專利名稱：一種杠柳苷元的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是一種杠柳苷元的制備方法。
背景技術(shù)：
中藥香加皮(又名北五加皮、杠柳皮)是蘿藦科植物杠柳(Periploca sepium)的干燥根皮，中醫(yī)認為其具有祛風(fēng)濕、強筋骨的功效，主要用于風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟、心悸氣短、下肢浮腫等。
香加皮中含有強心苷成分杠柳毒苷(periplocin，C36H56O13)，杠柳毒苷也存在于杠柳植物的莖(包括莖皮和莖的木質(zhì)部)中，這種成分也存在于杠柳的同屬植物黑龍骨(又名滇杠柳，Periploca forrestii)中。
杠柳毒苷在一定條件下可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦芰赵?C30H46O8)。
杠柳苷元有強心和抗腫瘤等藥理作用。據(jù)中華醫(yī)學(xué)雜志[J].1956，7651李章文等《杠柳皮(北五加皮)的強心作用》一文報道，杠柳苷元也有強心作用，而且起效迅速，蓄積性小。據(jù)中草藥[J].2006，37(4)519陳書紅等《香加皮的抗腫瘤活性成分研究(I)》一文中報道杠柳苷元對MCF-7腫瘤細胞增殖有很強的抑制作用。
關(guān)于杠柳苷元的制備目前沒有成熟的可以工業(yè)化的生產(chǎn)方法。Hideji Itokawa等在《Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploca Sepium》(Chem.Pharm.Bull，1987，35(11)4524)中公布的分離杠柳苷元的方法是用甲醇提取香加皮→正己烷萃取后→水層用氯仿萃取→反復(fù)硅膠柱層析→C18反相柱層析→杠柳毒苷→酸醇水解→硅膠柱層析→杠柳苷元。此工藝是先得到杠柳毒苷單體再水解得到杠柳苷元，流程較長，反復(fù)硅膠柱層析不僅耗費有機溶劑，而且對杠柳毒苷的死吸附量較大；另外杠柳毒苷的分子中帶有兩個糖分子，有一定的極性，在氯仿中幾乎不溶(孫文基天然藥物成分提取分離與制備.1994，北京中國醫(yī)藥科技出版社269)，因此本工藝只能將藥材中的微量的杠柳毒苷提取出來，采用此方法得到杠柳苷元成本較高。
胡英杰在《滇杠柳的化學(xué)成分》(云南植物研究[J]，1989，11(4)465)中報道的杠柳苷元的分離方法是以滇杠柳藥材為原料，經(jīng)過95％乙醇提取→石油醚脫脂→丙酮回流→硅膠柱層析→氯仿-甲醇混合溶劑洗脫→杠柳苷元單體，收率為0.06％。陳書紅等在《香加皮的抗腫瘤活性成分研究(I)》中采用的分離方法是80％乙醇提取→石油醚萃取后→水層用乙醚萃取→水層用乙酸乙酯萃取→硅膠柱層析→氯仿-甲醇混合溶劑洗脫→杠柳苷元單體，收率為3.6×10-4％。以上兩種分離方法基本上是直接采用有機溶媒提取原料中微量存在的杠柳苷元，而未對原料進行水解將杠柳毒苷變?yōu)楦芰赵虼耸章屎艿?，造成藥材資源浪費，工藝流程較長，無法實現(xiàn)大批量工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種杠柳苷元單體產(chǎn)率高、工藝方法簡單、低成本、可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的杠柳苷元的制備方法。
本發(fā)明的杠柳苷元的制備方法，包括如下步驟(1)對含有杠柳毒苷的原料進行酸水解和收集，得到中間體A；(2)將中間體A進行柱層析，采用洗脫劑進行梯度洗脫或等度洗脫，合并含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(3)將中間體B重結(jié)晶或高效液相制備得到純度為90％～100％的杠柳苷元；所述重結(jié)晶的溶劑為C1-3低級脂肪醇之一種，優(yōu)選甲醇或乙醇。
本發(fā)明所述含杠柳毒苷的原料可以是香加皮提取物、香加皮藥材、滇杠柳藥材(即杠柳的同屬植物黑龍骨，Periploca forrestii)、杠柳的莖(包括莖皮和莖的木質(zhì)部)或其他含有杠柳毒苷的中藥材。
本發(fā)明所述的酸水解所用的酸為無機酸或有機酸例如鹽酸、硫酸、醋酸、甲酸等等；水解溫度為10～100℃，水解時間為0.1～48小時，水解的PH值控制在1～6。
本發(fā)明所述酸水解和收集可以一步完成或分兩步完成。
酸水解和收集的一步完成是采用有機溶劑與酸水的混合溶液對含有杠柳毒苷的原料進行酸水解，分離有機層，濃縮干燥后得到中間體A；酸水解和收集的兩步完成是(1)先采用酸水溶液或含有5-95％的C1-3低級脂肪醇的酸水溶液進行酸水解，濃縮；若用含有Cl-3低級脂肪醇的酸水溶液進行酸水解，在濃縮時應(yīng)揮凈脂肪醇。(2)用有機溶劑對步驟(1)的濃縮液進行1次或多次萃取，萃取液再濃縮干燥后得到中間體A。其中所述有機溶劑為乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙醚、二氯甲烷之一種；常用的C1-3低級脂肪醇包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇等等，優(yōu)選甲醇、乙醇。
本發(fā)明所述的柱層析包括正向柱層析、反相柱層析，其中正向柱層析填料為80目～400目的硅膠或三氧化二鋁；反向柱層析所用填料是5μm或10μm粒度的C18或C8。
柱層析所用洗脫劑的體積比一般位為10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、乙醚、石油醚、正己烷、四氫呋喃、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、水之二種。優(yōu)選的體積比為10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、水之二種。例如石油醚—乙酸乙酯混合溶液；甲醇—水混合溶液；石油醚—氯仿混合溶液；石油醚—乙醇混合溶液等等。
本發(fā)明可以采用梯度洗脫，也可以采用等度洗脫，收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥，得到中間體B。將中間體B進行重結(jié)晶得到純度為90％～100％的杠柳苷元；所述重結(jié)晶所用溶劑為甲醇、乙醇等低級脂肪醇之一種。
本發(fā)明所述的中間體B采用高效液相制備的方法如下C18或C8反相制備色譜柱；色譜條件流動相為甲醇—水；檢測波長218nm～220nm，監(jiān)視流出曲線以指導(dǎo)產(chǎn)品收集，得到杠柳苷元收集液；收集液濃縮干燥，得到杠柳苷元純品。
用本發(fā)明方法制備的杠柳苷元經(jīng)UV、IR、MS、13C、NMR結(jié)構(gòu)鑒定確認為杠柳苷元。光譜數(shù)據(jù)與Hideji Itokawa等在文獻《Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fractionfrom Periploca Sepium》(Chem.Pharm.Bull，1987，35(11)4524)中公布的杠柳苷元的光譜鑒定數(shù)據(jù)一致。
(1)紫外光譜 樣品的紫外光譜的λmax為218nm。UV譜圖見附圖1。
(2)紅外光譜 樣品的主要吸收為3408，1777，1740，1628cm-1。樣品的IR譜圖見附圖2。
(3)質(zhì)譜 樣品的分子離子峰為m/z 390(M+)，基峰為m/z 373(M+-OH)。其質(zhì)譜譜圖見附圖3。
(4)核磁共振 樣品的1H-NMR譜圖見附圖4，13C-NMR譜圖見附圖5。樣品的核磁共振譜圖中各譜線的歸屬分別見表1和表2。
表11H-NMR譜數(shù)據(jù)及歸屬

表213C-NMR譜數(shù)據(jù)及歸屬


本發(fā)明制備杠柳苷元的方法，與現(xiàn)有技術(shù)的主要區(qū)別在于(1)本發(fā)明是先將原料中的杠柳毒苷水解為杠柳苷元后再采用有機溶媒進行萃取富集和柱層析，因此收率明顯提高。例如現(xiàn)有技術(shù)中香加皮藥材采用有機溶媒萃取的收率僅為3.6×10-4％，而且工藝流程長，很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而采用本發(fā)明的技術(shù)方案后所得杠柳苷元單體的收率可高達0.21～1.7％。
(2)本發(fā)明的工藝簡單，采用了酸水解后再分離的方法，簡化了工藝，降低了有機溶劑用量，從而使成本大大降低，可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；所制備的杠柳苷元經(jīng)重結(jié)晶或HPLC制備后純度可以達到90％～100％。


圖1為所制備杠柳苷元的UV圖。
圖2為所制備杠柳苷元的IR圖。
圖3為所制備杠柳苷元的MS圖。
圖4為所制備杠柳苷元的1H-NMR圖。
圖5為所制備杠柳苷元的13C-NMR圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的說明。其中所制備的杠柳苷元結(jié)晶的UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR圖詳見說明書附圖。
杠柳毒苷易溶于甲醇和乙醇，微溶于水，所以無論是以水、醇還是醇水混合的溶劑制備的提取物中均含有杠柳毒苷。采用專利技術(shù)(專利申請?zhí)?00410019975.5香加皮強心作用有效提取物、制備方法及用途)制備的香加皮提取物，因為使用了大孔樹脂純化，所以提取物中富集了杠柳毒苷，使杠柳毒苷的含量更高。以上均可作為制備杠柳苷元的原料。因為香加皮藥材中杠柳毒苷含量較低，而香加皮提取物中較高，所以以提取物為原料時杠柳苷元的產(chǎn)率較高。
實施例1杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取香加皮提取物100克，用pH為3的鹽酸水溶液與等體積的氯仿混合溶液進行酸水解，時間為1小時，溫度為80℃。
(2)水解完畢分出氯仿層，濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為硅膠，采用梯度洗脫，洗脫劑為10∶0～10的乙酸乙酯—甲醇混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(4)將中間體B用乙醇進行重結(jié)晶，得到杠柳苷元結(jié)晶1.7克，收率為1.7％。
實施例2杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取香加皮提取物100克，用pH為1的鹽酸水溶液進行酸水解，時間為0.1小時，溫度為100℃。
(2)用乙酸乙酯對(1)的酸水解液萃取3次，萃取液濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為三氧化二鋁，采用梯度洗脫，洗脫劑為10∶0～10的乙酸乙酯—乙醇混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(4)將中間體B用乙醇進行重結(jié)晶，得到杠柳苷元結(jié)晶1.5克，收率為1.5％。
實施例3杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取香加皮藥材1公斤，用pH為6的硫酸水溶液進行酸水解，時間為48小時，溫度為10℃。
(2)用乙醚對(1)的酸水解液進行萃取，萃取液濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為C18，采用等度洗脫，洗脫劑為10∶5的甲醇—水混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(4)將中間體B進行高效液相制備色譜柱Hypersil(5μm，20×250mm)，流動相為甲醇—水(70∶30)，流速2.5mL/min，得到杠柳苷元純品2.1克，收率為0.21％。
實施例4杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取滇杠柳藥材1公斤，用pH為2的硫酸水溶液與等體積的乙酸乙酯混合溶液進行酸水解，時間為6小時，溫度為40℃。
(2)分出乙酸乙酯層，濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為C8，采用等度洗脫，洗脫劑為10∶6的乙醇—水混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(4)將中間體B進行高效液相制備色譜柱Irregular C18(10μm，20×200mm)，流動相為甲醇—水(65∶35)，流速3.0mL/min，得到杠柳苷元純品3.2克，收率為0.32％。
實施例5杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取香加皮提取物100克，用pH為2的醋酸水溶液進行酸水解，時間為4小時，溫度為50℃。
(2)用氯仿對(1)的酸水解液進行萃取，萃取液濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為硅膠，采用梯度洗脫，洗脫劑為10∶0～10∶10的石油醚—氯仿混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B。
(4)將中間體B用甲醇進行重結(jié)晶，得到杠柳苷元結(jié)晶1.35克，收率為1.35％。
實施例6杠柳苷元的制備方法，其工藝步驟為(1)取杠柳莖1公斤，用pH為4的甲酸水溶液進行酸水解，時間2小時，溫度為70℃。
(2)用乙醚對(1)的酸水解液進行萃取，萃取液濃縮干燥得到中間體A。
(3)將中間體A進行柱層析，柱填料為硅膠，采用等度洗脫，洗脫劑為10∶5的石油醚—乙酸乙酯混合溶液；收集含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B。
(4)將中間體B用甲醇進行重結(jié)晶，得到杠柳苷元結(jié)晶3.0克，收率為0.3％。
權(quán)利要求
1.一種杠柳苷元的制備方法，其特征是包括如下步驟(1)對含有杠柳毒苷的原料進行酸水解和收集，得到中間體A；(2)將中間體A進行柱層析，采用洗脫劑進行梯度洗脫或等度洗脫，合并含有杠柳苷元的餾分，濃縮干燥后得到中間體B；(3)將中間體B重結(jié)晶或高效液相制備得到純度為90％～100％的杠柳苷元；所述重結(jié)晶的溶劑為C1-3低級脂肪醇之一種。
2.如權(quán)利要求1所述杠柳苷元的制備方法，其中所述含杠柳毒苷的原料可以是香加皮提取物、香加皮藥材、杠柳的莖和滇杠柳藥材或其他含有杠柳毒苷的中藥材。
3.如權(quán)利要求1所述杠柳苷元的制備方法，其中所述酸水解和收集可以一步完成，或分兩步完成。
4.如權(quán)利要求3所述杠柳苷元的制備方法，其中酸水解和收集的一步完成是采用有機溶劑與酸水的混合溶液對含有杠柳毒苷的原料進行酸水解，分離有機層，濃縮干燥后得到中間體A；兩步完成是(1)先采用酸水溶液或含有5-95％的C1-3低級脂肪醇的酸水溶液進行酸水解，濃縮；(2)用有機溶劑對步驟(1)的濃縮液進行1次或多次萃取，萃取液再濃縮干燥后得到中間體A；其中所述有機溶劑為乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙醚、二氯甲烷之一種；水解溫度為10～100℃，水解時間為0.1～48小時，水解的PH值控制在1～6。
5.如權(quán)利要求1所述杠柳苷元的制備方法，其中所述柱層析包括正向柱層析、反相柱層析；所用洗脫劑的體積比為10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、乙醚、石油醚、正己烷、四氫呋喃、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、水之二種。
6.如權(quán)利要求5所述杠柳苷元的制備方法，其中所用洗脫劑的體積比為10∶0～10的乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、水之二種。
7.如權(quán)利要求5所述杠柳苷元的制備方法，其中正向柱層析填料為硅膠或三氧化二鋁；反向柱層析所用填料是C18或C8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杠柳苷元的制備方法，其步驟為(1)對含有杠柳毒苷的原料進行酸水解和收集，得到中間體A；(2)將中間體A進行柱層析，濃縮干燥后得到中間體B；(3)將中間體B重結(jié)晶或高效液相制備得到純度為90％～100％的杠柳苷元。應(yīng)用本發(fā)明的方法制備杠柳苷元，將原料中的杠柳毒苷水解為杠柳苷元后再進行萃取和柱層析，因此收率高，工藝簡單，降低了有機溶劑用量，成本低，可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P9/00GK1850847SQ20061001362
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者高秀梅, 劉虹, 張伯禮, 王怡, 潘桂湘, 郭俊華 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)