專利名稱：抑制hsp90與iap蛋白的蛋白－蛋白相互作用的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制熱休克蛋白Hsp90與凋亡抑制物(IAP)蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用的化合物，以及鑒定和利用這樣的化合物的方法，所述化合物例如肽和肽衍生物，所述IAP蛋白例如存活蛋白(Survivin)，XIAP，cIAP1或cIAP2。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞在高度不利環(huán)境中存活并增殖的能力增強(qiáng)。例如，腫瘤細(xì)胞下調(diào)了多個(gè)阻止正常(即非-癌)細(xì)胞在有利環(huán)境中分裂的細(xì)胞途徑。腫瘤細(xì)胞還滅活了使多種正常組織在有害條件下死亡的凋亡途徑。腫瘤細(xì)胞上調(diào)了維持活性增殖所必需的途徑。例如，很多腫瘤細(xì)胞活化了細(xì)胞中使它們能合成并維持持續(xù)增殖所需的蛋白機(jī)制的應(yīng)激-反應(yīng)途徑(stress-responsepathway)。腫瘤中活化的應(yīng)激反應(yīng)包括上調(diào)熱休克蛋白(Hsp)，這些蛋白是ATPase-指導(dǎo)的陪伴分子(chaperones)。尤其是，Hsp90在多種癌組織中上調(diào)。Hsp90控制著有限量客戶蛋白(client protein)的折疊/成熟與蛋白酶體破壞之間的平衡，而這些蛋白中有一些參與了信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖。
凋亡抑制物(IAP)蛋白家族的成員的特征包括一或多個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)。這些蛋白最初是因它們通過阻止昆蟲宿主細(xì)胞防御性凋亡來促進(jìn)桿狀病毒繁殖的能力而被鑒定出來的。存活蛋白是IAP家族的小分子16.5kDa哺乳動(dòng)物成員，它在胚和胎的器官中廣泛表達(dá)，但在大多數(shù)終末分化的正常組織中幾乎無法檢測到。但存活蛋白在多種腫瘤組織中高水平表達(dá)，而且被認(rèn)為參與很多腫瘤細(xì)胞避免細(xì)胞死亡并持續(xù)增殖的機(jī)制中。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于，至少是部分基于，在存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等凋亡抑制物(IAP)蛋白中發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)與熱休克蛋白Hsp90之間蛋白-蛋白相互作用的特定區(qū)域，例如結(jié)合域或基序。這些區(qū)域被鑒定為具有介導(dǎo)這些IAP蛋白(例如存活蛋白)的抗-凋亡活性的特征。本發(fā)明提供了鑒定能破壞Hsp90與IAP蛋白相互作用的化合物的方法。能抑制Hsp90與存活蛋白等IAP蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用的化合物，例如肽、肽衍生物、肽模擬物以及小分子，都可以用于治療與不需要的(unwanted)細(xì)胞增殖相關(guān)的情況(condition)，例如癌癥一方面，本發(fā)明包括分離的化合物，其抑制Hsp90和存活蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物是分離的存活蛋白肽，其包含His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)或Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ IDNO26)，并且長度為50或更少，45或更少，40或更少，35或更少，30或更少，25或更少，20或更少，15或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5個(gè)氨基酸。存活蛋白肽的例子包括His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)，Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu-Ser-Val-Lys(SEQ ID NO3)，Ile-Asp-Asp-His-Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO4)，以及Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO5)。
在一些實(shí)施方案中，分離的存活蛋白肽與增強(qiáng)所述化合物的細(xì)胞通透性的異源序列相連，所述異源序列例如肽內(nèi)化序列(如，Tat，觸角足(antennapedia)，vβRR，transportin，或transportan序列)。觸角足肽內(nèi)化序列例如是RQKIWFQNRRMKWKK；(SEQ ID NO29)。在一些實(shí)施方案中，所述化合物是本文所述存活蛋白肽的肽模擬物，例如，所述化合物可以是反構(gòu)型-肽(retro-peptide)、反排列肽(inverso-peptide)，和/或所述化合物可以包括一或多種人工氨基酸類似物。肽模擬物也可以與肽內(nèi)化序列等異源序列相連。肽衍生物包括，例如與肽內(nèi)化序列相連的肽和肽模擬物。
本發(fā)明還提供了編碼本文所述存活蛋白肽和肽衍生物的核酸，以及含有這些核酸的重組細(xì)胞。另一方面，本文公開了與本文所述肽或肽衍生物結(jié)合的抗-存活蛋白抗體，例如細(xì)胞內(nèi)抗體(intrabodies)。這樣的抗體的實(shí)例包括對能產(chǎn)生抗體的動(dòng)物施用本文所述肽或肽衍生物所產(chǎn)生的抗體。
另一方面，本發(fā)明還提供了制備腫瘤生長的小分子抑制物的方法。通常，這些方法包括提供一種先導(dǎo)化合物(lead compound)，例如本文所述存活蛋白肽或肽衍生物，運(yùn)用醫(yī)學(xué)化學(xué)方法研發(fā)與該先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)類似的化合物，可選地(optionally)，測定該候選化合物是否抑制腫瘤細(xì)胞生長?？梢詫⒃摵蜻x化合物配制在藥用載體中，從而制備腫瘤生長的小分子抑制物。
另一方面，本發(fā)明包括鑒定候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物的篩選方法。這些方法一般包括(i)將受試化合物、Hsp90肽以及IAP肽(例如存活蛋白)在足以確保相互作用(例如結(jié)合)的條件下混合足夠的時(shí)間；和(ii)檢測受試化合物是否抑制Hsp90肽與IAP肽之間的蛋白-蛋白相互作用。抑制Hsp90肽與IAP肽(例如存活蛋白肽)之間蛋白-蛋白相互作用的受試化合物是候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物的篩選方法。這些方法一般包括(i)對表達(dá)Hsp90和IAP肽(例如存活蛋白肽)的細(xì)胞(例如，在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞或在培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞)施用所述化合物，和(ii)測量Hsp90肽和IAP肽(例如存活蛋白)之間的相互作用，例如結(jié)合?？蓽p少Hsp90肽和IAP肽(例如存活蛋白)之間相互作用的化合物是候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定凋亡誘導(dǎo)物的篩選方法，這些方法一般包括將腫瘤細(xì)胞與本文所述方法鑒定出的候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物接觸；和檢測一或多種凋亡標(biāo)記物的有無。使細(xì)胞表現(xiàn)出一或多種凋亡標(biāo)記物的候選誘導(dǎo)凋亡的化合物是凋亡誘導(dǎo)物。
本文還描述了鑒定腫瘤生長抑制物的篩選方法，這些方法一般包括將一或多種腫瘤細(xì)胞與本文所述方法鑒定出的候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物接觸；和測量所述腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)一種候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物使所述腫瘤細(xì)胞的增殖相對于未接觸所述化合物的一或多種腫瘤細(xì)胞的增殖而言受到抑制，則該化合物是腫瘤生長抑制物。
另一方面，本發(fā)明還涉及治療受試者的腫瘤的方法，包括(i)鑒別需要治療腫瘤的受試者；和(ii)對該受試者施用本文所述任一種抑制Hsp90和存活蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的化合物的藥物組合物。在治療受試者腫瘤的方法中使用的藥物組合物包括抑制Hsp90和存活蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的存活蛋白肽(或肽衍生物)和/或抗存活蛋白抗體。另一方面，治療受試者腫瘤的方法包括(i)鑒別需要治療腫瘤的受試者；和(ii)對該受試者施用含有本文所述方法鑒定出的化合物或受試物的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及抑制細(xì)胞中Hsp90與IAP多肽之間相互作用的方法，該方法包括將有效量的本文所述化合物或藥物組合物導(dǎo)入所述細(xì)胞中。
術(shù)語“蛋白”，“多肽”以及“肽”表示任意氨基酸鏈，不管它們有多長或者經(jīng)過了什么樣的翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)，除非特別指明，這些術(shù)語在本文中可互換使用。
術(shù)語“分離的肽”和“分離的核酸”分別包括肽分子和核酸分子，它們基本上不含有在其天然來源(如果有這種來源的話)中存在的其它肽和核酸。分離的肽例如是基本上不含有出現(xiàn)在細(xì)胞中的顯著量其它肽和物質(zhì)的肽。另一例中，分離的核酸可以不含有獲得或衍生(例如合成)該核酸的生物的基因組DNA中內(nèi)源核酸側(cè)翼的序列(即位于該核酸的5′和/或3′末端的序列)。分離的肽和核酸可以體外合成和/或從天然來源分離。
“保守氨基酸取代”是指一種氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基分組在本領(lǐng)域是已知的。這些組包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，lys，arg，his)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，asp，glu)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，gly，asn，gln，ser，thr，tyr，cys)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，ala，val，leu，ile，pro，phe，met，try)，具有beta-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，thr，val，ile)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，tyr，phe，try，his)。
“Hsp90肽”在本文中是指全長Hsp90或其與存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等IAP蛋白結(jié)合的肽。
“IAP肽”在本文中是指全長IAP蛋白或其與Hsp90結(jié)合的肽。
“存活蛋白肽”在本文中是指全長存活蛋白或其與Hsp90結(jié)合的肽。
除非另外說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常理解的含義。與本文所述方法和物質(zhì)類似或等效的方法和物質(zhì)也可以用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，但合適的方法和物質(zhì)在下文中描述。本文提到的所有出版物，專利申請，專利，及其它參考文獻(xiàn)都全文引入作為參考。在有沖突的情況下，參看本說明書，包括定義。此外，所述的物質(zhì)、方法和實(shí)施例都僅僅是舉例說明，并不作任何限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)可以從以下詳細(xì)描述及從權(quán)利要求中顯而易見。


圖1A的免疫印跡照片顯示與結(jié)合抗-存活蛋白抗體的Sepharose柱結(jié)合的細(xì)胞裂解蛋白。將柱結(jié)合蛋白充分洗滌后進(jìn)行洗脫，用圖中標(biāo)示的抗體鑒定洗脫級(jí)分中的蛋白。
圖1B的免疫印跡照片顯示與存活蛋白或作為對照的非結(jié)合IgG抗體發(fā)生免疫共沉淀的蛋白。S和P分別表示上清和免疫沉淀物。
圖1C的免疫印跡照片顯示體內(nèi)pull-down試驗(yàn)的結(jié)果，表明從細(xì)胞提取物中沉淀出Hsp90可用偶聯(lián)存活蛋白的SepharoseTM(“存活蛋白”)實(shí)現(xiàn)，但不能用單獨(dú)的SepharoseTM(“Sepharose”)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞用標(biāo)示的沉淀或上清處理(25％反應(yīng))，用抗-Hsp90進(jìn)行分析。
圖2A和圖2B的ELISA定量結(jié)果顯示與固相存活蛋白底物結(jié)合的Hsp90(圖2A)以及與固相Hsp90底物結(jié)合的野生型存活蛋白(圖2B)。而存活蛋白點(diǎn)突變C84A不結(jié)合Hsp90(圖2B)。
圖3A的免疫印跡照片顯示體外pull-down試驗(yàn)的結(jié)果，表明Hsp90 N-末端含有ATP酶的區(qū)域與偶聯(lián)SepharoseTM的存活蛋白結(jié)合，但Hsp90的該N-末端區(qū)下游的序列不與偶聯(lián)SepharoseTM的存活蛋白結(jié)合。
圖3B的免疫印跡照片顯示與Hsp90的FLAG偶聯(lián)區(qū)發(fā)生體內(nèi)免疫共沉淀的蛋白，表明存活蛋白僅與Hsp90的N-末端區(qū)沉淀，不與Hsp90該N-末端區(qū)的下游部分共沉淀。
圖4A的免疫印跡照片顯示cIAP1，cIAP2以及XIAP與Hsp90發(fā)生免疫沉淀。
圖4B的免疫印跡照片顯示體外pull-down試驗(yàn)的結(jié)果，表明cIAP1，cIAP2，XIAP，以及僅含有三個(gè)桿狀病毒重復(fù)序列(BIR)區(qū)的截短型XIAP(t-XIAP)與GST-Hsp90融合蛋白結(jié)合。
圖5A的免疫印跡照片顯示，HeLa細(xì)胞提取物經(jīng)指定濃度的格爾德霉素(geldanamycin，GA)處理24小時(shí)后，細(xì)胞中的IAP蛋白被降解。
圖5B的免疫印跡照片顯示，因存在蛋白酶體抑制物乳胱素(lactacystin)，存活蛋白受到保護(hù)而避免了GA-介導(dǎo)的降解。
圖5C的免疫印跡照片顯示，因存在蛋白酶體抑制物乳胱素，XIAP受到保護(hù)而避免了GA-介導(dǎo)的降解，但caspase抑制物Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F(ZVAD-fmk)不能保護(hù)XIAP免受GA-介導(dǎo)的降解。
圖6的免疫印跡照片顯示XIAP的第一個(gè)BIR區(qū)與GST-Hsp90結(jié)合。
圖7的柱狀圖是ELISA試驗(yàn)測量結(jié)果，顯示所示存活蛋白片段肽對Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用的抑制效應(yīng)。
圖8A的免疫印跡照片顯示，mAb 8E2抑制存活蛋白與GST-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，但mAb 58不具有這種抑制效應(yīng)。
圖8B的免疫印跡照片顯示，細(xì)胞內(nèi)加入mAb 8E2可誘導(dǎo)存活蛋白表達(dá)的下調(diào)。該免疫印跡的定量見其下圖。
圖9A是帶有免疫印跡照片的圖。該圖用caspase底物的積累量化caspase活性，是通過用流式細(xì)胞術(shù)測量加載了mAb 8E2或?qū)φ誌gG的細(xì)胞而測出的。這些細(xì)胞在無四環(huán)素(Tet-)時(shí)表達(dá)存活蛋白，在有四環(huán)素(Tet+)時(shí)不表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，利用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Tet-Off系統(tǒng))過表達(dá)存活蛋白可以克服細(xì)胞內(nèi)加載抗體8E2對凋亡的誘導(dǎo)作用。圖中的免疫印跡照片顯示，mAb8E2誘導(dǎo)aspase 9裂解，它指示誘導(dǎo)凋亡。
圖9B，圖9C和圖9D是一組400x放大的顯微照片，分別顯示加載了指定抗體的細(xì)胞。圖9B顯示加載了對照IgG的細(xì)胞。圖9C顯示加載了mAb8E2的細(xì)胞。圖9D顯示加載了mAb 58的細(xì)胞。加載了mAb 8E2的細(xì)胞在箭頭所示細(xì)胞中誘導(dǎo)多核化(multinucleation)(圖9C)，這是與存活蛋白功能喪失或下調(diào)有關(guān)的有絲分裂缺陷的特征。
圖9E對胞內(nèi)加載了mAbs 8E2，mAb 58或IgG的細(xì)胞中的有絲分裂缺陷進(jìn)行量化。
圖10A的免疫印跡照片顯示親和層析結(jié)果。免疫印跡表明，Hsp90和Hsp70以及相關(guān)蛋白Akt與指定的存活蛋白肽(Ile74-Leu87)親和柱結(jié)合，Hsp27不與該存活蛋白肽柱結(jié)合。
圖10B顯示含有Hsp90結(jié)合位點(diǎn)的存活蛋白肽(Ile74-Leu87)與Hsp90結(jié)合，是通過質(zhì)子共振(plasmon resonance)測出的。
圖10C丙氨酸掃描誘變對存活蛋白肽(K79-L87)與Hsp90結(jié)合的能力的影響，是通過ELISA定量測定的。每一種指定的存活蛋白肽突變體被固定在微滴板上，用來測試與Hsp90結(jié)合的能力。
圖11A的顯微照片顯示，與可通透細(xì)胞的存活蛋白肽(存活蛋白)、以及與對照倒序(scrambled)肽(對照)一起保溫的細(xì)胞在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下的圖像。在每一對柱中，左側(cè)柱表示存活蛋白，右側(cè)柱表示對照。
圖11B量化了圖11A的結(jié)果，證實(shí)對照和存活蛋白肽都已有效內(nèi)化至細(xì)胞中。
圖12A記錄了暴露于指定濃度的可通透細(xì)胞的存活蛋白肽或?qū)φ盏剐螂牡募?xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)的結(jié)果，表明可通透細(xì)胞的存活蛋白肽誘導(dǎo)凋亡。
圖12B比較了可通透細(xì)胞的存活蛋白肽以及指定的化學(xué)治療劑誘導(dǎo)凋亡的能力，是通過流式細(xì)胞術(shù)測量的。結(jié)果表明，可通透細(xì)胞的存活蛋白肽比這些化學(xué)治療劑更有效誘導(dǎo)凋亡。
圖13是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，X軸量化顯示caspase活性(指示凋亡)，Y軸量化顯示漿膜完整性的丟失(指示細(xì)胞死亡)。結(jié)果表明，在HeLa細(xì)胞中，可通透細(xì)胞的存活蛋白肽比對照倒序肽更有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
圖14是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，X軸量化顯示caspase活性(指示凋亡)，Y軸量化顯示漿膜完整性的丟失(指示細(xì)胞死亡)。結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，可通透細(xì)胞的存活蛋白肽比對照倒序肽更有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
圖15是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，X軸量化顯示caspase活性(指示凋亡)，Y軸量化顯示漿膜完整性的丟失(指示細(xì)胞死亡)。結(jié)果表明，在具有野生型p53等位基因的HCT116細(xì)胞以及在具有失活的p53等位基因的HCT116細(xì)胞中，可通透細(xì)胞的存活蛋白肽比對照倒序肽更有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
圖16的免疫印跡照片顯示細(xì)胞提取物，是來自加載了遞增濃度的存活蛋白細(xì)胞通透肽或?qū)φ盏剐螂牡募?xì)胞。表明，存活蛋白細(xì)胞通透肽降低存活蛋白和AKT的表達(dá)(穩(wěn)定性)。
圖17比較了遞增濃度的反構(gòu)型-反排列存活蛋白細(xì)胞通透肽(P3)和對照肽(P4)對指定腫瘤細(xì)胞系(HeLa，MDA-MB231，MCF-7和PANC-1)的細(xì)胞活力的影響。
圖18是一組顯微鏡檢照片，顯示經(jīng)反構(gòu)型-反排列存活蛋白細(xì)胞通透肽(P3)或?qū)φ针?P4)處理過的指定腫瘤細(xì)胞系。
圖19是軟瓊脂組織培養(yǎng)板照片，這些培養(yǎng)板上有～20,000個(gè)乳癌MCF-7細(xì)胞懸浮在含有指定濃度的P31存活蛋白肽或?qū)φ盏剐螂牡呐囵B(yǎng)基中。
圖20記錄了體內(nèi)腫瘤形成試驗(yàn)的結(jié)果，表明存活蛋白細(xì)胞通透肽(P3)比鹽水對照更有效抑制腫瘤生長，是通過腫瘤體積(y-軸)測量的。
圖21是一組存活蛋白細(xì)胞通透肽衍生物以及相應(yīng)的倒序?qū)φ?。野生?正向)存活蛋白氨基酸鏈序列和相應(yīng)的倒序序列用下劃線表示，它們各自的“反構(gòu)型-反排列”序列也用下劃線表示。序列中的“X”表示EAHX，是一種己酸間隔臂。
圖22A和圖22B顯示，存活蛋白肽(P31；實(shí)心符號(hào))和對照肽(P33；空心符號(hào))對腫瘤細(xì)胞系(圖22A)和正常細(xì)胞系(圖22B)的凋亡的影響。
圖23是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，X軸量化顯示膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記(指示凋亡)，Y軸量化顯示碘化丙錠(propidium iodide)染色(指示細(xì)胞死亡)。結(jié)果表明，存活蛋白肽以劑量依賴方式誘導(dǎo)凋亡而對照肽沒有該效果。
圖24A和24B顯示存活蛋白肽(相比于對照肽)與Hsp90的N-末端(圖24A)和C-末端(圖24B)區(qū)的結(jié)合，是通過ELISA定量的。
圖25A和圖25B是存活蛋白肽的分子模型。圖25A是反構(gòu)型-反排列存活蛋白K79-L87序列在溶液中顯示β-轉(zhuǎn)角顯性構(gòu)象的能量最小化預(yù)測結(jié)構(gòu)。圖25B顯示反構(gòu)型-反排列存活蛋白K79-L87肽?？?docking)在Hsp90的ATP酶口袋中，是通過分子建模(molecular modeling)預(yù)測的。
圖26A是存活蛋白、AKT、CDK-6、Hsp90、Hsp70和PCNA在經(jīng)存活蛋白肽處理的細(xì)胞中的免疫印跡復(fù)制圖。
圖26B是TRAP試驗(yàn)結(jié)果復(fù)制圖，該試驗(yàn)用于檢測經(jīng)存活蛋白肽處理的細(xì)胞的免疫沉淀物中端粒酶的活性。在標(biāo)示為“無反應(yīng)”的泳道中，未添加細(xì)胞提取物。R8，外部定量標(biāo)準(zhǔn)；ITAS，內(nèi)部擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。
圖27A顯示經(jīng)鹽水或存活蛋白肽處理11天期間的腫瘤體積。
圖27B是腫瘤細(xì)胞的免疫熒光顯微照片。有熒光表示存在存活蛋白肽。
圖28是小鼠體內(nèi)腫瘤生長圖，所述小鼠帶有源自MCF-7細(xì)胞的腫瘤，并按照圖中指定的時(shí)間間隔在腹腔中注射了鹽水或存活蛋白P3肽(50mg/kg/日)(6只小鼠/組)。每條線代表一只小鼠。
圖29A是免疫印跡復(fù)制圖，顯示AML細(xì)胞中的存活蛋白水平。圖29B-29D顯示存活蛋白肽對AML細(xì)胞的殺傷作用。圖29B顯示HL-60細(xì)胞中的存活蛋白肽活性，是用臺(tái)盼蘭(Trypan blue)排除法檢測的。圖29C和29D顯示全長存活蛋白肽(SEQ ID NO19)、存活蛋白肽K79-G83(SEQ ID NO20)或倒序肽(SEQ ID NO25和SEQ ID NO28)對HL-60(圖29C)或THP-1(圖29D)細(xì)胞的殺傷作用，是用MTT檢測的。
圖30顯示存活蛋白K79-G83在AML細(xì)胞中的殺傷活性。圖中指示的人AML細(xì)胞系(U937，K562，HL60和THP1)與倒序肽(SEQ ID NO28)或與存活蛋白(SEQ ID NO20)肽一起保溫，用MTT評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。
圖31顯示與存活蛋白肽結(jié)合的Hsp90，是用ELISA檢測的。圖中數(shù)據(jù)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.。
圖32是與熒光素(fluorescein)和羅丹明(rhodamine)偶聯(lián)的存活蛋白肽的分子結(jié)構(gòu)，該肽用于FRET和/或FP方法中。在FP方法中，存活蛋白肽可以僅與上述一種熒光團(tuán)偶聯(lián)。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于，至少是部分基于，在存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等凋亡抑制物(IAP)蛋白中發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)與熱休克蛋白Hsp90之間蛋白-蛋白相互作用的特定區(qū)域。Hsp90與IAP蛋白的相互作用在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)對凋亡的抑制。本文公開了可以在腫瘤細(xì)胞中用作Hsp90-IAP相互作用抑制物和凋亡調(diào)節(jié)物的IAP蛋白的肽和肽衍生物。例如，本文公開了在體外和體內(nèi)抑制Hsp90-存活蛋白相互作用并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的新存活蛋白肽。本發(fā)明還提供了鑒定抑制Hsp90-IAP例如Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物的篩選方法。存活蛋白肽的合理設(shè)計(jì)見Plescia et al.，Cancer Cell，7457-468(May 2005)，其全文引入作參考。
存活蛋白肽本文公開的存活蛋白肽及其肽衍生物共享Hsp90核心結(jié)合基序SEQ IDNO2(His Ser Ser Gly Cys)。該Hsp90核心結(jié)合基序位于存活蛋白的單個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)(BIR)區(qū)內(nèi)。更具體地，該基序?qū)?yīng)于全長存活蛋白(SEQ IDNO1) 80-84位的氨基酸殘基。含有該基序的肽及其肽衍生物可以(a)結(jié)合Hsp90的N端ATP酶區(qū)(“ATP口袋”)并(b)在體內(nèi)和體外抑制Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用。
術(shù)語存活蛋白肽和存活蛋白肽衍生物，在本文中用于指，含有比功能性存活蛋白完整氨基酸序列少的氨基酸序列且阻止凋亡的肽。本文公開的存活蛋白肽和肽衍生物在體內(nèi)和/或體外抑制Hsp90-存活蛋白相互作用，因此在體內(nèi)和/或體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
全長野生型人存活蛋白多肽具有以下氨基酸序列MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD (SEQ ID NO1)全長野生型人Hsp90多肽具有以下氨基酸序列MPEETQTQDQPMEEEEVETFAFQAEIAQLMSLIINTFYSNKEIFLRELISNSSDALDKIRYETLTDPSKLDSGKELHINLIPNKQDRTLTIVDTGIGMTKADLINNLGTIAKSGTKAFMEALQAGADISMIGQFGVGFYSAYLVAEKVTVITKHNDDEQYAWESSAGGSFTVRTDTGEPMGRGTKVILHLKEDQTEYLEERRIKEIVKKHSQFIGYPITLFVEKERDKEVSDDEAEEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKDGDKKKKKKIKEKYIDQEELNKTKPIWTRNPDDITNEEYGEFYKSLTNDWEDHLAVKHFSVEGQLEFRALLFVPRRAPFDLFENRKKKNNIKLYVRRVFIMDNCEELIPEYLNFIRGVVDSEDLPLNISREMLQQSKILKVIRKNLVKKCLELFTELAEDKENYKKFYEQFSKNIKLGIHEDSQNRKKLSELLRYYTSASGDEMVSLKDYCTRMKENQKHIYYITGETKDQVANSAFVERLRKHGLEVIYMIEPIDEYCVQQLKEFEGKTLVSVTKEGLELPEDEEEKKKQEEKKTKFENLCKIMKDILEKKVEKVVVSNRLVTSPCCIVTSTYGWTANMERIMKAQALRDNSTMGYMAAKKHLEINPDHSIIETLRQKAEADKNDKSVKDLVILLYETALLSSGFSLEDPQTHANRIYRMIKLGLGIDEDDPTADDTSAAVTEEMPPLEGDDDTSRMEEVD (SEQ IDNO21)本文公開的一種新存活蛋白肽是五肽His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ IDNO2)，它對應(yīng)于SEQ ID NO1的His 80-Cys 84。這種五肽序列可以再包含一或多個(gè)在全長存活蛋白中位于該五肽序列側(cè)翼的氨基酸(即恰好在該五肽序列之前或之后，它們之間不再插有其它氨基酸)。例如，本文公開的一種新肽是9肽SEQ ID NO24(Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu)，其含有SEQID NO1的殘基Lys 79-Leu 87。另一種新肽是10肽SEQ ID NO5(Lys Lys HisSer Ser Gly Cys Ala Phe Leu)，其含有SEQ ID NO1的殘基Lys 78-Leu 87。另一種新肽是12肽SEQ ID NO3(Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu SerVal Lys)，其含有SEQ ID NO1的殘基Lys 79-Cys 90。本文公開的另一種新肽是14肽SEQ ID NO4(Ile Asp Asp His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala PheLeu)，其含有SEQ ID NO1的殘基Ile 74-Leu 87。
本文提供的新肽包括位于SEQ ID NO1中His 80-Cys 84所示五肽序列一側(cè)(氨基側(cè)或羧基側(cè))或雙側(cè)的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16個(gè)氨基酸。
新存活蛋白肽還包括這樣的肽，其側(cè)翼有上述五肽序列氨基側(cè)的氨基酸殘基，也有上述五肽序列羧基側(cè)的氨基酸殘基，但氨基側(cè)殘基數(shù)不同于羧基側(cè)殘基數(shù)，例如，本發(fā)明包括這樣的肽，其具有SEQ ID NO1中His80-Cys 84所示五肽序列氨基側(cè)的0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16個(gè)氨基酸，還具有SEQ ID NO1中His 80-Cys 84所示五肽序列羧基側(cè)的0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16個(gè)氨基酸，且其中該五肽序列氨基側(cè)氨基酸數(shù)不同于該五肽序列羧基側(cè)氨基酸數(shù)。存活蛋白肽的例子見表1。
表1.存活蛋白肽舉例

本文公開的新存活蛋白肽包括肽SEQ ID NOs3-5。應(yīng)注意，緊接所述五肽基序N端的Lys(即SEQ ID NO1的Lys 79)可以被保守氨基酸取代，也可以被一些非保守氨基酸取代。例如參見實(shí)施例10。更常見地，在本文公開的存活蛋白肽中，可以對SEQ ID NO1的核心五肽序列His 80-Cys 84以外的一或多個(gè)氨基酸進(jìn)行保守氨基酸取代。此外，位于SEQ ID NO2任一端的一或兩個(gè)氨基酸可以被保守氨基酸取代或被刪除。因此，His-Ser-Ser(SEQ ID NO11)，Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO12)，Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO13)，His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO14)，Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO15)，以及Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO26)也都是存活蛋白肽。
此外，可以在SEQ ID NO2或SEQ ID NO26的任一側(cè)或全部雙側(cè)連接隨機(jī)氨基酸、或隨機(jī)氨基酸組成的鏈，而形成存活蛋白多肽。
其它可用于本文所述方法的存活蛋白肽包括，例如在本文所述方法中鑒定出的、結(jié)合Hsp90并在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的多肽。例如，存活蛋白肽包括結(jié)合Hsp90并在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)及其片段。
IAP肽與Hsp90相互作用的其它凋亡抑制物蛋白包括cIAP1(Entrez AccessionNo.NP_001156)，cIAP2(Entrez登錄號(hào)NP_001157)，以及XIAP(Entrez登錄號(hào)NP_001158)。見例如Deveraux and Reed，Genes and Dev.，13239-252(1999)。這些IAP蛋白包含至少一個(gè)介導(dǎo)與Hsp90的相互作用的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)，如本文所述。例如XIAP的第一個(gè)BIR區(qū)(BIR1)對應(yīng)于全長XIAP的約氨基酸1-123，它介導(dǎo)Hsp90-XIAP結(jié)合相互作用。
對應(yīng)于這些IAP蛋白中一或多個(gè)BIR區(qū)的肽或其Hsp90-結(jié)合片段因此可以用于本文所述方法中，抑制Hsp90-IAP蛋白相互作用，并因此調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡。例如，XIAP，cIAP1或cIAP2的第一個(gè)BIR區(qū)可以用于抑制Hsp90與XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。在另外的實(shí)施方案中，對應(yīng)于與Hsp9結(jié)合的IAP蛋白BIR區(qū)片段的肽可以用于破壞Hsp90-IAP蛋白相互作用。
XIAP第一個(gè)BIR區(qū)的例子包括以下序列RLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFIN (SEQ ID NO16)cIAP1第一個(gè)BIR區(qū)的例子包括以下序列RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKRGDSPTEKHKKLYPSCRFVQ (SEQ ID NO17)cIAP2第一個(gè)BIR區(qū)的例子包括以下序列RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQ (SEQ ID NO18)肽衍生物本文公開的肽的修飾形式稱“肽衍生物”，它們也可以用于所述新方法中。例如，在本文公開的篩選方法和治療方法中，可以用肽的肽衍生物代替該肽。
1.肽內(nèi)化序列結(jié)合Hsp90并在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的存活蛋白的肽可以通過附加細(xì)胞通透肽序列(有時(shí)稱載體區(qū)或蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū))來修飾。細(xì)胞通透肽序列的例子見Hom et al.，J Med.Chem.，461799(2003)和Bonny et al.，Diabetes，5077-82(2001)。
例如，本文公開的肽和片段可以附加觸角足載體序列第三個(gè)α-螺旋中的序列(Gratton et al.，Cancer Cell，431，(2003))?？梢愿郊颖疚乃鲭暮推蔚募?xì)胞通透序列的其它例子包括HIV-1的TAT蛋白序列(Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，964325(1999)Kelemen et al.，J.Biol.Chem.，2778741-8748，(2002)。另外的例子包括單純皰疹病毒的VP22蛋白(Lundberg and Johansson，Biochem.Biophys.Res.Comm.，291367-371(2002))和Pep-1肽載體(Morris et al.，Nature Biotech.，191173-1176(2001))。包含具有細(xì)胞通透肽序列的肽和片段的多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，如化學(xué)合成，或由編碼該多肽的核酸表達(dá)。含有內(nèi)化序列(internalization sequence)的肽的例子有RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSGCAFL(SEQ ID NO19)和RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSG(SEQ ID NO20)，其中的下劃線序列是存活蛋白的序列。
2.肽模擬物本文公開的肽可以按照本領(lǐng)域已知方法修飾，得到肽模擬物。見例如Kazmierski，W.M.，ed.，Peptidomimetics Protocols，Human Press(Totowa NJ1998)；Goodman et al.，eds.，Houben-Weyl Methods of Organic ChemistrySynthesis of Peptides and Peptidomimetics，Thiele Verlag(New York 2003)；Mayo et al.，J.Biol.Chem.，27845746(2003)。在一些例子中，本文所述肽和片段的這些修飾的肽模擬物比非-肽模擬性肽的體內(nèi)穩(wěn)定性增強(qiáng)。
產(chǎn)生肽模擬物的方法包括，將肽序列中的一或多個(gè)(例如全部)氨基酸替換為D-氨基酸對映異構(gòu)體。這種序列在本文中稱“反構(gòu)型(retro)”序列。在另一方法中，將氨基酸殘基從N-末端到C-末端的順序顛倒，使得原始肽中從N-端到C-端的氨基酸殘基排列順序變成修飾后的肽模擬物中從C-端到N-端的氨基酸殘基排列順序。這種序列可稱“反排列(inverso)”序列。
肽模擬物可以既是反構(gòu)型又是反排列的形式，即本文所述肽的“反構(gòu)型-反排列(retro-inverso)”形式。新的肽模擬物可以由D-氨基酸組成，這些氨基酸的排列導(dǎo)致，在肽模擬物中從N端到C端的氨基酸殘基順序與在原始肽中從C端到N端的氨基酸殘基順序一致。
其它制備肽模擬物的方法包括，將肽中的一或多個(gè)氨基酸殘基替換為與所述氨基酸的化學(xué)性質(zhì)不同、但可識(shí)別的功能類似物，即人工氨基酸類似物。人工氨基酸類似物包括β-氨基酸，β-取代的β-氨基酸(“β3-氨基酸”)，氨基酸的磷類似物(phosphorous analog)，如α-氨基膦酸(phosphonic acids)和α-氨基次膦酸(phosphinic acids)，以及具有非-肽連接的氨基酸。人工氨基酸可以用于制備肽模擬物，如肽寡聚物(如擬肽酰胺或酯類似物)，β-肽，環(huán)肽(cyclic peptide)，寡尿(oligourea)或寡氨基甲酸酯肽(oligocarbamate peptide)；或雜環(huán)分子。存活蛋白反構(gòu)型-反排列肽模擬物例子有LFACGSSHK，CGSSH，GSSHK，KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK，KKWKMRRNQFWVKVQRCGSSH和KKWKMRRNQFWVKVQRGSSHK，這些序列包括所有D-氨基酸。這些序列可以通過例如使氨基端生物素化和使羧基端酰胺化而修飾。
核酸，載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明一方面包括核酸，其編碼破壞Hsp90-IAP蛋白相互作用的肽或經(jīng)修飾的肽。例如，本發(fā)明包括編碼新肽的核酸，所述新肽包括位于五肽序列SEQ ID NO2(即SEQ ID NO1的His 80-Cys 84)的一側(cè)(氨基側(cè)或羧基側(cè))或雙側(cè)的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16個(gè)氨基酸。
所述新核酸包括編碼肽SEQ ID NOs2，3，4或5的核酸序列。本文公開的核酸還包括編碼一些經(jīng)修飾的存活蛋白肽(例如反構(gòu)型-存活蛋白肽、與細(xì)胞內(nèi)化(載體)序列相連的存活蛋白肽、以及與載體序列相連的反構(gòu)型-存活蛋白肽)的核酸。
所述核酸還編碼IAP蛋白家族成員中破壞Hsp90與XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的肽。例如，本發(fā)明包括編碼BIR1即XIAP蛋白的Met 1-Ser 123的核酸。本文公開的核酸可以編碼由本文所述方法鑒定出的破壞Hsp90與XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的任一種肽。本文公開的核酸還包括這樣的核酸，其編碼破壞Hsp90與XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的肽的修飾形式，例如反構(gòu)型肽，與細(xì)胞內(nèi)化(載體)序列相連的肽、以及與載體序列相連的反構(gòu)型肽。
本文公開的核酸還包括RNA和DNA兩者，包括基因組DNA和合成的(如化學(xué)合成的)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈。核酸可以用寡核苷酸類似物或衍生物(如肌苷或核苷酸硫代磷酸酯)來合成。這種寡核苷酸可以用于例如制備抗核酸酶抗性增強(qiáng)的核酸。
本發(fā)明還包括遺傳構(gòu)建物(如載體和質(zhì)粒)，其包含編碼本文所述肽的核酸且該核酸與能表達(dá)所述肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯序列可操作相連，例如是表達(dá)載體。選定的核酸(例如編碼本文所述肽的DNA分子)與另一核酸分子(例如啟動(dòng)子)“可操作相連”是指，前者緊鄰后者，或者處在可以由后者指導(dǎo)前者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的相同位置或其它位置。
本發(fā)明還包括多種經(jīng)過改造的細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包含本文所述核酸。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是這樣一種細(xì)胞，在該細(xì)胞或其祖先細(xì)胞中，利用重組DNA技術(shù)導(dǎo)入了編碼本文所述結(jié)合Hsp90和/或在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的肽的核酸。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)、酵母、真菌、細(xì)菌(如大腸桿菌(Escherichia coli))都可以作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明所包括的經(jīng)改造的細(xì)胞例如有表達(dá)存活蛋白肽的腫瘤細(xì)胞，見下文實(shí)施例。
鑒定抑制Hsp90與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法本發(fā)明一些方面提供了鑒定化合物的方法，所述化合物抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用，并因此分別抑制存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的抗凋亡活性，例如所述化合物是有機(jī)或無機(jī)小分子(分子量不到1,000Da)，寡肽，寡核苷酸，碳水化合物，抗體。這些小分子、寡肽和寡核苷酸可用于治療以細(xì)胞增生失控和凋亡機(jī)制失活為特征的疾病，例如癌癥。
受試化合物文庫在一些實(shí)施方案中，本文所述篩選利用了受試化合物文庫。本文中，“受試化合物”可以是任何化學(xué)化合物，例如，大分子(如多肽、蛋白復(fù)合物、糖蛋白、多糖或核酸)或小分子(如氨基酸、核苷酸或有機(jī)或無機(jī)化合物)。受試化合物的分子量可以是約10,000g/摩爾以下，5,000g/摩爾以下，1,000g/摩爾以下，或約500g/摩爾以下。受試化合物可以是天然產(chǎn)生的(例如，草(herb)或天然產(chǎn)物)、合成的或可以既有天然成分也有合成成分。受試化合物的例子有肽、肽模擬物(例如，擬肽，反構(gòu)型肽，反排列肽，和反構(gòu)型-反排列肽)、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、以及有機(jī)或無機(jī)化合物如雜有機(jī)化合物(heterorganic compound)或有機(jī)金屬化合物(organometallic compound)。
受試化合物可以單個(gè)地篩選或者平行篩選。一個(gè)平行篩選的例子是，化學(xué)物質(zhì)大文庫的高通量藥物篩選。這種候選化合物文庫可以自制或購買，例如從Chembridge Corp.，San Diego，CA購買。文庫經(jīng)過設(shè)計(jì)，可以涵蓋較寬范圍的化合物。例如，一個(gè)文庫可以包括500、1000、10,000、50,000或100,000或更多的唯一(unique)化合物?；蛘?，事先的實(shí)驗(yàn)和偶然的證據(jù)(anecdotal evidence)可以提示一類能力增強(qiáng)的化合物?？梢栽O(shè)計(jì)并合成文庫來涵蓋這類化學(xué)物質(zhì)。
組合文庫(combinatorial libraries)的合成是本領(lǐng)域已知的，已有綜述(見例如Gordon et al.，J.Med.Chem.，371385-1401(1994)；Hobbes et al.，Acc.Chem.Res.，29114(1996)；Armstrong，et al.，Acc.Chem.Res.，(1996)29123；Ellman，Acc.Chem.Res.，(1996)29132；Gordon et al.，Acc.Chem.Res.，29144(1996)；Lowe，Chem.Soc.Rev.，309(1995)；Blondelle et al.，Trends Anal.Chem.，1483(1995)；Chen et al.，J.Am.Chem.Soc.，1162661(1994)；U.S.Patents No5,359,115，5,362,899，and 5,288,514；PCT Publication Nos.WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
化合物文庫可以按照多種方法制備，其中一些方法是本領(lǐng)域已知的。例如，″分-合(split-pool)″策略如下將多個(gè)作為功能化、聚合物性質(zhì)支持物的珠置于多個(gè)反應(yīng)管中；適于固相肽合成的多種聚合物性質(zhì)支持物是已知的，其中一些可以商購(例如，見M.Bodansky″Principles of肽Synthesis，″2ndedition，Springer-Verlag，Berlin(1993))。向每一等份的珠中添加不同的經(jīng)活化的氨基酸的溶液，進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生多種固相氨基酸，每一反應(yīng)管中一種。然后洗這些經(jīng)過衍化的珠，″合并(pooled)″(即重新組合(recombined))，將合并的珠再分組，將每一等份放置在不同的反應(yīng)管中。然后向每一份珠中添加另一種經(jīng)活化的氨基酸。重復(fù)該合成循環(huán)，直到獲得所需的肽長度。每一合成循環(huán)中所加的氨基酸殘基可以隨機(jī)選擇；也可以通過選取氨基酸來產(chǎn)生″有偏好的(biased)″文庫，例如在文庫中抑制物的一些部分并不是隨機(jī)選擇的，因此可以提供與已知能與抗體相互作用的肽有已知的結(jié)構(gòu)相似性或同源性的抑制物，所述部分例如抗-獨(dú)特型抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。有利的是，廣泛多種肽化合物、肽模擬物化合物或非-肽化合物可以按照這種方式很容易地產(chǎn)生。
“split-pool”策略可以產(chǎn)生肽文庫，例如調(diào)節(jié)物文庫，其可用于制備本發(fā)明受試化合物的文庫。在另一例合成中，用Hobbs DeWitt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，906909(1993))的方法創(chuàng)建″多樣體文庫(diversomerlibrary)″。其它合成方法，包括Houghten(see，e.g.，Houghten et al.，Nature，35484-86(1991))的″茶袋(tea-bag)″技術(shù)，也可以用于合成本發(fā)明化合物文庫。
可以篩選化合物文庫，確定文庫中任一成員是否可以抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用，如果可以，則將其鑒定為抑制化合物。篩選組合文庫的方法已有文獻(xiàn)記載(見例如Gordon et al.，J Med.Chem.，同上)?？扇苄曰衔镂膸炜梢酝ㄟ^親和層析來篩選，利用合適的受體分離該受體的配體，然后用常規(guī)技術(shù)(例如，質(zhì)譜分析、NMR等)鑒定所分離的配體。固相化合物可以如下篩選使這些化合物與可溶性受體接觸，優(yōu)選所述可溶性受體與可被檢測的標(biāo)記物(例如，熒光團(tuán)、定量顯色的酶(colorimetric enzyme)、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光化合物等)偶聯(lián)，以便指示配體結(jié)合?；蛘撸梢詫⒐滔嗷衔镞x擇性釋放并使之?dāng)U散過膜而與受體相互作用?？捎糜诤Y選受試化合物文庫的試驗(yàn)的例子在上文中描述。
受試化合物也可包括抗體，例如與存活蛋白，cIAP1，cIAP2或XIAP結(jié)合的抗體。適用于在本文所述方法中進(jìn)行篩選的抗體包括選擇性結(jié)合本文所述肽的已知抗體和新抗體(下文祥述)。
篩選方法在本文所述篩選方法中，可以用肽的肽衍生物替代該肽。例如，可以用存活蛋白(或IAP蛋白)肽的肽衍生物替代該存活蛋白(或IAP蛋白)肽。
本發(fā)明提供了鑒定能(通過抑制IAP蛋白的抗凋亡活性)誘導(dǎo)細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)凋亡的化合物。盡管申請人不想將所涉及的生物學(xué)機(jī)制受限于任何具體理論，但認(rèn)為這種化合物可阻止Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2結(jié)合，并且在存活蛋白的情況中，由此而在細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)中阻止或抑制細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
在新方法的一些方面，篩選抑制凋亡的化合物可以是從一組受試化合物中鑒定出這樣的化合物，它們例如(a)結(jié)合本文所述包含Hsp90結(jié)合位點(diǎn)的肽，例如存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的肽，和/或(b)抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。結(jié)合本文所述存活蛋白肽的化合物可以用作也結(jié)合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90結(jié)合基序并因此抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物。這種化合物是候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物，可以進(jìn)一步分析它們在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
在新方法的另一些方面，篩選抑制凋亡的化合物可以是從一組受試化合物中鑒定出這樣的化合物，它們(a)結(jié)合本文所述包含IAP(如存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2)結(jié)合位點(diǎn)的肽，例如Hsp90的肽，和/或(b)抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。結(jié)合本文所述Hsp90肽的化合物可以用作也結(jié)合Hsp90的IAP結(jié)合基序并因此抑制Hsp90與IAP(如存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2)的蛋白-蛋白相互作用的化合物。這種化合物是候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物，可以進(jìn)一步分析它們在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
結(jié)合本文所述存活蛋白或Hsp90肽和/或抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的受試化合物在本文中稱“候選化合物”。凋亡誘導(dǎo)劑是通過進(jìn)一步測試發(fā)現(xiàn)能抑制存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的活性并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的候選化合物。在新的篩選方法中，可以但非必需測試候選化合物，以確定它們是否腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)劑。本文公開的試驗(yàn)可以在全細(xì)胞制劑中進(jìn)行和/或在離體(ex vivo)的無細(xì)胞體系中進(jìn)行。
一方面，本發(fā)明包括篩選受試化合物的方法，以鑒定出結(jié)合本文所述肽的化合物。受試化合物與本文所述肽的結(jié)合可以如下檢測例如，在體外將受試化合物或本文所述肽可逆地或不可逆地固定在支持物表面，例如96孔聚苯乙烯微滴板的孔表面。固定化合物(例如肽和其它小分子)的方法是本領(lǐng)域已知的。受試化合物結(jié)合本文所述肽的能力可以隨后測定使固相受試化合物或固相本文所述肽與非固相化合物或非固相本文所述肽接觸，洗支持物，測出仍結(jié)合在支持物上的非固相受試化合物或本文所述肽的量。例如，可以用本發(fā)明的肽包被微滴板，方法是將所述肽的溶液(通常是0.05-1mg/ml在1-100μl中)添加到每孔中，將板在室溫-37℃的溫度保溫一段時(shí)間，例如0.1-36小時(shí)。從板中除去(例如潷析、吸出或晃出)過量溶液，然后用水或緩沖液洗板(一次或多次)，從而除去未結(jié)合板的肽。通常，這種肽在水中或緩沖液中。再用不含結(jié)合肽的緩沖液洗板。為了封閉板上游離的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，可以用與結(jié)合多肽無關(guān)的蛋白將板封閉。例如，可以用300μl 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的TrisTM-HCl溶液。合適的支持物包括含有指定的交聯(lián)化學(xué)的支持物(例如，塑料支持物，如聚苯乙烯、苯乙烯或聚丙烯支持物，可得自Corning Costar Corp.(Cambridge，MA))。需要時(shí)，可以用珠粒，例如瓊脂糖珠或sepharose珠作為支持物。然后可將受試化合物添加到已包被的板上，使其結(jié)合固相的本文所述肽(例如，37℃ 0.5-12小時(shí))。之后如上述洗板。
本文所述肽與第二種化合物，例如上述受試化合物的結(jié)合，可以用任一種本領(lǐng)域已知方法來檢測。例如，可以在免疫分析中使用特異性結(jié)合本文所述肽的抗體。需要時(shí)，可以標(biāo)記該抗體(例如，進(jìn)行熒光標(biāo)記或用放射性同位素標(biāo)記)并直接檢測(見例如West and McMahon，J.Cell.Biol.74264，1977)?；蛘撸梢杂玫诙贵w進(jìn)行間接檢測。在另一種檢測方法中，標(biāo)記受試化合物(例如，用放射性同位素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)等標(biāo)記)并檢測該標(biāo)記物。在另一方法中，如果受試化合物是多肽(受試多肽)，則將其與可以可選地檢測的蛋白(例如可以在紫外線下檢測的綠色熒光蛋白)一起制成融合蛋白。在另一方法中，可以將受試多肽與具有可檢測的酶活性的酶一起制成融合蛋白，所述酶例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。編碼所有這些酶的基因已有克隆，是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的。需要時(shí)，融合蛋白可以包括抗原，該抗原可以通過常規(guī)方法用多克隆或單克隆抗體進(jìn)行檢測和測量。合適的抗原包括酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)以及非酶多肽(例如，血清蛋白如BSA和球蛋白，以及乳蛋白如酪蛋白)。
在鑒定與本文所述肽結(jié)合的受試多肽的多種方法中，可以采用傳統(tǒng)的鑒定蛋白/蛋白相互作用的雙-雜交體試驗(yàn)(two-hybrid assays，見例如Chien etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578，1991；Fields et al.，U.S.Pat.No.5,283,173；Fields and Song，Nature，340245，1989；Le Douarin et al.，NucleicAcids Research，23876，1995；Vidal et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310315-10320，1996；and White，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310001-10003，1996)。一般而言，雙-雜交體方法涉及重建轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)可分離的區(qū)。一種融合蛋白包含本文所述肽且該肽與轉(zhuǎn)錄因子(如Gal4)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)或DNA結(jié)合區(qū)融合。另一種融合蛋白包含受試多肽且該多肽與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)或轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。一旦在單個(gè)細(xì)胞(如酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中相遇，其中一種融合蛋白包含轉(zhuǎn)錄激活區(qū)而另一種融合蛋白包含DNA結(jié)合區(qū)。因此，本文所述肽與受試多肽結(jié)合導(dǎo)致重建轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子的重建可以通過檢測基因(即報(bào)告基因)的表達(dá)來檢測，該基因與結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合區(qū)的DNA序列可操作相連。實(shí)施多種雙雜交體方法的試劑盒可以商購(例如從Clontech；Palo Alto，CA購買)。
另一方面，本發(fā)明包括篩選受試化合物的方法，以鑒定抑制Hsp90與存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物。一種高通量篩選能調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法見Lepourcelet et al.，Cancer Cell，591-102(2004)，其全文引入本文作參考。通常，提供第一種蛋白。該第一種蛋白是(i)存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，或者(ii)該第一種蛋白是結(jié)合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90肽。提供第二種蛋白，它不同于第一種蛋白并帶有標(biāo)記。該第二種蛋白是(i)存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，或者(ii)結(jié)合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90肽。提供受試化合物。使所述第一種蛋白、第二種蛋白以及受試化合物彼此接觸。測定與第一種蛋白結(jié)合的標(biāo)記物的量?？梢酝ㄟ^結(jié)合的標(biāo)記物的量來評(píng)估第一種蛋白與第二種蛋白之間蛋白-蛋白相互作用(例如結(jié)合)的變化，它表明該化合物可以用于抑制Hsp90肽與存活蛋白、XIAP、cIAP1、cIAP2或本文所述肽的蛋白-蛋白相互作用。在一些實(shí)施方案中，這種變化是相對于不添加所述受試化合物時(shí)的相同反應(yīng)而評(píng)估的。
在一些實(shí)施方案中，所述第一種蛋白附著在固體支持物上。固體支持物的例子有瓊脂糖等樹脂、珠、多孔板。在一些實(shí)施方案中，所述方法在接觸步驟之后包括洗滌步驟，以便將結(jié)合的標(biāo)記物與未結(jié)合的標(biāo)記物分開。
在一些實(shí)施方案中，將多個(gè)受試化合物與所述第一種蛋白和第二種蛋白接觸。不相同的受試化合物可以同組(in groups)或分別(separately)與其它化合物接觸。在一些實(shí)施方案中，每一種受試化合物與不同孔中的第一種蛋白和第二種蛋白都進(jìn)行接觸。例如，所述方法可以篩選上文所述受試化合物文庫。文庫可以包括，例如天然產(chǎn)物、有機(jī)化學(xué)物質(zhì)、肽、和/或經(jīng)修飾的肽，包括例如D-氨基酸、非常規(guī)氨基酸和N-取代的氨基酸。通常，文庫采取適于在多孔板例如96孔板中篩選的形式。這種試驗(yàn)尤其可用于自動(dòng)進(jìn)行多孔檢測，其中的多數(shù)步驟可以由計(jì)算機(jī)控制并由自動(dòng)設(shè)備(roboticequipment)進(jìn)行操作。文庫也可以是其它形式，例如固定在固體支持物上和可以釋放到微滴(microdroplet)中的合成化學(xué)文庫。
在一些實(shí)施方案中，第一種蛋白是存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，第二種蛋白是Hsp90肽。在另一些實(shí)施方案中，第一種蛋白是Hsp90或其生物活性片段，例如含有SEQ ID NO21的氨基酸殘基1-272、可結(jié)合存活蛋白的片段，第二種蛋白是存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽。被第一種蛋白附著的固體支持物可以是SEPHAROSETM珠、閃爍親近測定(scintillation proximity assay，SPA)珠(內(nèi)含閃爍體的微球體)或多孔板。SPA珠可以在無需洗滌步驟的測定，例如閃爍親近測定中使用。SEPHAROSETM珠可以在包含洗滌步驟的測定中使用。第二種蛋白可以用能被檢測到的標(biāo)記物標(biāo)記，所述標(biāo)記物例如放射性標(biāo)記物、熒光試劑、生物素、肽標(biāo)簽或酶片段。第二種蛋白也可以用125I或3H等進(jìn)行放射性標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，用與第一種蛋白或第二種蛋白化學(xué)偶聯(lián)或者與之表達(dá)為融合蛋白的酶的酶活性來檢測結(jié)合的蛋白。本發(fā)明因此還包括結(jié)合試驗(yàn)，其中使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)方法檢測結(jié)合的蛋白。
在另一些實(shí)施方案中，第一種蛋白與第二種蛋白的相互作用通過供體熒光團(tuán)與受體熒光團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來檢測，所述供體熒光團(tuán)與第一種蛋白共價(jià)連接(例如是，與本文所述肽化學(xué)偶聯(lián)的熒光基團(tuán)或與本文所述肽相連而表達(dá)為綠色熒光蛋白(GFP)嵌合蛋白的GFP的變體)，所述受體熒光團(tuán)與第二種蛋白共價(jià)連接，當(dāng)?shù)谝环N蛋白與第二種蛋白發(fā)生蛋白-蛋白相互作用，使所述熒光團(tuán)靠得足夠近時(shí)，供體發(fā)射光譜和受體激發(fā)光譜出現(xiàn)合適的重疊，導(dǎo)致產(chǎn)生有效的非放射性能量轉(zhuǎn)移?；蛘撸梢詫⒐w熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)兩者都偶聯(lián)在同一肽例如存活蛋白肽的每一末端。游離的肽由于在供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)之間的分子內(nèi)FRET導(dǎo)致熒光強(qiáng)度淬滅，因此具有較高的FRET效力。通過與Hsp90結(jié)合，肽-染料偶聯(lián)物的分子內(nèi)FRET降低，供體信號(hào)增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，用熒光極化(fluorescence polarization，F(xiàn)P)監(jiān)控兩種蛋白之間的相互作用。例如，熒光標(biāo)記的肽快速旋轉(zhuǎn)，具有較弱的熒光極化。當(dāng)與蛋白結(jié)合后，復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)變慢，熒光極化增強(qiáng)。
在另一些實(shí)施方案中，蛋白-蛋白相互作用通過重建酶例如beta-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)域來檢測(見Rossi et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，948405-8410(1997))。
在另一些實(shí)施方案中，蛋白-蛋白相互作用通過第一種蛋白和第二種蛋白的適當(dāng)嵌合構(gòu)建體的熒光比例成像(fluorescence ratio imaging)來評(píng)估(Bacskai et al，Science，260222-226(1993))或通過改良的雙雜交體試驗(yàn)來評(píng)估(Fearon et al，Proc.Nat’l.Acad.Sci USA，897958-7962(1992)；Takacs et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9010375-10379(1993)；Vidal et al，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，9310315-10320(1996)；Vidal et al，Proc.Nat’l Acad.Sci USA，9310321-10326(1996))，這種改良試驗(yàn)利用了第一種蛋白和第二種蛋白的適當(dāng)構(gòu)建體，且所述構(gòu)建體通過修飾適于進(jìn)行高通量測定，因此可以檢測抑制第一種蛋白/第二種蛋白相互作用的化合物。這些實(shí)施方案的好處是，在測定時(shí)確保作為調(diào)節(jié)劑的化合物的細(xì)胞通透性。
例如，在一種試驗(yàn)中，但并非僅僅在該試驗(yàn)中，存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2，其肽或其片段吸附在ELISA板上。然后將吸附的多肽暴露于受試化合物，接著暴露于Hsp90或其肽(可選將其與報(bào)告肽例如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合)。洗滌ELISA板，用抗-Hsp90抗體(或選擇性結(jié)合該報(bào)告肽的抗體)檢測結(jié)合的蛋白。所述抗體可以直接檢測或用第二抗體間接檢測。干擾蛋白-蛋白相互作用的化合物在ELISA板中產(chǎn)生的抗體信號(hào)降低。
II.抗體本發(fā)明的特征在于純化的或分離的抗體，其與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)肽結(jié)合，例如，特異性結(jié)合。這樣的抗體抑制Hsp90分別與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用?？贵w“特異性結(jié)合”具體抗原(例如本文所述存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2肽)是指，在樣品(例如包含本文所述存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2肽的生物樣品)中，該抗體結(jié)合所述抗原的表位，但不實(shí)質(zhì)結(jié)合不含有該抗體結(jié)合的表位的其它分子。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、以及用Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的分子。
本發(fā)明的抗體包括抗本文所述肽的抗體。這樣的抗體可以如下制備分離或合成本文所述肽(例如，SEQ ID NO2，3，4或5或圖22中的肽)，可選地使所述肽與佐劑卵清蛋白偶聯(lián)，將所述肽注射到動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生多克隆抗體。
本文中術(shù)語“抗體”是指一種蛋白，其包括至少一個(gè)(例如兩個(gè))重鏈(H)可變區(qū)(本文中縮寫VH)和至少一個(gè)(例如兩個(gè))輕鏈(L)可變區(qū)(本文中縮寫VL)。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步分為超變區(qū)，也稱″互補(bǔ)決定區(qū)″(″CDR″)，其間間插更保守的區(qū)，稱″框架區(qū)″(FR)?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍已有明確限定(見Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，and Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.，196901-917)。每一個(gè)VH或V由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端到羧基端按照下列順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。
抗-存活蛋白，抗-XIAP，抗-cIAP1或抗-cIAP2抗體可以再分別包括重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，從而形成免疫球蛋白重鏈和輕鏈。所述抗體可以是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈組成的四聚體，其中重鏈和輕鏈通過例如二硫鍵相連。重鏈恒定區(qū)由CH1，CH2和CH3這三個(gè)區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由CL這一個(gè)區(qū)組成。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。抗體恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子的結(jié)合，所述因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種成分(Clq)。
抗體的“抗原結(jié)合片段”是指全長抗體上保留與抗原多肽或其部分特異性結(jié)合的能力的一或多個(gè)片段?？?存活蛋白，抗-XIAP，抗-cIAP1或抗-cIAP2抗體的抗原結(jié)合片段的例子包括但不限于(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CH1區(qū)組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，是兩個(gè)Fab片段在鉸鏈區(qū)以二硫鍵連接而成的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1區(qū)組成；(iv)Fv片段，由抗體單個(gè)臂的VL和VH區(qū)組成；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature，341544-546)，由VH區(qū)組成；以及(vi)單獨(dú)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的VL和VH兩個(gè)區(qū)可以由不同基因編碼，但可以將它們用重組方法通過合成性接頭連在一起，所述接頭確保這兩個(gè)區(qū)組成單一一條蛋白鏈，在該鏈中，VL和VH區(qū)配對形成單價(jià)分子(即單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird et al.(1988)Science，242423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883)。這種單鏈分子也包括在抗-存活蛋白抗體、抗-XIAP抗體、抗-cIAP1抗體、或抗-cIAP2抗體的術(shù)語中。這些抗體片段可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得。
為了制備抗體，可以使用存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或其與Hsp90結(jié)合的片段或肽，例如通過重組技術(shù)或肽合成技術(shù)產(chǎn)生的那些(見例如SolidPhase Peptide Synthesis，同上；Ausubel et al.，同上)。一般而言，可以使多肽偶聯(lián)載體蛋白，如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，見例如Ausubel et al.，同上，將其與佐劑混合，注射到宿主哺乳動(dòng)物中。“載體”是指這樣一種物質(zhì)，其使與之偶聯(lián)的分子穩(wěn)定、和/或幫助或增強(qiáng)與之偶聯(lián)的分子的轉(zhuǎn)運(yùn)或免疫原性。
通常，為了制備抗體，用抗原多肽注射多種宿主動(dòng)物。合適的宿主動(dòng)物的例子有兔、小鼠、豚鼠和大鼠。多種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，取決于宿主物種，包括但不限于，弗氏佐劑(Freund′s)(完全佐劑和不完全佐利)、礦物膠佐劑如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯、BCG(bacilleCalmette-Guerin)以及小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。這類方法導(dǎo)致從被免疫的動(dòng)物的血清產(chǎn)生多克隆抗體，即一群不均一的抗體分子。抗體可以從該宿主動(dòng)物的血液純化獲得，例如用親和層析法，其中將結(jié)合Hsp90的多肽抗原固定在樹脂上。
本發(fā)明還包括抗本文所述存活蛋白肽、XIAP肽、cIAP1肽或cIAP2肽的單克隆抗體。單克隆抗體(mAb)是抗具體抗原的一群均一的抗體分子，可以用本文所述肽(例如，SEQ ID NO2，3，4或5或圖25的肽)和標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)(見例如Kohler et al.，Nature，256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.，6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.，6292，1976；Hammerling et al.，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，NY，1981；Ausubel etal.，同上)來制備。
通常，單克隆抗體可以用任何能產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)來制備，所述技術(shù)例如通過連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)，參見Kohler et al.，Nature，256495，1975，美國專利4,376,110；人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor etal.，Immunology Today，472，1983；Cole et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802026，1983)；以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96，1983)。這樣的抗體可以是任一類免疫球蛋白IgG，IgM，IgE，IgA，IgD，及其任一亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。
多克隆抗體或單克隆抗體產(chǎn)生后，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在免疫分析(如Western印跡或免疫沉淀分析)中測試它們結(jié)合(例如特異性結(jié)合)存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的能力，參見Ausubel et al.，同上。特異性結(jié)合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2并抑制Hsp90與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2之間蛋白-蛋白相互作用的抗體可以用于本發(fā)明。例如，這樣的抗體可以用于在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
或者或此外，可以重組制備抗體，例如通過噬菌體展示或通過組合方法(combinatorial method)制備，見例如Ladner et al.美國專利5,223,409；Kanget al.國際公開文本W(wǎng)O 92/18619；Dower et al.國際公開文本W(wǎng)O 91/17271；Winter et al.國際公開文本W(wǎng)O 92/20791；Markland et al.國際公開文本W(wǎng)O92/15679；Breitling et al.國際公開文本W(wǎng)O 93/01288；McCafferty et al.國際公開文本W(wǎng)O 92/01047；Garrard et al.國際公開文本W(wǎng)O 92/09690；Ladner etal.國際公開文本W(wǎng)O 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology，91370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod Hybridomas，381-85；Huse et al.(1989)Science，2461275-1281；Griffths et al.(1993)EMBO J.，12725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226889-896；Clackson et al.(1991)Nature，352624-628；Gram et al.(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，893576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology，91373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acid Res.，194133-4137；Barbas et al.(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，887978-7982。
抗體可以是完全的人抗體(fully human antibody)(例如，在經(jīng)過遺傳改造可以由人免疫球蛋白序列產(chǎn)生抗體的小鼠中產(chǎn)生的抗體)或非-人抗體，例如嚙齒類(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類(例如猴)、駱駝、驢、豬或禽的抗體。
所述抗體可以有在非-人生物如大鼠或小鼠中產(chǎn)生的可變區(qū)或其一部分，例如CDR。所述抗體還可以是嵌合抗體，CDR-移植型抗體或人源化抗體。所述抗體還可以在非-人生物如大鼠或小鼠中產(chǎn)生，然后在例如可變區(qū)框架區(qū)或恒定區(qū)中進(jìn)行修飾，降低其在人體中的抗原性。
制備“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851，1984；Neuberger et al.，Nature，312604，1984；Takeda et al.，Nature，314452，1984)可以用于將具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體的基因連接。在嵌合抗體中，不同部分來自不同動(dòng)物物種，例如具有來自小鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合抗體。
或者，制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778和4,704,692)經(jīng)過改良，可以用于制備抗本文所述肽的單鏈抗體。將Fv區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段通過氨基酸橋聯(lián)，得到單鏈多肽，可以制備出單鏈抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將編碼本文所述抗體例如單鏈抗體的重組載體用基因療法技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞中，使所編碼的抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，與胞內(nèi)標(biāo)靶結(jié)合，從而抑制其功能。改造這類胞內(nèi)抗體(“intrabodies”)的方法是已知的。該技術(shù)已成功應(yīng)用在本領(lǐng)域中(見Richardson and Marasco，1995，TrendsBiotechnol.，13306-310的綜述)。
識(shí)別并結(jié)合特異性表位的抗體片段可以用已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這類片段可包括，但不限于F(ab′)2片段和Fab片段，前者可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生，后者可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse et al.，Science，2461275，1989)，從而能快速簡便地辨別具有所需特異性的單克隆Fab片段。
本發(fā)明還包括抗-獨(dú)特型抗體，其可模擬存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)肽的活性。制備這些抗體可以是，針對一群結(jié)合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的腫瘤凋亡誘導(dǎo)肽的抗體，篩選與其抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合的抗體。這些抗-獨(dú)特型抗體可以在本文所述誘導(dǎo)凋亡的方法中使用。
醫(yī)學(xué)化學(xué)一旦鑒定出目標(biāo)化合物(或試劑)，可以用醫(yī)學(xué)化學(xué)的常規(guī)原理制備該化合物的衍生物?？梢詫ρ苌锖Y選改進(jìn)的藥理學(xué)特性，例如效力、藥物動(dòng)力學(xué)、穩(wěn)定性、溶解度和清除特性。對于上述測定中負(fù)責(zé)化合物活性的部分(moieties)，可以通過研究結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)來描繪，本領(lǐng)域常常如此實(shí)踐。藥物化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可以修飾候選化合物或試劑(即先導(dǎo)化合物)上的一些部分，并測量該修飾對于該化合物或試劑的效力的影響，從而制得具有增強(qiáng)的能力的衍生物。例如見Nagarajan et al.(1988)J.Antibiot.，411430-8。而且，如果該化合物或試劑的生物化學(xué)標(biāo)靶是已知的或者是確定的，可以依據(jù)該標(biāo)靶和該化合物的結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)并優(yōu)化衍生物。用于此目的的分子建模軟件可以購買得到(例如從Molecular Simulations，Inc.購買)。
IV.藥物組合物抑制Hsp90與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2之間蛋白-蛋白相互作用的化合物和試劑、肽、及抗體(本文中都可稱為“活性化合物”或“受試化合物”)可以摻入藥物組合物中。這樣的組合物通常包括活性化合物和可藥用載體?！翱伤幱幂d體”可以包括與給藥方式相容的溶劑、分散介質(zhì)(dispersion media)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。也可以在組合物中補(bǔ)充活性化合物。
藥物組合物經(jīng)過配制使其與其想要采用的給藥途徑相容。給藥途徑的例子有非胃腸道途徑，例如靜脈、皮內(nèi)、皮下、口服(例如吸入(inhalation))、經(jīng)皮(transdermal)(局部表面(topical))、經(jīng)粘膜(transmucosal)、以及直腸給藥。非胃腸道、皮內(nèi)或皮下用藥的溶液或懸浮液可以包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、固定的油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成性溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯類(methylparabens)；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)；螯合劑如乙二氨四乙酸；緩沖液如乙酸、檸檬酸或磷酸緩沖液以及調(diào)節(jié)滲漲度(tonicity)的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或堿來調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。非胃腸道用藥的制劑可以容納在由玻璃或塑料制成的安瓿(ampoule)、一次性注射器、或者多劑量小瓶(multiple dose vial)中。
適于注射用藥的藥物組合物含有無菌水溶液(水溶性)或分散體(dispersion)以及可以現(xiàn)場制作出(extemporaneous preparation)無菌注射液或分散體的無菌粉末。靜脈用藥時(shí)，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水(bacteriostatic water)、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，所述組合物必需是無菌的、且必需具有簡便注射所需的流動(dòng)性。它在制備和貯存條件下必需穩(wěn)定、且必需保存在抗細(xì)菌和真菌等微生物污染的條件下。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、聚丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、以及它們的合適混合物。合適的流動(dòng)性(proper fluidity)可以通過以下方法維持例如，利用卵磷脂等包衣，在分散體的情況中維持所需的粒徑，以及利用表面活性劑。微生物的作用可以通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑預(yù)防，例如，對羥基苯甲酸類(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在多種情況中，優(yōu)選所述組合物含有等滲劑，例如糖(sugar)、聚醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。注射用組合物中含有延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁或明膠，可以實(shí)現(xiàn)延長吸收時(shí)間的效果。
將所需量的活性化合物加入合適的溶劑中，并根據(jù)需要加入一或多種上文列舉的成分，然后過濾除菌，可獲得無菌注射液。一般而言，將活性化合物加入無菌賦形劑(vehicle)中，并在該賦形劑中含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及所需的來自上文所列的其它成分，可以制得分散體。在可制成無菌注射液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是，真空干燥和冷凍干燥，這樣可以從事先過濾除菌的溶液得到活性成分加其它所需成分的粉末。
口服組合物通常含有惰性稀釋劑或可食用的載體。為了進(jìn)行口服治療性用藥，可以將活性化合物摻入賦形劑中，以片劑、錠劑(troche)或膠囊劑例如明膠膠囊的形式來用藥?？诜M合物也可以利用作為漱口水的流體載體來制備?？伤幱媒Y(jié)合劑和/或輔料也可以包括在組合物中。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以包含以下任一種成分或具有相似性質(zhì)的化合物結(jié)合劑(binder)如微晶體纖維素、西黃芪膠(gum tragacanth)或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖、崩解劑(disintegrating agent)如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑(lubricant)如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑(glidant)如膠體二氧化硅；增甜劑(sweetening agent)如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑(flavoring agent)如薄荷(peppermint)、水楊酸甲酯(methyl salicylate)或桔子汁調(diào)味劑(orangeflavoring)。
為通過吸入(inhalation)方式用藥，運(yùn)送的化合物采用氣溶膠形式，所述氣溶膠從壓力容器或含有合適推進(jìn)物(propellant)例如二氧化碳等氣體的布灑器(dispenser)或噴霧器(nebulizer)中噴出。
系統(tǒng)用藥也可以利用經(jīng)粘膜(transmucosal)或經(jīng)皮途徑。經(jīng)粘膜或經(jīng)皮用藥時(shí)，在配制劑中使用適于穿透屏障的穿透劑(penetrant)。這類穿透劑是本領(lǐng)域通常已知的，包括例如經(jīng)粘膜用藥時(shí)的清潔劑(detergent)、膽鹽(bile salt)和梭鏈孢酸(fusidic acid)衍生物。經(jīng)粘膜用藥可以利用鼻噴(nasal spray)或栓劑(suppositories)進(jìn)行。經(jīng)皮用藥時(shí)，將活性化合物配制在本領(lǐng)域已知的軟膏(ointment)、藥膏(salve)、膠(gel)或霜(creams)中。
也可以將所述化合物制成栓劑(例如，用常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂(cocoabutter)及其它甘油酯來制)或保留灌腸劑(retention enemas)以備直腸運(yùn)送。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將活性化合物與保護(hù)該化合物免于從機(jī)體快速清除的載體一起配制，例如控釋配制劑，包括植入體和微囊化運(yùn)送體系?？梢允褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔铮缫蚁┮宜嵋阴?、聚酸酐(polyanhydrides)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)、和聚乳酸。制備這類配制劑的方法是本領(lǐng)域已知的。所述物質(zhì)也可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc購得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的那些脂質(zhì)體)也可以用作可藥用載體。這些可以按照本領(lǐng)域已知的方法制備，例如見美國專利4,522,811。
有利的是，將口服組合物或非胃腸道組合物配制成可以很容易地用藥并且保持藥劑均一性(uniformity of dosage)的劑量單位形式(dosage unitform)。本文中劑量單位形式是指，適合對接受治療的受試者一次用量的物理不連續(xù)單位(physically discrete unit)；每一單位含有預(yù)定量的活性化合物和所需的可藥用載體，該預(yù)定量是經(jīng)過計(jì)算可以產(chǎn)生所需治療效果的量。
這類化合物的毒性和療效可以在細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動(dòng)物中用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測定，例如測定LD50(導(dǎo)致群體中50％死亡的劑量)和ED50(導(dǎo)致群體中50％有療效的劑量)。將毒性比療效的比例作為治療指數(shù)，可表示為LD50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)較高的化合物。具有毒性副作用的化合物也可以使用，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)運(yùn)送體系，將這樣的化合物靶向受累組織，例如骨或軟骨，將對未受累細(xì)胞的潛在危害降至最低，從而減小副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制人用的劑量范圍。這類化合物的劑量(dosage)優(yōu)選在具有ED50且無毒性或毒性很小的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)根據(jù)所用劑型和用藥途徑來變動(dòng)。對于在本發(fā)明方法中使用的任何化合物，其治療有效量可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)來初步估計(jì)。動(dòng)物模型中的用量可以配制為，使循環(huán)血漿濃度達(dá)到包括細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC50的范圍(即受試化合物半數(shù)最大抑制(half-maximalinhibition)癥狀的濃度)。這樣的信息可以用于更精確測定人用有效劑量。血漿水平可以通過例如高效液相色譜來測量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，有一些因素會(huì)影響有效治療病人所需的劑量和耗時(shí)，這樣的因素包括但不限于，接受治療的病人的類型，疾病的嚴(yán)重程度，在先的治療，該病人的總體健康狀況和/或年齡，以及同時(shí)存在的其它疾病。而且，用治療有效量的蛋白、多肽、抗體或其它化合物治療病人，可以包括單一一次治療，或者，優(yōu)選包括一系列治療。
本文所述肽的有效劑量范圍是約0.001-30mg/kg體重，例如約0.01-25mg/kg體重，例如約0.1-20mg/kg體重?？贵w的有效劑量是0.1mg/kg體重(通常為0.1mg/kg-20mg/kg)。通常，部分結(jié)構(gòu)來源于人的抗體(partially humanantibodies)和完全的人抗體(fully human antibodies)在人體內(nèi)比其它抗體具有更長的半衰期。相應(yīng)地，用量較少和用藥次數(shù)較少都是可能的。脂質(zhì)化等修飾可以用于使抗體穩(wěn)定并增強(qiáng)攝入和組織穿透。使抗體脂質(zhì)化的方法可參見Cruikshank et al.((1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes andHuman Retrovirology 14193)。
如果所述化合物是小分子，劑量舉例包括mg或μg小分子/kg受試者或樣品重量(例如，約1μg/kg-約500mg/kg，約100μg/kg-約5mg/kg或約1μg/kg-約50μg/kg。還應(yīng)理解，小分子的合適劑量取決于該小分子調(diào)節(jié)表達(dá)或活性方面的潛力。在將一或多種所述小分子對動(dòng)物(例如人)用藥以調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽或核酸的表達(dá)或活性時(shí)，醫(yī)師、獸醫(yī)或研究人員可以例如先開出相當(dāng)?shù)偷膭┝?，隨后增加劑量，直至產(chǎn)生合適的反應(yīng)。還應(yīng)理解，任何具體動(dòng)物受試者的特定劑量水平取決于多種因素，包括所用的具體化合物的活性，該受試者的年齡、體重、總體健康狀況、性別、以及飲食，用藥耗時(shí)，用藥途徑，排泄速度，任何聯(lián)用藥物，以及表達(dá)或活性需要調(diào)節(jié)的程度。
編碼本文所述多肽的核酸分子可以插入載體中，用作基因治療的載體。基因治療載體可以通過如下方式運(yùn)送至受試者例如，靜脈注射，局部施用(見例如美國專利5,328,470)或三維立體定位注射(stereotactic injection)(見例如Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)?；蛑委熭d體的藥用制劑可以將該基因治療載體包括在可接受的稀釋劑中，或者將基因運(yùn)送載體包埋在慢釋放基質(zhì)中。備選地，可以由重組細(xì)胞制備完整無損的完整基因運(yùn)送載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，此時(shí)，藥用制劑可以包括一或多種能產(chǎn)生該基因運(yùn)送體系的細(xì)胞。
藥物組合物可以與用藥說明一起，容納在容器、包裝(pack)或配藥器(dispenser)中。
治療方法存活蛋白的最顯著特征之一，是其在癌癥組織中的表達(dá)不同于其在正常組織中的表達(dá)。回顧″癌-胎(onco-fetal)″抗原，存活蛋白在胚器官和胎兒器官中強(qiáng)表達(dá)，但在絕大多數(shù)終末分化的正常組織中檢測不到。據(jù)報(bào)道表達(dá)存活蛋白的成年人正常組織包括，胸腺、CD34+骨髓-衍生的干細(xì)胞(低水平)、基底集落上皮(basal colonic epithelium)，但不包括基底角質(zhì)細(xì)胞。而在肺、乳房、結(jié)腸、胃、食管、胰腺、肝、子宮、卵巢和腦部的腫瘤中，已經(jīng)證實(shí)存活蛋白明顯過量表達(dá)。存活蛋白還在與以下疾病有關(guān)的腫瘤組織中過表達(dá)何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、大細(xì)胞非-何杰金淋巴瘤(large cellnon-Hodgkin’s lymphomas)、白血病、脊髓發(fā)育不良綜合癥伴有難治的貧血(myelodysplastic syndrome with refractory anemia)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)、嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma)、軟組織肉瘤、黑素瘤以及非-黑素瘤皮膚癌癥。在針對整個(gè)基因組范圍的搜索中，存活蛋白被鑒定為在結(jié)腸、肺、腦、乳腺的癌癥和黑素瘤中是位居第四的高水平表達(dá)的″轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)″，但該蛋白在相同器官的正常組織中的表達(dá)檢測不到或者可以檢測到但水平很低。見Velculescu，et al.，Nat.Genet.，23，387-388(1999)。
抑制Hsp90與存活蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的候選化合物，例如本文所述肽、肽衍生物、及小分子，可以用于治療失控細(xì)胞增生如癌癥的方法中。所述肽和肽衍生物可以對診斷患有癌癥例如本文所述任一種癌癥的病人給藥。例如，本文所述肽、肽衍生物和小分子可以用于治療肺、乳腺、結(jié)腸、直腸、胃、食管、胰腺、肝、膀胱、子宮、卵巢、頭頸部或腦部腫瘤患者。在另一些例子中，本文所述肽和肽衍生物可以用于治療何杰金氏病、大細(xì)胞非-何杰金淋巴瘤、白血病、脊髓發(fā)育不良綜合癥伴有難治的貧血、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、黑素瘤或非-黑素瘤皮膚癌癥。
實(shí)施例實(shí)施例1存活蛋白與Hsp90相互作用進(jìn)行數(shù)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)存活蛋白與Hsp90之間的蛋白-蛋白相互作用。人宮頸癌HeLa細(xì)胞和B淋巴瘤Raji細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)獲得，按照供應(yīng)商的說明維持在培養(yǎng)基中。為了進(jìn)行Western印跡，將12％十二烷基硫酸鈉(SDS)膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜，用1-5μg第一抗體保溫?？勾婊畹鞍椎耐枚嗫寺】贵w從NOVUS Biologicals(Littleton，CO)獲得；抗Hsp90的單克隆抗體(mAb)從BD-Transduction Laboratories(目錄號(hào)H38220；Lexington，KY)獲得；抗微管蛋白的單克隆抗體從Sigma獲得。第一抗體用辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的第二抗體(Amersham，Piscataway，NJ)和化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham)顯色。
圖1A顯示，存活蛋白與Hsp90和微管蛋白有相互作用。收集1.5×108HeLa細(xì)胞，用經(jīng)過冰冷卻的TrisTM-緩沖鹽水(TBS)洗一次，在2倍體積的裂解緩沖液(TBS pH 7.4，1％TritonTMX-100，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，加另外的蛋白酶抑制物)中4℃裂解1小時(shí)。細(xì)胞裂解物在4℃、15,000g離心30分鐘后澄清，然后上樣至0.5ml SepharoseTM4B(Amersham Pharmacia)，該柱已經(jīng)過溴化氰(CNBr)活化且已與5mg抗存活蛋白多克隆抗體偶聯(lián)。用空樹脂作對照。用裂解緩沖液充分洗柱后，加洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸，pH2.5)，收集0.5ml的級(jí)分，用1M TrisTMpH 8.0中和。樣品在TBS中透析，在12％SDS膠上分離，通過考馬斯亮蘭染色和Western印跡進(jìn)行分析。Western印跡鑒定出90kDa的Hsp90和55kDa的微管蛋白，它們與存活蛋白一起被洗脫下來，見圖1A。
圖1B顯示存活蛋白和Hsp90的免疫共沉淀。將不同步生長(asynchronously growing)的B淋巴瘤Raji細(xì)胞(5×105)裂解，如上述離心使之澄清。將上清和重懸的細(xì)胞團(tuán)(pellet)與存活蛋白(圖中標(biāo)示為存活蛋白)或?qū)φ铡⒎?結(jié)合IgG(圖中標(biāo)示為IgG)抗體(2.5-5μg/ml)在4℃免疫沉淀16小時(shí)。添加50μl 50∶50蛋白A或蛋白G漿液(slurry)，使免疫復(fù)合物沉淀。從細(xì)胞團(tuán)沉淀的免疫復(fù)合物(P)或從上清沉淀的免疫復(fù)合物(S)用抗Hsp90抗體或抗存活蛋白抗體通過Western印跡進(jìn)行分析，見圖1B。
圖1C顯示存活蛋白和Hsp90的體內(nèi)pull-down結(jié)果。收獲不同步生長的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)物，或者收獲經(jīng)過paclitaxel(TaxolTM)(2μM，Sigma)處理而同步在有絲分裂過渡期(synchronized at the mitotic transition)的HeLa細(xì)胞。將細(xì)胞提取物與SepharoseTM(圖中標(biāo)示為“Sepharose”)或存活蛋白-SepharoseTM(圖中標(biāo)示為“存活蛋白”)一起保溫，用Western印跡分析細(xì)胞團(tuán)或上清(25％的反應(yīng))中共結(jié)合的(co-associated)Hsp90。將不同步生長的培養(yǎng)物的樣品標(biāo)示為“None”，將經(jīng)過TaxolTM處理的細(xì)胞的樣品標(biāo)示為Taxol。這些結(jié)果證實(shí)了存活蛋白與Hsp90之間的蛋白-蛋白相互作用。
實(shí)施例2存活蛋白的正確折疊是與Hsp90結(jié)合所要求的重組存活蛋白(r-存活蛋白)(10mg/ml)或重組Hsp90(r-Hsp90)(10μg/ml)用碳酸氫鹽緩沖液pH 9.5(100μl/孔)在塑料微滴板的孔(ImmulonTM-2，Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)中4℃固定18小時(shí)，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。結(jié)合的蛋白用3％明膠37℃封閉1小時(shí)，用洗滌緩沖液(TBS pH 7.4，0.1％TweenTM，0.1％BSA)洗滌，然后與不同濃度的待測蛋白在37℃保溫1小時(shí)，確定是否該待測蛋白與固相蛋白結(jié)合。
GST-Hsp90(氨基酸1-732)、重組GST-存活蛋白、GST-存活蛋白(C84A)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)，并與谷胱甘肽珠(Sigma)結(jié)合。Hsp90α用PCR克隆到pGex-4T3(Amersham Pharmacia Biotech.)中。缺乏GST框的純化的r-存活蛋白通過用凝血酶(Sigma，20U/ml在50mM TrisTMpH 7.4，150mMNaCl，5mM MgCl2，2.5mM CaCl2，1mM DTT中)消化相應(yīng)GST融合蛋白而獲得。將20μg與谷胱甘肽珠結(jié)合的GST或GST融合蛋白(20μl)在結(jié)合緩沖液(10mM TrisTMpH 7.5，10mM EDTA，100mM NaCl，0.1％TritonTM，1mMDTT和多種蛋白酶抑制物)中洗兩次，在含有遞增量(5μg，10μg，20μg，40μg)的r-存活蛋白的100μl結(jié)合緩沖液中，室溫(RT)保溫2.5小時(shí)，然后洗5次。結(jié)合的蛋白以及四分之一未結(jié)合的蛋白在12％SDS膠上分離，用GelCodeBlue Stain Reagent(Pierce)染色。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，含有經(jīng)過封閉的固相r-存活蛋白的孔與r-Hsp90或重組CD11b整聯(lián)蛋白區(qū)(I-區(qū))一起保溫，洗10次，再與抗-Hsp90 mAb(1μg/ml)或?qū)φ辗?免疫IgG(1μg/ml)在37℃保溫1小時(shí)。再洗10次，然后分析第一抗體的結(jié)合添加偶聯(lián)了生物素的兔抗-小鼠IgG，在37℃保溫1小時(shí)，之后添加鏈霉親和素-堿性磷酸酶，用磷酸對硝基苯(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)作為底物，測定OD405的吸光度。圖2A顯示了這些實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果rHsp90以劑量依賴方式與固相r-存活蛋白結(jié)合；而作為對照的I區(qū)不結(jié)合r-存活蛋白。
在另一實(shí)驗(yàn)中，固相r-Hsp90存活蛋白與遞增濃度的r-存活蛋白或重組表達(dá)型存活蛋白Cys84→Ala突變體(存活蛋白(C84A))混合。存活蛋白(C84A)除去了BIR中的鋅配位層(Zinc coordination sphere)，產(chǎn)生不折疊的分子。結(jié)合的蛋白通過ELISA用多克隆抗-存活蛋白檢測，并通過OD405的吸光度定量，方法如上所述。結(jié)果見圖2B，存活蛋白和Hsp90可以彼此結(jié)合，但存活蛋白(C84A)不折疊型突變體不結(jié)合Hsp90。
這些結(jié)果表明，Hsp90以劑量依賴方式結(jié)合存活蛋白，且Hsp90與存活蛋白的結(jié)合不僅僅是對類似于不折疊型蛋白的存活蛋白區(qū)的非特異性伴侶蛋白應(yīng)答。這些結(jié)果還表明，存活蛋白要求有正確的折疊才與Hsp90相互作用。因此，Hsp90-存活蛋白復(fù)合體不參與促進(jìn)存活蛋白的降解，而恰恰相反，參與維持存活蛋白的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3存活蛋白與Hsp90的N末端結(jié)合對于全長Hsp90α(SEQ ID NO21；氨基酸1-732)或三種片段N-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸1-272)，M-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸273-617)，以及C-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸629-732)，將編碼它們的核苷酸序列利用BamHI克隆位點(diǎn)經(jīng)PCR克隆至pGex-4T3(Pharmacia Biotech.)和pFLAG-CMV 6c(Sigma)中。全長Hsp90或各個(gè)Hsp90片段的GST融合體在大腸桿菌中表達(dá)，并與谷胱甘肽珠(Sigma)結(jié)合。缺乏GST框的純化的重組存活蛋白按照實(shí)施例2所述而獲得。
圖3A顯示存活蛋白/Hsp90體外pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果。遞增濃度的r-存活蛋白(30，100和300ng/50μl反應(yīng)物)與SepharoseTM-GST-Hsp90(10μg/50μl反應(yīng)物)或與融合至N-Hsp90，M-Hsp90或C-Hsp90區(qū)的GST一起保溫。將反應(yīng)物離心，使SepharoseTM-GST融合體沉淀。蛋白結(jié)合通過用Western印跡分析沉淀(結(jié)合者)或上清(未結(jié)合者)來確定。圖3A顯示，存活蛋白僅與全長Hsp90或與含有Hsp90的ATP結(jié)合區(qū)的N-Hsp90片段(氨基酸1-272)結(jié)合。
圖3B顯示，存活蛋白與Hsp90的N末端區(qū)在體內(nèi)發(fā)生免疫共沉淀。HeLa細(xì)胞用圖中標(biāo)示的FLAG-Hsp90 N，M或C區(qū)轉(zhuǎn)染，使蛋白與抗FLAGmAb(Sigma，目錄號(hào)F3165，St.Louis，MO)進(jìn)行免疫沉淀，免疫復(fù)合物用抗存活蛋白多克隆抗體或抗FLAG mAb通過Western印跡分析共結(jié)合的存活蛋白。圖3B顯示，僅N-Hsp90片段能與存活蛋白發(fā)生免疫沉淀。
這些結(jié)果表明，存活蛋白與含有ATP酶區(qū)的Hsp90 N-末端結(jié)合。
實(shí)施例4Hsp90與IAP家族其它成員相互作用從HeLa細(xì)胞(TRI ReagentTM，Molecular Research Center Inc.)提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(SuperScriptTMFirst Strand Synthesis System for RT-PCR，Invitrogen)，獲得XIAP和XIAP桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)(BIR)(BIR1，Met 1至Ser 123；BIR2，Arg 124至Pro 260；BIR3，Ser 261至Gln 336)的cDNA，PCR擴(kuò)增，克隆至pcDNA3載體(Invitrogen)中。在有35S標(biāo)記的甲硫氨酸(Amersham)存在的情況下，用TNTTMQuick Coupled Transcription/TranslationSystem(Promega)，對pcDNA3-XIAP和pcDNA3-XIAP BIR區(qū)進(jìn)行體外翻譯，取2，5和8μl反應(yīng)物與10μgGST或上述GST蛋白一起保溫。
圖4A顯示，cIAP1，cIAP2和XIAP都與Hsp90結(jié)合。將Raji細(xì)胞提取物與抗cIAP1，cIAP2，XIAP的抗體或與作為對照的非結(jié)合IgG(IgG)進(jìn)行免疫沉淀(如上述)?？筙IAP，cIAP1和cIAP2的抗體分別從BD-TransductionLaboratories(目錄號(hào)610763)，BD-PharMingen(目錄號(hào)556533，San Diego，CA)以及Santa Cruz Biotechnology(目錄號(hào)sc-7944；Santa Cruz)獲得。免疫復(fù)合物(P)和未結(jié)合的物質(zhì)(S)用抗-Hsp90通過Western印跡進(jìn)行分析(上圖)。圖4A顯示，cIAP1，cIAP2以及XIAP免疫復(fù)合物(P)可以沉淀Hsp90，但對照IgG不可以。各種IAP的可比免疫沉淀(comparable immunoprecipitation)也通過Western印跡證實(shí)。
圖4B顯示Hsp90與各種IAP蛋白的體外相互作用。所述各種IAP蛋白包括，存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2，以及僅含有三個(gè)BIR區(qū)并跨殘基1-292的截短型XIAP(t-XIAP)，在有35S-甲硫氨酸存在的情況下，對這些蛋白進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，在pull-down實(shí)驗(yàn)中與SepharoseTM-GST或SepharoseTM-GST-Hsp90混合，結(jié)合的蛋白通過放射自顯影觀察。
這些結(jié)果表明，Hsp90與(a)cIAP1，(b)cIAP2和(c)XIAP之間存在蛋白-蛋白相互作用。
實(shí)施例5Hsp90控制存活蛋白及其它IAP蛋白的穩(wěn)定性按照實(shí)施例1所述，維持細(xì)胞，并進(jìn)行Western印跡。
圖5A顯示，Hsp90的ATP酶環(huán)的抑制物格爾德霉素(GA)誘導(dǎo)IAP蛋白降解。HeLa細(xì)胞用指定濃度的格爾德霉素(GA)處理24小時(shí)后，通過Western印跡分析IAP水平的變化。用1μM GA處理使存活蛋白，XIAP和cIAP2相對于未處理對照，穩(wěn)定狀態(tài)水平(steady-state level)下降。Hsp90和β-肌動(dòng)蛋白的水平不受GA處理影響。
圖5B顯示有GA存在時(shí)蛋白酶體抑制對存活蛋白穩(wěn)定性的影響。在有或無5μM蛋白酶體抑制物乳胱素存在的情況下，用1μM GA對HeLa細(xì)胞提取物處理30小時(shí)，通過Western印跡分析存活蛋白或β-肌動(dòng)蛋白水平的變化。抗肌動(dòng)蛋白抗體從Sigma獲得。經(jīng)乳胱素和GA處理后，存活蛋白水平等同于或高于未處理的細(xì)胞的水平，表明存活蛋白在GA處理期間發(fā)生了蛋白裂解。在該實(shí)驗(yàn)中，β-激動(dòng)蛋白水平不受處理的影響。
圖5C顯示，在有GA時(shí)的XIAP降解，被蛋白酶體介導(dǎo)，但不被活化的caspases介導(dǎo)。在無(None)或有蛋白酶體抑制物乳胱素或廣譜caspase抑制物ZVAD-fmk的情況下，將HeLa細(xì)胞提取物暴露于指定濃度的GA，然后收集細(xì)胞提取物。XIAP表達(dá)因有GA造成的Hsp90抑制而丟失，這種丟失被乳胱素逆轉(zhuǎn)，但不被ZVAD-fmk逆轉(zhuǎn)，可參見圖5C所示XIAP的Western印跡(*表示非特異性泳帶)。
這些結(jié)果表明，Hsp90功能是存活蛋白，cIAP1，cIAP2和XIAP的穩(wěn)定表達(dá)所要求的。因此，有可能本文所述肽/抗體/化合物的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)被它們阻止存活蛋白，cIAP1，cIAP2，和/或XIAP與Hsp90相互作用的能力介導(dǎo)，至少是部分介導(dǎo)，從而降低這些抗-凋亡蛋白的穩(wěn)定性和表達(dá)。
實(shí)施例6鑒定XIAP的Hsp90結(jié)合位點(diǎn)pcDNA3-XIAP和pcDNA3-XIAP BIR區(qū)如實(shí)施例4所述進(jìn)行體外翻譯。圖6顯示Hsp90和分離的XIAP BIR片段之間的體外相互作用，顯示了與BIR氨基-末端(BIR1)的選擇性結(jié)合。GST-Hsp90或GST與35S體外翻譯的XIAP或其單個(gè)的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)BIR1，BIR2和BIR3混合。將反應(yīng)物離心，與細(xì)胞團(tuán)結(jié)合的蛋白通過放射自顯影檢測。圖6顯示，僅有全長XIAP和分離的BIR1片段與GST-Hsp90結(jié)合。
這些結(jié)果鑒定出，BIR1含有XIAP的Hsp90結(jié)合區(qū)。XIAP的氨基酸Met1至Ser123的序列(含BIR1)是MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGS (SEQ ID NO27)實(shí)施例7鑒定存活蛋白(K79-K90)的Hsp90結(jié)合位點(diǎn)圖7顯示，鑒定了抑制存活蛋白與Hsp90相互作用的存活蛋白序列的合成肽。ELISA實(shí)驗(yàn)基本如實(shí)施例2所述，有以下變動(dòng)20μg/ml每種重組存活蛋白肽(表達(dá)在大腸桿菌中)與2.5mg/ml Hsp90在4℃預(yù)保溫16小時(shí)。使全長存活蛋白結(jié)合微滴板的孔并進(jìn)行封閉，之后將Hsp90和存活蛋白肽的預(yù)保溫混合物添加到這些孔中，37℃保溫1小時(shí)。洗孔后，孔用第一抗體保溫，再次洗滌后，如上述定量結(jié)合的抗體。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，示出標(biāo)準(zhǔn)偏差。具有12個(gè)氨基酸的存活蛋白肽包括賴氨酸79-賴氨酸90(K79-K90；SEQ ID NO3)對于Hsp90-存活蛋白結(jié)合相互作用是特別有效的抑制物。
這些結(jié)果與將Hsp90結(jié)合位點(diǎn)分配在存活蛋白的K79-K90區(qū)中的結(jié)果一致，可作為抑制Hsp90-存活蛋白相互作用的化合物的篩選方法的一個(gè)工作實(shí)施例。
實(shí)施例8鑒定存活蛋白-Hsp90相互作用的抗體拮抗劑小鼠抗-存活蛋白單克隆抗體(mAb)8E2和58從NOVUS Biologicals(Littleton，CO)獲得。圖8A顯示，在競爭實(shí)驗(yàn)中，mAb 8E2抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，mAb 58無此抑制作用。將R-存活蛋白(300ng)與3mg小鼠抗存活蛋白單克隆抗體mAb 58或8E2在50ml結(jié)合緩沖液中22℃預(yù)保溫1小時(shí)。然后，在該緩沖液中添加5mg GST-Hsp90或GST-N-Hsp90，將GST離心，通過存活蛋白的Western印跡檢測與Hsp90結(jié)合的蛋白。單克隆抗體8E2減少了被任一種GST融合蛋白沉淀的存活蛋白的量。
圖8B顯示，向細(xì)胞內(nèi)添加mAb 8E2，可以體內(nèi)置換(in vivo displacement)存活蛋白-Hsp90相互作用，使存活蛋白表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，在有BuoPORTERTM蛋白轉(zhuǎn)染試劑(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)存在的情況下，向HeLa細(xì)胞(2×105)中添加5μg抗存活蛋白mAb 8E2或58或小鼠IgG在OptiMEMTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的溶液。4小時(shí)后，向細(xì)胞中添加100μg/ml環(huán)己酰亞胺，用Western印跡分析90分鐘內(nèi)(第0，30，60和90分鐘時(shí))的存活蛋白表達(dá)(圖8B，上圖)?？贵w上樣的效率(90％)用FITC-偶聯(lián)IgG(5μg)和熒光顯微鏡檢測定。將蛋白量參照β-肌動(dòng)蛋白水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并定量(圖8B，下圖)。圖8B顯示，mAb 8E2介導(dǎo)對Hsp 90-存活蛋白相互作用的破壞，這抑制了存活蛋白表達(dá)/穩(wěn)定性。
這些結(jié)果表明，mAb 8E2抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此降低存活蛋白表達(dá)。
實(shí)施例9抗體對存活蛋白-Hsp90相互作用的破壞在體內(nèi)導(dǎo)致誘導(dǎo)凋亡和有絲分裂缺陷圖9A顯示，mAb 8E2誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志物caspase-9的裂解。這些實(shí)驗(yàn)使用了YUSAC-2黑素瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系已經(jīng)被適應(yīng)于野生型存活蛋白表達(dá)的系統(tǒng)(Tet-Off system)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。存活蛋白的適應(yīng)表達(dá)(Conditionalexpression)通過從培養(yǎng)基中除去四環(huán)素來誘導(dǎo)，見Grossman et al.(2001)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，98635。用BioPORTERTM蛋白轉(zhuǎn)染系統(tǒng)向YUSAC-2細(xì)胞內(nèi)添加mAb 8E2或IgG(見實(shí)施例8)，在無四環(huán)素(Tet-)或有四環(huán)素(Tet+)的情況下，添加caspase底物，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的caspase-3/7活性。該實(shí)驗(yàn)受兩個(gè)參數(shù)影響caspase水解熒光性caspase底物的活性(X-軸)以及經(jīng)碘化丙錠染色觀察到的非通透細(xì)胞中漿膜完整性的丟失。見Kim et al.，(2003) Lancet，362205。數(shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.。插圖顯示caspase-9在抗存活蛋白mAb 8E2或58轉(zhuǎn)導(dǎo)的HeL細(xì)胞中的蛋白裂解加工。圖中指示了Western印跡觀察到的caspase-9原型或裂解型的位置。這些數(shù)據(jù)表明，mAb 8E2誘導(dǎo)caspase 9裂解。
圖9B顯示，將mAb 8E2添加到HeLa細(xì)胞中引起有絲分裂缺陷，可通過熒光顯微鏡檢觀察。在HeLa細(xì)胞中添加抗存活蛋白mAb 8E2或58或IgG(陰性對照)，將這些細(xì)胞用抗β-微管蛋白抗體染色，通過熒光顯微鏡檢進(jìn)行分析。圖9B中箭頭指明經(jīng)mAb 8E2-轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的多核細(xì)胞，與這些細(xì)胞中凋亡介導(dǎo)性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)一致。
圖9C概括了添加mAb 8E2，mAb 58或IgG的細(xì)胞中的有絲分裂缺陷。有絲分裂指數(shù)量化了處于有絲分裂期間的細(xì)胞的百分比，通過在放大400x的至少5個(gè)視野(平均有100個(gè)細(xì)胞/視野)中，計(jì)數(shù)有絲分裂的HeLa細(xì)胞的數(shù)量來計(jì)算。數(shù)據(jù)為四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。添加了mAb 8E2的HeLa細(xì)胞有明顯不同的有絲分裂指數(shù)和多核表現(xiàn)，都指示凋亡誘導(dǎo)作用。
這些結(jié)果表明，抗體可以用于破壞存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例10存活蛋白肽序列79-90及相關(guān)序列與Hsp90的相互作用圖10A顯示在存活蛋白肽柱上通過親和層析分離Hsp90/Hsp70復(fù)合體。將含有Hsp90結(jié)合位點(diǎn)的存活蛋白Ile74-Leu87肽(SEQ ID NO4)固定在SulfolinkTMCoupling Gel(Pierce，Rockport，IL)上，用于分級(jí)分離Raji細(xì)胞提取物。用圖中指明的抗體通過Western印跡鑒定出流過物(flow through，F(xiàn)T)或洗脫物(eluate，E)中的蛋白。Hsp90和Hsp70明顯結(jié)合含有Ile74-Leu87殘基的存活蛋白肽?？?Hsp70抗體從Abcam，Cambridge，MA獲得(目錄號(hào)ab6535)。
圖10B顯示含有Hsp90結(jié)合位點(diǎn)的存活蛋白肽序列與Hsp90的物理結(jié)合，通過質(zhì)子共振測定。合成野生型存活蛋白肽77-91(SEQ ID NO22)或相應(yīng)的C84A突變體77-91肽(HKKHSSGAAFLSVKK；SEQ ID NO23)，其帶有N-末端生物素，將它們固定在經(jīng)過鏈霉親和素包被的芯片(chip，SA5)上，這些芯片購自Biacore Inc.(Piscataway，NJ)。然后，將60ml懸浮在10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％polysorbate-20，1mM DTT中的遞增濃度的(100nM-10μM)純化r-Hsp90注射到上述固相肽表面。維持恒定流速20ml/min，之后維持解離相300秒。每次解離相之后，用10ml 1MNaCl/50mM NaOH使表面再生。再生僅10分鐘后，開始新一輪注射，以確保徹底除去NaCl和NaOH。收集的數(shù)據(jù)用Biacore Inc.的Biaeval 3.0軟件包分析。
傳感圖(圖10B)顯示存活蛋白肽與Hsp90的結(jié)合，是通過測量分析物流過芯片表面期間表面質(zhì)子共振的增加、扣除僅有生物素的表面所發(fā)出的非特異性信號(hào)而測定的。野生型(SEQ ID NO22)或C84A(SEQ ID NO23)肽的結(jié)合速率(on-rate)相似，但野生型肽的解離速率(off-rate)低10倍，導(dǎo)致較高結(jié)合親和力(KD±SEM＝8.38×10-8±3.5×10-9M)。
圖10C顯示經(jīng)誘變的存活蛋白肽的功能分析，用于鑒定存活蛋白-Hsp90相互作用所必需的氨基酸(His 80-Cys 84；SEQ ID NO2)。合成指定的來自存活蛋白核心序列Ile79-Leu87(SEQ ID NO24)的合成肽，它們在每一指定位置有單個(gè)丙氨酸取代(丙氨酸掃描誘變)。將這些肽按照指定的遞增濃度分別固定在塑料微滴板上，與重組Hsp90一起保溫，用抗Hsp90抗體通過ELISA測定與多種底物的結(jié)合，通過OD405的吸光度來定量。數(shù)據(jù)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±S.D.，它們證實(shí)，存活蛋白核心序列的氨基末端氨基酸His 80，Ser 81，Ser 82，Gly 83和Cys 84對于Hsp90結(jié)合很重要。相反，未發(fā)現(xiàn)野生型肽序列與該序列側(cè)翼殘基Lys 79，Ala 85，Phe 86和Leu 87被丙氨酸取代后的序列有差異。
這些結(jié)果表明本文公開的肽與Hsp90結(jié)合，并鑒定了該結(jié)合所必需的氨基酸殘基。
實(shí)施例11基于存活蛋白K79-L87中的Hsp90結(jié)合位點(diǎn)開發(fā)細(xì)胞通透肽為了對caspase-依賴性細(xì)胞死亡和漿膜完整性的丟失進(jìn)行多參數(shù)分析，在HeLa，MCF-7或經(jīng)遺傳改造的HCT116細(xì)胞(從ATCC獲得)中添加遞增濃度的細(xì)胞通透型對照倒序肽或存活蛋白肽，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞活力(碘化丙錠，紅道(red channel))以及活性caspase-3的活性(CaspaTagTM，Intergen，Purchase，NY，綠道(green channel))。
將觸角足載體序列的第三個(gè)α-螺旋與含有Hsp90結(jié)合位點(diǎn)的存活蛋白肽序列K79-L87的氨基末端融合，合成出細(xì)胞通透肽(存活蛋白細(xì)胞通透肽)，產(chǎn)生P31存活蛋白肽(SEQ ID NO19；圖21)。另外合成對照肽(RQIKIWFQNRRMKWKKSKLACFSHG；SEQ ID NO25)，其中觸角足通透肽(RQKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO29)與倒序的存活蛋白K79-L87序列(對照)融合。合成的對照肽和存活蛋白肽都有氨基末端生物素部分，并且都通過HPLC分析純度和均一性。將這些肽以150μM終濃度與亞匯合(subconfluent)的HeLa細(xì)胞在37℃保溫6小時(shí)。收獲細(xì)胞，用鏈霉親和素-PE染色，通過相差顯微鏡檢(圖中標(biāo)示為相差)或熒光顯微鏡檢進(jìn)行分析。圖11A顯示存活蛋白肽(SEQ ID NO19)和倒序?qū)φ针?SEQ ID NO25)兩者的有效內(nèi)化。
圖11B通過分析各個(gè)細(xì)胞的熒光，量化了圖11A的觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件基本同圖11A，區(qū)別是，通過熒光顯微鏡檢分析25個(gè)細(xì)胞中對照肽或存活蛋白肽向胞內(nèi)穿透的情況。通過寬視野熒光顯微鏡檢(Olympus，JAPAN)，用63X物鏡從6個(gè)隨機(jī)視野中獲得13個(gè)光學(xué)區(qū)域(optical sections，333±50nm)。測量每個(gè)細(xì)胞時(shí)，獲得細(xì)胞輪廓外側(cè)區(qū)域的熒光值，將其作為本底從總測量值中扣除(通常為細(xì)胞熒光總測量值的5-10％)。在每一全細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖(full cell profile)中或者在整個(gè)群體內(nèi)，用MetamorphTM軟件(MolecularDevices Corporation，Sunnyvale，CA)或IP Lab軟件(3.5.4版，Scanalytics，F(xiàn)airfax，VA)計(jì)算每一光學(xué)區(qū)域的熒光強(qiáng)度(整合光學(xué)強(qiáng)度，IOD)。結(jié)果表明，對照肽和存活蛋白細(xì)胞通透肽變體都積累在靶細(xì)胞內(nèi)側(cè)，它們的穿透效率沒有差別。
這些結(jié)果表明，合成了新的存活蛋白細(xì)胞通透肽衍生物。
實(shí)施例12存活蛋白細(xì)胞通透肽有兩個(gè)Hsp90結(jié)合位點(diǎn)可在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡為通過亞二倍體DNA含量確定凋亡，將不同腫瘤細(xì)胞系與濃度遞增的細(xì)胞通透性倒序?qū)φ针?SEQ ID NO25)或存活蛋白肽(SEQ ID NO19)一起保溫，24小時(shí)后收獲(包括懸浮物和貼壁細(xì)胞)，在70％乙醇中固定，用10μg/ml碘化丙錠加100μg/ml RNA酶A和0.05％TritonTMX-100的PBS液，pH7.4染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)物中的DNA含量。為了通過比色定量細(xì)胞活力，使用了MTT實(shí)驗(yàn)。將不同腫瘤細(xì)胞系與濃度遞增的細(xì)胞通透性反構(gòu)型-反排列對照倒序肽P4或存活蛋白-特異性P3肽一起在37℃保溫24小時(shí)，用Bruffs培養(yǎng)基洗2次，加入5mg/ml MTT((4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，Sigma，St.Louis，MO)。通過在OD405處的比色吸光度的損失來分析細(xì)胞活力的降低。
圖12A顯示，存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQ ID NO19)在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，這可通過亞二倍體DNA含量測出。將HeLa細(xì)胞與圖中所示遞增濃度的細(xì)胞通透對照肽(倒序)或存活蛋白肽一起，在37℃保溫24小時(shí)，收獲細(xì)胞，通過碘化丙錠染色和流式細(xì)胞術(shù)測定亞二倍體DNA含量，以便進(jìn)行分析。將HeLa細(xì)胞暴露于存活蛋白細(xì)胞通透肽，導(dǎo)致細(xì)胞活力大大降低，表現(xiàn)為亞二倍體DNA含量增加。
圖12B顯示存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQ ID NO19)與現(xiàn)有化療藥的比較。將HeLa細(xì)胞與化療藥TaxolTM(10μM)、或阿霉素(adriamycin，300nM)、或細(xì)胞通透對照肽或存活蛋白肽一起保溫，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)測量亞二倍體DNA含量，以此分析凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。用圖中所示濃度的兩種化療藥處理，并沒有導(dǎo)致細(xì)胞活力大幅下降。相反，存活蛋白細(xì)胞通透肽而不是對照肽穿透到細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致出現(xiàn)一大群含有亞二倍體DNA的細(xì)胞(凋亡的細(xì)胞)。
這些結(jié)果表明，本文所述細(xì)胞通透肽衍生物在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例13存活蛋白細(xì)胞通透肽序列在宮頸癌HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)Caspase-依賴型凋亡圖13顯示，HeLa細(xì)胞(帶有無功能的p53)與圖中所示遞增濃度的對照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQ ID NO19)一起保溫后，對caspase活性的誘導(dǎo)。在與上述肽保溫24小時(shí)后收獲細(xì)胞，通過DEVD酶活性分析caspase活性(X-軸，綠色熒光)并同時(shí)通過碘化丙錠染色分析細(xì)胞膜完整性(Y-軸，紅色熒光)。右上四分之一象限中的細(xì)胞對應(yīng)的是caspase活性升高、細(xì)胞膜完整性丟失的群體(凋亡群體)。
這些結(jié)果通過其它方式(means)表明，本文所述肽衍生物在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例14存活蛋白細(xì)胞通透肽在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)Caspase-依賴型凋亡按照實(shí)施例13所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同的是，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞(野生型p53)中添加細(xì)胞通透對照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQID NO19)，之后通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞中caspase活性的誘導(dǎo)和細(xì)胞膜完整性的丟失。結(jié)果見圖14，表明存活蛋白細(xì)胞通透肽在不同類型腫瘤細(xì)胞(HeLa和MCF-7)中以可比的效率(comparable effiefficiency)和類似的機(jī)制(caspase-依賴型)誘導(dǎo)凋亡。
這些結(jié)果通過其它方式表明，本文所述肽衍生物在不止一種類型的癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例15存活蛋白細(xì)胞通透肽在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡與p53無關(guān)在這些實(shí)驗(yàn)中，將帶有野生型p53(p53+/+)或純合失活的p53(p53-/-)的HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞(Bunz et al.，Science，2821497-1501(1998)))與150mM細(xì)胞通透對照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQ ID NO19)一起保溫，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞中caspase活性的誘導(dǎo)和細(xì)胞膜完整性的丟失。結(jié)果見圖15，其表明，因存活蛋白細(xì)胞通透肽所致高caspase活性且丟失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞數(shù)在p53+/+和p53-/-HCT116細(xì)胞組中沒有區(qū)別。這證明，p53不參與介導(dǎo)不同類型腫瘤細(xì)胞中由存活蛋白細(xì)胞通透肽誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。
這些結(jié)果通過其它方式表明，本文所述肽衍生物在不止一種類型的癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，并且這種凋亡與p53無關(guān)。
實(shí)施例16存活蛋白細(xì)胞通透肽穿透到細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致抑制Hsp90功能、降解Hsp90客戶蛋白并激活Caspase活性為確定在胞內(nèi)添加存活蛋白細(xì)胞通透肽，是否可以重復(fù)出破壞存活蛋白-Hsp90相互作用的mAb 8E2在體內(nèi)使存活蛋白水平變得不穩(wěn)定的效應(yīng)(圖8)，在HeLa細(xì)胞中添加圖中所示遞增濃度的細(xì)胞通透對照肽(SEQ IDNO25)或存活蛋白細(xì)胞通透肽(SEQ ID NO19)，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，分析Hsp90客戶蛋白即存活蛋白和Akt的穩(wěn)定性。抗Akt多克隆抗體從CellSignaling Technology獲得(目錄號(hào)9272)。
圖16的Western印跡結(jié)果表明，存活蛋白細(xì)胞通透肽導(dǎo)致低水平的存活蛋白和Akt，對照倒序肽沒有這種效果。此外，存活蛋白細(xì)胞通透肽導(dǎo)致32kD的caspase-3原型的表達(dá)下降，說明有caspase的蛋白裂解激活并伴有caspase-依賴型細(xì)胞死亡。在細(xì)胞通透對照倒序肽的情況中，未觀察到caspase-3原型表達(dá)的改變。用β-肌動(dòng)蛋白使加樣量標(biāo)準(zhǔn)化。
這些結(jié)果表明，本文所述肽衍生物抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此在癌細(xì)胞中減少存活蛋白的表達(dá)和引起caspase-依賴型凋亡。
實(shí)施例17制備并鑒定活性存活蛋白肽序列K79-L87的肽模擬物變體為了增加細(xì)胞通透性存活蛋白K79-L87序列的體內(nèi)穩(wěn)定性，我們合成了一些肽模擬物變體，其中細(xì)胞通透性觸角足序列和存活蛋白活性序列K79-L87的合成使用了D-氨基酸(反構(gòu)型序列)以及反向排列(反排列序列)。將對照倒序肽和存活蛋白肽序列都合成為反構(gòu)型-反排列變體，并稱為P3(存活蛋白；KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK-CONH2)和P4(對照倒序肽；KKWKMRRNQFWVIWQRGHSFCALKS-CONH2)肽(見圖21)。為測試這些反構(gòu)型-反排列的細(xì)胞通透序列在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力，將一組腫瘤細(xì)胞系與圖中所示遞增濃度的P3(存活蛋白)或P4(對照)反構(gòu)型-反排列細(xì)胞通透肽一起保溫，然后用MTT試驗(yàn)分析細(xì)胞活力。圖17的結(jié)果顯示，P3序列在所測試的所有腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)了劑量-依賴性細(xì)胞活力下降(HeLa宮頸癌；MDA-MB231(Calvo et al.，Br.J.Cancer，48683-8(1983))乳腺癌；MCF-7乳腺癌；PANC-1(從ATCC獲得)胰腺癌)。P3活性與p53狀態(tài)無關(guān)。相反，在相同遞增濃度的細(xì)胞通透反構(gòu)型-反排列P4對照肽的情況下，在所測試的任一類型的細(xì)胞中都沒有觀察到細(xì)胞活力的降低。
這些結(jié)果表明，本文所述反構(gòu)型-反排列肽衍生物在多種不同類型的癌細(xì)胞中引起凋亡。
實(shí)施例18存活蛋白K79-L87序列的肽模擬物變體(P3)具有對抗較寬范圍內(nèi)多種類型腫瘤細(xì)胞的特異性抗-腫瘤活性但不影響正常細(xì)胞的活力為研究實(shí)施例17所述反構(gòu)型-反排列序列P3和P4的特異性，我們將多種腫瘤細(xì)系與細(xì)胞通透反構(gòu)型-反排列肽P3和P4(150μM)一起保溫，24小時(shí)后，用臺(tái)盼蘭(trypan blue，Sigma)排除法對培養(yǎng)物進(jìn)行染色。那些不能將蘭色染料排除在細(xì)胞外的細(xì)胞就是喪失細(xì)胞活力和漿膜完整性的細(xì)胞。
圖18的結(jié)果證實(shí)，在大多數(shù)所測試的腫瘤細(xì)胞中，P3反構(gòu)型-反排列存活蛋白肽的穿透使細(xì)胞活力迅速丟失HCT116結(jié)直腸癌，HeLa宮頸癌，MCF-7乳腺癌，PANC-1胰腺癌，PC3前列腺癌。另一方面，用反構(gòu)型-反排列對照肽P4進(jìn)行類似的保溫反應(yīng)(comparable incubation reactions)，結(jié)果并未使腫瘤細(xì)胞活力下降。而且，無論是存活蛋白P3還是對照肽P4，都未導(dǎo)致正常肺成纖維細(xì)胞LU18的活力下降，說明P4的促凋亡活性具有腫瘤細(xì)胞特異性。
這些結(jié)果表明，本文所述反構(gòu)型-反排列肽衍生物的廣譜抗-凋亡活性特異于癌細(xì)胞，不影響非癌細(xì)胞。這些結(jié)果支持了本文所述肽衍生物可以用在治療方法中治療癌癥患者的觀點(diǎn)。
實(shí)施例19P3肽體外抑制腫瘤發(fā)生，通過不依賴貼壁的細(xì)胞生長和存活來測量為了在軟瓊脂上形成集落，將2×104個(gè)經(jīng)過適應(yīng)(adapted)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞懸浮在36mm組織培養(yǎng)板中的1.5ml DMEM中，該DMEM中添加了10％FBS和0.35％bactoagar(Becton Dickinson，Sparks，MD)，該組織培養(yǎng)板底層為1.5ml 0.75％瓊脂-生長培養(yǎng)基。將這些板在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中保溫2-5周。生成的集落用0.005％結(jié)晶紫(Sigma)染色，并用立體顯微鏡(dissecting microscope)在高倍視野下計(jì)數(shù)。
圖19顯示，生長培養(yǎng)基中有75或150μm存活蛋白P31肽(SEQ IDNO19)可徹底抑制癌細(xì)胞的不依賴貼壁細(xì)胞生長和存活(相對于等量對照倒序肽(SEQ ID NO25))。圖19中上一排的兩個(gè)平板沒有肉眼可見的細(xì)胞集落。
這些結(jié)果表明，含有存活蛋白Hsp90-結(jié)合基序的存活蛋白肽是腫瘤細(xì)胞體外增殖的高效抑制物。
實(shí)施例20反構(gòu)型-反排列P3存活蛋白肽的體內(nèi)抗-腫瘤活性將MCF-7細(xì)胞注射到免疫受損動(dòng)物的肋腹(flank)，建立乳腺癌異種移植模型。對8周齡雌性CB17 SCID/米色鼠(beige mice)(Taconic Farms，Germantown，NY)肋腹皮下注射2.5×106個(gè)指數(shù)生長的腫瘤適應(yīng)MCF-7細(xì)胞在200μl無菌PBS，pH 7.4中的溶液。腫瘤生長用測徑器在兩維方向上(in thetwo dimensions)測量，將腫瘤假定為球體，用公式寬2×長/2計(jì)算腫瘤體積。在4個(gè)月的觀察期內(nèi)，腫瘤被限制在局部，未影響動(dòng)物存活。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到～50mm3時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分組(每組7或8只動(dòng)物)，給予鹽水(每日一次，200μl)或反構(gòu)型-反排列P3存活蛋白-衍生的肽模擬物(50mg/kg/i.p./日)。處理3周后將動(dòng)物處死。鹽水或P3肽處理組的動(dòng)物的腫瘤體積每日用測徑器測量，處理21日后處死動(dòng)物。圖20的數(shù)據(jù)顯示，在處理期內(nèi)，P3肽比鹽水更有效減緩腫瘤體積增長的速率。
在第二個(gè)模型中，將事先經(jīng)過體內(nèi)適應(yīng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞注射到SCID/米色鼠中。注入的細(xì)胞產(chǎn)生快速指數(shù)生長的腫瘤，其不依賴雌激素的補(bǔ)加，也不受鹽水給藥的影響(圖28)。在為期23日(圖28)或11日的處理期間，給予反構(gòu)型-反排列P3存活蛋白-衍生的肽模擬物(50mg/kg/ip./日)抑制了這些更具侵襲性(more aggressive)的腫瘤的生長。
在處理結(jié)束時(shí)回收MCF-7腫瘤，通過免疫組織化學(xué)分析Hsp90客戶蛋白的表達(dá)(Ambrosini et al.，Nat.Med.，39177-21(1997)；Basso et al.，Oncogene，211159-66(2002))。鹽水處理組的腫瘤細(xì)胞群體中有廣泛的存活蛋白和Akt標(biāo)記。相反，存活蛋白肽處理組的腫瘤細(xì)胞中，Akt水平幾乎徹底消失，存活蛋白的表達(dá)也大大減少。
這些結(jié)果表明，存活蛋白肽和含有存活蛋白Hsp90結(jié)合基序的肽衍生物是腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖的有效抑制物。
實(shí)施例21存活蛋白肽誘導(dǎo)的凋亡是腫瘤細(xì)胞特異性的圖22A和22B比較了P31(SEQ ID NO19)或P33(SEQ ID NO25)對腫瘤細(xì)胞系(圖22A)和正常細(xì)胞系(圖22B)的凋亡的影響。腫瘤細(xì)胞系DU145(前列腺癌，圓形)、PC3(前列腺癌，三角)或HeLa(宮頸癌，方塊)用圖中所示遞增濃度的P31肽(實(shí)心)或?qū)φ誔33肽(空心)處理，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，用MTT比色試驗(yàn)分析細(xì)胞活力。正常細(xì)胞(右圖)HFF(人包皮成纖維細(xì)胞，方塊)，HGF(人成纖維細(xì)胞，三角)或WS-1(人表皮細(xì)胞，圓形)用P31肽(實(shí)心)或P33對照倒序肽處理，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，用MTT比色試驗(yàn)分析總體細(xì)胞活力。所有細(xì)胞系從ATCC獲得。結(jié)果見圖22A和22B，證實(shí)，P31肽在所有三種癌細(xì)胞系中有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但在所有三種正常細(xì)胞中都未誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。對照P33肽在癌細(xì)胞或正常細(xì)胞中都未誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
實(shí)施例22P31-介導(dǎo)的凋亡是劑量依賴型的圖23顯示，用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記和碘化丙錠染色得知，P31肽(SEQ ID NO19)在HeLa細(xì)胞中以劑量依賴方式誘導(dǎo)凋亡。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物用圖中所示遞增濃度的P31(存活蛋白)或P33(對照；SEQ IDNO25)肽處理，37℃保溫8小時(shí)后收獲細(xì)胞，通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記(X-軸，為凋亡標(biāo)記物)和碘化丙錠染色(Y-軸，為細(xì)胞死亡標(biāo)記物)。結(jié)果表明，P31肽以劑量依賴方式誘導(dǎo)凋亡，而P33對照肽無此效果。
實(shí)施例23P31肽特異性結(jié)合Hsp90的氨基端圖24A和24B鑒定了P31肽上結(jié)合Hsp90 N末端區(qū)的位置。Hsp90 N-端或C-端重組片段按照實(shí)施例3所述來制備。ELISA實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2所述進(jìn)行，區(qū)別是，將圖中所示遞增濃度的P31肽(方塊；SEQ ID NO19)或?qū)φ誔33肽(圓形；SEQ ID NO25)固定在塑料微滴板中，與圖中所示Hsp90 N-端片段和C-端片段一起保溫。洗板后，不同Hsp90片段分別與固相肽的結(jié)合用抗Hsp90抗體檢測?？笻sp90 N-端片段和C-端片段的抗體分別從BD/Transduction Laboratories和Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)獲得。結(jié)果見圖24A和24B，表明P31肽特異性結(jié)合Hsp90 N端，表現(xiàn)為OD405比P33肽增加。
實(shí)施例24存活蛋白肽的分子建模存活蛋白反構(gòu)型-反排列肽LFACGSSHK(全部為D氨基酸)的結(jié)構(gòu)用長時(shí)間標(biāo)度分子動(dòng)力學(xué)(long time scale Molecular Dynamics，MD)模擬在明顯(explicit)水溶劑中建模。肽模擬物表現(xiàn)出顯性構(gòu)型，在G83-S84有一個(gè)轉(zhuǎn)角，總體上為β-發(fā)卡幾何形狀(圖25A)。在MD模擬中，肽模擬物?？吭贖sp90的ATP結(jié)合位點(diǎn)中(圖25B)。該復(fù)合體的幾何形狀與Hsp90-GA復(fù)合體的高度相關(guān)，其中的轉(zhuǎn)角區(qū)與GA的袢環(huán)骨架(ansa ring backbone)非常相似(Stebbins et al.，Cell，89239-50(1997))。存活蛋白肽模擬物與Hsp90形成18個(gè)預(yù)測的氫鍵，涉及H86、S85、S84的側(cè)鏈，G83的羰基，以及K87和C82的側(cè)鏈。
實(shí)施例25用存活蛋白K79-L87肽處理PC3前列腺癌細(xì)胞導(dǎo)致Hsp90客戶蛋白丟失存活蛋白影響Hsp90客戶蛋白在腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定性和功能。PC3細(xì)胞不經(jīng)處理，或暴露于75和150μM存活蛋白肽(SEQ ID NO19)(或?qū)φ盏剐螂?；SEQ ID NO25)維持8小時(shí)，經(jīng)處理后，進(jìn)行針對Hsp90客戶蛋白存活蛋白，AKT和CDK-6的免疫印跡。Western印跡顯示，存活蛋白細(xì)胞通透肽，而不是倒序肽，引起多個(gè)Hsp90客戶蛋白在PC3細(xì)胞中消失，包括存活蛋白、Akt、CDK-4和CDK-6(圖26A)。而Hsp90、Hsp70和PCNA水平不受影響(圖26A)。
另外還測試了經(jīng)存活蛋白肽處理的PC3細(xì)胞的端粒酶活性，該活性需要Hsp90(Holt et al.，Genes Dev.，13817-26(1999))。細(xì)胞如上述進(jìn)行處理，用抗Hsp90抗體進(jìn)行免疫沉淀，通過對免疫沉淀物進(jìn)行TRAP試驗(yàn)來測定端粒酶活性(Kim and Wu，Nucleic Acids Res.，252595-7(1997))。端粒酶活性通過端粒產(chǎn)物梯來指示。如圖26B所示，在該試驗(yàn)中，在免疫沉淀之前用存活蛋白肽進(jìn)行處理，消除了端粒酶活性。
這些結(jié)果表明，存活蛋白肽影響Hsp90客戶蛋白在腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定性和功能。
實(shí)施例26體內(nèi)抑制腫瘤生長將前列腺癌PC3細(xì)胞(2.5×106)注射到免疫受損SCID/米色鼠肋腹，使其形成可觸知的腫瘤(35-50mm3)。將動(dòng)物隨機(jī)分成兩組(6只動(dòng)物/組)，接受鹽水或細(xì)胞通透反構(gòu)型-反排列存活蛋白K79-L87肽P3(50mg/kg/日/i.p.)。用測徑器以12日的處理間隔時(shí)間測量腫瘤生長。在該系統(tǒng)中，所述存活蛋白肽模擬物大大降低腫瘤生長速率(圖25A)。
為確定存活蛋白肽模擬物是否在細(xì)胞內(nèi)積累，對肋腹攜帶PC3腫瘤的動(dòng)物腹腔注射鹽水或細(xì)胞通透反構(gòu)型-反排列K79-L87存活蛋白肽P3。1小時(shí)后，處死動(dòng)物，小心取出腫瘤，通過熒光顯微鏡檢分析腫瘤實(shí)質(zhì)中的肽積累。腫瘤細(xì)胞顯示胞內(nèi)熒光，說明這些細(xì)胞攝入并積累存活蛋白肽模擬物(圖25B)。
實(shí)施例27AML細(xì)胞系中的存活蛋白活性分析存活蛋白-Hsp90通路在急性粒細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞系中的表達(dá)和功能。Western印跡顯示，存活蛋白在四種AML細(xì)胞系U937、K-562、THP-1和HL-60中大量表達(dá)(圖29A)。細(xì)胞通透存活蛋白P31肽(SEQ IDNO19)處理導(dǎo)致HL-60細(xì)胞的劑量依賴性完全細(xì)胞殺傷(通過臺(tái)盼蘭排除法測出)，倒序P33肽(SEQ ID NO25)無此效果(圖29B)。在其它AML細(xì)胞系中也獲得類似結(jié)果。
另外還測試存活蛋白短肽在AML細(xì)胞系中的活性。將觸角足載體序列的第三個(gè)α-螺旋與存活蛋白肽序列K79-G83的氨基末端融合，合成出存活蛋白細(xì)胞通透短肽(SEQ ID NO20)。經(jīng)MTT試驗(yàn)測得，在AML細(xì)胞系中，這種短肽降低細(xì)胞活力的活性比P31肽強(qiáng)很多(圖29C，D)。倒序?qū)φ针?RQIKIWFQNRRMKWKKSGKHS；SEQ ID NO28)無此效果(圖29C，D)。這些試驗(yàn)中使用了大量細(xì)胞(4×105)，以便產(chǎn)生全長存活蛋白肽的50％殺傷效力。
在AML中更詳細(xì)鑒定K79-G83存活蛋白肽的抗-腫瘤活性。將K79-L87(SEQ ID NO19)和K79-G83肽(SEQ ID NO20)與AML細(xì)胞一起保溫，用MTT測量細(xì)胞活力。K79-L87和K79-G83存活蛋白肽都有效殺傷所測試的所有AML細(xì)胞系，但對照倒序肽(SEQ ID NO25和SEQ ID NO28)無此效果(圖30)。
與抗-腫瘤活性的功能性結(jié)果一致，存活蛋白序列K79-L87和K79-G83在體外與重組Hsp90可比結(jié)合(comparably bound)，并抑制重組存活蛋白與Hsp90的劑量依賴型結(jié)合(圖31)。
實(shí)施例28用高通量篩選鑒定存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗劑用高通量篩選(HTS)鑒定存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗劑。采用了兩種實(shí)驗(yàn)策略來進(jìn)行篩選熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonanceenergy transfer，F(xiàn)RET)和熒光極化(fluorescence polarization，F(xiàn)P)。按照本領(lǐng)域已知方法制備存活蛋白肽并用染料分子標(biāo)記。這種肽-染料偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)略圖見圖32。在該分子中，存活蛋白肽的任一末端的位點(diǎn)都用熒光素(FI；供體)或羅丹明(Rh；受體)標(biāo)記。
游離肽具有較高的FRET效力，這是由于供體與受體位點(diǎn)之間的分子內(nèi)FRET引起熒光強(qiáng)度的淬滅。通過與Hsp90結(jié)合，所述肽-染料偶聯(lián)物的分子內(nèi)FRET減弱，供體信號(hào)增強(qiáng)。根據(jù)相對供體熒光(FI)的變化，通過非線性回歸擬合(non-linear regression fitting)獲得結(jié)合解離常數(shù)(KD)。
利用FRET進(jìn)行的總體HTS策略如下來自化學(xué)文庫、競爭結(jié)合Hsp90的抑制物使存活蛋白肽-染料偶聯(lián)物被釋放，形成其天然折疊構(gòu)象。這導(dǎo)致在抑制物濃度遞增的情況下，F(xiàn)RET效力增強(qiáng)、供體熒光強(qiáng)度減弱、受體信號(hào)增強(qiáng)。用FI的相對熒光強(qiáng)度作為抑制物濃度的函數(shù)，通過擬合作圖來獲得該抑制物的結(jié)合解離常數(shù)Ki。
為了進(jìn)行篩選，優(yōu)化信噪比，使得用50μM終濃度的用于鑒定一級(jí)熱點(diǎn)(primary hit)的化合物在存活蛋白肽-染料偶聯(lián)物內(nèi)獲得FRET最大信號(hào)。進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，以便檢測針對FRET效力的任何溶劑影響。
在另一例中，用FP監(jiān)控存活蛋白肽-Hsp90相互作用。熒光素-標(biāo)記的存活蛋白肽快速旋轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出低水平熒光極化。相反，與Hsp90結(jié)合使旋轉(zhuǎn)速度減慢，熒光極化增加。用各向異性(anisotropy，r)定量熒光極化，將其定義為，平行熒光強(qiáng)度和垂直強(qiáng)度和總熒光之間的差異的比。用r作為蛋白濃度的函數(shù)，通過擬合作圖獲得相互作用的KD值。
HTS實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)文庫從Chem.Bridge Corporation(San Diego，CA)獲得，通過計(jì)算機(jī)多樣化和藥物樣特性分析，選出330,000個(gè)小分子化合物。通過利用各種篩選指標(biāo)(filter)，包括溶解度曲線圖、LogP、離子負(fù)荷、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)據(jù)、極性表面積計(jì)算、以及雜原子數(shù)，選出一個(gè)多樣化群體，有30,000個(gè)分子。將這些分子溶于DMSO中至5mM濃度，然后分配在多個(gè)96-孔板中。所有板都用條形碼標(biāo)記，從而能方便地辨別這些小分子。
一級(jí)篩選的目的是，鑒定出競爭性抑制存活蛋白-Hsp90相互作用的化合物。用上述二元FRET/FP方法，快速方便地篩選整個(gè)文庫，分離出1-3％的一級(jí)熱點(diǎn)化合物，相當(dāng)于來自所述文庫的300-900個(gè)分子。在二級(jí)篩選中測試這些一級(jí)熱點(diǎn)化合物，鑒定出具有存活蛋白肽-樣特性的先導(dǎo)分子(leadmolecule)。為提高二級(jí)篩選的特異性，平行測試Hsp90 N-區(qū)突變體和野生型Hsp90，所述突變體(SEQ ID NO21的N51A，S52A或S113A取代變體)與存活蛋白肽的結(jié)合減弱(Plescia et al.，Cancer Cell，7457-68(2005))。
在三級(jí)篩選中，每一種所選化合物各合成20mg，測定它們抑制Hsp90的IC50值。在三級(jí)篩選中，使用兩種獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(readout)(i)對Hsp90ATP酶活性的抑制(酶抑制實(shí)驗(yàn))，和(ii)對存活蛋白-Hsp90相互作用的抑制(蛋白-蛋白相互作用實(shí)驗(yàn))。第一組實(shí)驗(yàn)中，在有4μg重組Hsp90存在的情況下，測試各種化合物在96孔板上濃度遞增時(shí)，對MDCC-標(biāo)記的磷酸結(jié)合蛋白(PBP，1μM)的相對熒光發(fā)射進(jìn)行的調(diào)節(jié)。用GA(60μM)作為這些實(shí)驗(yàn)中的對照。第二組實(shí)驗(yàn)中，將遞增濃度的所選化合物與網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物(100μl)混合，與重組存活蛋白(0.5μg)一起保溫，再用對照IgG或抗Hsp90抗體進(jìn)行免疫沉淀。在有各種化合物存在時(shí)存活蛋白與Hsp90的差異結(jié)合，通過Western印跡測定，并通過密度計(jì)量術(shù)定量。將網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物與存活蛋白肽或倒序肽事先保溫，用作對照。
實(shí)施例29確認(rèn)存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗劑所鑒定的結(jié)合Hsp90的化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性分為多個(gè)結(jié)構(gòu)類型，根據(jù)相對IC50值(對結(jié)合親和力的粗略度量)分為Hsp90功能的強(qiáng)效抑制物和弱效抑制物。每種化合物各合成50mg。首先從每一種結(jié)構(gòu)類型制備“最強(qiáng)效”抑制物，通過熒光各向異性鑒定它們對Hsp90的結(jié)合親和力。在這些實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合Hsp90的化合物用熒光素標(biāo)記，測定它們對野生型或突變型Hsp90 N-區(qū)的結(jié)合親和力。在染料和化合物之間使用多種接頭(6-12碳)，使得所述化合物的活性不受影響?；蛘?，將Hsp90用染料分子標(biāo)記，未標(biāo)記的結(jié)合Hsp90的化合物也用于這些實(shí)驗(yàn)。
接著，在基于細(xì)胞的研究中，測試所確認(rèn)的化合物對細(xì)胞活力和凋亡的影響。在這些實(shí)驗(yàn)中，將遞增濃度的各種化合物與腫瘤細(xì)胞系包括AML細(xì)胞(1×107/ml)或正常人成纖維細(xì)胞一起，在37℃按照遞增的時(shí)間段(0.5-36小時(shí))進(jìn)行保溫。用臺(tái)盼蘭排除法分析細(xì)胞的漿膜完整性，用MTT試驗(yàn)分析細(xì)胞的活力，用氨基三氟甲基香豆素(aminotrifluoromethylcoumarin，AFC)熒光分析來測定細(xì)胞的溶酶體通透性，通過測定線粒體功能紊亂以及多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析DEVD酶活性/膜聯(lián)蛋白V和PI標(biāo)記來確定細(xì)胞的凋亡。
進(jìn)一步研究所述化合物結(jié)合Hsp90并抑制伴侶分子功能的特異性。首先，濃度遞增的化合物通過親和層析來分析對Hsp90與γ-磷酸-偶聯(lián)型ATP-Sepharose結(jié)合的競爭性抑制，另通過熒光極化來測試對Hsp90或Hsp70的不同結(jié)合。其次，將腫瘤細(xì)胞包括AML細(xì)胞與濃度遞增的所選化合物一起保溫0.5-36小時(shí)，收獲細(xì)胞，通過Western印跡來分析Hsp90客戶蛋白(例如存活蛋白，Akt，CDK-4，CDK-6，c-Raf-1和c-Src)的丟失，通過對Hsp90免疫沉淀物進(jìn)行TRAP試驗(yàn)來分析端粒酶活性。將正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系與17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)(5-10μM)、或與存活蛋白細(xì)胞通透肽或倒序肽一起保溫，作為這些確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的對照。
實(shí)施例30體內(nèi)測試存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗劑測試對腫瘤細(xì)胞系具有活性的小分子存活蛋白肽模擬物在人AML異種移植模型中的體內(nèi)效力。將HL-60細(xì)胞(5×106)懸浮在無菌PBS，pH 7.4中，總體積100μl，將其注射到8-10周齡CB-17 SCID/米色鼠(20-25g)的尾靜脈中。每日觀察動(dòng)物的總體疾病表現(xiàn)(麻痹(paralysis)，昏睡(lethargy)，卷毛(ruffled fur))，這些表現(xiàn)在移植的10-14日后逐漸變成臨床明顯水平，如果一直不給予治療，在3-5周內(nèi)100％死亡。為促進(jìn)骨髓移植，這些動(dòng)物從直線加速器(linear accelerator)接受預(yù)適應(yīng)性亞致死劑量的輻射(350R)。HL-60細(xì)胞在脾臟和骨髓中的積累，用抗人HLA抗體按照一周一次(at weeklyintervals)在重建后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析來確定。移植當(dāng)時(shí)，動(dòng)物按照短期(15日)或長期(50日)方案，腹腔給予小分子存活蛋白肽模擬物，劑量為0.01-50mg/kg。對照動(dòng)物注射鹽水。用經(jīng)處理的動(dòng)物比對照動(dòng)物存活率的增加來確定效力。
其它實(shí)施方案可以理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)在說明書中詳細(xì)描述，但上述描述只是為了舉例說明定義在所附權(quán)利要求書中的本發(fā)明范圍，并不想對本發(fā)明的范圍作任何限制。其它方面、優(yōu)勢和變動(dòng)都包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.分離的存活蛋白肽片段，具有11個(gè)或更少的氨基酸，包含5個(gè)氨基酸的序列His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)，可抑制Hsp90與存活蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。
2.權(quán)利要求1的肽片段，其中所述片段是9個(gè)氨基酸或更少。
3.分離的多肽，其抑制Hsp90與存活蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用，其包含權(quán)利要求1或2的肽片段，且該肽片段與促進(jìn)所述多肽的細(xì)胞通透性的肽內(nèi)化序列相連。
4.權(quán)利要求3的肽，其中所述內(nèi)化序列選自Tat序列，觸角足序列，transportin序列或transportan序列。
5.一種肽模擬物，其為權(quán)利要求1-4之一的肽片段或多肽的肽模擬物。
6.權(quán)利要求5的肽模擬物，其中所述肽模擬物具有一或多個(gè)以下特征(a)所述肽模擬物是一種反構(gòu)型-肽，其包含一種序列，該序列中，該肽的氨基酸從氨基到羧基的排列是反向的；(b)所述肽模擬物是一種反排列-肽，其中有一或多個(gè)D-氨基酸替代了L-氨基酸；和(c)所述肽模擬物包含一或多個(gè)人工氨基酸類似物。
7.制備腫瘤生長抑制物的方法，包括獲得先導(dǎo)化合物，其為權(quán)利要求1-4之一的肽；利用醫(yī)學(xué)化學(xué)研發(fā)與候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物結(jié)構(gòu)類似的受試物；可選地測定該受試物是否抑制腫瘤細(xì)胞生長；和將該受試物與藥物載體一起配制成腫瘤生長抑制物。
8.鑒定候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物的方法，包括將受試化合物、Hsp90肽以及凋亡蛋白抑制物(IAP)肽在足以確保相互作用的條件下混合足夠的時(shí)間；和檢測受試化合物是否抑制Hsp90肽與IAP肽之間的相互作用；其中抑制Hsp90肽與IAP肽之間相互作用的受試化合物是候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述IAP肽是存活蛋白肽。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述相互作用是結(jié)合。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述IAP肽是存活蛋白肽，且存活蛋白肽和Hsp90肽都位于細(xì)胞中。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
13.制備腫瘤生長抑制物的方法，包括實(shí)施權(quán)利要求8-12之一的方法；利用醫(yī)學(xué)化學(xué)研發(fā)與候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物結(jié)構(gòu)類似的受試物；可選地測定該受試物是否抑制腫瘤細(xì)胞生長；和將該受試物與藥物載體一起配制成小分子的腫瘤生長抑制物。
14.鑒定凋亡誘導(dǎo)物的方法，包括將腫瘤細(xì)胞與權(quán)利要求8-12之一所述方法鑒定出的候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物接觸；和檢測一或多種凋亡標(biāo)記物的有無；其中使細(xì)胞表現(xiàn)出一或多種凋亡標(biāo)記物的候選誘導(dǎo)凋亡的化合物是凋亡誘導(dǎo)物。
15.鑒定腫瘤生長抑制物的方法，包括將一或多種腫瘤細(xì)胞與權(quán)利要求8-12之一所述方法鑒定出的候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物接觸；和測量所述腫瘤細(xì)胞的增殖；其中當(dāng)一種候選的誘導(dǎo)凋亡的化合物使所述腫瘤細(xì)胞的增殖相對于未接觸所述化合物的一或多種腫瘤細(xì)胞的增殖而言受到抑制，則該化合物是腫瘤生長抑制物。
16.治療受試者的腫瘤的方法，包括鑒別需要治療腫瘤的受試者；和對該受試者施用藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-6之一的肽或權(quán)利要求7或8的肽模擬物。
17.治療受試者的腫瘤的方法，包括鑒別需要治療腫瘤的受試者；和對該受試者施用藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求8-12，14和15之一的方法鑒定出的化合物或受試物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述對受試者施用的化合物或受試物是抑制Hsp90與存活蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的抗存活蛋白抗體。
19.抗-存活蛋白抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1-4之一的肽。
20.核酸，其編碼權(quán)利要求1-4之一的肽。
21.細(xì)胞，其含有權(quán)利要求20的核酸。
22.抗-存活蛋白抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求5或6的肽模擬物。
23.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽含有氨基酸序列Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO24)。
24.權(quán)利要求4的肽，其中所述肽含有氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSGCAFL(SEQ ID NO19)。
25.權(quán)利要求6的肽模擬物，其中所述肽模擬物含有D-氨基酸序列(D-Leu)-(D-Phe)-(D-Ala)-(D-Cys)-(D-Gly)-(D-Ser)-(D-Ser)-(D-His)-(D-Lys)。
26.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽選自His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)；Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO5)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO6)；His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)；Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO9)；His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe(SEQ ID NO10)；His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO14)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO24)；和Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO26)。
27.分離的XIAP肽，其與Hsp90結(jié)合且具有以下氨基酸序列MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGS(SEQ ID NO27)。
28.抑制細(xì)胞中存活蛋白多肽與熱休克蛋白Hsp90之間的蛋白-蛋白相互作用的方法，該方法包括將有效量的權(quán)利要求1-6之一所述肽或肽模擬物導(dǎo)入所述細(xì)胞中。
29.權(quán)利要求1-4，23，24和26之一所述肽在治療受試者腫瘤中的用途。
30.權(quán)利要求5，6和25之一所述肽模擬物在治療受試者腫瘤中的用途。
31.權(quán)利要求1-4，23，24和26之一所述肽在制備用于治療受試者腫瘤的藥物組合物中的用途。
32.權(quán)利要求5，6和25之一所述肽模擬物在制備用于治療受試者腫瘤的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本文提供了抑制Hsp90與存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2等IAP蛋白相互作用的化合物，以及鑒定和應(yīng)用這類化合物的方法。
文檔編號(hào)A61K38/04GK101065138SQ200580032164
公開日2007年10月31日 申請日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日
發(fā)明者達(dá)里奧·C·奧爾蒂里, 珍妮特·普萊西亞, 惠特妮·薩爾茲 申請人:馬薩諸塞大學(xué)