)行開環(huán)聚合，然后再經(jīng)過脫保護(hù)基反應(yīng)得到的。根據(jù)NCA與引發(fā)劑的摩爾投料比，以及大分子引發(fā)劑分子量的不同，能夠制備不同組成的ABA型三嵌段共聚物，其中B段為低玻璃化溫度的疏水性聚四氫呋喃嵌段，A段為親水性聚肽均聚物嵌段。所得到的三嵌段共聚物可以溶解于不同pH和鹽濃度的水溶液中得到粒徑不同的納米及微米級(jí)自組裝體。該自組裝體可用于藥物控釋，基因轉(zhuǎn)染治療，診斷試劑，納米反應(yīng)器，化學(xué)污染物回收處理，食品及化妝品等行業(yè)。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1869099SQ20061007877
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者馮增國(guó), 田振, 李海賓, 張愛英 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)