專利名稱：手掌參提取物及在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥提取物及其在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺纖維化是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病。多種因素如細(xì)菌、粉塵、放射性物質(zhì)、創(chuàng)傷以及藥物均可引起肺纖維化。由于肺纖維化發(fā)病率高，治愈率低，目前缺乏有效的治療藥物而成為嚴(yán)重危害人民健康的疾病。如可以引起肺纖維化的疾病塵肺病是我國的一種主要職業(yè)病，自上世紀(jì)50年代以來我國累計(jì)報(bào)告塵肺病例58萬多人，已死亡14萬多人，現(xiàn)患者44萬多人。近年來塵肺病的流行呈現(xiàn)出群發(fā)性、低齡化以及致殘率高的新特點(diǎn)，2001年-2003年我國每年新發(fā)塵肺病患者1萬例左右，因此造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)90多億，間接損失難以計(jì)數(shù)。又如2003年造成影響全國的突發(fā)性事件的非典型肺炎SARS，也可以引起患者的肺纖維化?？傊?，隨著我國工業(yè)化的進(jìn)程，環(huán)境污染的加劇，各種原因造成的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年提高，多數(shù)會(huì)轉(zhuǎn)歸為肺纖維化，對(duì)我國國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展造成了很大的影響。目前，臨床上用于治療的肺纖維化的藥物存在副作用大，療效差等缺點(diǎn)，開發(fā)治療肺纖維化的新藥非常迫切和重要。
手掌參屬蘭科多年生草本植物的塊莖，味甘微苦，性平，入肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)益氣血、生津止渴、收斂止血等多種功效?，F(xiàn)代藥理研究表明手掌參含有多糖、甙類、菲類和芪類等多種活性成分，具有抗炎、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種手掌參提取物。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種手掌參提取物在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種手掌參提取物，用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量4-10倍的體積百分比濃度為50～70％乙醇水溶液浸泡18-30小時(shí)后，加熱回流提取0.5-3小時(shí)，過濾，所述提取次數(shù)為1-3次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.05-1.2，即制成一種手掌參提取物。
所述乙醇水溶液的加入量為手掌參生藥粉重量的8倍，所述乙醇水溶液的濃度為60％。
所述手掌參生藥粉的浸泡時(shí)間為24小時(shí)。
權(quán)利要求1-3之一的手掌參提取物，在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明手掌參提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺具有一定的治療作用，提示手掌參提取物在其它肺部纖維化病變也具有使用價(jià)值。


圖1手掌參醇提物對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織形態(tài)的影響(HE染色，×100)；圖2手掌參醇提物對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織I、III膠原合成的影響(天狼猩紅染色，×200)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種手掌參提取物，用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量8倍的體積百分比濃度為60％乙醇水溶液浸泡24小時(shí)后，加熱回流提取2小時(shí)，過濾，提取2次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.05，即制成一種手掌參提取物。
實(shí)施例2一種手掌參提取物，用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量4倍的體積百分比濃度為70％乙醇水溶液浸泡18小時(shí)后，加熱回流提取3小時(shí)，過濾，提取1次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.2，即制成一種手掌參提取物。
實(shí)施例3一種手掌參提取物，用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量10倍的體積百分比濃度為50％乙醇水溶液浸泡30小時(shí)后，加熱回流提取0.5小時(shí)，過濾，提取3次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.1，即制成一種手掌參提取物。
各種肺間質(zhì)疾病(如矽肺)，膠原性疾病所致的肺纖維化導(dǎo)致的肺間質(zhì)纖維化改變病理過程相似從肺泡炎開始，在發(fā)展和過度修復(fù)過程中導(dǎo)致肺纖維化。本發(fā)明采用大鼠氣管暴露法注入矽塵(50mg/只)造成矽肺動(dòng)物模型，隨機(jī)將大鼠分為四組，即對(duì)照組、染矽塵組、手掌參治療組、陽性藥對(duì)照組，大鼠染塵24小時(shí)后各治療組開始灌胃給藥(手掌參組每天給予手掌參醇提物8g/kg，陽性藥組隔日給予漢防己甲素50mg/kg)，觀察時(shí)間點(diǎn)為7天、14天、21天、28天、60天。在各時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下解剖后腹主動(dòng)脈取血及摘取肺臟，作病理和生化分析。主要指標(biāo)包括臟器系數(shù)；天狼猩紅染色觀測I III膠原合成；丙二醛含量；超氧化物歧化酶活力；谷胱甘肽過氧化物酶活力；常規(guī)HE染色觀測肺病理變化。結(jié)果顯示矽肺組和治療組在上述指標(biāo)上都存在顯著性差異，與傳統(tǒng)的抗矽肺藥物漢防己甲素療效相當(dāng)。從而，證實(shí)了本發(fā)明的手掌參提取物可有效用于抗肺纖維化的治療。
利用本發(fā)明的一種手掌參提取物與藥學(xué)上可接受的載體，制成各種劑型，如顆粒劑、片劑、膠囊、丸劑和液體藥劑等形式口服給藥。
實(shí)施例4本發(fā)明手掌參提取物的藥效學(xué)試驗(yàn)材料和方法材料1動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠160只，雄性，體重200-240g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2試劑 SiO2購于美國Sigma公司，純度99％，粒子大小范圍在0.5-10μm，80％的粒子直徑在1-5μm之間，用生理鹽水配成50g/L混懸液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用；天狼猩紅購于Mobay化學(xué)試劑公司；MDA、SOD和GHS-Px試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
3藥物 手掌參購于西藏藥品公司，經(jīng)本校生藥教研室鑒定符合藥用。用實(shí)施例1的方法制備。
方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及模型的建立根據(jù)隨機(jī)化原則將160大鼠分為對(duì)照組、染矽塵組、手掌參提取物治療組、陽性藥對(duì)照組，各40只。經(jīng)腹腔注射0.4％戊巴比妥麻醉后，于無菌條件下，在大鼠頸部皮膚正中線縱向切口，暴露氣管，對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)注入1ml滅菌生理鹽水，染矽塵組、手掌參治療組和陽性藥對(duì)照組注入1ml配制好的矽塵混懸液。染塵后第2d，手掌參治療組按8g·kg-1·d-1灌胃給予用實(shí)施例1的方法制備的手掌參提取物，陽性藥對(duì)照組按50mg·kg-1·3d-1給予漢防己甲素，對(duì)照組、染矽塵組給予等容蒸餾水。
2血漿丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)；谷胱甘肽過氧化物酶活力(GHS-Px)的測定染塵后第7、14、21、28、60d各組分別取8只大鼠，稱重后，腹主動(dòng)脈取血，離心得血漿，采用硫代巴比妥酸顯色法測定含量；采用亞硝酸鹽形成法測定SOD活力；采用二硝基苯甲酸直接法測定GHS-Px活力。操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。
3肺組織標(biāo)本的處理 取血后處死大鼠，經(jīng)右心灌注生理鹽水沖洗肺內(nèi)血液，將整個(gè)肺臟從胸腔內(nèi)取出，剔除氣管、支氣管等結(jié)締組織，在生理鹽水內(nèi)漂洗一次，記錄肉眼病理變化，電子天平稱肺重，計(jì)算肺系數(shù)(肺系數(shù)＝肺重/體重)。取左肺中段用10％中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色和天狼猩紅染色。
4圖象分析 用Nikon E600POL偏振光顯微鏡觀察大鼠肺組織I III型膠原的形成。每組至少觀察5只動(dòng)物，每只動(dòng)物隨機(jī)觀察一張切片，每張切片隨機(jī)選取上、中、下、左、右5個(gè)視野，攝像并存入計(jì)算機(jī)，然后用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。用HIS模式(Hue，Saturation，Intensity)將陽性目標(biāo)從背景色中分離出來，用陽性區(qū)域的面積百分比代表膠原含量。
5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)值均用x±s表示，在不同時(shí)間點(diǎn)四組間的比較用單因素方差分析的LSD法，全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS 11.5 for windows統(tǒng)計(jì)分析軟件。
結(jié)果與分析1肺臟器系數(shù)染矽塵組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織臟器系數(shù)均高于對(duì)照組，在14d、21d、28d、60d有顯著性差異(P＜0.01)。與染矽塵組比較，手掌參提取物治療組肺組織臟器系數(shù)在14d、21d、28d、60d時(shí)顯著降低(P＜0.05)，陽性藥對(duì)照組在14d、28d、60d時(shí)顯著降低(P＜0.05)，兩組間在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異。見表1。
2I、III膠原含量染矽塵組I型膠原面積百分比呈進(jìn)行性增加，與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)都有顯著性差異(P＜0.01)；手掌參提取物治療組各時(shí)間點(diǎn)I型膠原面積百分比亦高于對(duì)照組，都有顯著性差異(P＜0.05)。與染矽塵組比較，手掌參提取物治療組及陽性藥對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)I型膠原面積百分比低于染矽塵組，差異有顯著性(P＜0.01)。表明矽塵能夠增加染矽塵大鼠I型膠原的形成，手掌參提取物對(duì)矽塵誘導(dǎo)的I型膠原的增加具有抑制作用，作用與陽性藥相當(dāng)。與對(duì)照組比較，染矽塵組各時(shí)間點(diǎn)III膠原面積百分比都高于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05)；與染矽塵組比較，手掌參提取物及陽性藥對(duì)照組治療組各時(shí)間點(diǎn)III膠原面積百分比均低于染矽塵組，14d、21d有顯著性差異(P＜0.01)。見表2-3。
3血漿丙二醛含量與對(duì)照組比較，染矽塵組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿MDA含量顯著升高，其中7d、14d、21d、28d時(shí)P＜0.01，60d時(shí)P＜0.05。手掌參提取物治療組及陽性藥組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿MDA含量均低于染矽塵組，其中7d、14d、21d、28d時(shí)有顯著性差異(P＜0.05)。見表4。
4血漿超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽過氧化物酶活力與對(duì)照組比較，不同時(shí)間點(diǎn)染矽塵組大鼠血漿SOD及GSH-PX活力變化相似除在7d時(shí)略高外，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低。SOD在14d、21d、28d、60d顯著降低(P＜0.05)，GSH-PX在14d、21d、28d顯著降低((P＜0.05)，其中14d時(shí)陡然下降到最低(P＜0.01)然后開始緩慢增加。與染矽塵組比較，手掌參治療組及陽性藥組大鼠血漿SOD及GSH-PX活力從14d開始均不同程度地增高，在14d、21d、28d時(shí)有顯著性差異(P＜0.05)。見表5-6。
5病理結(jié)果5.1HE染色結(jié)果對(duì)照組，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。染矽塵組，注入矽塵后7d，肺泡隔水腫并明顯增厚，內(nèi)有淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞侵潤，肺泡腔小肉芽腫彌漫存在，并融合成較大的肉芽腫，可發(fā)生中心壞死。肉芽腫內(nèi)伴有成纖維細(xì)胞增生、膠原纖維形成和玻璃樣變化，出現(xiàn)膠原性結(jié)節(jié)和纖維化改變，病灶內(nèi)肺泡腔變小。14d時(shí)，肺泡隔仍有較多的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少數(shù)中性粒細(xì)胞侵潤，伴有較多的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生并平行排列，肺泡壁增厚，可見膠原纖維積聚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斑片狀纖維化。細(xì)胞結(jié)節(jié)數(shù)量多，體積大。21d時(shí)，肺泡間隔斷裂現(xiàn)象較嚴(yán)重，肉芽腫大面積纖維化，結(jié)節(jié)間有灶性肺氣腫形成。28d時(shí)，肺泡壁顯著增厚，肺泡結(jié)構(gòu)大部遭到破壞，部分肺泡腔消失，由膠原纖維和成纖維細(xì)胞占據(jù)，肺組織廣泛纖維化，可見纖維性結(jié)節(jié)。60d時(shí)纖維組織明顯增生，形成巨大的纖維性矽結(jié)節(jié)。手掌參提取物治療組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)HE染色結(jié)果介于與矽塵組與對(duì)照組之間，肺泡炎和纖維化有不同程度的減輕。見圖1。圖1中A7天，對(duì)照組；B7天，矽肺組；C7天，手掌參提取物治療組；D14天，對(duì)照組；E14天，矽肺組；F14天，手掌參提取物治療組；；G21天，對(duì)照組；H21天，矽肺組；I21d天，手掌參提取物治療組；J28天，對(duì)照組；K28天，矽肺組；L28天，手掌參提取物治療組；M60天，對(duì)照組；N60天，矽肺組；O60天，手掌參提取物治療組。
5.2天狼猩紅染色鏡下觀對(duì)照組，肺泡隔正常。染矽塵組，7d時(shí)，正常肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，取而代之的是交織存在的兩型膠原I型膠原較粗，呈桔黃、深紅色；III型膠原較細(xì)，呈淡綠色。14d時(shí)，可見彌漫性、淡綠色彎曲的膠原呈網(wǎng)織狀存在，其間夾雜少量粗大的桔黃色纖維及矽塵顆粒。21d時(shí)，淡綠色膠原進(jìn)一步增加，桔紅色膠原也增加，但相對(duì)較少。28d時(shí)，粗大的桔紅色膠原明顯增多，與纖細(xì)的淡綠色膠原呈網(wǎng)狀交織存在，布滿整個(gè)視野，其間夾雜矽塵顆粒。60d時(shí)，粗大的桔紅色膠原進(jìn)一步增加，纖細(xì)的淡綠色膠原較少。手掌參醇提物治療組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的膠原染色介于染矽塵組和對(duì)照組之間，兩種膠原的數(shù)量有不同程度的減少，在28d和60d時(shí)，尤為明顯。見圖2。圖2中A7天，對(duì)照組；B7天，矽肺組；C7天，手掌參提取物治療組；D14天，對(duì)照組；E14天，矽肺組；F14天，手掌參提取物治療組；；G21天，對(duì)照組；H21天，矽肺組；I21d天，手掌參提取物治療組；J28天，對(duì)照組；K28天，矽肺組；L28天，手掌參提取物治療組；M60天，對(duì)照組；N60天，矽肺組；O60天，手掌參提取物治療組。
從以上結(jié)果表明手掌參提取物可以提高染矽塵大鼠機(jī)體抗氧化能力，減少矽塵導(dǎo)致的氧化損傷，抑制矽肺早期的炎癥反應(yīng)和中后期I、III膠原合成的增加。從而，證實(shí)了本發(fā)明的手掌參提取物可有效用于抗肺纖維化的治療。
表1 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺臟器系數(shù)的影響(n＝8，x±S，mg/g)

*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較表2 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)I型膠原面積百分比的影響(n＝8，x±S，％)

p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較表3 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)III型膠原面積百分比的影響(n＝8，x±S，％)

*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較表4 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿MDA含量的影響(n＝8，x±S，nmol/ml)

p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較表5 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺臟器系數(shù)的影響(n＝8，x±S，U/ml)

*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較表6 手掌參對(duì)染矽塵大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿GHS-PX活力的影響(n＝8，x±S，U)

*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01vs與矽肺組比較。
權(quán)利要求
1.一種手掌參提取物，其特征是用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量4-10倍的體積百分比濃度為50～70％乙醇水溶液浸泡18-30小時(shí)后，加熱回流提取0.5-3小時(shí)，過濾，所述提取次數(shù)為1-3次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.05-1.2，即制成一種手掌參提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種手掌參提取物，其特征是所述乙醇水溶液的加入量為手掌參生藥粉重量的8倍，所述乙醇水溶液的濃度為60％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種手掌參提取物，其特征是所述手掌參生藥粉的浸泡時(shí)間為24小時(shí)。
4.權(quán)利要求1-3之一的手掌參提取物，在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種手掌參提取物及在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，手掌參提取物是用下述方法制成將手掌參生藥粉碎后過篩，用所述手掌參生藥粉重量4－10倍的體積百分比濃度為50～70％乙醇水溶液浸泡18－30小時(shí)后，加熱回流提取0.5－3小時(shí)，過濾，所述提取次數(shù)為1－3次，合并濾液，濾液減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.05－1.2，即制成一種手掌參提取物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明手掌參提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺具有一定的治療作用，提示手掌參提取物在其它肺部纖維化病變也具有使用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K125/00GK101077390SQ20061001379
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者王世鑫, 汪駿, 曾錦波 申請(qǐng)人:中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院