專利名稱：蟲草頭孢菌粉抗心律失常有效部位的制備及其藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蟲草頭孢(C.sinensis Chen.sp.nov)菌粉中提取、分離、純化抗心律失?；钚圆课坏姆椒ê退幬镏苿撍幬镏苿┯糜谥委熜穆墒С５榷喾N心血管疾病。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為冬蟲夏草味甘、性溫，有補(bǔ)肺益腎的作用，可治久咳虛喘、勞嗽咳血和腎虛引起的陽(yáng)痿、遺精等癥。但由于冬蟲夏草特殊的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)習(xí)性，使得其數(shù)量稀少，資源稀缺。人們從冬蟲夏草中分離真菌菌株并進(jìn)行大規(guī)模的深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得蟲草菌粉。研究表明這些蟲草菌粉具有與冬蟲夏草類似的活性成分和藥理作用，可以代替冬蟲夏草藥材起治療和滋補(bǔ)作用。目前，市場(chǎng)上已經(jīng)有多種以蟲草菌粉為主要原料的藥品和滋補(bǔ)品面世，如金水寶、寧心寶、至靈膠囊等，這些產(chǎn)品療效確切，銷售良好，取得了較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
心律失常是指心率及心動(dòng)節(jié)律的改變、心臟沖動(dòng)形成和(或)沖動(dòng)的傳導(dǎo)異常，在中醫(yī)上屬于驚悸、怔忡的范疇，臨床表現(xiàn)為心慌、心悸、驚恐不安和脈律不齊，伴有氣短、胸悶、憋喘和頭暈等癥狀。藥物、心肌缺血、電解質(zhì)紊亂、自主神經(jīng)功能紊亂等原因引起心臟沖動(dòng)形成、傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致心律失常。心律失常是常見疾病，目前，心律失常的發(fā)病率尚無(wú)確切的統(tǒng)計(jì)。據(jù)有關(guān)資料對(duì)各種心律失常發(fā)病率進(jìn)行比較表明，其中竇性心律不齊發(fā)病率最高，為25％～27％，竇性心動(dòng)過(guò)速次之，為20％～22％，竇性心動(dòng)過(guò)緩為13％～15％，室性過(guò)早搏動(dòng)為14％～16％，房性過(guò)早搏動(dòng)為5％～7％，心房顫動(dòng)為11％～15％，房室傳導(dǎo)阻滯為5％～7％，其它各種心律失常約5％～8％。目前，用于治療抗心律失常的西藥大致可以歸納成四大類型鈉通道阻滯劑、β受體阻斷藥、延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程藥和鈣通道阻滯劑等。臨床上常用的抗心律失常藥物均有其不足①作為抗心律失常藥物往往易誘發(fā)心律失常，發(fā)生率約為3％～13％。②對(duì)傳導(dǎo)系統(tǒng)抑制作用較強(qiáng)，劑量不當(dāng)或長(zhǎng)期用藥易誘發(fā)傳導(dǎo)阻滯及心衰。而與西藥相比，抗心律失常中藥又存在作用效能效價(jià)低的問題，其主要原因是①對(duì)心律失常的作用靶點(diǎn)少而且作用弱。②作用缺乏特異性。③復(fù)方制劑的有效成分不明確。④中藥有效成分口服時(shí)生物利用度低。這些因素影響了抗心律失常中藥的臨床治療效果。
從冬蟲夏草中分離的麥角菌科真菌蟲草頭孢(C.sinensis Chen.sp.nov)經(jīng)液體深層發(fā)酵得到蟲草頭孢菌粉，其含有蟲草多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、甘露醇、脂肪、脂肪酸、蟲草素、生物堿、微量元素等多種成份，物質(zhì)組成復(fù)雜，藥效物質(zhì)不清楚。
寧心寶膠囊為蟲草頭孢菌粉簡(jiǎn)單干燥后即裝入膠囊所得制劑。它具有提高竇性心律，改善竇房結(jié)、房室傳導(dǎo)功能，改善心臟功能的作用，用于治療多種難治性緩慢型心律失常和房室傳導(dǎo)阻滯。但由于寧心寶未經(jīng)現(xiàn)代工藝提取，對(duì)于心律失常起效較慢而且服藥量大；而復(fù)雜的藥物組份使得有效物質(zhì)不清楚，作用機(jī)制不明了，導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)中缺乏有效的質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)量控制方法，從而影響了對(duì)藥材的質(zhì)量檢測(cè)和控制，不利于產(chǎn)品的進(jìn)一步推廣和利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是采用現(xiàn)代提取分離純化技術(shù)和化合物結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究方法，提供一種從蟲草頭孢菌粉中適合產(chǎn)業(yè)化提取、分離、純化具有明確物質(zhì)組成的抗心律失常活性有效部位的方法；本發(fā)明還提供該抗心律失常活性有效部位為主要藥物與其它一種或多種藥學(xué)上允許的賦形劑制成的中藥制劑，用于心血管疾病的治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案為
(1)將蟲草頭孢菌粉用體積重量比為2～5倍量的8％-98％乙醇浸泡12～48小時(shí)，用8％-98％乙醇超聲提取，提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘，合并3次超聲提取液；(2)回收乙醇溶劑后得到含有效部位的乙醇提取物，再用蒸餾水超聲提取3次，每次用體積重量比3倍的蒸餾水，超聲時(shí)間30分鐘，合并3次超聲提取液，回收水溶劑，得到水提取物；將水提取物均勻混懸在水中，或含乙醇的水中后用有機(jī)溶劑分步萃取，水提取物與混懸溶劑水或含乙醇水的體積之比為3∶1，有機(jī)溶劑與含有效部位的混懸物體積之比為1∶1；(3)得到的萃取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿或氯仿與甲醇混合溶劑洗脫，得到抗心律失常的有效部位。
所述的乙醇提取物均勻混懸在含乙醇的水中，乙醇∶水的體積之比為0.1-1.0∶9.9-9.0。
所述的萃取有機(jī)溶劑為環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、異丙醇或水飽和正丁醇中的一種或幾種。
所述的洗脫用氯仿與甲醇混合溶劑時(shí)，其重量配比在10～1∶0～1之間。
本發(fā)明制備方法得到的有效部位主要成分為腺苷、尿苷和胸苷等核苷類化合物，可作為心律失常的治療藥物。
本提取分離純化方法步驟較少，操作簡(jiǎn)單，可以將蟲草菌絲體粉末中所含有的大部分核苷類成分提取出來(lái)，最終所得的抗心律失?；钚圆课?，采用HPLC加量法，測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷的含量為30％～50％；而腺苷的含量為20％～40％。
本發(fā)明的上述方法可以用于產(chǎn)業(yè)化大量制備抗心律失?；钚杂行Р课唬ㄟ^(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，共得到3個(gè)化合物。根據(jù)化合物的理化特性和波譜數(shù)據(jù)，確定3個(gè)主要化合物，分別為尿苷、胸苷和腺苷。其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
尿苷(uridine) 胸苷(thymidine)腺苷(adenosine)主要化合物結(jié)構(gòu)確定方法化合物1尿苷(uridine)，MFC9H12N2O6，無(wú)色針晶(MeOH)，mp168.5-170.0℃，MW244。[ESI-MS]+m/z 267[M+Na]+；245[M+H]+；113[M-132+H]+。[ESI-MS]-m/z 487[2M-H]-；243[M-H]-。根據(jù)上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以推出化合物的分子量為244，含有偶數(shù)個(gè)N原子，結(jié)合化合物的13CNMR和1H NMR數(shù)據(jù)，確定化合物的分子式為C9H12N2O6。根據(jù)化合物的13C NMR，1H NMR和HMQC譜，完成了化合物中C及其所連接的H原子的化學(xué)位移歸屬(見Table 1)。
Table 11H and13C NMR data of compound 1 in Pyridine*
*Recorded on a Bruker AV 400(400MHZ for1H，100MHz for13C)NMR spectrometer
上述ESI-MS，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的尿苷數(shù)據(jù)基本一致，因此確定該化合物為尿苷(uridine)。
化合物2胸苷(thymidine)，MFC10H14N2O5，黃色粉末，mp186-187.5℃，MW242。[ESI-MS]+m/z 265[M+Na]+；243[M+H]+。[ESI-MS]-m/z 483[2M-H]-；241[M-H]-。根據(jù)上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以推出化合物的分子量為242，含有偶數(shù)個(gè)N原子，結(jié)合化合物的13C NMR和1HNMR數(shù)據(jù)，確定化合物的分子式為C10H14N2O5。
根據(jù)化合物的13C NMR，1H NMR和HMQC譜，完成了化合物中C及其所連接的H原子的化學(xué)位移歸屬(見Table 2)。
Table 21H and13C NMR data of compound 2 in DMSO*
*Recorded on a Bruker AV 400(400MHZ for1H，100MHz for13C)NMR spectrometer上述ESI-MS，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的胸苷數(shù)據(jù)基本一致，因此確定該化合物為胸苷(thymidine)。
化合物3腺苷(adenosine)，MFC10H13N5O4，無(wú)色針晶(MeOH)，mp 236.8-238℃，MW267。1％的茴香醛硫酸試劑顯黃灰色。[ESI-MS]+m/z 290[M+Na]+；268[M+H]+；136[M-132+H]+。[ESI-MS]-m/z 533[2M-H]-；266[M-H]-；134[M-132-H]-。根據(jù)上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以推出化合物的分子量為267，含有奇數(shù)個(gè)N原子，結(jié)合化合物的13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)，確定化合物的分子式為C10H13N5O4。
化合物的13C NMR，1H NMR的數(shù)據(jù)如下表所示(Table 3)。
Table 31H and13C NMR data of compound 3 in Pyridine*
*Recorded on a Bruker AV 400(400MHZ for1H，100MHz for13C)NMR spectrometer將本化合物與腺苷對(duì)照品共薄層，發(fā)現(xiàn)兩者在不同的展開系統(tǒng)中均有相同的Rf值，而如上所述的ESI-MS，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的腺苷數(shù)據(jù)基本一致，因此確定該化合物為腺苷(adenosine)。
按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明的有效部位制成多種臨床藥物劑型作為治療心律失常的藥物，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說(shuō)的口服制劑選自片劑、膠囊劑、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊、口崩片、滴丸或軟膠囊制劑當(dāng)中的一種；非腸道給藥劑型選自透皮吸收劑或注射劑當(dāng)中的一種。
本發(fā)明的藥物含有5％～25％的有效部位和95％～75％的賦形劑。
本發(fā)明的藥物中的輔料是指常規(guī)的賦形劑，如淀粉、PVP、羧甲基淀粉鈉等。
本發(fā)明所述的蟲草頭孢(C.sinensis Chen.sp.nov)，購(gòu)自購(gòu)自浙江萬(wàn)豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司。
以下對(duì)上述方案的具體步驟進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.蟲草頭孢菌粉活性有效部位的制備(1)蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏制備蟲草頭孢菌粉1kg以2-5倍量(V/W)的乙醇浸泡12-48小時(shí)后，超聲提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘。合并3次的超聲提取液，回收溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉乙醇提取物濕浸膏。經(jīng)過(guò)乙醇提取的蟲草頭孢菌粉再用蒸餾水超聲提取三次，每次用蒸餾水3倍量(V/W)，超聲30分鐘。合并3次的超聲水提取液，回收溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏。上述用于浸泡和提取的乙醇濃度范圍可以在8％-98％之間。
(2)蟲草頭孢菌粉水提取物的萃取分離將上述蟲草頭孢菌粉的水醇提取物浸膏均勻分散在含有1％～10％乙醇的蒸餾水(2000mL)中，用等體積的有機(jī)溶劑(如環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯或水飽和正丁醇等一種或幾種混合)萃取，萃取3次。分離萃取液，回收溶劑，得蟲草頭孢菌粉萃取物。
(3)蟲草頭孢菌粉水提取物柱層析分離將上述萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析后，洗脫，即得本發(fā)明所述的活性有效部位，洗脫溶劑可選用氯仿或氯仿與甲醇的混合溶劑，選用氯仿與甲醇混合溶劑時(shí)，氯仿與甲醇的重量之比在10～1∶1～1之間。
2.制備蟲草頭孢菌粉活性有效部位的抗心律失常的藥物本發(fā)明制備的活性有效部位，可以直接制成治療藥物，通過(guò)口服、靜脈、肌肉注射或其它給藥方式施用于心律失常患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型，包括片劑、膠囊劑、注射劑、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊、各種透皮吸收劑、口崩片、滴丸或軟膠囊。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有特出的特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
本發(fā)明采用提取、萃取和柱層析等方法，從蟲草頭孢(C.sinensisChen.sp.nov)菌粉中分離純化抗心律失?；钚圆课?，其藥理活性高于現(xiàn)有的蟲草菌粉制劑。
本發(fā)明中的活性有效部位用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化(LC-8A制備型高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社)、AQUSAILSS4251(120)10×250mm和SHIM-PACK PREP-ODS(20×250mm)流動(dòng)相為甲醇/水(15/85V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30℃)，共得到3個(gè)化合物。根據(jù)化合物的理化特性和波譜數(shù)據(jù)，確定3個(gè)主要化合物，分別為尿苷、胸苷和腺苷。經(jīng)采用HPLC加量法測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷所占重量百分比為30％～50％，腺苷所占重量百分比為20％～40％。
本發(fā)明所得到的有效部位物質(zhì)組成清楚、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控。與寧心寶相比，本發(fā)明得到的有效部位主要成分為腺苷、尿苷和胸苷等核苷類化合物，該有效部位活性高，有效提高藥物的治療作用，藥物服用量少，同時(shí)又避免制成產(chǎn)品時(shí)提取物的其它雜質(zhì)成分對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)。同時(shí)，由于有效物質(zhì)明了，工業(yè)化生產(chǎn)中產(chǎn)品質(zhì)量易控制，質(zhì)量可靠性高。
本發(fā)明有效部位可以開發(fā)成多種劑型，用于治療心律失常等多種心血管疾病。
本發(fā)明所得的活性有效部位開發(fā)的抗心律失常藥物，用于心血管疾病的治療，解決了現(xiàn)有冬蟲夏草制劑活性物質(zhì)含量小，服用量大，服用不方便的問題。而且對(duì)比化藥其毒性小，可制成各種劑型，如片、膠囊或針劑。
本發(fā)明制備的活性有效部位經(jīng)體外試驗(yàn)表明其可對(duì)抗由氯化鈣和異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌細(xì)胞抗心律失常作用，且療效與現(xiàn)有抗心律失常藥相當(dāng)。本發(fā)明所得的有效部位藥物，日劑量少，藥效作用時(shí)間早，發(fā)揮藥效作用時(shí)間長(zhǎng)，獲得了意想不到的效果。
本發(fā)明制備的活性有效部位經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明其使用范圍很寬，保持了中藥毒副作用小的特點(diǎn)。
(四)具體實(shí)施方案下面，參照附隨的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例決不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1有效部位提取試驗(yàn)1蟲草頭孢菌粉1kg以3倍量(V/W)的8％乙醇浸泡24小時(shí)后，超聲提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘。合并3次的超聲提取液，回收乙醇溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉乙醇提取物浸膏。浸膏再用蒸餾水超聲提取三次，每次用蒸餾水3000mL，超聲30分鐘。合并3次的超聲水提取液，回收水溶劑，得到蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏。將上述蟲草頭孢菌粉的水醇提取物浸膏均勻分散在含有10％乙醇的蒸餾水(2000mL)中，用等體積的環(huán)己烷萃取3次。分離萃取液，回收溶劑得萃取物。將上述萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析，用氯仿進(jìn)行洗脫，后即得本發(fā)明所述的活性有效部位。標(biāo)記為A1。
有效部位A1化學(xué)成分的HPLC分離、純化及檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例1所得有效部位經(jīng)制備型高效液相色譜儀分離純化(LC-8A制備型高效液相色譜儀、AQUSAIL SS4251(120)10×250mm和SHIM-PACK PREP-ODS(20×250mm)色譜柱、洗脫劑甲醇為色譜純、流動(dòng)相為甲醇/水(15/85，V/V)，)，共得到3個(gè)化合物。根據(jù)化合物的理化特性和波譜數(shù)據(jù)，確定3個(gè)主要化合物，分別為尿苷、胸苷和腺苷。經(jīng)采用HPLC加量法測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷的含量為35％；而腺苷的含量為38.1％，這兩種主要成分的含量達(dá)到73.1％。
實(shí)施例2有效部位提取試驗(yàn)2蟲草頭孢菌粉1kg以5倍量(V/W)的98％乙醇浸泡12小時(shí)后，超聲提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘。合并3次的超聲提取液，回收溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉乙醇提取物浸膏。浸膏再用蒸餾水超聲提取三次，每次用蒸餾水3000mL，超聲30分鐘。合并3次的超聲水提取液，回收溶劑，得到蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏。將上述蟲草頭孢菌粉的水醇提取物浸膏均勻分散在含有5％乙醇的蒸餾水(2000mL)中，用等體積的氯仿萃取3次。分離萃取液，回收溶劑得萃取物。將上述萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析，用氯仿與甲醇(重量比1∶1)進(jìn)行洗脫，后即得本發(fā)明所述的活性有效部位。標(biāo)記為A2。
有效部位A2化學(xué)成分的HPLC分離、純化及檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例1，實(shí)施例2所得A2同樣分離得尿苷、胸苷和腺苷。經(jīng)采用HPLC加量法測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷的含量為45.3％；而腺苷的含量為29.6％，這兩種主要成分的含量達(dá)到74.9％。
實(shí)施例3有效部位提取試驗(yàn)3蟲草頭孢菌粉1kg以2倍量(V/W)的60％乙醇浸泡48小時(shí)后，超聲提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘。合并3次的超聲提取液，回收溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉乙醇提取物浸膏。浸膏再用蒸餾水超聲提取三次，每次用蒸餾水3000mL，超聲30分鐘。合并3次的超聲水提取液，回收溶劑，得到蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏。將上述蟲草頭孢菌粉的水醇提取物浸膏均勻分散在含有1％乙醇的蒸餾水(2000mL)中，用等體積的異丙醇萃取3次。分離萃取液，回收溶劑得萃取物。將上述萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析，用氯仿與甲醇(重量比8∶2)進(jìn)行洗脫，后即得本發(fā)明所述的活性有效部位。標(biāo)記為A3。
有效部位A3化學(xué)成分的HPLC分離、純化及檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例1，實(shí)施例3所得A3同樣分離得尿苷、胸苷和腺苷。經(jīng)采用HPLC加量法測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷的含量為42.7％；而腺苷的含量為24.5％，這兩種主要成分的含量達(dá)到67.2％。
實(shí)施例4有效部位提取試驗(yàn)4蟲草頭孢菌粉1kg以3.5倍量(V/W)的80％乙醇浸泡30小時(shí)后，超聲提取3次，每次超聲時(shí)間為30分鐘。合并3次的超聲提取液，回收溶劑，即得到蟲草頭孢菌粉乙醇提取物浸膏。浸膏再用蒸餾水超聲提取三次，每次用蒸餾水3000mL，超聲30分鐘。合并3次的超聲水提取液，回收溶劑，得到蟲草頭孢菌粉水提取物浸膏。將上述蟲草頭孢菌粉的水醇提取物浸膏均勻分散在蒸餾水(2000mL)中，用等體積的水飽和正丁醇萃取3次。分離萃取液，回收溶劑得萃取物。將上述萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析，用氯仿與甲醇(重量比9∶1)進(jìn)行洗脫，后即得本發(fā)明所述的活性有效部位。標(biāo)記為A4。
有效部位A4化學(xué)成分的HPLC分離、純化及檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例1，實(shí)施例4所得A4同樣分離得尿苷、胸苷和腺苷。經(jīng)采用HPLC加量法測(cè)得蟲草頭孢菌絲體提取物抗心律失常有效部位中尿苷的含量為48.2％；而腺苷的含量為30.6％，這兩種主要成分的含量達(dá)到78.8％。
實(shí)施例5本發(fā)明制備的活性部位制備抗心律失常藥膠囊制劑配方本發(fā)明獲得的活性有效部位2克，顆粒型預(yù)膠化淀粉18克。
制備方法取上述任一實(shí)施例中制備的蟲草抗心律失常有效部位共2克，加入填充劑顆粒型預(yù)膠化淀粉18克，混合均勻，裝入膠囊，共得膠囊100粒，每粒膠囊的總重量為200mg，有效部位含量為20mg。
用法和用量用溫開水沖服，每次1粒，一日3次。
實(shí)施例6本發(fā)明制備的活性部位制備抗心律失常藥片劑配方本發(fā)明獲得的活性有效部位3克，藥用淀粉15克，硬脂酸鎂2克。
制備方法取上述任一實(shí)施例中制備的蟲草抗心律失常有效部位共3克，加入賦形劑藥用淀粉15克，潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂2克，混合均勻，制成片劑100粒，每粒片劑的總重量為200mg，有效部位含量為30mg。
用法和用量用溫開水沖服，每次1片，一日3次。
實(shí)施例7本發(fā)明制備的活性部位制備抗心律失常藥緩釋片制劑配方本發(fā)明獲得的活性有效部位5克，羥丙甲纖維素13克，聚丙烯酸樹脂II2克。
制備方法取上述任一實(shí)施例中制備的蟲草抗心律失常有效部位共5克，加入填充劑羥丙甲纖維素13克和緩釋劑聚丙烯酸樹脂II 2克，混合均勻，制成緩釋片劑100片，每片的總重量為200mg，有效部位含量為50mg。
用法和用量用溫開水沖服，每次1片，一日3次。
實(shí)施例8本發(fā)明制備的活性部位制備抗心律失常藥注射劑配方本發(fā)明獲得的活性有效部位2.5克，其余為注射用水，定容至500ml。
制備方法取上述任一實(shí)施例中制備的蟲草抗心律失常有效部位共2.5克加入注射用水完全溶解，定容至500ml，以微孔濾膜過(guò)濾，灌裝，規(guī)格為5ml/瓶，得到蟲草總核苷注射液100瓶，有效部分的含量為25mg/瓶。
實(shí)施例9本發(fā)明制備的活性有效部位的藥效實(shí)驗(yàn)本發(fā)明制備的活性有效部位具有治療心律失常等心血管疾病作用，通過(guò)以下的藥效實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
實(shí)驗(yàn)試劑與材料本發(fā)明制備的活性有效部位；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(Sigma公司)；膠原酶II型(上海生工產(chǎn)品)；5％CaCl2注射液(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)030602)；鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)020801)。出生1-3天SD大鼠(乳鼠)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞；光電換能裝置及光電換能軟件系統(tǒng)。
1.有效部位對(duì)氯化鈣誘發(fā)的心肌細(xì)胞抗心律失常體外抑制作用試驗(yàn)方法 分別取以上本發(fā)明制備的活性有效部位，設(shè)不同梯度濃度0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml；以氯化鈣誘發(fā)的心肌細(xì)胞心律失常為模型組，分別以維拉帕米作陽(yáng)性對(duì)照；記錄給藥前后心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率和節(jié)律。采用細(xì)胞搏動(dòng)頻率絕對(duì)值數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果顯示A1、A2、A3、A4在1.0-10.0μg/ml濃度時(shí)，對(duì)氯化鈣所致的乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞正性頻率作用有明顯的改善效應(yīng)，其作用強(qiáng)度與10*10-6μmol/ml維拉帕米相當(dāng)。
有效部位對(duì)乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞氯化鈣誘發(fā)心律失常的體外抑制作用(n＝3)
注#p＜0.05 ##p＜0.01 ###p＜0.001氯化鈣組vs造模前組*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001有效部位組vs氯化鈣組結(jié)果 本發(fā)明所制備的活性有效部位成份明確，對(duì)氯化鈣誘發(fā)的心肌細(xì)胞心律失常試驗(yàn)證明了本發(fā)明所制備的活性有效部位在較低濃度下即可取得與維拉帕米相當(dāng)?shù)男Ч?，具備良好的抗心律失常效果?br> 2.有效部位對(duì)異丙腎上腺素誘發(fā)的乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞心律失常抑制作用試驗(yàn)方法 分別取本發(fā)明制備的活性有效部位，設(shè)不同梯度濃度0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml；以異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌細(xì)胞心律失常為模型組，分別以普萘洛爾作陽(yáng)性對(duì)照；記錄給藥前后心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率和節(jié)律。采用細(xì)胞搏動(dòng)頻率絕對(duì)值數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果顯示A1、A2、A3、A4在10.0μg/ml，50.0μg/ml濃度時(shí)對(duì)異丙腎上腺素所致的乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞正性頻率作用有明顯的改善效應(yīng)，其作用強(qiáng)度與0.500μg/ml普萘洛爾大致相當(dāng)。
有效部位對(duì)乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞異丙腎上腺素誘發(fā)心律失常的體外抑制作用(n＝3)
注#p＜0.05##p＜0.01###p＜0.001異丙腎上腺素組vs造模前組*p＜0.05 **p＜0.01 ***p＜0.001加有效部位組vs異丙腎上腺素組結(jié)果 本發(fā)明所制備的活性有效部位成份明確，對(duì)異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌細(xì)胞心律失常試驗(yàn)證明了本發(fā)明所制備的活性有效部位在較低濃度下即可取得與普萘洛爾相當(dāng)?shù)男Ч?，具備良好的抗心律失常效果?br> 3.有效部位急毒試驗(yàn)方法取以上本發(fā)明制備的活性有效部位，對(duì)其急性毒性進(jìn)行(半數(shù)致死量LD50)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表
結(jié)果 本發(fā)明制備的活性有效部位灌胃LD50為9.290g/kg，95％可信區(qū)間為8.507-10.14g/kg。
因此有效部位急毒試驗(yàn)表明了本發(fā)明所制備的活性有效部位毒性低，安全性高，有很好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種蟲草頭孢菌粉抗心律失常有效部位的制備方法，其特征是(1)將蟲草頭孢菌粉用2～5倍量的8％-98％乙醇浸泡12～48小時(shí)，然后用8％-98％乙醇超聲提??；(2)回收溶劑后得到含有效部位的乙醇提取物，再用蒸餾水超聲提取，得到水提取物；將水提取物均勻混懸在水中后用有機(jī)溶劑分步萃取，水提取物與混懸溶劑水的體積之比為3∶1，有機(jī)溶劑與含有效部位的混懸物體積之比為1∶1；(3)得到的萃取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿或氯仿與甲醇混合溶劑洗脫，得到抗心律失常的有效部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是步驟(2)中，將水提取物均勻混懸在含乙醇的水中后用有機(jī)溶劑分步萃取，乙醇∶水的體積之比為0.1～1.0∶9.9～9.0，水提取物與混懸溶劑含乙醇水的體積之比為3∶1，有機(jī)溶劑與含有效部位的混懸物體積之比為1∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征是分步萃取所用有機(jī)溶劑為環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、異丙醇或水飽和正丁醇中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是步驟(3)中洗脫用氯仿與甲醇混合溶劑時(shí)，其重量配比在10～1∶0～1之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是抗心律失常的有效部位主要成分為核苷類化合物腺苷、尿苷和胸苷，可作為心律失常的治療藥物。
6.一種藥物制劑，其特征是含有治療有效量的蟲草頭孢菌粉抗心律失常有效部位和一種或多種藥學(xué)上允許的賦形劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物制劑，其特征是含有5％～25％的有效部位和95％～75％的賦形劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的藥物制劑，其特征是所說(shuō)的藥物制劑是口服制劑或非腸道給藥的劑型，口服制劑選自片劑、膠囊劑、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊、口崩片、滴丸或軟膠囊制劑當(dāng)中的一種；非腸道給藥劑型選自透皮吸收劑或注射劑當(dāng)中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蟲草頭孢菌粉中產(chǎn)業(yè)化提取制備抗心律失常有效部位的新方法和藥物制劑，其方法為將蟲草頭孢菌粉以乙醇浸泡，超聲提??；回收溶劑后乙醇提取物均勻混懸在水中，分步萃?。惠腿∥锝?jīng)硅膠柱層析，以氯仿或氯仿與甲醇混合溶劑洗脫，得到抗心律失常的有效部位。該方法適合產(chǎn)業(yè)化大量制備，制備的有效部位可制成各種劑型，具有起效快、日服用劑量小、中藥毒副作用小等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1899319SQ200610052509
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月18日
發(fā)明者鄒崢嶸, 王如偉, 胡江寧, 姚新生, 顏小峰 申請(qǐng)人:浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司