專利名稱：過氧化物酶體增殖物激活受體(ppar)活化劑以及使用了該活化劑的藥品、補(bǔ)充劑、功能性 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)活化劑以及使用了該活化劑的藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑。
背景技術(shù)：
據(jù)說糖尿病的發(fā)病與胰島素分泌降低和胰島素抵抗性兩方面相關(guān)。最近，在日本人中，糖尿病患者有所增加，但由于胰島素分泌降低的遺傳因素很大，因此認(rèn)為其并非是糖尿病患者增加的主要原因，主要原因是胰島素抵抗性。據(jù)說，這是由于日本人的飲食生活歐美化、脂肪攝取量增加，以及運(yùn)動不足、肥胖、壓力所導(dǎo)致的。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗性的發(fā)生機(jī)理是由脂肪細(xì)胞的肥大化所引起的。即，如果脂肪細(xì)胞變得肥大，則分泌TNF-α和游離脂肪酸(FFA)，這些物質(zhì)阻礙了肌肉細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中糖的攝入，同時抑制了促進(jìn)胰島素作用的脂聯(lián)素(adiponectin)的分泌，結(jié)果產(chǎn)生胰島素抵抗性。
另外，胰島素抵抗性的研究表明，如果將作為核內(nèi)受體的PPAR活化，則對于胰島素抵抗性的改善具有效果。已知在PPAR中存在α、σ、γ三種類型的幾個亞型。PPARα主要在肝臟細(xì)胞中表達(dá)，另外在心肌細(xì)胞、消化管細(xì)胞中也有所表達(dá)，與脂肪酸氧化、酮體的生成、載脂蛋白的生成等有關(guān)。PPARσ沒有組織特異性，在整個身體內(nèi)均有表達(dá)，但在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)最為顯著。PPARγ可以分為γ1型和γ2型的2種亞型。γ1型在脂肪組織、免疫系統(tǒng)組織、腎上腺、小腸中表達(dá)，γ2型在脂肪細(xì)胞中特異性地表達(dá)，對于脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)和脂肪合成起到重要的作用。
這樣，PPAR與胰島素抵抗性的改善密切相關(guān)，而且還與高胰島素血癥、2型糖尿病、肥胖、高血壓、高血脂癥和動脈硬化的改善相關(guān)。從這種觀點(diǎn)出發(fā)，對于活化PPAR的物質(zhì)進(jìn)行了研究，例如已知有貝特(fibrate)類化合物、噻唑烷衍生物、脂肪酸、白三烯B4、消炎痛、布洛芬、非諾洛芬、15-去氧-Δ-1，2，14-PGJ2之類的合成物質(zhì)類PPAR活化劑。但是，合成物質(zhì)類的PPAR活化劑具有長期攝取產(chǎn)生副作用的問題，不適于在日常生活中攝取來預(yù)防或者改善胰島素抵抗性等疾病。另外，作為天然成分來源的PPAR活化劑，報(bào)告了姜黃中所含的姜黃素、作為油脂中一種的單酰基甘油、茶葉等中所含的兒茶酸類等天然物質(zhì)作為PPAR活化劑(例如參照專利文獻(xiàn)1)。但是，即便是天然成分來源的物質(zhì)，由于油脂等的卡路里高，因此連續(xù)攝取存在問題。另外，為了日常攝取，理想的是添加到食品等中進(jìn)行攝取，但天然成分來源的物質(zhì)多具有特殊的味道，這種物質(zhì)不適于添加到食品等中。
專利文獻(xiàn)1日本特開平2002-80362號公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明鑒于上述事實(shí)而完成，其目的在于提供沒有副作用的問題、能夠長期攝取、而且即便添加到食品等中也沒有問題的PPAR活化劑。
為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的PPAR活化劑的特征在于含有川皮苷。
本發(fā)明人為了解決上述課題，對于天然成分的PPAR活化劑進(jìn)行了一系列的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柑橘類果實(shí)、特別是沖繩地方特產(chǎn)的扁實(shí)檸檬(學(xué)名Citrus depressa HAYATA，臺灣檸檬)中所含的川皮苷具有PPAR的活化作用，進(jìn)而完成了本發(fā)明。即，大量含有川皮苷的扁實(shí)檸檬被長年地食用，其安全性得到了確認(rèn)。另外，川皮苷的卡路里低，就這點(diǎn)來說，即便糖尿病患者或肥胖患者等長期攝取也沒有問題。而且，川皮苷無味無嗅，因此即便添加到食品等中，也不會破壞該食品獨(dú)特的風(fēng)味，因此也可以添加到食品中長期地日常攝取。因而，通過本發(fā)明，川皮苷通過將PPAR活化，促進(jìn)脂肪的燃燒，抑制TNF-α和游離脂肪酸的分泌，且促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌，因此可以使脂肪細(xì)胞的狀態(tài)恢復(fù)到正常，可以改善胰島素抵抗性，還可以改善高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖等癥狀。另外，其不僅對人有效，對其它動物也有效。


圖1為表示本發(fā)明的一個實(shí)施例中川皮苷的PPARγ配位基活性的圖。
圖2為表示本發(fā)明的其他實(shí)施例中川皮苷所導(dǎo)致的脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量增加的圖。
圖3為表示本發(fā)明的其他實(shí)施例中川皮苷所產(chǎn)生的糖尿病改善效果的圖。
具體實(shí)施例方式
對于本發(fā)明的PPAR活化劑而言，被活化的PPAR可以是PPARα和PPARγ的任一種，優(yōu)選為兩者。另外，本發(fā)明的PPAR活化劑還可以含有川皮苷以外的其他成分。作為上述其他成分，例如有各種添加劑、川皮苷以外的其它PPAR活化劑等。
如上所述，由于川皮苷具有PPAR活化作用，因此本發(fā)明的PPAR活化劑具有例如脂肪細(xì)胞中的TNF-α和游離脂肪酸的分泌抑制作用、脂聯(lián)素的分泌促進(jìn)作用以及肝臟細(xì)胞中脂肪的β氧化促進(jìn)作用。另外，本發(fā)明的PPAR活化劑誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡、分化和小型化中的至少一種。
對于本發(fā)明的PPAR活化劑而言，所使用的川皮苷沒有特別限定，例如可以使用來自于柑橘類的川皮苷，優(yōu)選為來自于作為沖繩特產(chǎn)果實(shí)而被眾人所知的扁實(shí)檸檬的川皮苷。扁實(shí)檸檬的果汁中大量地含有川皮苷，因此可以直接使用，還可以使用從柑橘類中分離精制的川皮苷或市售品。
本發(fā)明的藥品為用于預(yù)防或治療選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的藥品，其含有上述本發(fā)明的PPAR活化劑。本發(fā)明的藥品除了含有本發(fā)明的PPAR活化劑之外，還可以含有例如其他的PPAR活化劑和各種添加劑等。對于本發(fā)明的藥品而言，作為具體的劑型，例如可以列舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠囊劑和液體制劑(包括糖漿劑)等。本發(fā)明的藥品可以適當(dāng)使用適于各劑型的添加劑或基材等，根據(jù)日本藥典等所記載的通常方法來制造。另外，作為給藥途徑，沒有特別限定，例如可以列舉出口服給藥和非口服給藥，作為上述非口服給藥，例如可以列舉出口腔內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉給藥和靜脈內(nèi)給藥等。對于本發(fā)明的藥品而言，可以按照川皮苷的每日給藥量例如達(dá)到10mg以上的方式含有川皮苷，優(yōu)選為20mg以上。
本發(fā)明的補(bǔ)充劑為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的補(bǔ)充劑，其含有上述本發(fā)明的PPAR活化劑。本發(fā)明的補(bǔ)充劑除了含有本發(fā)明的PPAR活化劑之外，還可以含有例如其他的PPAR活化劑、各種添加劑和其他補(bǔ)充劑等，作為上述其他補(bǔ)充劑，例如可以列舉出維生素C等各種維生素類、氨基酸和寡糖等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出片劑、顆粒劑(包括散劑)、膠囊劑和液體制劑(包括糖漿劑)等。本發(fā)明的補(bǔ)充劑中，川皮苷的含量與上述藥品相同。
本發(fā)明的功能性食品為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的功能性食品，其含有上述本發(fā)明的PPAR活化劑。本發(fā)明的功能性食品除了含有本發(fā)明的PPAR活化劑之外，還可以含有例如其他的PPAR活化劑和各種添加劑等。另外，本發(fā)明的功能性食品的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出面類、點(diǎn)心類和功能性飲料等。
本發(fā)明的食品添加劑為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的食品添加劑，其含有上述本發(fā)明的PPAR活化劑。本發(fā)明的食品添加劑除了含有本發(fā)明的PPAR活化劑之外，還可以含有例如其他的PPAR活化劑和各種添加劑等。本發(fā)明的食品添加劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以列舉出液體狀、糊狀、粉末狀、薄片狀和顆粒狀等。本發(fā)明的食品添加劑包括飲料用食品添加劑。
本發(fā)明的PPAR活化方法是通過川皮苷活化PPAR的方法。更優(yōu)選使上述川皮苷與例如脂肪細(xì)胞等接觸，從而活化PPAR。
本發(fā)明的PPAR活化方法中所使用的川皮苷與在上述本發(fā)明的PPAR活化劑中使用的川皮苷相同，例如可以使用來自于柑橘類的川皮苷，優(yōu)選為來自于作為沖繩特產(chǎn)果實(shí)而被眾人所知的扁實(shí)檸檬的川皮苷。如上所述，扁實(shí)檸檬的果汁中大量地含有川皮苷，因此可以直接使用，還可以使用從柑橘類中分離精制的川皮苷或市售品。
本發(fā)明的疾病的預(yù)防、治療或改善方法為選自哺乳動物的胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的預(yù)防、治療或改善方法，其包括將川皮苷給藥。川皮苷的每日給藥量例如為10mg/天以上、優(yōu)選為20mg/天以上。作為上述哺乳動物，例如可以列舉出人、小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、牛、馬、豬和猴子等。
本發(fā)明的試劑盒為用于預(yù)防或治療選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病的試劑盒，其中包括a)川皮苷、b)含有對于預(yù)防或治療選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病有用的第二化合物的第二藥品組合物、以及c)用于放入上述川皮苷和上述第二藥品組合物的容器。
本發(fā)明的用途為川皮苷用于制造PPAR活化劑的用途。
另外，本發(fā)明的用途包括為了預(yù)防、治療或改善選自哺乳動物的本發(fā)明的胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中至少一種疾病而將川皮苷給藥。川皮苷的每日給藥量以及所述哺乳動物如上所述。
在本發(fā)明的用途中所使用的川皮苷與在上述本發(fā)明的PPAR活化劑中使用的川皮苷相同，例如可以使用來自于柑橘類的川皮苷，優(yōu)選為來自于作為沖繩特產(chǎn)果實(shí)而被眾人所知的扁實(shí)檸檬的川皮苷。如上所述，扁實(shí)檸檬的果汁中大量地含有川皮苷，因此可以直接使用，還可以使用從柑橘類中分離精制的川皮苷或市售品。
本發(fā)明的用途中，川皮苷誘導(dǎo)例如脂肪細(xì)胞中TNF-α和游離脂肪酸的分泌抑制、脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素的分泌促進(jìn)、肝臟細(xì)胞中脂肪的β氧化促進(jìn)等作用中的至少一種。本發(fā)明的用途中，川皮苷誘導(dǎo)例如脂肪細(xì)胞的凋亡、分化和小型化等中的至少一種。
本發(fā)明的川皮苷例如從扁實(shí)檸檬等柑橘類果實(shí)中如下制造。
首先，將果實(shí)截?cái)嗷蚍鬯闉樗璐笮?。使用的果?shí)可以是剛采摘后的新鮮果實(shí)，也可以是干燥的果實(shí)。將進(jìn)行了截?cái)嗟鹊墓麑?shí)浸漬在溶劑中得到提取物。作為浸漬所使用的溶劑，例如可以列舉出水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、叔丁醇等低級醇類，丙酮等酮類，二乙醚、石油醚等醚類，氯仿、二氯甲烷等氯系有機(jī)溶劑等，這些溶劑可以單獨(dú)使用，還可以并用2種以上。其中，從毒性等的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用水和乙醇的混合物或乙醇。溶劑的用量沒有特別限定，例如相對于100重量份果實(shí)量為200重量份～10000重量份的范圍。提取處理例如可以在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在4～120℃范圍、更優(yōu)選在40～100℃范圍的溫度條件下進(jìn)行。提取時間由提取溫度等適當(dāng)決定，例如在室溫下的提取時間為1～10天，在50℃以上的條件下為1～96小時。
然后，通過利用過濾器的過濾等，從殘?jiān)蟹蛛x得到提取液。由于該提取液或其干燥物含有川皮苷，因此可以直接使用。另外，還可以如后所述那樣進(jìn)一步精制以提高川皮苷的純度后使用。
上述提取物的精制例如可以通過使用了適當(dāng)洗脫液的硅膠色譜法來進(jìn)行。作為上述洗脫液，例如優(yōu)選使用乙酸乙酯、甲醇、異丙醚、四氫呋喃、苯或二甲苯等溶劑與己烷、庚烷、氯仿或二氯乙烷等溶劑的混合溶劑。
實(shí)施例1如下所示，本實(shí)施例為確認(rèn)由川皮苷導(dǎo)致PPARγ的活化的例子。
首先，在24孔培養(yǎng)板中接種CV-1細(xì)胞(來自于雄性非洲綠猴腎臟的培養(yǎng)細(xì)胞)達(dá)到0.2μg/孔，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)基使用含有10％FBS(胎牛血清)、10mg/mL青霉素鏈霉素溶液的DMEM(杜氏改良細(xì)胞培養(yǎng)基，Dulbecco’s Modified Eagle MediumGIBCO公司)。接著，使用Lipofectamine系統(tǒng)(Invitrogen公司)，將pM-hPPARγ和p4×UASg-tk-luc轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的CV-1細(xì)胞中。另外，上述pM-hPPARγ是用于表達(dá)含有作為GAL4結(jié)合域的1～147殘基和作為人PPARγ配位基結(jié)合域的204～505殘基的融合蛋白質(zhì)的載體，上述p4×UASg-tk-luc是在熒光素酶基因上游含有4個拷貝的用于GAL4結(jié)合域的上游活化序列(UAS)和胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因啟動子的報(bào)告質(zhì)粒。將進(jìn)行了上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)約24小時，接著將上述細(xì)胞的培養(yǎng)基改換為各種濃度(0.1、1.0、10和50μM)的川皮苷或無處理對照用的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時。含有上述川皮苷的培養(yǎng)基通過在培養(yǎng)基中加入溶解在二甲基亞砜(DMSO)中的川皮苷而制備，無處理對照用的培養(yǎng)基通過在培養(yǎng)基中僅添加DMSO來制備。培養(yǎng)后，溶解上述細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司)測定熒光素酶活性(測定組)。
與上述測定組同樣地，作為對照組，使用pM(在pM-hPPARγ中含有作為GAL4結(jié)合域的1～147殘基，但不含作為PPARγ配位基結(jié)合域的204～505殘基的載體)來代替pM-hPPARγ，進(jìn)行測定。對于各樣品，求出測定組和對照組的發(fā)光強(qiáng)度的平均值(n＝4)之比(測定組/對照組)，將相對于無處理對照組的相對熒光素酶活性作為樣品的PPARγ配位基結(jié)合活性。結(jié)果示于下述表1和圖1中。
表1

(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)如上述表1和圖1可知，通過川皮苷，PPARγ的活性提高，其活性隨著川皮苷濃度的提高而顯著地提高。
實(shí)施例2如下所述，本實(shí)施例為確認(rèn)由川皮苷產(chǎn)生的脂聯(lián)素的分泌促進(jìn)效果的例子。
(前脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo))首先，準(zhǔn)備以下2種培養(yǎng)基。
1.分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.25μMDEX、0.5mMMIX、10μg/mL胰島素/10％FBS/DMEM)在500mL的DMEM(SIGMA生產(chǎn))中加入55mL的FBS(胎牛血清(GIBCO生產(chǎn)))，制備10％FBS/DMEM。在其中加入138.75μL的1mM DEX(地塞米松)/DMSO(ナカライ生產(chǎn))、555μL的10mg/mL胰島素/PBS(SIGMA生產(chǎn))。另外，胰島素/PBS是在PBS中預(yù)先加入1N HCl，使其達(dá)到胰島素可溶程度的酸性后，使胰島素溶解。在要使用前將必需量的MIX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)(ナカライ生產(chǎn))加入到培養(yǎng)基中，使其達(dá)到0.5mM，從而制備分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。由于MIX非常難溶，因此首先溶解在少量的99.5％乙醇中后，再加入到10％FBS/DMEM中。此時，要使得99.5％乙醇的最終濃度不超過1％。
2.分化促進(jìn)培養(yǎng)基(5μg/mL胰島素/10％FBS/DMEM)在555mL的10％FBS/DMEM中加入277.5μL的10mg/mL胰島素/PBS，制備分化促進(jìn)培養(yǎng)基。
接著，解凍培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞3T3-L1，接種在100mm的培養(yǎng)皿中，將3T3-L1培養(yǎng)至達(dá)到約80％融合。將達(dá)到約80％融合的1個培養(yǎng)皿的10T1/2傳代至1個六孔板中，在6孔板中將3T3-L1進(jìn)一步培養(yǎng)至達(dá)到融合后，更換為分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使其分化誘導(dǎo)。48小時后，更換為分化促進(jìn)培養(yǎng)基，之后每2天更換一次分化促進(jìn)培養(yǎng)基。開始分化誘導(dǎo)7天后，使用Sepasol RNA I super(ナカライ生產(chǎn))提取mRNA，使用Light Cycler(TM)測定作為脂肪細(xì)胞分化初期指標(biāo)的36B4、aP2和脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)量。
(利用Light Cycler(TM)定量mRNA)總RNA的提取和定量從上述6孔板中除去培養(yǎng)基，在各孔中各加入1mL Sepasol RNA Isuper(ナカライ生產(chǎn))，通過反復(fù)吹吸(Pipetting)使細(xì)胞分散。將該液體移至1.5mL的管中，在室溫下放置5分鐘后，加入200μL氯仿，利用漩渦充分地?cái)嚢?，在室溫下放?分鐘。冷卻至4℃，在12000×g下離心15分鐘。注意不要打亂苯酚層(下層黃色)和水層(上層無色)的界面，同時僅將水層移至另外的管(容量為1.5mL)中。此時，注意不要取出浮在中間的蛋白質(zhì)。在上述管中加入500μL異丙醇并混合，在室溫下放置10分鐘。冷卻至4℃，在12000×g下離心10分鐘，除去約1mL的上清。在該沉淀中加入1mL的75％乙醇并進(jìn)行攪拌，將沉淀充分地混懸后，冷卻至4℃，在12000×g下離心10分鐘，除去上清。將所得沉淀(總RNA)干燥后，溶解在20μL的無核酸酶水中，通過NanoDrop(スクラム生產(chǎn))測定mRNA的濃度。
逆轉(zhuǎn)錄將提取后測定過的mRNA溶液調(diào)制成mRNA濃度達(dá)到1μg/μL。在8聯(lián)管(容量為0.2mL)中加入1μL Oligo dT引物和10μL上述RNA溶液。在熱循環(huán)儀中，在70℃下培養(yǎng)上述混合液10分鐘，破壞RNA的高級結(jié)構(gòu)，移到冰上，放置1分鐘以上后，依次加入下述試劑。
表2

在熱循環(huán)儀中，在42℃下培養(yǎng)5分鐘后，加入1μL逆轉(zhuǎn)錄酶，吹吸管中的內(nèi)容物，從而充分地混合。在熱循環(huán)儀中，在42℃下培養(yǎng)50分鐘，再在70℃下培養(yǎng)15分鐘，之后放在冰上進(jìn)行冷卻，輕輕離心使反應(yīng)液集中在管的底部，在-20℃下冷凍保存。另外，在用于Light Cycler(TM)測定時，每次稀釋10倍使用。
Light Cycler(TM)測定以下的操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。將5mL加入有用于測定表達(dá)量的基因的片斷的質(zhì)粒溶液添加到0.65mL的管中，用45mL在LightCycler(TM)DNAMaster SYBR Green中所附帶的水稀釋至10倍。反復(fù)該操作，制作102、103、104、105、106、107和108倍的稀釋溶液。使用小鑷子在Light Cycler(TM)Centrifuge Adapter上安裝專用毛細(xì)管，分別注入各18μL上述試劑。然后，分別添加各2μL的作為陰性對照的水、作為參照物的7級稀釋溶液以及測定用樣品的cDNA的10倍稀釋液后，使用小鑷子蓋上蓋子。在5000rpm、4℃下離心10秒鐘后，將毛細(xì)管裝填到轉(zhuǎn)盤(Carrousel)中后放置到容器中，進(jìn)行測定。
使用Light Cycler(TM)的定量結(jié)果，對各個樣品計(jì)算36B4的mRNA與aP2和脂聯(lián)素的各自的mRNA的表達(dá)量之比。結(jié)果示于下述表3和圖2的圖中。
表3

(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)對在添加有川皮苷的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞和在無處理對照的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果為，通過添加川皮苷，脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素的分泌顯著增加。因此認(rèn)為川皮苷具有脂聯(lián)素分泌促進(jìn)效果。
實(shí)施例3本實(shí)施例為使用自然發(fā)病糖尿病小鼠(KKAy)確認(rèn)川皮苷的糖尿病改善效果的例子。
首先，用普通食物對12只自然發(fā)病糖尿病小鼠(6周齡、雌性)進(jìn)行一周預(yù)備飼養(yǎng)。接著，按照平均體重相等的方式，將上述小鼠分為對照組和NOB組2組(n＝6)。然后，使對照組的小鼠僅攝取高脂肪食物，使NOB組的小鼠攝取含有0.02％川皮苷的高脂肪食物。在攝取開始的27或28天后從這些小鼠中采集血清。另外，川皮苷使用來自于扁實(shí)檸檬提取物的川皮苷。
(利用ELISA測定脂聯(lián)素的分泌量)利用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)進(jìn)行的脂聯(lián)素分泌量的測定是使用小鼠/大鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒(商品名)(大塚制藥株式會社生產(chǎn))進(jìn)行的。另外，上述試劑盒的構(gòu)成如下所述。
洗滌用原液檢體稀釋用原液抗體板(抗小鼠脂聯(lián)素多克隆抗體(兔)固相板)標(biāo)準(zhǔn)品8.0ng/mL(重組小鼠脂聯(lián)素)生物素標(biāo)記抗體液(生物素標(biāo)記抗小鼠脂聯(lián)素多克隆抗體(兔))酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液(HRP標(biāo)記鏈霉卵白素)酶標(biāo)記鏈霉卵白素稀釋液基質(zhì)液A(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)基質(zhì)液B(過氧化氫)反應(yīng)停止液首先，調(diào)制以下試劑和檢體液。
洗滌液相對于40mL上述洗滌用原液，以960mL的比例混合精制水，在2.8℃下保存。
檢體稀釋液相對于50mL上述檢體稀釋用原液，以200mL的比例混合精制水，在2.8℃下保存。
標(biāo)準(zhǔn)液用上述檢體稀釋液將8.0ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品倍半稀釋，調(diào)制4.0ng/mL、2.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5ng/mL和0.25ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。
酶標(biāo)記鏈霉卵白素液相對于12mL上述酶標(biāo)記鏈霉卵白素稀釋液，以60μL的比例混合上述酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液。
基質(zhì)液相對于6mL上述基質(zhì)液B，以6mL的比例混合上述基質(zhì)液A。
檢體液將上述對照組和上述NOB組的血清稀釋至4萬倍。
僅取出檢查所需的上述抗體板的條帶。在上述抗體板的各孔中各加入約200μL的上述洗滌液后，利用洗板機(jī)將各孔中的液體完全地吸引除去。再次重復(fù)該洗滌和吸引后，在各孔中分別添加各100μL的各濃度標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋過的各檢體液，連續(xù)測定2次。另外，標(biāo)準(zhǔn)液在每次測定和每板中都必須測定。通過封板條覆蓋抗體，在室溫下靜置60分鐘以使其反應(yīng)后，從抗體板上取下封板條，利用洗板機(jī)將孔中的液體完全地吸引除去。接著，在各孔中分別各加入約200μL的洗滌液，并迅速地吸引除去。再次反復(fù)該洗滌和吸引4次。在上述抗體板的各孔中分別加入各100μL的上述生物素標(biāo)記抗體液后，利用封板條覆蓋抗體，在室溫下靜置60分鐘以使其反應(yīng)。與上述同樣地反復(fù)孔的洗滌和吸引5次。在抗體板的各孔中分別各加入100μL的上述酶標(biāo)記鏈霉卵白素液后，利用封板條覆蓋抗體，在室溫下靜置60分鐘以使其反應(yīng)。與上述同樣地反復(fù)孔的洗滌和吸引5次。在抗體板的各孔中分別各加入100μL的基質(zhì)液，在室溫下靜置15分鐘以使其反應(yīng)，在抗體板的各孔中分別各加入100μL反應(yīng)停止液，利用板讀取器測定各孔在450nm下的吸光度。將通過上述吸光度的測定獲得的脂聯(lián)素分泌量的測定結(jié)果(平均值)示于下述表4和圖3的圖中。
表4

(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)對攝取了川皮苷的NOB組的糖尿病小鼠和未攝取川皮苷的對照組的糖尿病小鼠的脂聯(lián)素分泌量進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過攝取川皮苷，脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素的分泌量顯著增加。也就是說，糖尿病患者通過攝取川皮苷，促進(jìn)了脂聯(lián)素的分泌，脂肪細(xì)胞的狀態(tài)恢復(fù)正常，糖尿病得以改善，因此可以說川皮苷具有糖尿病改善效果。
如上所述，本發(fā)明的PPAR活化劑具有優(yōu)異的PPAR活性，沒有副作用的問題，可以長期攝取，可以優(yōu)選用在食品等中。另外，川皮苷具有優(yōu)異的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)效果等。因此，本發(fā)明的PPAR活化劑可以用作例如用于預(yù)防或改善胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖等疾病的藥品、補(bǔ)充劑、功能性食品和食品添加劑。另外，其不僅對人有效，對其他動物也有效。
權(quán)利要求
1.一種過氧化物酶體增殖物激活受體的活化劑，其中，其含有川皮苷。
2.權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑，其中，對于脂肪細(xì)胞，其具有抑制TNF-α和游離脂肪酸的分泌以及促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌之中的至少一種的作用；對于肝臟細(xì)胞，其具有促進(jìn)脂肪的β氧化的作用。
3.權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑，其誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡、分化和小型化中的至少一種。
4.權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑，其中，所述川皮苷來自于柑橘類果實(shí)。
5.權(quán)利要求4所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑，其中，所述柑橘類為扁實(shí)檸檬(臺灣香檬)。
6.含有權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的藥品，其為用于預(yù)防或治療選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病的藥品。
7.含有權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的補(bǔ)充劑，其為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病的補(bǔ)充劑。
8.含有權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的功能性食品，其為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病的功能性食品。
9.含有權(quán)利要求1所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的食品添加劑，其為用于預(yù)防或改善選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病的食品添加劑。
10.一種過氧化物酶體增殖物激活受體活化方法，其通過川皮苷將過氧化物酶體增殖物激活受體活化。
11.權(quán)利要求10所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化方法，其中，所述川皮苷來自于柑橘類果實(shí)。
12.權(quán)利要求11所述的過氧化物酶體增殖物激活受體活化方法，其中，所述柑橘類為扁實(shí)檸檬(臺灣香檬)。
13.一種預(yù)防、治療或改善哺乳動物的胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病的方法，其中，該方法包括將川皮苷給藥。
14.川皮苷用于制造過氧化物酶體增殖物激活受體活化劑的用途。
15.權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述川皮苷來自于柑橘類果實(shí)。
16.權(quán)利要求15所述的用途，其中，所述柑橘類為扁實(shí)檸檬(臺灣香檬)。
17.一種用途，該用途包括為了預(yù)防、治療或改善哺乳動物的選自胰島素抵抗性、高胰島素血癥、2型糖尿病、高血壓、高血脂癥、動脈硬化和肥胖中的至少一種疾病而將川皮苷給藥。
18.權(quán)利要求17所述的用途，其中，對于脂肪細(xì)胞，其具有抑制TNF-α和游離脂肪酸的分泌以及促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌之中的至少一種的作用；對于肝臟細(xì)胞，其具有促進(jìn)脂肪的β氧化的作用。
19.權(quán)利要求17所述的用途，其誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡、分化和小型化中的至少一種。
20.權(quán)利要求17所述的用途，其中，所述川皮苷來自于柑橘類果實(shí)。
21.權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述柑橘類為扁實(shí)檸檬(臺灣香檬)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種沒有副作用問題、能夠長期攝取、沒有特殊味道的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)活化劑。其中將川皮苷用作PPAR活化劑。川皮苷具有優(yōu)異的PPAR活性和優(yōu)異的脂聯(lián)素分泌促進(jìn)效果，其大量地含有在柑橘類果實(shí)、特別是沖繩特產(chǎn)的扁實(shí)檸檬(臺灣香檬)中，由于柑橘類果實(shí)被長年地食用，因此在安全性上沒有問題，而且卡路里低，因而可以長期攝取。另外，由于川皮苷無味無嗅，因此即便添加在食品中，也不會損害該食品特有的風(fēng)味，因而可以添加在食品中進(jìn)行攝取。
文檔編號A61P9/12GK101052391SQ200580036729
公開日2007年10月10日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者佐佐木貴生 申請人:愛科來株式會社