專利名稱：：落新婦苷在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及落新婦苷在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景落新婦苷具有抗心肌缺血、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[邵春紅，新華,周承明，等.赤土茯苓苷對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23(3):205-207.;高思海，潘鐵成.落新婦甙的提取及對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2003,3:1693-1694]。本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)明了落新婦苷在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明提供了落新婦苷在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了落新婦苷在制備治療或預(yù)防腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了以落新婦苷為活性成分的用于腎功能衰竭及腎纖維化的藥物組合物。本發(fā)明提供的落新婦苷在用于急慢性腎功能衰竭及腎纖維化時(shí)，其注射時(shí)使用劑量范圍是25mg1000mg;優(yōu)選255()0mg，口服時(shí)使用劑量范圍是50mg2000mg;優(yōu)選501000mg。本發(fā)明提供的落新婦苷可以按文獻(xiàn)公開的方法制備，優(yōu)選按下述方法制備取土茯苳藥材粉碎后加濃度為80%的乙醇溶液浸泡過夜；提取2次，每次10倍量體積，將提取液合并濃縮脫醇至5倍量體積，再用水稀釋至20倍量體積，放置沉淀；過濾取上清上聚酰胺層析柱，先用酸水(pH^2)洗脫6個柱體積，再用20%濃度的醇溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液濃縮至有沉淀析出；過濾取沉淀，干燥得到落新婦苷粗品，再結(jié)晶即得。本發(fā)明提供的落新婦苷藥物組合物可以根據(jù)制劑需要，加入相應(yīng)輔料，以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿等形式存在，優(yōu)選為凍干粉針和膠囊。本發(fā)明提供的各種劑型均可以采用藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。本發(fā)明人進(jìn)行了下列試驗(yàn)來證實(shí)治療或預(yù)防急慢性腎炎和急慢性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用，但藥理作用不僅限于此。具體實(shí)施實(shí)例制備例l:落新婦苷的制備取土茯苳藥材5kg，粉碎后加濃度為80%的乙醇溶液浸泡過夜；提取2次，第一次60L,第二次40L，將提取液合并濃縮脫醇至5L，再用水稀釋至20L，放置沉淀；過濾取上清上聚酰胺層析柱(CV=5L)，先用酸水(pH二2)洗脫6個柱體積，再用20%濃度的醇溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液濃縮至有沉淀析出；過濾取沉淀，干燥得到落新婦苷粗品42g，再結(jié)晶得到落新婦苷純品34g,純度95.8%。制備例2:落新婦苷的制備取土茯苳藥材5kg，粉碎后用20倍濃度為95%的乙醇溶液滲漉；合并滲漉液，濃縮脫醇至3L，再用水稀釋至15L，放置沉淀；過濾取上清上聚酰胺層析柱(CV=5L)，先用酸水(pH=2)洗脫6個柱體積，再用30%濃度的醇溶液洗脫6個柱體積，收集洗脫液濃縮至有沉淀析出；過濾取沉淀，干燥得到落新婦苷粗品38g，再結(jié)晶得到落新婦苷純品28g。純度97.8%。制備例3落新婦苷片劑的制備稱取40.0g落新婦苷、85.()g糖粉、40.0g乳糖和23.0g羧甲基淀粉鈉充分混合均勻后過100目篩，加入適量的3y。PVPK3o水溶液適量制軟材，20目篩制粒，6(TC干燥3小時(shí)，18目篩整粒，加入2.0g硬脂酸鎂，混合均勻后壓1000片，每片約200mg，即得。制備例4落新婦苷軟膠囊的制備稱取20.Og落新婦苷加200ml藥用豆油充分混合均勻后制1000粒軟膠囊，每粒約200mg，即得。制備例5落新婦苷元滴丸的制備分別取30mg聚乙二醇4000和20.0g落新婦苷，混合后置75。C恒溫水浴中加熱熔融，置75'C保溫下攪拌1小時(shí)使分散均勻，藥液轉(zhuǎn)移至滴丸機(jī)75'C恒溫儲料罐中，在滴頭口徑為5.0/6.0mm，滴速60滴/分鐘，冷卻劑為二甲基硅油，冷卻液溫度l(TC條件下，調(diào)節(jié)滴丸丸重為60mg，滴制成1000丸，除去滴丸表面上的冷卻液分裝，即得。制備例6落新婦苷注射液制備落新婦苷30.0g吐溫80lg加注射用水至1000ml__共制成1000支試驗(yàn)l落新婦苷對大鼠急性腎衰的影響1.1藥品與試劑落新婦苷按制備例1與制備例6制備甲強(qiáng)龍(比利時(shí)法瑪西亞普強(qiáng)公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實(shí)驗(yàn)動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g—350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。1.2試驗(yàn)方法與結(jié)果大鼠130只，體重150-200k，動物喂養(yǎng)l周，將動物分為13組，即正常組，模型組，甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射小劑量(lmg/kg)組，落新婦苷靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射大劑量(10mg/kg)組1，落新婦苷靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2,落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4，落新婦苷灌胃劑量(5mg/kg)組1，落新婦苷灌胃劑量(50mg/kg)組2，落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4。甘油配成50%(V/V)，除正常組外，給大鼠禁水，16h后一次性肌注，劑量為lmL/100g，各組連續(xù)給藥3天，從眼眶取血，測定血清肌酐和尿素氮(肌酐和尿素氮試劑盒測定肌酐和尿素氮)從表1結(jié)果可以看出，落新婦苷靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.05);甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，落新婦苷靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷靜脈注射大劑量(100rag/kg)組4,落新婦苷灌胃劑量(50mg/kg)組2，落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.01);落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮與落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4比較，無顯著性差異；落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮與落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。表1落新婦苷對大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>試驗(yàn)2落新婦苷對腺嘌呤導(dǎo)致大鼠慢性腎衰的影響2.1藥品與試劑落新婦苷按制備例1與制備例6制備腺嘌呤(常州華通化工公司)甲強(qiáng)龍(比利時(shí)法瑪西亞普強(qiáng)公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實(shí)驗(yàn)動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g—350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。大鼠130只，體重150-200g，動物喂養(yǎng)1周，將動物分為13組，即正常組，模型組，甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射小劑量(lmg/kg)組，落新婦苷靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射大劑量(10mg/kg)組1，落新婦苷靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2,落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4，落新婦苷灌胃劑量(5mg/kg)組1，落新婦苷灌胃劑量(50mg/kg)組2，落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4，除正常組外，每只大鼠ip腺嘌呤200mg/kg，7天后，大鼠眼框取血，測定血清肌酐和尿素氮，觀察造模情況，從第8天開始給藥，連續(xù)給藥14天，從眼眶取血，測定血清肌酐和尿素氮(肌酐和尿素氮試劑盒測定肌酑和尿素氮)，處死作病理切片，觀察腎功能的病理改變。從表2結(jié)果可以看出，落新婦苷靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.05);甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，落新婦苷靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4，落新婦苷灌胃劑量(50mg/kgi組2，落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠慢性腎衰血清肌酑和尿素氮(與模型組比較，p<0.01);落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4比較，無顯著性差異；落新婦苷灌胃劑量(lOOmg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌酑和尿素氮與落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。病理檢査正常對照組腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組有明顯腎組織結(jié)晶沉淀物，腎小管破壞，萎縮，管腔變小，其中可見淋巴細(xì)胞浸潤及局部纖維組織增生，腎小球腫大，腎小球上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，內(nèi)皮細(xì)胞下出現(xiàn)大量疏松物質(zhì)，基底膜增厚，定量分析腎小管面積與腎小球體積，模型組與正常對照組比較有顯著性差異。落新婦苷各組各劑量組隨劑量增加損傷程度明顯減輕，但仍未恢復(fù)至正常水平。表2落新婦苷對大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>'，p<0.05，**，p<0.01,與模型組比較試驗(yàn)3落新婦苷對腎切除導(dǎo)致大鼠慢性腎衰的影響3.1藥品與試劑落新婦苷按制備例1與制備例6制備甲強(qiáng)龍(比利時(shí)法瑪西亞普強(qiáng)公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實(shí)驗(yàn)動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g_350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。3.2試驗(yàn)方法與結(jié)果大鼠195只，體重150-200g,動物喂養(yǎng)1周，將動物分為13組，每組15只，即正常組，模型組，甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷注射小劑量(lmg/kg)組，落新婦苷注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷注射大劑量(10mg/kg)組l，落新婦苷注射大劑量(25mg/kg)組2，落新婦苷注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷注射大劑量(100mg/kg)組4，落新婦苷灌l(xiāng)，落新婦苷灌胃劑量(50mg/kg)組2，落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4,除正常組外，大鼠用5/6腎切除方法制成慢性腎衰模型，第一次手術(shù)切除左腎2/3，一周后行第二次手術(shù)切除右腎，第二次手術(shù)后一周開始給藥，給藥方式為灌胃給藥或腹腔注射給藥，給藥后4周、8周分別大鼠眼框取血，測定血清肌酐和尿素氮，給藥后4周處死5只，試驗(yàn)結(jié)束處死10只，作病理切片，觀察腎功能的病理改變。從表3、表4結(jié)果可以看出，落新婦苷靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，落新婦苷灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.05);甲強(qiáng)龍(12mg/kg)組，落新婦苷靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，落新婦苷靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2,落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4，落新婦苷灌胃劑量(50mg/kg;，組2,落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3，落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.01);落新婦苷靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與落新婦苷靜脈注射大劑量(100mg/kg)組4比較，無顯著性差異；落新婦苷灌胃劑量(100mg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌軒和尿素氮與落新婦苷灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。病理改變給藥第4周模型組光鏡下見腎小球有不同程度代償性肥大，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管襻呈分葉狀，部分腎小球囊腔消失，毛細(xì)血管管壁增厚，腎小管腫脹、擴(kuò)張，管腔內(nèi)有蛋白沉積，部分小管萎縮，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，各給藥組亦見上述改變，但病變程度較輕，隨劑量增大，病變程度減輕；給藥第8周模型組光鏡下見系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)明顯增多，毛細(xì)血管管壁塌陷，毛細(xì)血管節(jié)段性硬化，硬化區(qū)多在血管壁附近硬化的腎小球內(nèi)可見均質(zhì)圓形PAS染色深紅色的沉積物，個別腎小球有局灶球囊粘連，局灶新表3落新婦苷對大鼠腎切除慢性腎衰給藥4周血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4落新婦苷對大鼠腎切除慢性腎衰給藥8周血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗(yàn)4落新婦苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響4.1材料落新婦苷按制備例1與制備例6制備實(shí)驗(yàn)動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。苯那普利，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號040306;羥脯氨酸試劑盒，南京建成生物公司，批號050906。4.2試驗(yàn)方法與結(jié)果大鼠130只，體重200-230g，動物喂養(yǎng)1周，各大鼠以10%水合氯醛3.OmL/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，剪毛后用碘酒、75%酒精消毒手術(shù)區(qū)，行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，其中io只大鼠僅切開腹腔并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷，作為假手術(shù)組，其余120大鼠用4-0絲線結(jié)扎兩道，上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下極水平，然后在兩道結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合，120只造模大鼠隨機(jī)分為12組，即模型組、依那普利(10mg/kg)組、落新婦苷靜脈注射lmg/kg組、落新婦苷靜脈注射2.5mg/kg組、落新婦苷靜脈注射25mg/kg組、落新婦苷靜脈注射50mg/kg組、落新婦苷靜脈注射100mg/kg組、落新婦苷灌胃2mg/kg組、落新婦苷灌胃5mg/kg組、落新婦苷灌胃50mg/kg組、落新婦苷灌胃100mg/kg組、落新婦苷灌胃200mg/kg組，各組給藥21天后，10%水合氯醛麻醉后處死各組動物，生理鹽水反復(fù)灌洗后留取左側(cè)腎臟，腎組織經(jīng)4%的多聚甲醛緩沖液固定。切取適量腎組織，按羥脯氨酸試劑盒測定說明測定羥脯氨酸。從表5結(jié)果可以看出，，落新婦苷靜脈注射2.5mg/kg組、落新婦苷靜脈注射25mg/kg組、落新婦苷靜脈注射50mg/kg組、落新婦苷靜脈注射K)Omg/kg組、落新婦苷灌胃5mg/kg組、落新婦苷灌胃50mg/kg組、落新婦苷灌胃100mg/kg組、落新婦苷灌胃200mg/kg組明顯降低大鼠羥脯氨酸水平(與模型組比較，p〈0.05或0.01),落新婦苷灌胃100mg/kg組降低羥脯氨酸水平與落新婦苷灌胃200mg/kg組比較，無顯著性差異；落新婦苷靜脈注射50mg/kg組降低羥脯氨酸與落新婦苷靜脈注射100mg/kg組比較，無顯著性差異。常規(guī)病理學(xué)檢査①肉眼檢査假手術(shù)組腎臟顏色鮮紅，表面光滑，包膜光澤，無粘連。其他各組腎臟體積增大，顏色蒼白，表面呈顆粒狀，類似人體大白腎，少數(shù)區(qū)域腎包膜粘連。②光鏡檢査假手術(shù)組腎單位結(jié)構(gòu)清晰，腎小球囊無擴(kuò)張或縮小，腎小管上皮細(xì)胞無明顯變性及壞死，管腔內(nèi)無脫落上皮細(xì)胞或管型，間質(zhì)中無血管擴(kuò)張或炎細(xì)胞浸潤。模型對照組大片腎小管壞死，腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生，腎小管擴(kuò)張，內(nèi)有大量棕黃色折光物質(zhì)或壞死脫落的上皮細(xì)胞，腎小球數(shù)目減少，部分腎小球纖維化并與包曼氏囊壁粘連，囊腔消失。給藥各組病變與模型對照組類似，但均有不同程度的形態(tài)學(xué)改善，尤以落新婦苷大劑量各組顯著，與模型對照組比較有明顯差異。表5落新婦苷對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.落新婦苷在制備治療或預(yù)防急性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。2.落新婦苷在制備治療或預(yù)防慢性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。3.落新婦苷在制備治療或預(yù)防腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一所述的應(yīng)用，其注射時(shí)給藥劑量范圍為25-1000mg，口服時(shí)給藥劑量范圍為50-2000mg。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其注射給藥劑量范圍為25-500mg，口服為50-1000mg。6.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一所述的應(yīng)拜j,落新婦苷的制備方法為取土茯苓藥材粉碎后加濃度為80%的乙醇溶液浸泡過夜，提取2次，每次10倍量體積，將提取液合并濃縮脫醇至5倍量體積，再用水稀釋至20倍體積，放置沉淀；過濾取上淸液上聚酰胺層析柱，先用酸水(PH-2)洗脫6個柱體積，再用20%醇溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液濃縮至有沉淀析出，過濾取沉淀，干燥再結(jié)晶即得。7.—種以落新婦苷為活性成分的用于腎功能衰竭和腎纖維化的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明提供了落新婦苷在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61K31/7048GK101152200SQ20061006922公開日2008年4月2日申請日期2006年9月27日優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日發(fā)明者岳喜典,蔣王林申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司