專利名稱：：Il－18抑制劑在治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血管病領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及IL-8抑制劑在治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：動脈粥樣硬化是最常見和最主要的血管病，當然還有許多其它血管病。動脈粥樣硬化主要影響大、中動脈，它的病變包括脂肪紋、溶纖維斑塊(fibrolyticplaques)和并發(fā)癥病變。動脈粥樣硬化是動脈壁的一種慢性炎癥，其特點是脂質(zhì)，如膽固醇，細胞，如巨噬細胞、T淋巴細胞或平滑肌細胞，及細胞外基質(zhì)(1)的逐漸積聚。大量積聚稱為動脈粥樣化或斑塊，它們通常含有鈣。脂肪組織可侵蝕動脈壁，使動脈的彈性減少，并影響血液流動。最后，在斑積聚周圍形成血塊，進一步阻礙血液流動，以致完全堵塞血管。動脈粥樣硬化通常與高水平低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇、Lp(a)纖維蛋白原和因子VII以及低水平高密度脂蛋白(LDL)-膽固醇有關(guān)。危險因數(shù)包括年紀大、男性、吸煙、糖尿病、肥胖、高膽固醇血癥、高脂肪飲食以及有個人和家族史心臟病。器官性局部缺血，如心肌梗塞，是主要原因。動脈粥樣化是動脈最常見的病變，可進一步并發(fā)血栓栓塞。動脈粥樣化斑塊往往使動脈管腔變窄，從而造成局部缺血，有時還會導(dǎo)致血流灌注區(qū)的組織萎縮。嚴重后果包括由于心肌缺血而造成的心絞痛、由于局部缺血或非缺血性事件而造成的心衰竭、由于腎動脈狹窄而造成的高血壓以及腎臟在生理上應(yīng)答腎素分泌增加而出現(xiàn)的血流灌注。動脈粥樣硬化和動脈硬化有時指不同的病理狀況，本發(fā)明的動脈粥樣硬化定義為具體由于動脈粥樣化使動脈硬化或失去彈性，而動脈硬化是指由任何一個原因所造成的動脈硬化或失去彈性。動脈粥樣硬化的并發(fā)癥或后果包括冠狀動脈疾病(冠狀動脈粥樣硬化)、由于阻塞而引致供血不足(局部缺血/心絞痛)、急性心肌梗塞(心肌梗塞、心臟病發(fā))、短暫性缺血發(fā)作(TIA)或中風(fēng)、以及對血管、肌肉或身體器官的損害。動脈瘤是血管的永久異常擴張，也是動脈粥樣硬化的一般成因。動脈粥樣硬化腹主動脈瘤通常發(fā)生在年老病人身上。它們會破裂進入腹膜后腔。在動脈粥樣硬化動脈瘤中，由于主動脈中層的肌肉缺血，所以往往會失去大量彈性組織并使血管中層纖維化，隨后釋放出巨噬細胞酶，使彈性纖維斷裂。治療或預(yù)防動脈粥樣硬化的推薦藥物包括減少血脂/膽固醇。具體地說，廣泛采用降低LDL-膽固醇治療法。目前，最常用的是斯達汀斯(statins)，其是HMGCoA還原酶的特異性抑制劑。另外一些降脂劑包括諸如消膽胺(cholestyramine)、降膽寧(colestipol)、煙酸、吉非貝齊(gemfibrozil)、丙丁酚、美降脂(lovastatin)等藥物。另一種方法是在已生成的粥樣硬化病變上使血栓形成的危險降至最小。阿斯匹林可用于減少血塊形成的危險性，似乎是一種介導(dǎo)血小板凝集的血栓素A2的特異性抑制劑或抗凝劑。經(jīng)皮”氣囊血管成形術(shù)”用頂端氣囊導(dǎo)管使斑塊變平，并增加流過阻塞的血液。這種技術(shù)與用于打開心臟動脈的技術(shù)相似，但該技術(shù)可應(yīng)用在身體的其它許多動脈中。冠狀動脈狹窄可用縫合在近端主動脈的部分隱靜脈的靜脈或通過切開胸壁的乳房內(nèi)動脈，以及將其遠程與心臟前面的動脈吻合來進行分流。在一些情況(例如頸動脈的動脈內(nèi)膜切除)中建議用手術(shù)除去積聚(動脈內(nèi)膜切除術(shù))。然而，主要還是治療或控制危險因數(shù)，如保持低脂、低膽固醇、和低鹽飲食，并按專家建議注意健康，治療和控制高血壓、糖尿病及其它疾病，降低體重和戒煙，以及進行正常鍛煉以改善心臟機能和增強循環(huán)。動脈粥樣硬化的不同階段都有炎癥過程(1)。由包括低切應(yīng)力、修飾脂蛋白和發(fā)炎前細胞因子等因素引起內(nèi)皮激活被認為是動脈粥樣硬化的第一步，並由炎癥控制(1)。最近許多研究均表明，血管和炎癥細胞之間的相互作用在動脈粥樣化形成中起關(guān)鍵作用(1)。特別是，抑制限定的發(fā)炎前通道可減少動脈粥樣硬化的產(chǎn)生(1)。發(fā)炎在動脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成中也起主導(dǎo)作用(2-5)，從而導(dǎo)致急性缺血性綜合征及其相關(guān)死亡出現(xiàn)(6)。事實上，動脈粥樣硬化的嚴重臨床表現(xiàn)包括心臟、腦及其它動脈粥樣硬化影響的器官出現(xiàn)梗塞，主要是由于在破裂動脈粥樣硬化斑塊的接觸面上形成血栓阻塞血管管腔(3，4)。病理研究已經(jīng)顯示，易損或不穩(wěn)定斑塊，即易破裂或已破裂的斑塊，與不易破裂的穩(wěn)定斑塊相比在細胞和基質(zhì)組成上明顯不同(7)。炎癥細胞(巨噬細胞和T淋巴細胞)含有大量易損斑塊，這些斑塊包含血栓脂質(zhì)核心，其特點是薄纖維帽失去大量細胞外基質(zhì)(7)。減少由發(fā)炎前細胞因子IFNγ介導(dǎo)的膠原合成，以及增加降解金屬蛋白酶并衍生自巨噬細胞的基質(zhì)的活性都可使纖維帽變薄和變脆(7)。易脆纖維帽破裂使高血栓脂質(zhì)核心受到循環(huán)血液的作用，而導(dǎo)致阻塞性血栓形成(1，7)。所以，在給定動脈粥樣硬化病變內(nèi)炎癥細胞的密度被認為是其不穩(wěn)定性的良好指示劑。動脈粥樣硬化病人的臨床預(yù)后僅部分取決于病變的大小(19，20)。現(xiàn)在普遍認為病變的質(zhì)量(斑塊的組成)而非大小能更好預(yù)示缺血事件的出現(xiàn)。事實上，動脈粥樣硬化的嚴重臨床表現(xiàn)(心臟和腦梗塞)主要是由于在破裂動脈粥樣硬化斑塊的接觸面上形成血栓阻塞血管管腔(19)。病理研究已經(jīng)證實，易損或不穩(wěn)定斑塊，即易破裂或已破裂的斑塊，主要存在于炎癥細胞中，并呈現(xiàn)大量失去平滑肌細胞和膠原量(20，21)。另外，這樣一些斑塊使凋亡細胞的死亡率大幅提高，從而形成高血栓脂質(zhì)核心(13，22)。發(fā)炎前細胞因子參與了炎癥過程。細胞因子白介素18(IL-18)最初被稱為干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)因子(8)。它是T淋巴細胞輔助細胞1(Th1)應(yīng)答發(fā)展中產(chǎn)生的早期信號。IL-18與IL-12、IL-2、抗原、有絲分裂原、以及一些潛在因子一起作用誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。IL-18也可增加GM-CSF及IL-2的產(chǎn)生，增強抗CD3誘導(dǎo)的T細胞的增殖能力及增加自然殺傷細胞的Fas介導(dǎo)的殺傷力。成熟的IL-18由L-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE，caspase-1)自其前體產(chǎn)生。IL-18受體由至少兩個在配體結(jié)合中相互協(xié)作的成分組成。在經(jīng)小鼠IL-12刺激的T細胞中發(fā)現(xiàn)對IL-18的高和低親和力結(jié)合位(9)，這可假定為一種多鏈受體復(fù)合物。到目前為止，已識別了兩種受體亞基，均屬于IL-1受體族(10)。IL-18的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括激活NF-κB(11)。最近，從人尿液分離出對IL-18有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)，并克隆了人和小鼠cDNA以及人基因(12；W099/09063)。該蛋白被命名為IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)。IL-18BP不是已知IL-18受體之一的胞外區(qū)域，而是一種分泌性天然循環(huán)蛋白。它屬于分泌性蛋白的一個新家族，該家族還包括幾種痘病毒編碼蛋白質(zhì)(12)。IL-18BP在脾臟中按組成表達(12)。尿液以及重組體IL-18特異性地與具有高親和力的IL-18結(jié)合，并調(diào)節(jié)IL-18的生物親合力。IL-18BP基因位于人染色體11q13上，在8.3Kb的基因組序列中沒發(fā)現(xiàn)編碼跨膜區(qū)的外顯子。在人身上發(fā)現(xiàn)IL-18BP的四種拼接變體或異構(gòu)體，命名為IL-18BPa，b，c和d，它們均共享相同的N末端，但C末端不同(12)。在各種cDNA庫中，發(fā)現(xiàn)因mRNA拼接產(chǎn)生4種人和2種小鼠IL-18BP異構(gòu)體，其已被表達、純化并對其結(jié)合與中和IL-18生物活性的能力進行了評估(23)。人IL-BP異構(gòu)體a(IL-18BPa)對IL-18顯示出最大的親和力，結(jié)合快，離解慢，離解常數(shù)(K(d))為399pM。IL-18BPc除29個C末端氨基酸外，還享有IL-18BPa的Ig區(qū)。IL-18BPc的K(d)小10倍(2.94nM)。然而在超過2摩爾濃度時，IL-18BPa和IL-18BPc可中和超過95％的IL-18。IL-18BPb和IL-18BPd異構(gòu)體缺乏完整的Ig區(qū)，并缺乏結(jié)合或中和IL-18的能力。小鼠IL-18BPc和IL-18BPd異構(gòu)體具有相同的Ig區(qū)，在超過2摩爾濃度時也可中和超過95％的小鼠IL-18。而具有與人IL-18BPa共同C末端型主的小鼠IL-18BPd也能中和人IL-18。分子模型識別到IL-18BP的Ig區(qū)中有一個大的靜電和疏水性混合結(jié)合位，這可解釋其與配體的高親和力結(jié)合(23)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于這樣的研究結(jié)果IL-18抑制劑對動脈粥樣硬化的小鼠模型中斑塊的產(chǎn)生、斑塊的發(fā)展及斑塊的穩(wěn)定性具有明確的有益效果。抑制IL-18不僅可預(yù)防胸主動脈病變的形成，而且誘導(dǎo)已生成的動脈粥樣硬化斑轉(zhuǎn)成穩(wěn)定斑表型。因此，本發(fā)明涉及用IL-18抑制劑來制造預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。本發(fā)明還涉及治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化基因療法的治療方法。圖1所示為人臍靜脈內(nèi)皮細胞分別單獨用氧化脂蛋白培育，或用氧化脂蛋白和IL-18抗體或IL-18BP一起培育后的存活率的矩形圖。圖2所示為在動脈粥樣硬化動脈與受控動脈中的蛋白質(zhì)提取物上進行的WesternBlot的比較。在WesternBlot中，使用對IL-18BP(hIL-18BP)、IL-18受體α亞基(hIL18Rα)、IL-18(IL-18BP)及凋亡蛋白酶(Caspase)-1(Caspase-1p10)的抗體。圖3所示為溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠，其顯示動脈粥樣硬化斑細胞中IL-18及IL-18BPmDNA的RT-PCT分析結(jié)果。圖4所示為動脈粥樣硬化斑中IL-18及IL-18BP與有癥狀及無癥狀斑塊的人α-肌動蛋白(調(diào)控)表達相比較的有代表性的RT-PCT結(jié)果。圖5所示為用于小鼠肌肉內(nèi)電轉(zhuǎn)移的表達載體的分布圖。圖6所示為動脈粥樣硬化動脈內(nèi)脂質(zhì)染色面積的矩形圖。定量計算機輔助圖像分析脂質(zhì)積聚。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示(空質(zhì)體n＝19，IL-18BP質(zhì)體n＝14)。****表示P＜0.0001。圖7所示為以IL-18BP治療后與受控(空質(zhì)體)的主動脈竇病變面積的比較的矩形圖。定量計算機輔助圖像分析病變區(qū)域。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示(空質(zhì)體n＝19，IL-18BP質(zhì)體n＝14)。**表示P＜0.0001。圖8所示為IL-18BP治療對病變炎癥細胞量的影響。用定量計算機輔助圖像分析測定主動脈竇病變受控下(巨噬細胞染色n＝12，T淋巴細胞染色n＝15)或以IL-18BP治療的小鼠(巨噬細胞n＝13，T淋巴細胞n＝12)巨噬細胞陽性面積(黑色方塊)的百分比以及每平方毫米浸潤T淋巴細胞的數(shù)量(灰色方塊)。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。***表示P＜0.0001。圖9所示為IL-18BP治療對病變平滑肌細胞及膠原含量的影響。用定量計算機輔助圖像分析測定主動脈竇病變受控下(平滑肌細胞n＝6，膠原n＝11)和以IL-18BP治療的小鼠(平滑肌細胞n＝6，膠原n＝13)平滑肌細胞陽性面積(黑色方塊)以及膠原積聚(灰色方塊)的百分比。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。具體實施例方式本發(fā)明基于這樣的研究結(jié)果急性冠狀動脈綜合征病人的循環(huán)IL-18水平會上升及引致中風(fēng)的不穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑使IL-18的產(chǎn)生會增加。另外，業(yè)已證明，IL-18BP編碼的表達質(zhì)體DNA體內(nèi)電轉(zhuǎn)移可預(yù)防胸主動脈中脂肪紋產(chǎn)生，并減慢非常確實的動脈粥樣硬化小鼠模型中主動脈竇晚期動脈粥樣硬化斑的發(fā)展。更重要的是，以IL-18質(zhì)體轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)斑組成發(fā)生重大變化(巨噬細胞、T細胞、細胞死亡及脂質(zhì)含量減少，而平滑肌細胞及膠原含量增加)，從而形成穩(wěn)定的斑塊表型。這些結(jié)果第一次顯示IL-18抑制劑在減少斑塊的產(chǎn)生/發(fā)展及促進斑塊的穩(wěn)定起著重要作用。因此，本發(fā)明涉及用IL-18抑制劑來制造治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物。本發(fā)明上下文中的術(shù)語”預(yù)防”，不僅指完全預(yù)防某一種影響，也指在疾病發(fā)作前或發(fā)作早期任何部分或基本上預(yù)防、減弱、降低、減退或消除這種影響。本發(fā)明上下文中的術(shù)語”治療”，指任何對疾病的進展有益的效果，包括在疾病發(fā)作后減弱、降低、減退或消除病理的發(fā)展。本發(fā)明上下文中的術(shù)語“IL-18抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、大量地或完全地防止或阻斷IL-18產(chǎn)生和/或作用的方式來調(diào)節(jié)IL-18的產(chǎn)生和/或作用的任何分子。一種生產(chǎn)的抑制劑可以是任何一種對IL-18合成、加工或成熟有負面影響的分子。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是，例如，白介素IL-18基因表達的抑制基因、降低或阻止IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄或?qū)е略搈RNA降解的反義mRNA、損害正確折疊或部分或基本上阻止IL-18成熟或分泌的蛋白質(zhì)、一旦合成即能降解IL-18的蛋白酶等。生產(chǎn)的抑制劑可以是，例如，阻止IL-18成熟的Caspase-1抑制劑或ICE抑制劑。IL-18作用抑制劑可以是，例如，IL-18拮抗劑。拮抗劑可以以足夠親和力和特異性結(jié)合或隔離IL-18分子本身而部分或基本上中和負責IL-18與其配體結(jié)合的IL-18或IL-18結(jié)合位(例如，其受體)。拮抗劑也可抑制在IL-18/受體結(jié)合時細胞中所激活的IL-18信號通道。IL-18作用抑制劑也可以是可溶性IL-18受體或仿真受體的分子，或阻斷IL-18受體的物質(zhì)，或IL-18抗體，如單克隆抗體，或阻止IL-18與其靶結(jié)合的其它物質(zhì)或分子，從而減弱或阻止由IL-18介導(dǎo)的細胞內(nèi)外反應(yīng)的觸發(fā)。動脈粥樣硬化也稱為動脈硬化。本發(fā)明上下文中的術(shù)語”動脈粥樣硬化”包括所有通常描述動脈粥樣硬化的動脈表現(xiàn)出的疾病或病況，其中脂肪物質(zhì)積聚在血管壁，最后導(dǎo)致血液流動狹窄和受損，并形成血栓造成破裂和/或侵蝕。根據(jù)本發(fā)明，動脈粥樣硬化包括由于動脈粥樣化(動脈粥樣硬化)和其它原因(動脈硬化)而使動脈硬化和失去彈性。本文使用的術(shù)語”動脈粥樣硬化”包括動脈粥樣硬化的病理狀況及動脈粥樣硬化的并發(fā)癥或后遺癥，在上文”
背景技術(shù)：
”中已有詳細敘述。動脈粥樣硬化發(fā)展包括動脈粥樣硬化斑的形成及其發(fā)展至越來越不穩(wěn)定形式。因此，本發(fā)明也涉及用IL-18抑制劑來制造減弱或預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)展的藥物。在動脈粥樣硬化斑上形成血栓導(dǎo)致血管阻塞是心臟和腦梗塞的主要原因，是動脈粥樣硬化最嚴重的后遺癥之一。因此，本發(fā)明也涉及用IL-18抑制劑來制造治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化斑的血栓形成的藥物。斑穩(wěn)定性影響動脈粥樣硬化斑發(fā)展成容易引發(fā)血栓形成的有害或易損斑。因此，本發(fā)明進一步涉及用IL-18抑制劑來制造預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化斑不穩(wěn)定的藥物。不穩(wěn)定斑容易破裂，而斑破裂又會導(dǎo)致血栓形成。因此，本發(fā)明進一步涉及用IL-18抑制劑來制造預(yù)防動脈粥樣硬化斑侵蝕或破裂的藥物。斑不穩(wěn)定性和血栓形成可由細胞凋亡引起，使前凝血活劑的活性提高，這可能是導(dǎo)致破裂或侵蝕的動脈粥樣硬化斑形成血栓及造成栓塞的主要原因(13，14)?，F(xiàn)已證明，氧化脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的巨噬細胞及內(nèi)皮細胞凋亡(15)。如以下實施例所示那樣，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，IL-18抑制劑能顯著減少由氧化脂蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡。根據(jù)本發(fā)明，意外發(fā)現(xiàn)，與沒有返回醫(yī)院的病人相比，在出現(xiàn)復(fù)發(fā)事件，如死亡、復(fù)發(fā)性局部缺血、血管反復(fù)閉塞、動脈粥樣硬化發(fā)展或因心衰竭經(jīng)常入院的病人中，血液中的IL-18水平顯著上升。與生存下來的病人相比，在后來死亡的病人體內(nèi)這種IL-18水平上升尤為明顯。局部缺血病人和非缺血病人的血液循環(huán)都有高水平IL-18。因此，本發(fā)明也涉及用IL-18抑制劑來制造治療和/或預(yù)防心衰竭復(fù)發(fā)的藥物。復(fù)發(fā)事件可以是心衰竭后的任何事件，如死亡、復(fù)發(fā)性局部缺血、血管反復(fù)閉塞、動脈粥樣硬化發(fā)展或因心衰竭經(jīng)常入院。在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，心衰竭是局部缺血，即由于心肌缺血而引起心衰竭。在另一個優(yōu)選實施例中，心衰竭是非局部缺血，如由于系統(tǒng)性高血壓、心血管病、或先回復(fù)至正常，然后又發(fā)生充血性心力衰竭的肺病。在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑選自由以下組成的組ICE抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18受體信號通道抑制劑、能與IL-18競爭和阻斷IL-18受體的拮抗劑、以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)、其具有相同活性的異構(gòu)體、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。本文所用的術(shù)語“突變蛋白”指IL-18BP的同類物，或病毒性IL-18BP的同類物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所取代，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產(chǎn)生的產(chǎn)物的活性與野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比無顯著改變。這些突變型蛋白由已知的合成和/或定位點誘變技術(shù)，或任何適合的其它已知技術(shù)制備。任何這一種突變蛋白最好具有一IL-18BP充分復(fù)制、或病毒性IL-18BP充分復(fù)制的氨基酸序列，從而具有與IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的活性之一是其能結(jié)合IL-18。只要該突變蛋白對IL-18具有很大的結(jié)合活性。它就可用于純化IL-18，如借助親和力色譜法，從而認為其具有與IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常規(guī)實驗方法來確定某個給定突變蛋白是否具有與IL-18BP基本相同的活性，其方法包括對這樣一種突變蛋白進行諸如簡單的夾心競爭試驗(simplesandwichcompetitionassay)來確定它是否能與適當標記的IL-18結(jié)合，如放射免疫試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。本發(fā)明可用的IL-18BP多肽突變蛋白或病毒性IL-18BP突變蛋白，或其編碼核酸，包括一組有限的基本上與取代肽或多肽相應(yīng)的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)本文所述的教導(dǎo)和指引用常規(guī)方法獲得，而無須進行過多實驗。本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變化被稱為“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一組內(nèi)同義氨基酸，其具有足夠相似的生理化學(xué)特性，該組原子之間的取代將保留該分子的生物功能(16)。很明顯，在上述序列中不改變其功能還可進行氨基酸的插入和缺失，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸時，如30個以下，最好為10個以下，而且不會移去或取代對功能性構(gòu)造起關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。優(yōu)選同義氨基酸組是表1列出的那些組；更好的同義氨基酸組是表2列出的那些組；最好的同義氨基酸組是表3列出的那些組。表1優(yōu)選同義氨基酸組氨基酸同義組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2更好的同義氨基酸組氨基酸同義組SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表3最好的同義氨基酸組氨基酸同義組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸取代的實施例可用來獲得本發(fā)明中所用的IL-18BP多肽或蛋白質(zhì)的突變蛋白，或病毒性IL-18BP的突變蛋白，其包括任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691專利中提出的方法，以及美國專利No.4,904,584(Shaw等人)中提出的賴氨酸取代蛋白質(zhì)。術(shù)語“融合蛋白”指一多肽包含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突變蛋白與另一蛋白質(zhì)，如在體液中停留時間延長的蛋白質(zhì)，融合。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可與另一蛋白質(zhì)、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP衍生物或病毒性IL-18BP及其突變蛋白和融合蛋白，它們可用本領(lǐng)域已知方法從殘基或N端或C端基團側(cè)鏈存在的功能性基團制備。只要它們?nèi)匀辉谒帉W(xué)上可接受，即它們沒有破壞與IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白質(zhì)活性，并且不會使含它們的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。這些衍生物例如可以包括聚乙二醇側(cè)鏈，其可遮蔽抗原位并延長IL-18BP或病毒性IL-18BP在體液中的停留。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與酰基部分分子(如烷?；蛱辑h(huán)芳酰基)形成的N-?；苌铩⒒蛴坞x羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與酰基部分分子形成的O-?；苌?。本發(fā)明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突變蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括單獨蛋白分子多肽鏈的片段或前體，或蛋白分子與相關(guān)分子或與其相連的殘基，如糖或磷酸根殘基一起，或蛋白分子或糖殘基自身的聚集物，只要所述部分具有與IL-18BP基本上相似的活性。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是IL-18抗體?？笽L-18抗體可以是多克隆或單克隆、嵌合、人化或甚至完全人化的抗體。重組抗體及其片段的特征是在體內(nèi)能與IL-18高親和力結(jié)合，而且毒性低?？捎糜诒景l(fā)明的抗體應(yīng)具有的特征是對病人進行足夠時間的治療，它們能良好至優(yōu)異地減退或緩解病情或與病情相關(guān)的任何一種癥狀或一組癥狀，并且毒性低。通過以IL-18免疫，易在兔、山羊或小鼠等動物中產(chǎn)生中和抗體。免疫小鼠特別適用于提供B細胞來源以制備雜交瘤，進而培養(yǎng)雜交瘤產(chǎn)生大量抗IL-18單克隆抗體。嵌合抗體是具有來自不同動物物種的二個或多個節(jié)段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗體的可變區(qū)來自非人哺乳動物抗體，如鼠單克隆抗體，而該免疫球蛋白的穩(wěn)定區(qū)來自人免疫球蛋白分子。這兩個區(qū)及其組合最好如常規(guī)方法測定那樣有低免疫原性(24)。人化抗體是用基因工程技術(shù)構(gòu)建的免疫球蛋白分子，其中用人對比物置換鼠穩(wěn)定區(qū)，而保留鼠抗原結(jié)合區(qū)。所產(chǎn)生的鼠-人嵌合抗體更好地降低了免疫原性，并改善了在人體中的藥物動力學(xué)(25)。因此在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體是人化IL-18抗體，例如，歐洲專利申請EP0974600敘述了人化抗IL-18抗體的優(yōu)選例子。在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體是全人抗體。在WO00/76310，WO99/53049，US6,162,963或AU5336100中詳細敘述了產(chǎn)生人抗體的技術(shù)。全人抗體優(yōu)選是轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生的重組抗體，例如異種小鼠，含有所有或部分功能的人Ig基因座。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是IL-18BP，或其異構(gòu)體、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。這些異構(gòu)體、突變蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特別是結(jié)合IL-18的活性，優(yōu)選具有至少一基本上類似于IL-18BP的活性。理想的話，這些蛋白質(zhì)具有的生物活性甚至比未改性的IL-18BP更高。優(yōu)選活性部分的活性比IL-18BP更好或更具優(yōu)異性，如穩(wěn)定性更好，毒性或免疫原性更低，或它們更易大量生產(chǎn)，或更易提純。IL-18BP及其拼接變體/異構(gòu)體的序列可從WO99/09063或(12)以及(23)中獲得。可將IL-18BP的功能性衍生物與聚合物結(jié)合以改進該蛋白質(zhì)的性能，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用性、人體耐受性、或免疫原性。為達到此目的，可將IL-18BP與聚乙二醇(PEG)聯(lián)接。例如，按WO92/13095所述已知方法進行聚乙二醇化。因此，本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，IL-18BP是聚乙二醇化的。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是融合蛋白，包含IL-18結(jié)合蛋白的全部或一部分，其與免疫球蛋白全部或一部分融合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道所產(chǎn)生的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特別是結(jié)合IL-18的活性。這種融合可以是直接的，或通過一個短交聯(lián)肽相融合，長度短至1-3個氨基酸殘基或較長，如13個氨基酸殘基的長度。所述交聯(lián)劑可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列；或13個氨基酸的交聯(lián)劑序列的三肽，其含位于IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之間的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所產(chǎn)生的融合蛋白具有改進的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，比活性提高，表達水平增加或有利于融合蛋白的純化。在一優(yōu)選實施例中，IL-18BP融合于Ig分子的穩(wěn)定區(qū)。優(yōu)選融合于重鏈區(qū)，例如，人IgG1的CH2和CH3區(qū)。產(chǎn)生的特定融合蛋白包括WP99/09063的實施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它異構(gòu)體也適合用來產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，例如，異構(gòu)體IgG2或IgG4，或其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質(zhì)或同質(zhì)多聚體。干擾素主要因其對病毒復(fù)制和細胞增殖有抑制作用而為人所認知。例如，干擾素-γ在促進免疫和炎癥應(yīng)答中起重要作用。據(jù)說干擾素β(IFN-β，I型干擾素)有抗炎癥作用。本發(fā)明還涉及IL-18抑制劑和干擾素的組合在制造治療動脈粥樣硬化的藥物的應(yīng)用。也可將干擾素與聚合物結(jié)合以改進該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，例如，WO99/55377敘述了干擾素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之間的共軛物。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，干擾素是干擾素-β(IFN-β)，更優(yōu)選是IFN-β1a。IL-18產(chǎn)生和/或作用的抑制劑最好與干擾素同時、先后或分開使用。在本發(fā)明另一實施例中，IL-18抑制劑與TNF拮抗劑結(jié)合使用。TNF拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。首先，拮抗劑能以足夠的親和力和特異性結(jié)合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或負責與TNF受體結(jié)合的表位(以下稱為”遮蔽性拮抗劑”)。例如，一種遮蔽性拮抗劑可以是抗TNF的抗體。另一方面，TNF拮抗劑可抑制TNF結(jié)合后由細胞表面受體激活的TNF信號通道(以下稱為”信號拮抗劑”)。這二組拮抗劑可單獨或一起，與IL-18抑制劑結(jié)合使用來治療動脈粥樣硬化。TNF拮抗劑易于識別并通過常規(guī)方法篩選評價，即在體外敏感細胞系，如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B細胞中用候選拮抗劑對天然TNF活性的影響來評價。該試驗包括不同稀釋度，例如，試驗所用TNF摩爾量的0.1倍-100倍，的候選拮抗劑的TNF制劑，以及無TNF或只有拮抗劑的調(diào)控(26)。封蔽拮抗劑是本發(fā)明優(yōu)選使用的TNF拮抗劑。在封蔽拮抗劑中，優(yōu)選使用那些以高親和力結(jié)合TNF并具有低免疫原性的多肽。特別優(yōu)選使用可溶性TNF受體分子和抗TNF的中和抗體。例如，可溶性TNF-RI和TNF-RII可用于本發(fā)明。這些平截形受體是本發(fā)明更優(yōu)選的拮抗劑，其包括受體的細胞外區(qū)或其功能部分，例如，EP914431敘述了平截的可溶性TNF-I型和TNF-II型受體。平截形的TNF受體是可溶的，在尿和血清中檢測到30kDa和40kDa的TNF抑制性結(jié)合蛋白，這兩種TNF抑制性結(jié)合蛋白分別稱為TBPI和TBPII(27)。根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑與TNF拮抗劑和/或干擾素可同時、先后或分開使用。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選TNF拮抗劑是TBPI和TBPII，與IL-18抑制劑結(jié)合使用。該受體分子的衍生物、片段、區(qū)段和生物活性部分，按功能裝配成本發(fā)明用的受體分子。受體分子的這種生物活性等價物或衍生物，指多肽部分或編碼該受體分子的序列部分，其大小足夠并能以親和力結(jié)合TNF，以致抑制或封閉與膜結(jié)合的TNF受體的相互作用。本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本發(fā)明用的TNF拮抗劑。歐洲專利EP308378、EP398327和EP433900敘述了天然和重組的可溶性TNF受體分子及其制備方法。IL-18抑制劑可與TNF抑制劑同時、先后或分開使用。較好是使IL-18抗體或抗血清與具有TNF抑制活性的可溶性TNF受體結(jié)合使用。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，這種藥物還包括COX-抑制劑，優(yōu)選COX-2抑制劑。COX抑制劑在本領(lǐng)域已公知。例如，WO01/00229敘述了一些具體COX-2抑制劑。血栓素(thromboxane)，特別是血栓素A2抑制劑，目前廣泛用于治療動脈粥樣硬化。所以，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，這種藥物還包括血栓素抑制劑，特別是血栓素A2抑制劑，可同時、先后或分開使用。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選以阿斯匹林和IL-18抑制劑配合使用。導(dǎo)致動脈粥樣硬化的其中一個原因是血液中脂質(zhì)濃度過高。所以，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，這種藥物還包括降脂劑，可同時、先后或分開使用。本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的降脂劑包括消膽胺、降膽寧、煙酸、吉非貝齊、丙丁酚等藥物。特別優(yōu)選是HMGCoA還原酶抑制劑，更好是稱為statins的還原酶抑制劑。本領(lǐng)域已知的statins還原酶抑制劑有很多，如Simvastain或lovastatin。為了更好預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例涉及以低脂和/或低膽固醇和/或低鹽飲食配合使用IL-18抑制劑。在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑用量大約為0.0001-10mg/kg體重，或大約0.01-5mg/kg體重，或約0.1-3mg/kg體重，或約1-2mg/kg體重。在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑用量為約0.1-1000μg/kg體重，或約1-100μg/kg體重，或約10-50μg/kg體重。本發(fā)明還涉及利用含有IL-18抑制劑編碼序列的表達載體來制備預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。即采用基因療法來治療和/或預(yù)防疾病。優(yōu)點是IL-18抑制劑是原位表達的，從而有效地直接阻斷受疾病影響的組織或細胞中的IL-18。如以下實施例所解釋那樣，已經(jīng)表明，在電轉(zhuǎn)移含有IL-18BP編碼序列的表達載體后，疾病小鼠模型可顯示IL-18BP的有效表達。所以，在一優(yōu)選實施例中，表達載體通過電轉(zhuǎn)移，最好在肌肉內(nèi)注射施用。本發(fā)明還考慮在正常不表達IL-18抑制劑或表達抑制劑的量不充分的細胞中，使用能誘導(dǎo)和/或增強內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體。該載體可包含在所需表達IL-18抑制劑的細胞中起作用的調(diào)控序列。例如，這類調(diào)控序列可以是啟動子或增強子。然后，可通過同源重組將該調(diào)控序列導(dǎo)入基因組的正確基因座中，使調(diào)控序列與基因作可操作性相連，所需要的表達即被誘導(dǎo)或被增強。該技術(shù)通常稱為”內(nèi)源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所敘述。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，也可用同一技術(shù)降低IL-18表達，即導(dǎo)入一個負調(diào)節(jié)組件，如沉默組件，到IL-18的基因座中，從而導(dǎo)致下調(diào)或防止IL-18表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，IL-18表達的這種下調(diào)或沉默與使用IL-18抑制劑的效果相同，用于預(yù)防和/或治療疾病。本發(fā)明還涉及使用經(jīng)過基因修飾，以產(chǎn)生IL-18抑制劑的細胞來制造治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物。本發(fā)明還涉及特別用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物組合物，其包括有效治療量的IL-18抑制劑和有效治療量的干擾素。作為IL-18抑制劑，該組合物可包括caspase-1抑制劑、抗IL-18抗體、抗所有IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道的抑制劑、與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、以及具有相同活性的IL-18結(jié)合蛋白、異構(gòu)體、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或其循環(huán)變換衍生物。該藥物組合物的優(yōu)選活性成分是上述IL-18BP及其異構(gòu)體、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。該藥物組合物的干擾素優(yōu)選IFN-β。在另一優(yōu)選實施例中，該藥物組合物包括有效治療量的IL-18抑制劑，可選擇是一干擾素和TNF拮抗劑。該TNF拮抗劑可以是中和TNF活性的抗體，或可溶性平截的TNF受體片段，也稱為TBPI和TBPII。本發(fā)明的藥物組合物還可包括一種或多種COX抑制劑，優(yōu)選COX-2抑制劑。本發(fā)明的藥物組合物還可包括血栓素抑制劑，如阿斯匹林，和/或降脂劑，如statins。定義“藥學(xué)上可接受的”指包含不會干擾活性成分的生物活性效果，并對施藥的宿主無毒性的任何載體。例如，為了在外腸胃道施藥，可將這些活性蛋白以注射用劑量單位形式配制在載體中，如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)液。本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以以各種方法給個體施用。施藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋制劑)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻內(nèi)等途徑。也可采用其它有效治療途徑施藥，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因治療將編碼活性藥物的DNA分子施加給病人(如通過載體)，導(dǎo)致該活性藥物在體內(nèi)表達和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與生物活性藥物的其它組分，如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋和載體劑等，一起施用。對于外腸胃道(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))施藥，可將活性蛋白質(zhì)配制成溶液、懸浮液、乳液或與藥學(xué)上可接受的腸胃道外載體(如水、鹽水、葡萄糖液)以及能維持等滲性(如甘露糖醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起制成凍干粉末。以常規(guī)技術(shù)給制劑滅菌。本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)也可用共軛方法增加分子在人體內(nèi)的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT專利申請WO92/13095所述那樣，使分子與聚乙二醇交聯(lián)?；钚缘鞍椎挠行е委熈渴呛芏嘧兞康暮瘮?shù)，包括拮抗劑類型、拮抗劑對IL-18的親和力、拮抗劑顯示的殘留毒性、施用途徑、病人的臨床狀態(tài)(包括維持內(nèi)源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)?！坝行е委熈俊笔鞘┯脮rIL-18抑制劑抑制IL-18生物活性的量。給個體施加單劑或多劑的劑量取決于各種因素，包括IL-18抑制劑的藥物動力學(xué)性能、施藥途徑、病人的病情和特征(性別、年齡、體重、健康狀況和身型大小)、癥狀程度、并行治療、治療頻度和所要求的效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員都掌握了調(diào)整和操作已確定的劑量范圍以及在體內(nèi)外測定個體IL-18抑制的方法。按照本發(fā)明，IL-18抑制劑的用量約為0.0001-10mg/kg體重，或約0.01-5mg/kg體重，或約0.01-5mg/kg體重，或約0.1-3mg/kg體重，或約1-2mg/kg體重。更優(yōu)選的IL-18抑制劑用量是約0.1-1000μg/kg體重，或約1-100μ/kg體重或10-50μ/kg體重。本發(fā)明優(yōu)選的施藥途徑是皮下途徑，本發(fā)明更優(yōu)選的是肌肉內(nèi)施藥。在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是每天或每隔一天施用。每日藥量通常分成幾劑或以緩釋形式施用，以有效獲得所需結(jié)果。第二次或隨后施藥可以與首次或原先施加給該個體的相同劑量、少于或多于此劑量進行?？稍诩膊“l(fā)作時或發(fā)作前進行第二次或隨后施藥。按照本發(fā)明，IL-18抑制劑可以以有效量治療先于、同時或依次與其它治療方案或藥物(如多種藥物方案)預(yù)防性或治療性地施加給個體?；钚运幬锟稍谙嗤虿煌慕M合物中與其它治療劑同時施用。本發(fā)明還涉及一種治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的方法，其包括給有需要的宿主施加一有效抑制量的IL-18抑制劑。本發(fā)明還涉及一種治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的方法，其包括給有需要的宿主施加一包含IL-18抑制劑編碼序列表達載體。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，表達載體系統(tǒng)地施加，更優(yōu)選為通過肌肉內(nèi)注射施加。本發(fā)明進一步涉及使用IL-18作為心衰竭嚴重臨床預(yù)后的診斷標記物。嚴重臨床預(yù)后包括病人狀態(tài)的任何惡化，如第一次心肌梗塞后復(fù)發(fā)，甚至死亡。IL-18優(yōu)選用作第一次心衰竭后復(fù)發(fā)事件的診斷標記物。復(fù)發(fā)病包括，但不限于，死亡、復(fù)發(fā)性局部缺血、血管反復(fù)閉塞、動脈粥樣硬化發(fā)展或因心衰竭經(jīng)常入院。以上為對本發(fā)明進行的敘述，參照以下提供的實施例將會更容易理解本發(fā)明的內(nèi)容，但以下實施例是用于闡述而不意味著對本發(fā)明的限制。實施例材料和方法標本收集進行頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)的36個病人切除下來的41塊人動脈粥樣硬化斑塊。用于調(diào)控的是無動脈粥樣硬化的2條胸和3條乳房內(nèi)動脈(其中2條的最小纖維肌肉增厚)，它們?nèi)∽允w解剖或冠狀動脈分流術(shù)。迅速將這些動脈浸在液氮中，并儲存在-80℃。用于提取蛋白質(zhì)和RNA的斑塊在儲存于-80℃之前要先迅速清洗，然後浸在液氮中。用于免疫組織化學(xué)研究的斑塊先置于4％新鮮多聚甲醛2小時，再轉(zhuǎn)移到30％蔗糖-PBS溶液中，然后用液氮急速冷凍于最優(yōu)切割溫度組織處理培養(yǎng)基中，并儲存在-80℃以便低溫恒溫切片。每個標本得到幾片8至10μm的切片，以進行組織分析和免疫組織化學(xué)研究。病人分類為了研究IL-18/IL-18BP表達和斑不穩(wěn)定跡象之間潛在的關(guān)系，我們以隨機方式收集在2000年5月和8月間進行動脈內(nèi)膜切除術(shù)的連續(xù)23(有36個病人)個病人的臨床數(shù)據(jù)。由進行動脈內(nèi)膜切除術(shù)的醫(yī)生系統(tǒng)地報告用肉眼檢查斑內(nèi)是否有潰瘍。這樣，我們可以將斑分成潰瘍性斑或非潰瘍性斑。另外，按臨床病征將病人分成不同的兩組。具有與頸動脈狹窄相關(guān)的腦缺血性發(fā)作臨床病征的病人歸為有癥狀一組。這些病人在臨床病征發(fā)作后2-66天(17.6±5.3天)進行動脈內(nèi)膜切除術(shù)。而那些從來沒有在頸動脈區(qū)出現(xiàn)腦缺血病征的病人歸為無癥狀一組?；趯跔顒用}或其周圍發(fā)病的病人進行的系統(tǒng)臨床檢查，檢測到無癥狀頸動脈狹窄，由一個有經(jīng)驗執(zhí)業(yè)回波描記員用多普勒回波描記術(shù)(Dopplerechography)重復(fù)多次確定其嚴重程度。盡管無癥狀病人從未有過頸動脈狹窄區(qū)缺血發(fā)作，但已有研究顯示腦動脈內(nèi)膜切除術(shù)對這些病人的病情有利，如無癥狀腦動脈粥樣硬化研究(ACAS)調(diào)查者(AsymptomaticCarotidAtherosclerosisStudyinvestigators)(28)揭示的那樣。WesternBlot分析從12塊動脈粥樣硬化斑和5條調(diào)控正常動脈中提取蛋白質(zhì)。在液氮條件下將冷凍樣本磨成粉末。再以每10mg凈重配0.3mL溶液的比率將粉末重新懸浮于冰凍溶解緩沖液[20mmol/L三鹽酸，5mmol/LpH7.5EGTA，150mmol/L氯化鈉，20mmol/L甘油磷酸鹽，10mmol/L氟化鈉，1mmol/L原釩酸鈉，1％三硝基甲苯X-100，0.1％Tween20，1μg/mL抑肽酶，1mmol/LPMSF，0.5mmol/LN-甲基磺?；?L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)，0.5mmol/LN(a)-p-甲基磺?；?L-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)]中。提取液在冰上培養(yǎng)15分鐘，然后離心(12000g，15分鐘，4℃)。保留可溶于去污劑的上清液餾分，用Bio-Rad蛋白質(zhì)試驗法平衡樣本中的蛋白濃度。為了用wersternblot分析IL-18和IL-18R，將蛋白質(zhì)提取液煮沸5分鐘，并裝在7.5％或15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠。對于IL-18BP，根據(jù)制造商的協(xié)議，用1mg/mL樹脂使從大腸桿菌(E.Coli)(SeronoPharmaceuticalResearchInstitute，Geneva)純化來的重組人IL-18、rhIL-18與Affligel15(Biorad)偶聯(lián)。蛋白質(zhì)提取液(60μg)在輥筒上于4℃培養(yǎng)過夜，用20μl樹脂調(diào)整至500μl含0.05％PBS的Tween。為了消除任何非特異性結(jié)合，將樹脂離心，并用10mMpH8的三鹽酸、140mM氯化鈉、0.5％三硝基甲苯-X-100(Fluka)、0.5％脫氫膽酸鹽洗滌，再用50mMpH8的Tris、200mM氯化鈉、0.05％三硝基甲苯-X-100、0.05％P40去污劑(Fluka)、2mMCHAPS(Boehringer，Mannheim)洗一次，最后用50mMpH8的三鹽酸洗滌。然后將樹脂離心，在還原條件下使樹脂重新懸浮于樣本緩沖液中，煮沸5分鐘，最后裝在10％的SDS-聚丙烯酰胺NuPAGE凝膠(Invitrogen)上。通過電泳將樣本從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素。硝酸纖維素膜在室溫下浸在含5％無脂無水牛奶的TBST溶液[50mmol/LpH7.5三鹽酸，250mmol/L氯化鈉，及0.1％Tween鹽水]中2小時。然后，將這些膜和山羊抗人IL-18和IL-18R(α-鏈)多克隆抗體(1μg/ml)(R&D系統(tǒng))、小鼠抗人IL-18BP單克隆抗體(5μg/ml的單克隆抗體657.27)(Corbaz等人，2000manuscriptsubmitted)、兔抗人caspase-1多克隆抗體(1μg/ml)(A-19，SantaCruz)一起培養(yǎng)。使過量200倍摩爾濃度rhIL-18BP-6his(從中國倉鼠卵巢細胞純化來的，SeronoPharmaceuticalResearchInstitute，Geneva)與5μg/ml單克隆抗體657.27一起培養(yǎng)1小時，通過競爭在條帶膜上分析單克隆抗體657.27的特異性。根據(jù)制造商提供的操作規(guī)程，再與結(jié)合于相應(yīng)抗體的HRP一起培養(yǎng)，用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)使陽性條帶顯露出來，這些條帶與HyperfilmECL(Amersham公司)接觸后，即可用肉眼看到。免疫組織化學(xué)將來自6塊動脈粥樣化斑的冷凍切片與1∶10正常馬血清或1∶10正常山羊血清在室溫下培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗一次，再與抗CD68主小鼠單克隆抗體一起培養(yǎng)以識別巨噬細胞(DAKO-CD68，KP1)，或與抗人平滑肌α-肌動蛋白主小鼠單克隆抗體一起培養(yǎng)以識別平滑肌細胞(1A4，DAKO)。為了識別動脈粥樣化斑內(nèi)的IL-18和IL-18受體，使用稀釋濃度為5μg/ml的特異性山羊多克隆抗體(R&D系統(tǒng))。用抗重組人IL-18BP異構(gòu)體a(H20)的特異性單克隆抗體(Corbaz等人，2000manuscriptsubmitted)來檢測IL-18BP。用PBS洗滌后，將切片與下列第二生物素化抗體培養(yǎng)稀釋濃度為1∶200的生物素化馬抗小鼠IgG(VectorLaboratories，Inc.)，其用于檢測具有抗CD68、平滑肌α-肌動蛋白以及IL-18BP抗體的染色，以及稀釋濃度為1∶200的生物素化馬抗山羊IgG(Vector)，其用于檢測抗IL-18和抗IL-18受體抗體。用親合素-生物素HRP顯影系統(tǒng)(VectastainABCKitPK-6100Vector)觀察免疫染色。為了作負調(diào)控，用與同型匹配無關(guān)的抗體而非主抗體使相鄰切片染色。RNA制備按照Chomczynski和Sacchi所述方法(29)，自酸性硫氰酸鈲溶液中的29塊動脈粥樣化斑提取總RNA，再用苯酚和氯仿提取。純化的RNA溶解在水中，并通過260nm的吸收度測定其濃度。在1％瓊脂糖凝膠上電泳評定RNA完整性。根據(jù)制造商協(xié)議，用Promega逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)從1μg總RNA合成cDNA。人動脈粥樣化斑內(nèi)人IL-18和IL-18BP的半定量和實時(RT)-PCR在含1UAmpliTagDNA聚合酶(PerkinElmerRoche，USA)、2.5mMdNTP(Amersham，USA)和50pmole正向和反向PCR引物的50μl總體積中進行半定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)物按以下條件在PTC-200PeltietEffect熱循環(huán)儀(MJResearch，USA)中進行培育94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延長1分鐘。為了保證與PCR反應(yīng)線性相時PCR產(chǎn)物的量相當，在循環(huán)25、28和31次后分析IL-18BP、IL-18和β-肌動蛋白。測定條帶飽和前IL-18BP、IL-18和β-肌動蛋白的最佳循環(huán)次數(shù)(分別為31、28和25輪)。根據(jù)發(fā)表的序列(AF110799，D49950，X00351)設(shè)計如下PCR引物IL-18反向5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’，正向5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’；IL-18BP正向5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’，反向5’-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3’；β-肌動蛋白反向5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’；正向5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’。為了排除可能污染樣品基因組DNA的擴增，在沒有cDNA模板時進行PCR反應(yīng)。在1％瓊脂糖凝膠上以1×TAE緩沖液對PCR產(chǎn)物(10μl)作電泳分析。凝膠染色后與1kb梯(Gibco)比較驗證PCR產(chǎn)物大小。在紫外線燈下用柯達(Kodak)數(shù)字科學(xué)分析軟件進行溴乙錠染色條帶的相對定量測定，所得結(jié)果用靶基因(hIL-18BP、hIL-18)對管家基因(hβ-肌動蛋白)的比值來表示。根據(jù)發(fā)表的序列(AF110799，D49950，NM002046)，用來自PE生物系統(tǒng)的引物表達軟件設(shè)計以下IL-18BP、IL-18和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(管家基因調(diào)控)的SYBR綠色RT-PCR引物IL-18反向5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’，正向5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3’；IL-18BP反向5’-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3’，正向5’-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3’；GAPDH反向5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’，正向5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’；內(nèi)含子GAPDH反向5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’，正向5’-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3’。測試特異性和最佳引物濃度。將PCR和特異性內(nèi)含子GAPDH引物反應(yīng)以排除可能存在的基因組DNA污染。在3.5％瓊脂糖凝膠上對PCR產(chǎn)物作電泳分析以證實沒有非特異性擴殖。用5μl/孔的RT產(chǎn)物(0.5ng總DNA)、25μl/孔的含有AmpErase尿嘧啶轉(zhuǎn)葡糖基酶(UracilN-Glycosylase，簡稱UNG)(0.5單位/孔)的SYBR綠色PCR主混合物(PEBiosystem，CA，USA)及20μl引物(300nM)進行SYBR綠色RT-PCR。PCR在50℃進行2分鐘(用于AmpEraseUNG培養(yǎng)以去除任何導(dǎo)入cDNA的尿嘧啶)，在90℃進行10分鐘(用于激活A(yù)mplitaqGold)，然后在ABIPRISM7700檢測系統(tǒng)上在95℃循環(huán)15秒，60℃循環(huán)1分鐘。這樣，使逆轉(zhuǎn)錄cDNA擴增，并測定其Ct(循環(huán)閾)值。所有Ct值均正?；凉芗一騁APDH。用凝膠電泳分析法觀察IL-18、IL-18BP及GAPDH的單特異性DNA條帶。用”SYBR綠色PCR主混合物”實時檢測的原理基于SYBR綠色與雙鏈DNA結(jié)合而導(dǎo)致熒光增強，從而可直接檢測PCR產(chǎn)物。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SEM)表示。用Mann-Whitney試驗比較組間的IL-18水平，P＜0.05就認為統(tǒng)計上有顯著差異。實施例1IL-18抑制劑保護因氧化脂蛋白(oxLDL)導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的死亡在IL-18結(jié)合蛋白或抗IL-18抗體存在或不在的情況下，將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)與氧化脂蛋白接觸16小時。如圖1所示，83％HUVEC在與氧化脂蛋白接觸后死亡。而與IL-18BP或抗IL-18抗體培養(yǎng)幾乎能使全部細胞存活下來。與IL-18BP培養(yǎng)還沒發(fā)現(xiàn)有細胞死亡。而與抗IL-18抗體培養(yǎng)細胞的存活率為89％。此試驗清楚表明，兩種不同IL-18抑制劑對由于動脈粥樣硬化斑中的凋亡的細胞死亡的保護效果。實施例2動脈粥樣硬化斑內(nèi)IL-18蛋白質(zhì)及其內(nèi)源性抑制劑IL-18BP的表達用Westernblot分析來自12條頸動脈粥樣硬化動脈和5條正常調(diào)控動脈的蛋白質(zhì)提取液。包括活化型在內(nèi)的IL-18蛋白質(zhì)在所有動脈粥樣硬化斑內(nèi)都高度表達，而在正常動脈(圖2)內(nèi)檢測到很少或沒有表達。條帶1至4為來自動脈粥樣硬化斑的樣本，條帶5至7為來自正常動脈的樣本。令人感興趣的是，IL-18活化形式的檢測結(jié)果好象和參與IL-18處理(圖2前排)的caspase-1活化形式的表達有關(guān)。在所有動脈粥樣硬化斑內(nèi)還檢測到IL-18受體蛋白質(zhì)(即α鏈)顯著表達，與此相比，正常動脈(圖2第二排)只有極低水平表達。另外，雖然表達水平是異源的(圖2第一排)，但大部分動脈粥樣硬化斑都表達IL-18BP。實施例3動脈粥樣硬化斑內(nèi)IL-18蛋白質(zhì)及其內(nèi)源性抑制劑IL-18BP的細胞定位為了確定IL-18蛋白質(zhì)及IL-18BP的細胞定位，在6塊頸動脈粥樣硬化斑上進行免疫組織化學(xué)研究。如圖2所示，IL-18主要在巨噬細胞內(nèi)表達，這些細胞可能是斑內(nèi)IL-18(未圖示)的主要來源。這些區(qū)域也有大量CD3-陽性淋巴細胞。然而，T淋巴細胞似乎沒有直接參與IL-18的產(chǎn)生。一些內(nèi)膜平滑肌細胞和偶然內(nèi)皮細胞也表達IL-18。不同的是，盡管所有血管都沒有表達，但在斑微脈管和腔表面內(nèi)皮細胞卻檢測到IL-18BP顯著表達。在一些富含巨噬細胞區(qū)，主要在細胞外，也檢測到相對較低和不均一性更大的IL-18BP表達。實施例4動脈粥樣硬化斑內(nèi)IL-18和IL-18BPmRNA轉(zhuǎn)錄物的表達及與斑不穩(wěn)定性的關(guān)系為了測定人頸動脈粥樣硬化斑(圖3)是否表達hIL-18和IL-18BPmRNA，在6塊動脈粥樣硬化斑上進行半定量RT-PCR。雖然IL-18和IL-18BPmRNA的量不均一，但所有動脈粥樣硬化斑均檢測到IL-18和IL-18BPmRNA。所以，為了準確定量IL-18和IL-18BPmRNA表達水平，用SYBR綠色RT-PCR法進一步分析該23塊動脈粥樣硬化斑(圖4)。這些斑的特征是經(jīng)臨床和病理檢查分成有癥狀(不穩(wěn)定)及無癥狀(穩(wěn)定)斑塊，肉眼觀察到有潰瘍或無潰瘍。表4簡要列出這些病人的臨床特征。兩組病人之間沒有區(qū)分頸動脈直徑減少的百分比(60％-95％)及危險因數(shù)，包括年齡、糖尿病、高膽固醇、高血壓和吸煙與否。表4病人特征無癥狀有癥狀病人(n＝9)病人1(n＝14)年齡66.9±4.070.2±3.9性別男(8)男(9)高血壓289高膽固醇348糖尿病31正在吸煙78冠狀動脈病541這些病人在進行動脈內(nèi)膜切除術(shù)前2-66天出現(xiàn)短暫或持久腦缺血發(fā)作2用抗高血壓劑治療臨床高血壓病人的數(shù)目3用降脂劑治療臨床高膽固醇病人的數(shù)目與無癥狀的動脈粥樣硬化斑相比，在有癥狀的動脈粥樣硬化斑內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-18的量被向上調(diào)升(分別是0.67±0.17和2.03±0.5)(圖4A)。統(tǒng)計學(xué)分析表明，在有癥狀的斑內(nèi)IL-18的產(chǎn)生量明顯增加(p＜0.0074)，而在有癥狀對無癥狀的斑內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-18BP的量并無增加，(分別是4.64±0.98和2.5±0.92)(圖4B)。換句話說，雖然有癥狀與無癥狀兩組均顯示IL-18和IL-18BPmRNA之間是正函數(shù)關(guān)系，但兩組之間的斜率相差很大(有癥狀一組斜率為1.16，r2＝0.36，而無癥狀一組斜率為4.79[2.39-7.20]，r2＝0.76；p＜0.05)。所以，有癥狀一組的IL-18BP表達的相對增加好象不足以補償IL-18表達的增加。而且，由于潰瘍也被認為是造成斑不穩(wěn)定的其中一個原因，所以在潰瘍或無潰瘍斑上作進一步統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示潰瘍斑內(nèi)IL-18的量顯著向上調(diào)節(jié)(p＜0.018)(圖4C)。這些數(shù)據(jù)表明，動脈粥樣硬化斑內(nèi)IL-18表達的增加與斑不穩(wěn)定有關(guān)。實施例5在疾病體內(nèi)模型中IL-18BP調(diào)控動脈粥樣硬化斑病變的發(fā)展和穩(wěn)定性方法病人特征在急性缺血性冠狀動脈綜合征(不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗塞)病人發(fā)病后7天內(nèi)抽取血漿樣本。不穩(wěn)定心絞痛定義為與心電圖的缺血性改變或與冠狀動脈病相關(guān)的典型胸痛。心肌梗塞是基于心電圖上與循環(huán)血液中的心肌酶(磷酸肌酸激酶和肌鈣蛋白)顯著上升相關(guān)的缺血性改變而作出的診斷。在同一個心臟病學(xué)部門就診的非缺血性病人，他們完全沒有缺血跡象。用市售藥劑盒(MBL，Japan)測定hIL-18的血漿水平。小鼠IL-18BP表達質(zhì)體在體內(nèi)肌肉內(nèi)電轉(zhuǎn)移每隔3個星期，給14只14周大的雄性C57BL/6apoEKO小鼠注射3次IL-18BP表達質(zhì)體及pcDNA3IL-8BP。給調(diào)控小鼠(n＝19)注射調(diào)控空質(zhì)體。按已知方法(附屬編號為#Q9ZOM9)(23)使小鼠IL-18BP異構(gòu)體dcDNA分離出來，并在巨細胞病毒激活子(Invitrogen)的控制下將其亞克隆到哺乳動物細胞表達載體pcDNA3的EcoR1/Not1位上。圖5所示為稱為334.yh的構(gòu)造。調(diào)控質(zhì)體具有相似構(gòu)造，但沒有治療性的cDNA。如前所述(13)，在麻醉小鼠的兩塊脛頭顱肌肉內(nèi)注射IL-18BP或調(diào)控表達質(zhì)體(60μg)。簡而言之，在腿兩側(cè)設(shè)置相距4.2至5.3mm的兩塊不銹鋼電極，經(jīng)PS-15電脈沖儀發(fā)出經(jīng)皮電脈沖(200V/cm的8方波電脈沖，在2Hz持續(xù)200毫秒)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠IL-18BP(mIL-18BP)孔板用自兔多克隆抗體純化來的重組小鼠IL-18BPd親合物(5μg/孔)覆蓋過夜。先后用抗大腸菌類的生物素化重組小鼠IL-18BP(Peprotec)的兔多克隆抗體(0.3μg/ml)和外親合素過氧化酶(1/1000)(Sigma)檢測可溶性mIL-18BP。為了確認mIL-18BP的特異性，用WesternBlot法測試捕獲兔多克隆抗體。以HEK293細胞產(chǎn)生的重組小鼠IL-18BPd為標準。ELISA的靈敏度為5ng/ml。分析小鼠如前所述(13)，從主動脈竇獲得低溫恒溫切片(8μm)，以便用油紅檢測脂質(zhì)積聚，用天狼星紅(SiriusRed)檢測膠原以及進行免疫組織化學(xué)分析。如前所述(13)，用特異性主抗體，如抗小鼠巨噬細胞、克隆MOMA2(BioSource)、與磷酸酶堿共軛的抗平滑肌細胞α-肌動蛋白以及抗T淋巴細胞CD3(Dako)，使這些切片染色。用TUNEL技術(shù)(13)檢測細胞的死亡率。用肉眼隨機數(shù)一數(shù)CD3陽性細胞。如前所述(13)，用計算機輔助圖像定量(NS15000Microvision)測定在主動脈竇和主動脈區(qū)內(nèi)巨噬細胞、平滑肌細胞、膠原或TUNEL的染色為陽性的動脈粥樣硬化斑。用具有與非免疫同型匹配的免疫球蛋白的染色來評估免疫染色的特異性。用酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的缺失來評估TUNEL的特異性。用10％緩沖甲醛溶液使跨越左鎖骨下動脈和腎動脈的胸主動脈凝固，并用油紅使脂質(zhì)積聚染色。然后，將這些主動脈順著縱向方向打開，用計算機輔助圖像定量(NS15000Microvision)計算脂質(zhì)積聚的百分比。結(jié)果本研究測試證明了假設(shè)IL-18/IL-18BP調(diào)控在動脈粥樣硬化和斑穩(wěn)定性兩方面起關(guān)鍵作用。測量急性冠狀動脈綜合征病人(20個男性，18個女性，平均年齡為66.2±1.8歲，其中14人有不穩(wěn)定心絞痛，34人有心肌梗塞)和在同一個心臟病學(xué)部門就診的非缺血性調(diào)控病人(10個男性，3個女性，平均年齡為60.0±5.2歲)的IL-18血漿水平。急性冠狀動脈綜合征病人的IL-18血漿水平與調(diào)控病人相比顯著上升(分別為73.0±12.2和146.9±17.1pg/ml，p＜0.05)，而IL-18BP的循環(huán)水平剛好與此相反，只有輕微升高(分別為7.5±2.5和20.1±2.7ng/ml，p＝0.06)。另外，也發(fā)現(xiàn)有嚴重缺血性心臟機能障礙和肺水腫臨床跡象(224.03±39.1pg/ml，與調(diào)控相比p＜0.001)的病人，其IL-18水平與疾病的嚴重程度有關(guān)，病情越重，IL-18水平越高。急性冠狀動脈病病人所得的這些結(jié)果與已知的在中風(fēng)病人的動脈粥樣硬化斑內(nèi)IL-18水平高的觀察結(jié)果，均表明IL-18/IL-18BP調(diào)控在動脈粥樣硬化過程中可能起著重要作用。為此，我們用自發(fā)產(chǎn)生類人動脈粥樣硬化病變的apoE昏迷(KO)小鼠測試這一假設(shè)。14只14周大的雄性小鼠通過在體內(nèi)肌肉內(nèi)電轉(zhuǎn)移編碼小鼠IL-18BPd的表達質(zhì)體DNA來接受IL-18BP補給，而19只年齡相當?shù)恼{(diào)控小鼠接受空質(zhì)體。每3星期重復(fù)質(zhì)體電轉(zhuǎn)移，治療9星期后，在23周大時處死小鼠。在注射了空質(zhì)體的KO小鼠中，小鼠IL-18BP的血漿水平比檢測極限(5ng/ml)低。然而，注射單次IL-18BP質(zhì)體后二天發(fā)現(xiàn)，血液的IL-BP水平達到最高(323.5±100.9ng/ml)，二星期后，還測到127.4±35.4ng/ml。用IL-18BP或空質(zhì)體治療9個星期后，2組病人之間的總膽固醇(分別為489.4±34.6和480.8±36.3mg/dl)和高密度脂蛋白血清水平(分別為52.3±9.4和48.8±5.1mg/dl)差別不大。與調(diào)控一組相比，以IL-18BP治療的一組動物體重適度地但會顯著增加(分別為28.6±0.8g和31.8±0.9g，p＜0.05)。在兩個不同位置檢驗IL-18補給對動脈粥樣硬化的影響，即下胸主動脈和主動脈竇。選擇胸主動脈來確定IL-18BP對脂肪紋產(chǎn)生(動脈粥樣化形成)的作用，這是因為IL-18BP開始轉(zhuǎn)染時14周大的小鼠(數(shù)據(jù)未示出)幾乎沒有出現(xiàn)胸動脈粥樣硬化病變。在14周大的小鼠(數(shù)據(jù)未示出)中卻發(fā)現(xiàn)主動脈竇動脈粥樣硬化病變，用這些主動脈竇檢驗晚期斑的發(fā)展和并發(fā)癥，這是斑穩(wěn)定的一個重要決定因素。IL-18BP治療對apoEKO小鼠的動脈粥樣硬化病變的產(chǎn)生和發(fā)展有顯著影響。胸主動脈的檢驗結(jié)果顯示，IL-18BP脂質(zhì)治療與空質(zhì)體治療相比，小鼠的脂質(zhì)積聚下降得更多(圖6)。定量計算機輔助圖像分析顯示，動脈粥樣硬化病變的程度減低69％(p＜0.0001)(圖6)，證明IL-18對動脈粥樣硬化有治療作用。另外，與用空質(zhì)體治療相比，用IL-18BP質(zhì)體治療僅9星期，就可顯著限制主動脈竇動脈粥樣硬化斑的發(fā)展(斑的面積減少24％，p＝0.01)(圖7)。更重要的是，晚期病變的組成是斑不穩(wěn)定的一個主要決定因素，通過IL-18BP治療得到明顯改善。用IL-18BP質(zhì)體治療小鼠的動脈粥樣硬化病變使巨噬細胞浸潤大幅減少50％(p＜0.0001)(圖8)，T淋巴細胞減少67％(p＜0.005)(圖8)，而平滑肌細胞積聚增加2倍(p＜0.05)(圖9)。此外，經(jīng)天狼星紅染色確定，病變細胞組成的這些重要改變與膠原含量大幅增加85％，而總脂質(zhì)含量下降有關(guān)。故IL-18治療可顯著減弱動脈粥樣硬化病變的炎癥過程，并使動脈粥樣硬化斑趨于穩(wěn)定。而且，在用IL-18BP治療的小鼠中，病變的炎癥組成顯著減少也使斑內(nèi)細胞死亡率大大降低(用IL-18BP治療的小鼠為2.9±0.9％，而調(diào)控小鼠為10.5±3.6％，p＜0.05)，因而限制了非細胞脂質(zhì)核心的擴大和血栓形成(Mallat，1999)。結(jié)論通過進展良好的類人動脈粥樣硬化小鼠模型，上述結(jié)果清楚顯示，IL-18和IL-18BP肯定在動脈粥樣硬化斑的產(chǎn)生、發(fā)展和穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。而為了預(yù)防胸主動脈早期病變的形成，通過補給IL-18BP抑制IL-18活性也對主動脈竇晚期病變組成有顯著影響，包括轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定斑表型。動脈粥樣硬化病人的臨床預(yù)后只會部分取決于病變的面積?，F(xiàn)在已有廣泛共識，病變的質(zhì)量(斑的組成)而不是面積能更好預(yù)測缺血性疾病的發(fā)作。事實上，動脈粥樣硬化(心臟和腦梗塞)的嚴重臨床表現(xiàn)主要是在破裂動脈粥樣硬化斑的接觸面上形成血栓堵塞血管(19)。病理研究業(yè)已證明，易損和不穩(wěn)定斑容易破裂或已破裂，主要存在在炎癥細胞中，它們失去大量平滑肌細胞和膠原量(20，21)。另外，這些斑塊使凋亡細胞的死亡率大幅提高，從而形成高血栓脂質(zhì)核心(13，22)。值得注意的是，在用IL-18BP治療的小鼠中，所有這些斑不穩(wěn)定跡象均明顯減弱，這表明IL-18信號是斑不穩(wěn)定的一個主要決定因素。我們發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動脈綜合征病人的循環(huán)IL-18水平升高，導(dǎo)致中風(fēng)的不穩(wěn)定頸動脈樣硬化斑內(nèi)產(chǎn)生的IL-18也增加，由此更加證實了apoEKO小鼠所得的結(jié)果與人類疾病的關(guān)系。將這些發(fā)現(xiàn)綜合考慮，確定IL-18抑制劑的活性可作為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化斑產(chǎn)生及限制斑并發(fā)癥的重要新治療手段。實施例6高水平IL-18與心衰竭病人的復(fù)發(fā)有關(guān)用IL-18特異性抗體經(jīng)ELSIA試驗測量病人血清的IL-18水平。共測試56個有或無心衰竭的缺血性或非缺血性病人。在后來死亡的病人中，IL-18水平為216.0±41.5pg/ml，而生存的病人中，IL-18水平為112.2±12.2pg/ml(p＝0.0018)。在出現(xiàn)復(fù)發(fā)事件的病人中，如死亡、復(fù)發(fā)性局部缺血、血管反復(fù)閉塞、動脈粥樣硬化發(fā)展或因心衰竭而經(jīng)常入院，測定的IL-1的水平為165.8±23.8pg/ml，而在任何無復(fù)發(fā)的病人中，IL-18水平為107.7±14.6pg/ml(p＝0.03)。這些結(jié)果表明，有嚴重臨床預(yù)后，如復(fù)發(fā)或者甚至死亡，的病人的IL-18水平很高。測定16個有或無心衰竭的非缺血性病人的血樣IL-18水平。在后來死亡的病人中，IL-18水平為199.0±34.8pg/ml，而在仍然生存的病人中，IL-18水平為95.3±20.4pg/ml(p＝0.09)。有復(fù)發(fā)的病人與無復(fù)發(fā)的病人的IL-18水平分別是146.6±34.4pg/ml和95.4±23.9pg/ml(p＝0.03)。雖然由于病人數(shù)目較小，IL-18水平的差異未達到統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但仍清楚看到IL-18的水平上升這一趨勢。在缺血性病人中，死亡病人與生存病人的IL-18水平分別是214.2±45.9pg/ml和118.4±12.8pg/ml(p＝0.007)。有復(fù)發(fā)和無復(fù)發(fā)的病人的IL-18水平分別是162.8±24.7pg/ml和116.2±16.0pg/ml。參考文獻1.RossR.Atherosclerosis-aninflammatorydisease.NEnglJMed1999；340115-126.2.vanderWalAC，BeckerAE，vanderLoosCM，DasPK.Siteofintimalruptureorerosionofthrombosedcoronaryatheroscleroticplaquesischaracterizedbyaninflammatoryprocessirrespectiveofthedominantplaquemorphology.Circulation1994；8936-44.3.FusterV，BadimonL，BadimonJJ，ChesebroJH.Thepathogenesisofcoronaryarterydiseaseandtheacutecoronarysyndromes(1).NEnglJMed1992；326242-250.4.FusterV，BadimonL，BadimonJJ，ChesebroJH.Thepathogenesisofcoronaryarterydiseaseandtheacutecoronarysyndromes(2).NEnglJMed1992；326310-318.5.LeeRT，LibbyP.Theunstableatheroma.ArteriosclerThrombVascBiol1997；171859-1867.6.RidkerPM，CushmanM，StampferMJ，TracyRP，HennekensCH.Inflammation，aspirin，andtheriskofcardiovasculardiseaseinapparentlyhealthymen.NEnglJMed1997；336973-979.7.LibbyP.Molecularbasesoftheacutecoronarysyndromes.Circulation1995；912844-2850.8.Nakamura，K，Okamura，H，Nagata，KandTamura，T.(1989).Infect.Immun.57，590-595.9.YoshimotoT，Takeda，K，Taraka，T，Ohkusu，K，Kashiwamura，S，Okamura，H，Akira，SandNakanishi，K(1998).J.Immunol.161，3400-3407.10.Parnet，P，Garka，KE，Bonnert，TP，Dower，SK，andSims，JE.(1996).J.Biol.Chem.271，3967-3970.11.DiDonato，JA，Hayakawa，M，Rothwarf，DM，Zandi，EandKarin，M.(1997).Nuture388，16514-16517.12.Novick，D，Kim，S-H，F(xiàn)antuzzi，G，Reznikov，L，Dinarello，C，andRubinstein，M(1999).Immunity10，127-136.13.MallatZ，HugelB，OhanJ，LesècheG，F(xiàn)reyssinetJM，TedguiA.Shedmembranemicroparticleswithprocoagulantpotentialinhumanatheroscleroticplaques.Aroleforapoptosisinplaquethrombogenicity.Circulation1999；99348-353.14.TricotO，MallatZ，HeymesC，BelminJ，LesècheG，TedguiA.RelationBetweenEndothelialCellApoptosisandBloodFlowDirectioninHumanAtheroscleroticPlaque.Circulation2000；inpress.15.DimmelerS，HaendelerJ，GalleJ，ZeiherAM.Oxidizedlow-densitylipoproteininducesapoptosisofhumanendothelialcellsbyactivationofCPP32-likeproteases.Amechanisticcluetothe′responsetoinjury′hypothesis.Circulation1997；951760-3.16.Grantham，Science，Vol.185，pp.862-864(1974).17.DimmelerS，HaendelerJ，GalleJ，ZeiherAM.Oxidizedlow-densitylipoproteininducesapoptosisofhumanendothelialcellsbyactivationofCPP32-likeproteases.Amechanisticcluetothe′responsetoinjury′hypothesis.Circulation1997；951760-3.18.MirLM，BureauMF，GehlJ，RangaraR，RouyD，CaillaudJM，DellereP，BranellecD，SchwartzB，SchermanD.Highefficiencygenetransferintoskeletalmusclemediatedbyelectricpulses.ProcNatlAcadSciUSA1999；964262-7.19.Lee，R.T.&Libby，P.Theunstableatheroma.ArteriosclerThrombVascBiol17，1859-1867(1997).20.Davies，M.J.Thecompositionofcoronary-arteryplaques[editorial；comment].NEnglJMed336，1312-1314(1997).21.Virmani，R.，Kolodgie，F(xiàn).D.，Burke，A.P.，F(xiàn)arb，A.&Schwartz，S.M.Lessonsfromsuddencoronarydeathacomprehensivemorphologicalclassificationschemeforatheroscleroticlesions.ArteriosclerThrombVascBiol20，1262-1275.(2000).22.Kolodgie，F(xiàn).D.etal.Localizationofapoptoticmacrophagesatthesiteofplaqueruptureinsuddencoronarydeath[InProcessCitation].AmJPathol157，1259-1268(2000).23.Kim，S.H.etal.StructuralrequirementsofsixnaturallyoccurringisoformsoftheIL-18bindingproteintoinhibitIL-18.ProcNatlAcadSciUSA97，1190-1195(2000)。24.Elliott，M.J.，Maini，R.N.，F(xiàn)eldmann，M.，Long-Fox，A.，Charles，P.，Bijl，H.，andWoody，J.N.，1994，Lancet344，1125-1127.25.KnightDM，TrinhH，LeJ，SiegelS，ShealyD，McDonoughM，ScallonB，MooreMA，VilcekJ，DaddonaP，etal.Constructionandinitialcharacterizationofamouse-humanchimericanti-TNFantibody.MolImmunol1993Nov30161443-53.26.Tucci，A.，James，H.，Chicheportiche，R.，Bonnefoy，J.Y.，Dayer，J.M.，andZubler，R.H.，1992，J.Immunol.148，2778-2784.27.Engelmann，H.，D.Novick，andD.Wallach.1990.Twotumornecrosisfactor-bindingproteinspurifiedfromhumanurine.Evidenceforimmunologicalcross-reactivitywithcellsurfacetumornecrosisfactorreceptors.J.Biol.Chem.2651531-1536.28.MooreWS，BarnettHJ，BeebeHG，etal.Guidelinesforcarotidendarterectomy.AmultidisciplinaryconsensusstatementfromtheAdHocCommittee，AmericanHeartAssociat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