專利名稱：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種緩釋微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位特殊類型神經(jīng)元的逐漸喪失或者損傷而導(dǎo)致的以神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要臨床表現(xiàn)的一類疾病，譬如老年性癡呆，老年性癡呆是因?yàn)榛浊澳X膽堿能神經(jīng)元的潰變死亡導(dǎo)致病人出現(xiàn)的以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力的損害，并伴有不同程度的運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言和人格等多方面的異常?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子敏感神經(jīng)元，它們的細(xì)胞膜上有P75NTF受體和TrkA受體，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與這些受體結(jié)合后，能提高膽堿能神經(jīng)元的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活能力，發(fā)揮正常的生理功能；將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子向側(cè)腦室灌注，能夠使?jié)⒆兊哪憠A能神經(jīng)元存活并且促進(jìn)神經(jīng)元再生新的突觸。此外，與帕金森病、亨廷頓病密切相關(guān)的多巴胺能神經(jīng)元以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他多種類型的神經(jīng)元都是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子敏感神經(jīng)元。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已在臨床上成功地應(yīng)用于老年性癡呆、帕金森病以及腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗(yàn)性治療。
現(xiàn)代生物技術(shù)使大規(guī)模生產(chǎn)高純度的重組生長(zhǎng)因子成為可能，現(xiàn)在人們可以用各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。但是，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子應(yīng)用于病人還有一些困難①多數(shù)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物半衰期往往較短，故需要反復(fù)大劑量應(yīng)用，因此增加了治療的成本；②多數(shù)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是大分子物質(zhì)，較難透過(guò)血腦屏障，必須長(zhǎng)期的側(cè)腦室埋管灌注，長(zhǎng)期的側(cè)腦室埋管灌注能夠引起病人劇烈的背痛和體重的明顯減輕等副作用，并且大大增加了顱內(nèi)感染的機(jī)會(huì)；③許多機(jī)體組織細(xì)胞也存在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的受體，因此全身應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子將引起廣泛的毒性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生物半衰期長(zhǎng)、能夠配制成注射液的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將5mg-15mg質(zhì)量比為1/2000-1/50的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去離子水中；(2)將50mg-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或體積比為5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；
(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20-40W的條件下超聲0.5-2min或2000-4000rpm勻速攪拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板源性生長(zhǎng)因子之一。
所述天然高分子囊材為明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉或殼聚糖之一。
所述半合成高分子囊材為羧甲基纖維素鈉、醋酸纖維素酞酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素或羥丙甲基纖維素之一。
所述合成高分子囊材為聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一，這些聚合物的分子量沒(méi)什么特殊要求，可用的范圍很寬。
一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法，是由下述步驟組成(1)將5mg-15mg質(zhì)量比為1/2000-1/50的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去離子水中；(2)將50-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或體積比為5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20-40W的條件下超聲0.5-2min或2000-4000rpm勻速攪拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板源性生長(zhǎng)因子之一。
所述天然高分子囊材為明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉或殼聚糖之一。
所述半合成高分子囊材為羧甲基纖維素鈉、醋酸纖維素酞酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素或羥丙甲基纖維素之一。
所述合成高分子囊材為聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是①微球能夠維持包載的蛋白類藥物在較長(zhǎng)的時(shí)期活性不變；②微球能夠配制成注射劑，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行腦內(nèi)注射，避免對(duì)周圍腦組織的損傷，同時(shí)起到藥物的靶向給藥作用，從而大大方便了臨床上的應(yīng)用；③微球能夠持續(xù)或脈沖式釋放有生物活性蛋白幾周甚至幾個(gè)月，避免了生物半衰期較短的蛋白藥物要多次應(yīng)用給病人帶來(lái)的不便。因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來(lái)新的希望。


圖1為FITC標(biāo)記的rhNGF-PLGA緩釋微球在熒光顯微鏡下的照片(200×)；圖2為FITC標(biāo)記的rhNGF-PLGA緩釋微球共聚焦激光顯微鏡下的照片；圖3為實(shí)例1制備的rhNGF-PLGA微球進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)相差顯微鏡下的照片，A為.培養(yǎng)基中加入rhNGF(30ng/ml)(200×)；B.為培養(yǎng)基中加入從rhNGF微球中釋放的rhNGF(30ng/ml)(200×)；C為.培養(yǎng)基中加入不含NGF的白蛋白微球的釋放釋放液(400×)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF)/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PLGA)溶于4ml體積比為3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20W的條件下超聲1min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
比較不同的蛋白/多聚物比率對(duì)微球的粒徑、蛋白載藥量和包封率的影響，同時(shí)觀察不同的蛋白/多聚物比率制備的微球體外釋放藥物特征的差異。
結(jié)果顯示所得微球呈圓形，形態(tài)圓整，粒徑分布較均勻；蛋白/多聚物比率越低，蛋白的包封率越高，突釋效應(yīng)越??；粒徑和蛋白載藥量逐漸增大。
FITC標(biāo)記的rhNGF-PLGA緩釋微球的制備按照實(shí)例1的方法制備FITC標(biāo)記的rhNGF-PLGA緩釋微球，將5mg rhNGF/FITC標(biāo)記的白蛋白(1/2000，w/w)溶于100μl去離子水中，100mg PLGA溶于4ml二氯甲烷/丙酮(3∶1，v/v)的混合溶液中，將蛋白溶液加到PLGA溶液中，在冰浴條件下超聲1min(超聲功率為20W)，即形成油包水(W1/O)型的乳液，然后，將蛋白和PLGA的混合溶液加入25ml1％PVA的水溶液中，在冰浴的條件下勻速攪拌5min(1000rpm)，即形成水包油包水(W1/O/W2)型的復(fù)乳液。在常壓下，磁力攪拌3-4h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗三遍除掉微球表面的PVA和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，最后冷凍干燥24h，去除微球中的水分。
分別在熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡下觀察蛋白在微球中的分布。結(jié)果顯示微球形態(tài)圓整，粒徑分布較均勻，蛋白均勻地分布在微球中。
實(shí)施例2一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將5mg質(zhì)量比為1/50的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于50μl去離子水中；(2)將50mg明膠溶于3ml一氯甲烷中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20W超聲2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20ml質(zhì)量百分比為10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌4min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗3遍，冷凍干燥24h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例3一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將15mg質(zhì)量比為1/2000的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3/白蛋白混合物溶于200μl去離子水中；(2)將300mg阿拉伯膠溶于10ml二氯甲烷中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為40W超聲0.5min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到35ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800rpm攪拌10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗4遍，冷凍干燥20h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例4一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將7mg質(zhì)量比為1/1000的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將60mg海藻酸鈉溶于5ml三氯甲烷中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為30W超聲1min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例5一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6/白蛋白混合物溶于150μl去離子水中；(2)將100mg殼聚糖溶于7ml體積比為5/1的一氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為30W超聲1min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例6一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/1000的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將200mg羧甲基纖維素鈉溶于3/2的一氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在2000rpm勻速攪拌3min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例7一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將5mg質(zhì)量比為1/100的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將150mg醋酸纖維素酞酸酯溶于8ml 5/2的一氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在4000rpm勻速攪拌0.5min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；
(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例8一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg鄰苯二甲酸醋酸纖維素溶于5ml 5/1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例9一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將15mg質(zhì)量比為1/1500的胰島素樣生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg乙基纖維素溶于5ml 3/2的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌1min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例10一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將15mg質(zhì)量比為1/500的白細(xì)胞介素/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg甲基纖維素溶于5ml 5/2的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例11一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成
(1)將15mg質(zhì)量比為1/200的表皮生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg羥丙甲基纖維素溶于4ml 5/1的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例12一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/1000的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚乳酸溶于4ml 3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例13一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/1000的血小板源性生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚乙醇酸溶于4ml 5/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例14一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚乙烯醇溶于4ml體積比為3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例15一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚苯乙烯溶于5ml體積比為4∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例16一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚己內(nèi)酯溶于6ml體積比為3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例17一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚氨基酸溶于4ml體積比為3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)施例18一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，是用下述方法制成(1)將10mg質(zhì)量比為1/2000的重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子/白蛋白混合物溶于100μl去離子水中；(2)將100mg聚乳酸-聚乙醇酸共聚物溶于4ml體積比為3∶1的二氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在3000rpm勻速攪拌2min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到25ml質(zhì)量百分比為1％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，1000rpm攪拌5min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌3h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗3遍，除掉微球表面的聚乙烯醇和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，冷凍干燥24h，去除微球中的水分，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
實(shí)例19.
不同的水溶性添加劑對(duì)蛋白包封率的影響按照實(shí)例1的方法制備rhNGF-PLGA緩釋微球。將甘油、蔗糖和聚乙烯醇加到蛋白溶液(5mg rhNGF/白蛋白(1/2000，w/w)，100μl去離子水)中，形成不同濃度的甘油、蔗糖和聚乙烯醇-蛋白溶液(5％和10％)；將蛋白溶液加到PLGA溶液(100mg PLGA溶于4ml二氯甲烷/丙酮(3∶1，v/v))中，在冰浴條件下超聲形成油包水(W1/O)型的乳液。然后，將蛋白和PLGA的混合溶液加入25ml 1％ PVA的水溶液中，在冰浴的條件下勻速攪拌5min(1000rpm)，即形成水包油包水(W1/O/W2)型的復(fù)乳液。在常壓下，磁力攪拌3-4h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，固化的微球通過(guò)離心(12000rpm，10min)收集，用去離子水清洗三遍除掉微球表面的PVA和沒(méi)有包進(jìn)的藥物，最后冷凍干燥24h，去除微球中的水分。
重點(diǎn)比較內(nèi)水相中不同濃度的水溶性添加劑對(duì)蛋白包封率的影響。結(jié)果顯示內(nèi)水相中加有10％的聚乙烯醇能夠?qū)⒌鞍装饴蕪?9.1％提高到97.5％。
實(shí)例20微球中藥物活性的鑒定將按照實(shí)例1制備的rhNGF-PLGA微球進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，收集第一天釋放的溶液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。具體的過(guò)程如下將PC12細(xì)胞接種于預(yù)先置有涂有賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，接種密度為1×104細(xì)胞/cm2，每孔加1.5ml DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組①rhNGF組(30ng/ml)；②rhNGF微球釋放組(30ng/ml)；③不含NGF的白蛋白微球釋放組(微球釋放液用0.22μm濾器過(guò)濾除菌)。24h后觀察細(xì)胞長(zhǎng)出突起的情況，計(jì)數(shù)100-200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算長(zhǎng)出突起細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhNGF組和rhNGF微球釋放組的PC12細(xì)胞長(zhǎng)出較多的突起，不含NGF的白蛋白微球釋放組的PC12細(xì)胞幾乎看不到長(zhǎng)出突起。見圖3A.培養(yǎng)基中加入rhNGF(30ng/ml)(200×)；B.培養(yǎng)基中加入從rhNGF微球中釋放的rhNGF(30ng/ml)(200×)；C.培養(yǎng)基中加入不含NGF的白蛋白微球的釋放釋放液(400×)。
將按照實(shí)例1制備的微球注射到大鼠的基底前腦，取不同時(shí)間點(diǎn)，取腦切片后進(jìn)行間接免疫熒光染色。結(jié)果顯示移植的微球呈現(xiàn)抗rhNGF陽(yáng)性發(fā)應(yīng)。
微球中所包載的藥物穩(wěn)定性的鑒定可以證實(shí)微球中藥物的生物學(xué)活性是否還存在。該方法包括以下幾個(gè)部分(A)利用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，將體外釋放的藥物加到體外培養(yǎng)的敏感細(xì)胞體系中，觀察其對(duì)敏感細(xì)胞的作用；(B)通過(guò)切片，利用免疫學(xué)技術(shù)直接證實(shí)微球中藥物的生物學(xué)活性。
緩釋微球的腦內(nèi)遞送本發(fā)明中涉及將微球遞送至腦內(nèi)的方法，該方法主要包括以下幾部分(A)將微球懸浮于一定的溶液中；(B)將受試動(dòng)物的腦部固定于立體定位上；(C)根據(jù)立體定位圖譜選定進(jìn)針坐標(biāo)，同時(shí)在顱上鉆一個(gè)合適的進(jìn)針孔；(D)利用微量注射的形式在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間將微球注射到腦內(nèi)特定的區(qū)域。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是用下述方法制成(1)將5mg-15mg質(zhì)量比為1/2000-1/50的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去離子水中；(2)將50mg-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或體積比為5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20-40W的條件下超聲0.5-2min或2000-4000rpm勻速攪拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板源性生長(zhǎng)因子之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是所述天然高分子囊材為明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉或殼聚糖之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是所述半合成高分子囊材為羧甲基纖維素鈉、醋酸纖維素酞酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素或羥丙甲基纖維素之一。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是所述合成高分子囊材為聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
6.一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法，其特征是由下述步驟組成(1)將5mg-15mg質(zhì)量比為1/2000-1/50的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于50-200μl去離子水中；(2)將50-300mg天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于3-10ml一氯甲烷或二氯甲烷或三氯甲烷或體積比為5/1-3/2的一氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的二氯甲烷/丙酮或體積比為5/1-3/2的三氯甲烷/丙酮中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，在功率為20-40W的條件下超聲0.5-2min或2000-4000rpm勻速攪拌0.5-3min，制成油包水型乳液；(4)將所述油包水型乳液加到20-35ml質(zhì)量百分比為1％-10％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，800-1500rpm攪拌3-10min，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)在常壓下，磁力攪拌2-5h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，將固化的微球通過(guò)離心收集，用去離子水清洗1-4遍，冷凍干燥20-36h，即制成一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法，其特征是所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為重組人的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板源性生長(zhǎng)因子之一。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法，其特征是所述天然高分子囊材為明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉或殼聚糖之一。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球的制備方法，其特征是所述半合成高分子囊材為羧甲基纖維素鈉、醋酸纖維素酞酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素或羥丙甲基纖維素之一。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球，其特征是所述合成高分子囊材為聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚乙烯醇共聚物之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球及其制備方法，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球是用下述方法制成(1)將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/白蛋白混合物溶于去離子水中；(2)將天然高分子囊材或半合成高分子囊材或合成高分子囊材溶于一氯甲烷中；(3)將步驟(1)制成的溶液加到步驟(2)制成的溶液中，冰浴條件，超聲，制成油包水型乳液；(4)將油包水型乳液加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴條件，攪拌，形成水包油包水型復(fù)乳液；(5)常壓下，磁力攪拌，揮發(fā)有機(jī)溶劑，離心收集固化微球，水洗，干燥，制成，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子緩釋微球能夠維持包載的蛋白類藥物在較長(zhǎng)的時(shí)期活性不變；能夠配制成注射劑，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行腦內(nèi)注射，能夠持續(xù)或脈沖式釋放有生物活性蛋白。
文檔編號(hào)A61P25/16GK1879876SQ20061001360
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者宋存先, 谷海剛 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所