專利名稱：一種包含銀納米粒的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含有效量銀納米粒的藥用組合物及其用途，以及局 部給予宿主所述藥用組合物以增加毛發(fā)生長的方法。
背景技術：
金屬納米粒因為其在許多學科領域(如催化和納米電子)有著重
要的應用，已吸引了越來越多的對化學領域的關注(參見:(a)El-Sayed, M. A. Ace. Chem. Res. 2004， 37, 326.(b)Ho， C-M.; Yu, W.-Y.; Che， C-M. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3303.(c)Lang， H.; May, R. A.; Iversen, B. L.; Chandler, B. D. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, M832.(d)Lewis, L. N. Chem. Rev. 1993， 93， 2的3)。近來，已付出大量努力致力于開發(fā)金 屬納米粒的生物醫(yī)學應用。當生物學標記取得顯著進展時(參 見(a)Nicewamer-Pena， S. R.; Freeman, R. G.; Reiss, B. D.; He, L.; Pena, D. J.; Walton, I. D.; Cromer, R.; Keating, C. D.; Natan, M. J. Science 2001， 294, 137.(b)Elghanian, R.; Storhoff, J. J.; Mucic, R. C; Letsinger， R. L.; Mirkin, C. A. Science 1997, 277, 1078)，幾乎沒有納米粒的治療學應 用在文獻中被報導。值得一提的實施例是銀納米粒的抗微生物特性， 該實施例用于傷口愈合(Wright， J. B.; Lam, K.; Hansen, D.; Burrell, R. E. Am. J. Inf. Cont 1999, 27， 344)。據(jù)我們所知，銀納米粒在脫發(fā)中增加 毛發(fā)生長的用途還未見文獻報導。
斑禿是頭皮和身體其它部位毛發(fā)脫落的疾病。被報導與自身免疫 相關，其作用機制是毛嚢被自身免疫系統(tǒng)通過自身免疫攻擊，從而阻 止毛發(fā)生長。另一個觀察結果是高水平的自然產(chǎn)生的激素(稱為雙羥 睪丸酮(DHT))存在于遺傳學歸為男性模式脫發(fā)的人頭皮中，縮短毛 發(fā)生長期。最終，毛發(fā)變得小至實際上看不見。如果不阻止的話，這樣能導致典型的男性禿頭發(fā)際線。
斑殼經(jīng)常開始于頭皮上一個或多個小的、圓的、光滑的禿塊，能
斑殼影響大約全世界人口的1.7%,包括僅美國就超過470萬人，這種 病癥/疾病對個人的自我形象和自信心有深遠的影響，從而影響生活質 量，無論在工作還是學習中。
各種年齡和人種的男性和女性均可發(fā)生斑殼。其發(fā)病經(jīng)常開始于 兒童期/成人早期，且可為心理學破壞性的。盡管斑禿不危及生命，它 幾乎肯定是改變生活的，其突然發(fā)病、反復發(fā)作和不可預期的病程對 被這種疾病困擾的人的生活有深遠的心理學影響。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過使用人血清白蛋白(HAS)作為穩(wěn)定劑來 構建銀納米粒，這些納米粒在動物模型和人中顯示出有希望的增加毛 發(fā)生長作用。
因此，本發(fā)明涉及包含有效量銀納米粒、至少一種穩(wěn)定劑(例如 一種或多種蛋白和/或肽)和至少 一種藥學可接受稀釋劑的藥用組合 物。優(yōu)選地，蛋白選自人血清白蛋白和轉鐵蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本申請的藥用組合物包含選自水、乙 醇、二曱基亞砜、乙腈、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、 檸檬酸緩沖液、血清或任何其它生理學相關的溶劑或溶液，和其混合 物的稀釋劑。
本發(fā)明也涉及增加毛發(fā)生長的方法，該方法包含局部給予需要治 療的宿主(優(yōu)選人)本發(fā)明藥用組合物。
本發(fā)明也涉及包含有效量銀納米粒組合物在制備增加宿主毛發(fā) 生長藥物中的用途。
在本發(fā)明的用途中，組合物包含有效量的銀納米粒、至少一種穩(wěn) 定劑(例如一種或多種蛋白和/或肽)和至少一種藥學可接受的稀釋劑。優(yōu)選地，蛋白選自人血清白蛋白和轉鐵蛋白。
在用途的優(yōu)選實施方案中，本申請的藥用組合物包含選自水、乙
醇、二曱基亞砜、乙腈、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、 檸檬酸緩沖液、血清或任何其它生理學相關的溶劑和溶液，或其混合 物的稀釋劑。
有許多產(chǎn)生不同形狀和大小銀納米粒的方法(參見:(a)Raveendran， P.; Fu, J.; Wallen， S. L. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13940.(b)Sun， Y.; Xia, Y. Science 2002， 298, 2176.(c)Esumi， K.; S畫ki， A.; Yamahira， A.; Torigoe, K. Langmuir 2000, 16, 2604)。在本發(fā)明中，使用Hepes緩沖液 容易地制^4艮納米粒。典型反應是室溫下AgN03(2或5 mM)溶解于 Hepes緩沖液(0.1 M, pH7.4)中至終濃度為lmMAgN03，在室溫下攪 拌120小時或在回流條件下攪拌4小時。納米粒的形成受緩沖液酸度 影響，因為當pH調(diào)整至〈時無銀納米粒形成。從圖l可看出，制備 的納米?；旧弦?至20nm(平均直徑約10 nm)的直徑均勻地分布。 點圖(spot-profile )能量-分散X射線分析(EDX)顯示來自銀原子的強 信號和來自銅網(wǎng)格的銅原子信號，和來自C、0和C1原子的弱信號(圖 2)。
大量樣品的粉末X射線衍射(XRD)圖顯示Hepes緩沖液中生成的 銀納米粒以面心立方晶狀態(tài)存在。如圖3描述，4分末X射線衍射圖中 與(lll)、 (200)、 (220)和(311)的20值對應的強峰與文獻中報導的值相 同(JCPDS No. 04-0783)。銀納米粒顯示出在410 nm有吸收峰(圖4)， 與大量樣品的粉末X射線衍射(XRD)圖的報告數(shù)據(jù)接近。
HAS存在時，在37。C下用UV- Vis光譜持續(xù)觀測達7天，未觀 測到濃度至ImM的銀納米粒的顯著性光譜改變。在此實施例中， HSA(lmM，生理學相關水平)用來穩(wěn)定銀納米粒(見圖5)。
根據(jù)UV-vis吸收滴定結果(見圖6)，可見銀納米粒可與HSA相 互作用(AAma^+4nm;增色效應=3%)。
TEM圖4象顯示當《艮納米粒溶于1 mMHSA 3天時，大小從10 nm改變至 20nm;然而，未觀察到銀沉淀(見圖7)。
通過使用動物模型研究銀納米粒對毛發(fā)生長的作用。在此動物模 型中，在棵鼠后部頭皮覆以浸有以下物質的紗布敷料只有l(wèi)mM參 比對照(即人血清白蛋白；HSA)或1 mMHAS中的0.1 mM銀納米粒。 42天后，可在應用了銀納米粒的小鼠后部頭皮觀察到毛發(fā)生長(見圖8 的右圖)，而只應用參比對照的小鼠則未觀察到(見圖8的左圖)。每組 n=5。
另一個研究中，兩組凈果鼠以上述相同方式在后部頭皮應用1 mM 參比對照或1 mM HAS中的1 mM銀納米粒。42天后，可在應用了 銀納米粒的后部頭皮觀察到毛發(fā)生長(右圖)，而只有參比對照的d 、鼠 中則未觀察到(左圖)。每組n-5(見圖9)。
從正常毛發(fā)生長的鼠(Balb/c)和僅應用參比對照或應用1 mM銀 納米粒42天的棵鼠取全層皮膚的組織學。結果表明應用銀納米粒的 棵鼠皮膚的真皮中有正常外觀的毛嚢(見圖IO中間圖)，至少在形態(tài)學 相似于正常毛發(fā)生長鼠中發(fā)現(xiàn)的(見圖IO上圖)。相反，取自應用參比 對照棵鼠的皮膚幾乎沒有可確認的毛嚢(見

圖10下圖)。
穩(wěn)定性對用于治療應用的銀納米粒是個重要問題。先前研究顯示 銀納米粒在溶液中不穩(wěn)定，在高濃度或平均粒徑> 40 nm時容易聚集 (參見Mafune, F.; Kohno， J,Y.; Takeda, Y.; Kondow, T.; Sawabe， H. J. Phy. Chem. B 2000, 104， 8333)。為保持適當?shù)娜芤悍€(wěn)定性，本研究中 制備的銀納米粒的大小限制在直徑5 - 20 nm。這些納米粒在Hepes緩 沖液中50 [iM時顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性；在37°C用UV-vis光譜;險測， 經(jīng)3天未觀察到顯著的光譜改變。然而，在lmM水平，在37。C孵 育3天后發(fā)現(xiàn)銀沉淀和UV光譜改變。相似地，使用常見的NaBHU 方案在擰檬酸緩沖液中制備的銀納米粒也顯示出在50 (iM有好的溶液 穩(wěn)定性，但在1 mM水平為差的溶液穩(wěn)定性。
人血清白蛋白(HSA)是循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的血漿蛋白。先前報導 顯示這種血清蛋白可用來穩(wěn)定各種金屬納米粒(參見Xie, H.;Tkachenko， A. G.; Glomm, W. R.; Ryan, J. A.; Brennaman, M. K.; Papanikolas, J. M.; Franzen, S.; Feldheim, D. L. Anal. Chem. 2003, 75， 5797)。在本研究中，HSA(l mM，生理學相關水平)用來穩(wěn)定銀納米粒。 我們發(fā)現(xiàn)HSA存在時，濃度至1 mM的銀納米粒在37°C下用UV-Vis 光i普持續(xù)檢測達7天，未觀察到顯著的光譜改變(圖5)。近來，Shen 及其同事揭示了血清白蛋白和《艮納米粒(60 nm)相互作用的滯后作用 (Shen, X.; Y薩，Q.; Liang, H.; Yan, H.; He, X. ScL in China 2003, 46, 387)。通過UV-Vis吸收滴定，我們也發(fā)現(xiàn)銀納米粒與HSA相互作用 (A^a^ +4 nm;增色效應=3%，圖6)。 TEM圖像顯示當銀納米粒用 HAS處理3天時，大小從10 nm改變至 20 nm;然而，未觀察到《艮沉 淀(見圖7)。
附圖簡述
圖1顯示實施例1中制備的銀納米粒的透射電子顯微鏡(TEM， A 和B)和高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM, C和D)圖像。
圖2為實施例1中制備的銀納米粒的點圖能量色散X射線分析 (EDX)。
圖3為取自實施例1中制備的大量樣品的粉末X射線衍射(XRD)圖。
圖4為實施例1中制備的銀納米粒的吸收光譜。
圖5為1 mM 4艮納米粒在1 mM HAS存在時于37°C持續(xù)觀測7
天觀察到的UV-Vis光譜。
圖6顯示銀納米粒與HAS的UV-vis吸收滴定。
圖7為銀納米粒溶于1 mMHAS中3天的透射電子顯微鏡圖像。
圖8為棵鼠每天在后部頭皮覆以浸有以下物質的紗布敷料只有
ImM參比對照(即，人血清白蛋白；HSA)(左圖)或l mMHAS中的O.l
mM銀納米粒(右圖)42天后的圖片。每組n二5。
圖9為棵鼠每天在后部頭皮覆以浸有以下物質的紗布敷料只有
ImM參比對照(即，人血清白蛋白；HSA)(左圖)或1 mMHAS中的lmM銀納米粒(右圖)42天后的圖片。每組n二5。
圖10顯示取自正常毛發(fā)生長鼠(Balb/c)(上圖)、取自^f叉應用參比 對照(下圖)或應用銀納米粒(中間圖)42天棵鼠的全層皮膚的組織學。
實施本發(fā)明的模式
本發(fā)明將在以下實施例中被進一步說明。然而，不能認為由此而 限制本發(fā)明。本領域普通技術人員知道怎樣改變示例的條件來得到所 需要的結果。
實施例
材料。除了另外指明的，所有化學品均購自Sigma-Aldrich Chemical Co.。
儀器。XRD譜用Philips PW1 830粉末X射線衍射儀記錄。UV-vis 吸收光譜取自Varian Cary 50分光光度計。銀納米粒的TEM圖像取自 使用200 kV的加速電壓的JEOL JEM-2000透射電子顯微鏡，在配有 Oxford incax-sight EDX附件(使用200 kV的加速電壓)的Philips Tecnai 20和Philips EM208s (使用80 kV的加速電壓)上進行。
銀納米粒的制備。在磁力攪拌棒攪拌下，向含有人血清白蛋白和 水的圓底燒瓶緩慢加入AgNO3水溶液(2-50mM, 1 mL)，至終濃度為 1 mM HAS和1 mM AgN03。實際的銀納米粒濃度用電感耦合等離子 體質譜儀(ICP-MS)測量。
吸收滴定。置含4艮納米粒(5 ^M)的Hepes緩沖液(3000 ^L)于分 光光度儀的恒溫吸收池中。向此溶液中加入毫摩爾儲備人血清白蛋白 (HSA)溶液的等分試液。每等分試液平衡IO分鐘后記錄吸收光譜直至 到達飽和點。
生物學研究和測量。Whn(Winged-helix)突變的棵鼠購自Jackson 實驗室(加拿大)，在4-5周大時使用。在實驗前，檢查這些棵鼠以確 認無可見毛發(fā)(參見Anat Gafter-Gvili， Benjamin Sredni, Rivka Gal, Uzi Gafter, and Yona Kalechman. Cyclosporin A-induced hair growth in mice is associated with inhibition of calcineurin-dependent activation of NFATin follicular keratinocytes (環(huán)孢素A誘導小鼠毛發(fā)生長與嚢角質形成 細胞中NFAT的鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶-依賴活化的抑制相關)。Am J Physiol Cell Physiol 284: 1593-1603， 2003)。 lxl cm的紗布用含0.1或1 mM銀納米粒的500 jiil HSA溶液浸濕，并覆在后部頭皮(圖8中銀納 米粒使用0.1 mM)或后部頭皮(圖9中銀納米粒使用1 mM)。紗布每天 更換直至第42天。每天進行直接檢查直至第42天。選擇的小鼠在第 42天處死，取皮膚進行組織學實驗以4企查毛嚢的形態(tài)學(如圖10所示)。
實施例1
4艮納米粒的制備和特征
A) 通過室溫下AgN03(5 mM)溶解于Hepes緩沖液(O.l M, pH 7.4) 中至終濃度為1 mM AgN03,和室溫下攪拌120小時，獲得4艮納米粒。 圖1顯示銀納米粒的透射電子顯微鏡(TEM， A和B)和高分辨透射電 子顯微鏡(HR-TEM， C和D)圖像。這些納米粒以5-20nm粒徑(平均直 徑約10 nm)均勻地分布。點圖能量色散X射線分析(EDX)顯示了來自 銀原子的強信號和來自銅網(wǎng)格的銅原子信號，和來自C、 O和Cl原 子的弱信號的存在(圖2)。
從大量樣品分析得到的粉末X射線衍射(XRD)圖提示Hepes緩沖 液中生成的銀納米粒以面心立方晶狀態(tài)存在。如圖3描述，粉末X射 線衍射圖中與(lll)、 (200)、 (220)和(311)的20值對應的強峰與文獻中 ^艮導的值相同(JCPDS No. 04-0783)。 4艮納米粒顯示出在410 nm有吸收 峰(圖4)，與報導的數(shù)據(jù)接近。
B) 重復實驗A，但使用AgN03(2mM),得到相同結果。
C) 除了混合物在回流條件下攪拌4小時而不是室溫下攪拌120小 時外，重復實驗A，得到相同結果。
實施例2銀納米粒在棵鼠后部頭皮應用42天后增加毛發(fā)生長的作用。
在棵鼠后部頭皮覆以浸有以下物質的紗布敷料只有l(wèi)mM參比 對照(即，人血清白蛋白；HSA)或1 mMHAS中的0.1 mM銀納米粒。 紗布每天更換。42天后，應用銀納米粒的小鼠后部頭皮可觀察到毛發(fā) 生長(右圖，圖8),而在只應用參比對照的小鼠中未見(左圖，圖8)。 每組n:5。
實施例3
銀納米粒在棵鼠后部頭皮應用42天后增加毛發(fā)生長的作用。
另外兩組棵鼠以與實施例2相同的方式在后部頭皮應用lmM參 比對照或1 mMHSA中的1 mM 4艮納米粒。42天后，后部頭皮應用 ^L納米粒的可觀察到毛發(fā)生長(右圖，圖9),而在只應用參比對照的小 鼠中未見(左圖，圖9)。每組11=5。
實施例4
取自正常毛發(fā)生長小鼠、應用或未應用銀納米粒42天后的棵鼠 (如實施例3所描述)的皮膚組織學
全層皮膚的組織學取自正常毛發(fā)生長鼠(Balb/c)、僅應用參比對照 或應用1 mMHSA中的1 mM銀納米粒42天后棵鼠。結果表明取自 應用銀納米粒棵鼠的皮膚在真皮中有正常形態(tài)的毛嚢(中間圖，圖10)， 至少在形態(tài)學與正常毛發(fā)生長小鼠中發(fā)現(xiàn)的相似(上圖，圖10)。相反， 取自應用參比對照棵鼠的皮膚幾乎沒有可確認的毛嚢(下圖，圖10)。
實施例5
銀納米粒在小鼠中的毒性試驗。
每天給予正常、健康小鼠lmMHSA中的10mM銀納米粒，共 42天。這個劑量高于毛發(fā)生長有效量的100倍。監(jiān)測鼠的活動。至 42天期間結束，無小鼠死亡或生病，這表明HAS中銀納米粒對鼠是 安全和無毒的。實施例6
NAGs對小鼠皮膚的過敏試驗
應用1 mM HSA中的1 mM銀納米粒至棵鼠皮膚。在1小時、 24小時和48小時間隔監(jiān)測小鼠。未在皮膚上觀察到皮滲、瘀傷(bruise) 或任何刺激反應，這表明HAS中的銀納米粒是安全的、不產(chǎn)生任何 皮膚過敏反應。
權利要求
1.一種藥用組合物，該組合物包含有效量的銀納米粒、至少一種穩(wěn)定劑和至少一種藥學可接受稀釋劑。
2. 權利要求l的藥用組合物，其中一種或多種蛋白和/或肽用作 穩(wěn)定劑。
3. 權利要求2的藥用組合物，其中蛋白選自人血清白蛋白和轉 鐵蛋白。
4. 權利要求1-3中任一項的藥用組合物，其中銀納米粒直徑為 1 -100 nm，且銀納米粒在組合物中的濃度為10 jiM- 10 mM。
5. 權利要求4的藥用組合物，其中組合物中銀納米粒的濃度為 100 jiM-l mM。
6. 權利要求1-3中任一項的藥用組合物，其中稀釋劑選自水、 乙醇、二甲基亞砜、乙腈、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖 液、檸檬酸緩沖液、血清或任何其它生理學相關的溶劑或溶液，和其 混合物。
7. —種增加毛發(fā)生長的方法，該方法包括局部給予需要治療的 宿主權利要求1-6中任一項的藥用組合物。
8. 權利要求7的方法，其中宿主為人。
9. 一種包含有效量銀納米粒的組合物在制備增加宿主毛發(fā)生長 藥物中的用途。
10. 權利要求9的用途，其中組合物包含有效量的銀納米粒、至 少 一種穩(wěn)定劑和至少 一種藥學可接受稀釋劑。
11. 權利要求10的用途，其中一種或多種蛋白和/或肽用作穩(wěn)定劑。
12. 權利要求11的用途，其中蛋白選自人血清白蛋白和轉鐵蛋白。
13. 權利要求9-12中任一項的用途，其中4艮納米粒直徑為1-100nm，組合物中銀納米粒的濃度為10 fxM-10 mM。
14. 權利要求13的用途，其中組合物中銀納米粒的濃度為100 pM-l mM。
15. 權利要求9-12中任一項的用途，其中稀釋劑選自水、乙醇、 二曱基亞砜、乙腈、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸 檬酸緩沖液、血清或任何其它生理學相關的溶劑或溶液，和其混合物。
16. 權利要求9的用途，其中宿主為人。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含有效量銀納米粒的藥用組合物及其用途、一種局部給予宿主所述藥用組合物以增加毛發(fā)生長的方法。
文檔編號A61K33/38GK101287477SQ200580051729
公開日2008年10月15日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權日2005年8月4日
發(fā)明者林成龍 申請人:林成龍