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生長激素釋放激素增強疫苗接種應(yīng)答的制作方法

文檔序號:1110213閱讀:821來源:國知局

專利名稱::生長激素釋放激素增強疫苗接種應(yīng)答的制作方法背景本申請要求美國臨時專利申請序列號60/590,739的優(yōu)先權(quán),所述臨時專利申請的標(biāo)題為“GROWTHHORMONERELEASINGHORMONEENHANCESVACCINATIONRESPONSE”,于2004年7月23日提交,所列出的發(fā)明人有Ruxandra、Draghia-Akli、PatriciaA.Brown、AmirS.Khan和WilliamC.Davis,其全部內(nèi)容引入本文作為參考。本發(fā)明涉及下述組合物及方法對受試者進(jìn)行疫苗接種;增強疫苗接種的效能;在接種疫苗之前準(zhǔn)備受試者;以及改善接種了疫苗的受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果。更具體而言,本發(fā)明涉及在將疫苗遞送給受試者之前或與之相伴地將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸構(gòu)建體遞送到受試者組織中,其中GHRH在受試者體內(nèi)表達(dá),并且受試者包括人、豬、牛、鳥或接受疫苗的其他任何動物種類。傳染病在人和動物中仍然是一個重大問題。因此,需要適合年齡的抗生素選擇,和特異性疫苗以及其他免疫增強療法的臨床效力的評估。大量的努力致力于疾病的預(yù)防而不是治療。每年對于疫苗接種的市場超過200億美元。眾多報道指出神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間相互依賴的關(guān)系。下丘腦的GHRH刺激垂體前葉分泌生長激素(“GH”),但近期研究也已證實這種肽的免疫調(diào)節(jié)特性(Siejka等人,2004)。GHRH在生理和病理條件下調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)的重要性(Marshall等人,2001)已得到描述,通過刺激GH/胰島素樣生長因子-I(“IGF-I”)軸和直接作為免疫調(diào)節(jié)劑(Dialynas等人,1999;Khorram等人,2001)。GHRH在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)中是必需的。然而,關(guān)于GHRH究竟真正如何介導(dǎo)那些作用或GHRH治療對疫苗接種和病原體攻擊的影響,仍然還缺乏細(xì)節(jié)。生長激素釋放激素(“GHRH”)和生長激素(“GH”)軸為了更好地理解利用GHRH質(zhì)粒介導(dǎo)的補充給藥法作為增強特異性疫苗接種應(yīng)答和改善感染性攻擊后的臨床結(jié)果的方法,將提及關(guān)于GHRH/GH軸的機制和目前的了解。盡管不希望被理論束縛,但GH的中心作用是控制人和其他脊椎動物的軀體生長。調(diào)節(jié)垂體分泌GH的生理學(xué)相關(guān)途徑完全是本領(lǐng)域眾所周知的。GH途徑基因包括(1)配體,例如GH和IGF-I;(2)轉(zhuǎn)錄因子,例如pit1的前體(prophet),或prop1,和pit1;(3)激動劑和拮抗劑,例如分別為GHRH和生長激素釋放抑制激素(“SS”);以及(4)受體,例如GHRH受體(“GHRH-R”)和GH受體(“GH-R”)。這些基因在不同的器官和組織中表達(dá),包括下丘腦、垂體、肝臟和骨骼。GH途徑的有效且受調(diào)節(jié)的表達(dá)是最佳線性生長,以及碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的。GH從垂體前葉的合成及分泌受到GHRH的刺激并受到生長激素釋放抑制激素的抑制,這兩種均為下丘腦激素。GH增加了IGF-I的產(chǎn)生,主要在肝臟以及其他靶器官中。反過來,IGF-I和GH反饋作用于下丘腦和垂體以抑制GHRH和GH釋放。GH引發(fā)了對外周組織的直接和間接作用,間接效應(yīng)主要由IGF-I介導(dǎo)。GHRH和免疫功能質(zhì)粒介導(dǎo)的GHRH補充給藥法在由于疾病或各種治療方案而免疫系統(tǒng)低下的動物中已顯示出具有各種免疫刺激作用(Dorshkind和Horseman,2001)。研究表明,免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生GHRH、GH和IGF-I(Burgess等人,1999),這提示免疫功能可能被自分泌和旁分泌機制調(diào)節(jié)。這還提示,在老年人中發(fā)病率增加例如呼吸系統(tǒng)疾病可能歸因于伴隨衰老而發(fā)生的改變GH/IGF-I產(chǎn)生減少、IGF-I可用性減少以及免疫監(jiān)視特別是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視減少(Gelato,1996;Krishnaraj等人,1998)。相反地,在老年人中施用GHRH或其類似物,在治療后短期和長期均導(dǎo)致顯著的免疫增強效應(yīng)。這些效應(yīng)包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞以及表達(dá)T細(xì)胞受體αβ和T細(xì)胞受體γδ的細(xì)胞的數(shù)目增加(Khorram等人,1997)。在無免疫應(yīng)答的患者中,例如在骨髓移植后,IGF-I的施用可以增強淋巴和骨髓的重建(Alpdogan等人,2003)。同樣地,疾病和疫苗接種的動物模型研究顯示出,GH的體內(nèi)施用可以有效地準(zhǔn)備好巨噬細(xì)胞并增加對病原體的抵抗力(Sakai等人,1997)。在不同動物模型和人中的幾項研究已顯示,GHRH具有免疫刺激作用,其是通過刺激GH軸和直接作為免疫調(diào)節(jié)劑(Dialynas等人,1999;Khorram等人,2001)。已知GH直接地或通過由GH誘導(dǎo)的IGF-I而增強免疫應(yīng)答。近來,發(fā)現(xiàn)GH促分泌素(“GHS”)誘導(dǎo)了通過垂體腺產(chǎn)生GH,還決定了年老小鼠中胸腺細(xì)胞構(gòu)成(cellularity)以及分化的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加。當(dāng)接種可移植的淋巴瘤細(xì)胞系EL4時,經(jīng)處理的年老小鼠對腫瘤發(fā)生和后續(xù)的轉(zhuǎn)移顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的抵抗力。在經(jīng)處理的小鼠中對于EL4細(xì)胞的CTL的產(chǎn)生也是增強的,這提示GHS具有相當(dāng)大的免疫增強作用(Koo等人,2001)。免疫功能還由IGF-I調(diào)節(jié),它對B細(xì)胞發(fā)育具有兩個主要作用增強和成熟,以及作為與白介素-7一起工作的B細(xì)胞增殖輔助因子。這些活性通過使用抗IGF-I抗體、針對IGF-I的反義序列以及使用重組IGF-I以替代活性來鑒別。用重組IGF-I處理小鼠證實了這些觀察,因為它增加了骨髓中pre-B和成熟B細(xì)胞的數(shù)目(Jardieu等人,1994)。成熟B細(xì)胞保留了對IGF-I的敏感性,因為免疫球蛋白的產(chǎn)生在體外和體內(nèi)也受IGF-I刺激(Robbins等人,1994)。在衰老的哺乳動物中,GHRH-GH-IGF-I軸經(jīng)歷相當(dāng)大的減退,與骨骼肌質(zhì)量損失(肌肉減少(sarcopenia))、骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、脂肪沉淀增加和瘦體重減少相關(guān)的GH分泌和IGF-I產(chǎn)生減少(Caroni和Schneider,1994;Veldhuis等人,1997)。已證實這些改變的形成可以通過重組GH療法來抵消。致力于感染風(fēng)險增加和消瘦的治療在患者健康和生活質(zhì)量中將會是一個主要的前進(jìn)步驟。在最近20年中重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生提供了治療許多不同病狀的有用工具。例如,在身材矮小癥兒童中的GH缺乏,在燒傷、敗血病和AIDS患者中的同化激素類藥。然而,對GH作用的抗性已在營養(yǎng)不良和感染中得到報道。然而,當(dāng)前的GH療法具有幾個缺點,包括頻繁的皮下或靜脈內(nèi)注射、胰島素耐受性和葡萄糖耐量降低(Rabinovsky等人,1992);兒童還易遭受骺過早閉合以及首股骨骺滑脫(Liu和LeRoith,1999)。已開發(fā)出只需要每14天注射一次的“緩慢釋放”形式的GH(來自Genentech)。然而,這種GH產(chǎn)品似乎擾亂了正常生理學(xué)脈動的GH特性,并且還與時常發(fā)生的副作用相關(guān)。生長激素釋放激素對生長激素或生長激素釋放肽(“GHRP”)GH和GHRH目前在治療上作為重組蛋白質(zhì)施用。關(guān)于GH及其受體之間的相互作用的當(dāng)前認(rèn)識提示,循環(huán)性GH的分子異質(zhì)性可能具有重要的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)關(guān)聯(lián)。已提出,包括胰島素抗性在內(nèi)的不良反應(yīng)可能起因于外源性GH提高了基礎(chǔ)GH血清水平并且消除了自然的GH偶發(fā)性脈動。研究已顯示,GHRH的連續(xù)輸注恢復(fù)了正常的GH脈動模式,而不會使GHRH受體脫敏或損耗人、綿羊或豬中的GH供應(yīng)(Dubreuil等人,1990;Vance等人,1989;Vance等人,1985)。同時,這個系統(tǒng)能夠反饋,這在GH療法中被完全消除。事實上沒有關(guān)于GHRH療法的副作用的報道(Thorner等人,1986a)。因此,GHRH療法可能比GH療法更符合生理學(xué)。GHRP在臨床中用于在人類中短期刺激GH和IGF-I。海沙瑞林(hexarelin),一種有效且充分研究的GHRP,能夠在正常個體中引起明顯的GH釋放。在人類中GH對海沙瑞林的應(yīng)答在長期施用后變得具有較為明顯的減弱。盡管這種減弱是局部的且可逆的,但它可以嚴(yán)重限制海沙瑞林和類似藥劑潛在的長期治療用途(Rahim和Shalet,1998)。與疫苗相結(jié)合的使用海沙瑞林的長期治療是刺激免疫功能所必需的。隨著GH釋放藥劑的開發(fā)及其在人受試者中的應(yīng)用,很明顯這些藥劑對于GH釋放不是特異的。在人中更近來的研究已證實,在施用GHRP(海沙瑞林,MK-0677)后(Schleim等人,1999)發(fā)生了促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)(Ghigo等人,1999)、皮質(zhì)醇和催乳素(PRL)(Svensson和Bengtsson,1999)的急劇增加。在使用GHRP和類似藥劑的長期治療過程中,短暫的(甚至輕微的)高催乳素血癥和高皮質(zhì)醇血癥的反復(fù)發(fā)作的潛在不良反應(yīng)引起了關(guān)注,需要進(jìn)一步的研究,并且在面對感染性攻擊的患者中是不希望的(Rahim等人,1999)。相反地,基本上沒有關(guān)于重組GHRH療法的副作用的報道。顱外分泌的GHRH,作為成熟肽或截短的分子(如具有胰島細(xì)胞瘤和各種定位的類癌時可見),通常是具有生物學(xué)活性的并且甚至可以產(chǎn)生肢端肥大癥(Esch等人,1982;Thorner等人,1984)。對缺乏GH的兒童或成人施用重組GHRH增加了IGF-I的水平,與GHRH劑量成比例地增加了GH分泌,還引起了對大劑量重組GHRH的應(yīng)答(Bercu和Walker,1997)。因此,施用GHRH代表了用于增加低于正常的GH和IGF-I水平的更符合生理學(xué)的選擇方案(Corpas等人,1993)。盡管重組GHRH蛋白療法產(chǎn)生并刺激基本上沒有副作用的正常的周期性GH分泌,但GHRH在體內(nèi)短暫的半衰期要求頻繁的(一天1-3次)靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)(要求高300倍的劑量)施用。因此,作為長期治療,施用GHRH不可行。野生型GHRH在人(Frohman等人,1984)和家畜的循環(huán)系統(tǒng)中具有相對短暫的半衰期。在血漿中孵育60分鐘后,95%的GHRH(1-44)NH2被降解,而該激素的更短的(1-40)OH形式在類似條件下孵育時,在孵育60分鐘后只顯示出77%的肽降解(Frohman等人,1989)。在治療性核酸載體中整合入編碼特定蛋白酶抗性GHRH類似物的cDNA,產(chǎn)生了在血清中具有更長半衰期并且效力增加的分子,并在注射了質(zhì)粒的動物中提供了更大的GH釋放(Draghia-Akli等人,1999),此處引用作為參考。通過蛋白酶敏感性氨基酸的氨基酸替代進(jìn)行誘變延長了GHRH分子的血清半衰期。此外,GHRH的生物學(xué)活性的增強通過使用可以增加其與特異性受體的結(jié)合親和力的強效類似物來達(dá)到(Draghia-Akli等人,1999)。家畜中的生長激素(“GH”)和生長激素釋放激素(“GHRH”)重組GH或重組GHRH的施用已在受試者中使用多年,但不是作為用于刺激疫苗接種后的應(yīng)答或改善感染性攻擊后的臨床結(jié)果的途徑。更具體而言,家畜中的重組GH治療已顯示出可增強無脂肪組織沉積和/或乳汁產(chǎn)生,同時增加飼料轉(zhuǎn)化效率(Etherton等人,1986;Klindt等人,1998)。眾多研究已顯示,重組GH顯著減少屠體的脂肪量;并且因此增加了產(chǎn)品的品質(zhì)。然而,長期的GH施用具有實踐、經(jīng)濟和生理學(xué)的局限性,這潛在地減少弱了其有用性和功效(Chung等人,1985;Gopinath和Etherton,1989b)。在實驗中,重組GH釋放激素(“GHRH”)已被用作更符合生理學(xué)的替代方案。GHRH在大的動物種類(例如豬或牛)中的使用不僅增強了生長表現(xiàn)和乳汁產(chǎn)生,而且更重要地,從實踐和代謝的觀點來看增強了生產(chǎn)效率(Dubreuil等人,1990;Farmer等人,1992)。例如,在泌乳母豬中使用重組GHRH對于剛斷奶的小豬的生長具有有利的影響,然而GHRH發(fā)揮其全部潛力還需要最佳營養(yǎng)和激素條件(Farmer等人,1996)。GHRH和GH的施用刺激乳汁產(chǎn)生,伴隨著飼料向乳汁轉(zhuǎn)化的增加。這種療法主要通過增加瘦體重(Lapierre等人,1991;vanRooij等人,2000)并同時全面改進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化效率來增加生長。通過施用GHRH和GH,熱和冷的屠體重量增加并且屠體脂質(zhì)(軟組織質(zhì)量的百分比)減少(Etherton等人,1986)。轉(zhuǎn)基因遞送和體內(nèi)表達(dá)盡管不希望被理論束縛,但向軀體組織遞送特定轉(zhuǎn)基因以校正先天或后天的缺乏和不平衡是可能的。此類基于轉(zhuǎn)基因的遞送提供了許多超過施用重組蛋白質(zhì)的優(yōu)點。這些優(yōu)點包括保持天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);改進(jìn)生物學(xué)活性;避免全身毒性;以及避免有傳染性和毒性的雜質(zhì)。因為蛋白質(zhì)被連續(xù)合成并分泌到循環(huán)中,所以質(zhì)粒介導(dǎo)的療法允許在治療范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的延長產(chǎn)生。相反,使用重組蛋白質(zhì)的首要局限是在每次施用后蛋白質(zhì)的有限的生物利用率。在基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)中,除編碼治療性基因產(chǎn)物的核酸之外,非病毒載體可以包含合成的轉(zhuǎn)基因遞送系統(tǒng)。這樣,可以避免與大多數(shù)病毒載體使用相關(guān)的風(fēng)險,包括能夠誘導(dǎo)針對靶組織或病毒載體的免疫應(yīng)答的病毒蛋白質(zhì)表達(dá),以及DNA突變或激活癌基因的可能性。由于使用“物種特異性”組分用于基因遞送,因而非病毒表達(dá)載體產(chǎn)物一般具有低毒性,這將由質(zhì)粒所靶向的免疫原性和表達(dá)喪失的風(fēng)險降至最低。另外,迄今為止在體內(nèi)沒有報道質(zhì)粒序列以超過自發(fā)突變速度而明顯整合入宿主染色體中,因此這種類型的治療應(yīng)當(dāng)不會激活癌基因也不會失活腫瘤抑制基因。因為附加型系統(tǒng)存在于染色體外,所以質(zhì)粒具有指定的藥物動力學(xué)和清除特性,導(dǎo)致基因表達(dá)在靶組織中的持續(xù)時間有限。利用良好的制造實踐技術(shù)易于制造質(zhì)粒載體。與病毒載體相比較它們具有低的風(fēng)險/利益比,如于2003年3月13-14日在由AmericanSocietyofGeneTherapy(ASGT)和FoodandDrugAdministration’sCenterforBiologicsEvaluationandResearch(FDA/CBER)發(fā)起的研討會上所提出的(Frederickson等人,2003)。當(dāng)前,直接的質(zhì)粒DNA基因轉(zhuǎn)移是許多涌現(xiàn)的核酸療法策略的基礎(chǔ)并且不需要病毒組分或脂質(zhì)顆粒(Aihara和Miyazaki,1998;Muramatsu等人,2001)。骨骼肌是靶組織,因為肌纖維具有長的壽命并且可以由在免疫活性宿主中表達(dá)的環(huán)狀DNA質(zhì)粒來轉(zhuǎn)導(dǎo)(Davis等人,1993;Tripathy等人,1996)。質(zhì)粒DNA構(gòu)建體對于進(jìn)入受試者骨骼肌中的直接治療來說是有吸引力的候選物,因為構(gòu)建體是非常明確的實體,其是生物化學(xué)穩(wěn)定的并且已成功使用了很多年(Acsadi等人,1991;Wolff等人,1990)。在直接質(zhì)粒DNA注射后編碼產(chǎn)物的相對低的表達(dá)水平有時足以表明被分泌的肽的生物活性(Danko和Wolff,1994;Tsurumi等人,1996)。以前的報道顯示,在小鼠中通過質(zhì)??梢詫⑷薌HRHcDNA遞送至肌肉,在那里它短暫地刺激GH分泌至適當(dāng)?shù)某潭瘸^2周的時間(Draghia-Akli等人,1997)。質(zhì)粒介導(dǎo)的GHRH補充給藥法刺激免疫功能在健康犬中的初步研究提示,單次施用GHRH質(zhì)粒到骨骼肌中將確保生理學(xué)GHRH表達(dá)數(shù)月(Draghia-Akli等人,2003a)。設(shè)計了一項初期研究以評估基于質(zhì)粒的GHRH治療在年老的或受癌癥折磨的伴侶犬中產(chǎn)生有利效果的能力,以及評估治療方案的長期安全性。對16只受癌癥折磨的犬施用了肌肉特異性的GHRH表達(dá)質(zhì)粒。最初的56天評價(Draghia-Akli等人,2002a)證實GHRH生物活性指示劑即IGF-I的血清濃度增加。在經(jīng)處理的動物中發(fā)現(xiàn)循環(huán)淋巴細(xì)胞水平顯著增加。在極度衰弱的年老犬和具有自發(fā)產(chǎn)生的腫瘤的伴侶犬中進(jìn)行了進(jìn)一步的先導(dǎo)研究。在這種情況下,發(fā)現(xiàn)IGF-I水平在治療后升高了超過365天。為了這項研究的縱向繼續(xù),包括了可以在治療后被分析至少180天的犬。除了血液學(xué)參數(shù)的改善和維持之外,還觀察了體重、活躍水平和運動耐力的增加。經(jīng)處理的犬的全面長期評估顯示出生活質(zhì)量的改善,這種改善在研究期間自始至終都保持。這些結(jié)果暗示了質(zhì)粒介導(dǎo)的GHRH治療在逆轉(zhuǎn)與衰老和癌性貧血和/或惡病質(zhì)相關(guān)的分解代謝過程中的作用,并且暗示了被改善的健康狀態(tài)可能與刺激了免疫功能相關(guān)。質(zhì)粒遞送和電穿孔已付出努力以便通過物理方法(包括電穿孔、聲波穿孔和壓力)來增強質(zhì)粒DNA向細(xì)胞的遞送。盡管不希望被理論束縛,但通過電穿孔施用核酸構(gòu)建體包括施加脈沖電場以在細(xì)胞膜中產(chǎn)生瞬時的孔而不會導(dǎo)致細(xì)胞的永久性損傷,這允許外源性分子進(jìn)入細(xì)胞(Smith和Nordstrom,2000)。通過調(diào)整由電穿孔系統(tǒng)產(chǎn)生的電脈沖,核酸分子可以穿過在操作過程中產(chǎn)生的細(xì)胞中的通道或孔。于1998年1月6日頒發(fā)、標(biāo)題為“Electroporationandiontophoresiscatheterwithporousballoon”、Hofmann等人列為發(fā)明人的美國專利5,704,908描述了用于在患者身體內(nèi)的腔中于選定位置處將分子遞送給細(xì)胞的電穿孔設(shè)備。類似的脈沖電壓注射裝置還在下述專利文獻(xiàn)中得到描述于1997年12月30日頒發(fā)、標(biāo)題為“Needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”、Hofmann等人列為發(fā)明人的美國專利5,702,359;于1995年8月8日頒發(fā)、標(biāo)題為“Electroporationsystemwithvoltagecontrolfeedbackforclinicalapplications”、Hofmann列為發(fā)明人的美國專利5,439,440;于1996年5月5日公開、標(biāo)題為“ElectroporeticGeneandDrugTherapybyInducedElectricFields”、Hofmann等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/96/12520;于1996年4月25日公開、標(biāo)題為“FlowThroughElectroporationApparatusandMethod”、Hofmann等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/96/12006;1995年7月27日公開、標(biāo)題為“ElectroporationandIontophoresisApparatusandMethodForinsertionofDrugsandgenesintoCells”、Hofmann列為發(fā)明人的PCT申請WO/95/19805;以及于1997年3月6日公開、標(biāo)題為“InVivoElectroporationofCells”、Nicolau等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/97/07826,上文列舉的每一篇參考文獻(xiàn)的整體內(nèi)容引入本文作為參考。近來,利用電穿孔技術(shù)獲得了增強質(zhì)粒體內(nèi)遞送以及隨后達(dá)到分泌型蛋白質(zhì)的生理學(xué)水平的重要進(jìn)展。電穿孔已非常成功地用于在注射質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(Lucas等人,2002;Matsubara等人,2001)或在人中將抗腫瘤藥物博來霉素遞送給皮膚和皮下腫瘤(Gehl等人,1998;Heller等人,1996)。電穿孔還在小鼠(Lesbordes等人,2002;Lucas等人,2001;Vilquin等人,2001)、大鼠(Terada等人,2001;Yasui等人,2001)和犬(Fewell等人,2001)中廣泛用于遞送編碼各種激素、細(xì)胞因子或酶的治療性基因。利用GHRH的先前研究顯示,使用電穿孔的質(zhì)粒療法是可擴縮的并且代表了在大型動物和人中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和受調(diào)節(jié)的分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人,1999;Draghia-Akli等人,2002c)。電穿孔還已經(jīng)廣泛用于嚙齒動物和其他小型動物中(Bettan等人,2000;Yin和Tang,2001)。肌內(nèi)注射質(zhì)粒后進(jìn)行電穿孔已在反芻動物中成功用于接種疫苗的目的(Babiuk等人,2003;Tollefsen等人,2003)。已觀察到,電極構(gòu)造影響電場分布以及后續(xù)結(jié)果(Gehl等人,1999;Miklavcic等人,1998)。盡管不希望被理論束縛,但在大型動物模型中與外部鉗狀電極相比,針狀電極一致地產(chǎn)生更好的結(jié)果并且可以用于人類。電穿孔增強將質(zhì)粒攝入骨骼肌內(nèi)的能力已被充分證明。類似地,觀察到用聚L-谷氨酸(“PLG”)或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)配制的質(zhì)粒具有增加的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,這從而增加了所需轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。例如,觀察到用PLG或PVP配制的質(zhì)粒使小鼠、大鼠和犬的骨骼肌中的基因表達(dá)增至高達(dá)10倍(Fewell等人,2001;Mumper等人,1998)。盡管不希望被理論束縛,但陰離子聚合物PLG鈉增強了在低質(zhì)粒濃度下的質(zhì)粒攝取并減少了由該操作引起的任何可能的組織損傷。PLG是穩(wěn)定的化合物并且它對相對較高的溫度有抵抗力(Dolnik等人,1993)。PLG已用于增加抗癌藥物的穩(wěn)定性(Li等人,2000),并且在受傷和組織修復(fù)過程中作為“膠”使傷口閉合或阻止組織出血(Otani等人,1996;Otani等人,1998)。PLG已用于增加疫苗制劑的穩(wěn)定性(Matsuo等人,1994)而不增加其免疫原性。PLG還已經(jīng)在抗原吸入或暴露于臭氧后用作抗毒素(Fryer和Jacoby,1993)。盡管不希望被理論束縛,但PLG增加了電穿孔過程中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,不僅通過穩(wěn)定質(zhì)粒DNA以及促進(jìn)經(jīng)過膜孔的胞內(nèi)運輸,還通過活性機制。例如,細(xì)胞上帶正電荷的表面蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而與連接至質(zhì)粒DNA的帶負(fù)電荷的PLG復(fù)合。當(dāng)施加電場時,表面蛋白質(zhì)倒轉(zhuǎn)方向并且活躍地內(nèi)在化DNA分子,這個過程實質(zhì)上增加了轉(zhuǎn)染效率。此外,PLG還將會防止與體內(nèi)質(zhì)粒遞送相關(guān)的肌肉損傷(Draghia-Akli等人,2002b),并且將會增加注射前質(zhì)粒的體外穩(wěn)定性。存在旨在用線性DNA對真核細(xì)胞進(jìn)行電穿孔的研究(McNally等人,1988;Neumann等人,1982)(Toneguzzo等人,1988)(Aratani等人,1992;Nairn等人,1993;Xie和Tsong,1993;Yorifuji和Mikawa,1990),但這些例子只舉例說明了轉(zhuǎn)染入細(xì)胞懸液、細(xì)胞培養(yǎng)物等之中,而此類經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不存在于軀體組織中。美國專利號4,956,288旨在用于制備包含高拷貝數(shù)的外源DNA的重組宿主細(xì)胞的方法,該方法包括在外源DNA存在下對一群細(xì)胞進(jìn)行電穿孔,培養(yǎng)所述細(xì)胞,和殺死具有低拷貝數(shù)的外源DNA的細(xì)胞。盡管不希望被理論束縛,但GHRHcDNA可以與可注射的肌源性表達(dá)載體一起遞送給小鼠肌肉,其中它可以短暫地刺激GH分泌超過2周的時間(Draghia-Akli等人,1997)。這種可注射的載體系統(tǒng)通過整合入與新型蛋白酶抗性GHRH分子(pSP-HV-GHRH)(Draghia-Akli等人,1999)偶聯(lián)的強有力的合成肌肉啟動子(Li等人,1999)而得到優(yōu)化,所述GHRH分子具有實質(zhì)上更長的半衰期和更大的GH分泌活性。優(yōu)化高效的電穿孔技術(shù)以將核酸構(gòu)建體遞送給動物的骨骼肌(Draghia-Akli等人,2002b)。利用載體設(shè)計和電脈沖質(zhì)粒遞送方法的這種組合,發(fā)明人能夠在豬中顯示出生長加速以及經(jīng)有利修飾的機體組成(Draghia-Akli等人,1999;Draghia-Akli等人,2003b)。經(jīng)修飾的GHRH核酸構(gòu)建體在患有癌癥和與癌癥治療相關(guān)的貧血的伴侶動物中增加了紅細(xì)胞的產(chǎn)生(Draghia-Akli等人,2002a)。在豬中,可獲得的數(shù)據(jù)提示,經(jīng)修飾的豬HV-GHRH類似物(SEQID#1)在促進(jìn)生長和積極的機體組成改變方面比野生型的豬GHRH更有效(Draghia-Akli等人,1999)。已經(jīng)報道了,為了增加生長激素釋放的目的而施用新型GHRH類似物蛋白(美國專利號5,847,066;5846,936;5,792,747;5,776,901;5,696,089;5,486,505;5,137,872;5,084,442,5,036,045;5,023,322;4,839,344;4,410,512,RE33,699)或者合成或天然發(fā)生的GHRH肽片段。已經(jīng)報道了包含下述突變的GHRH類似物(美國專利號5,846,936)第1位的Tyr突變?yōu)镠is;第2位的Ala突變?yōu)閂al、Leu或其他;第8位的Asn突變?yōu)镚ln、Ser或Thr;第15位的Gly突變?yōu)锳la或Leu;第27位的Met突變?yōu)镹le或Leu;以及第28位的Ser突變?yōu)锳sn。該GHRH類似物是于2003年4月22日頒發(fā)、標(biāo)題為“Super-activeporcinegrowthhormonereleasinghormoneanalog”、Schwartz等人列為發(fā)明人的美國專利6,551,996(“‘996專利”)的主題,它教導(dǎo)了包含突變的GHRH類似物的應(yīng)用,所述突變能改善引起生長激素釋放的能力。此外,‘996專利申請涉及利用施用生長激素釋放激素類似物來治療生長不足;改善生長表現(xiàn);在動物中刺激以比與正常生長相關(guān)的水平更高的水平來產(chǎn)生生長激素;以及增強生長,該專利引入本文作為參考??傊鰪娨呙缃臃N應(yīng)答和效力并改善受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果在以前是不經(jīng)濟的而且在范圍上受到限制。相關(guān)技術(shù)已顯示,利用重組蛋白技術(shù)可以以有限的容量改善這些不同的病狀,但這些治療具有一些明顯缺陷。已教導(dǎo)編碼重組蛋白的核酸表達(dá)構(gòu)建體是頻繁注射和傳統(tǒng)重組療法的高成本這些問題的可行的解決方法。本領(lǐng)域需要通過利用核酸表達(dá)構(gòu)建體來擴展對患有疾病的受試者的治療,所述核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者中并在體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定的治療性蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及對受試者進(jìn)行疫苗接種的組合物和方法;在接種疫苗前準(zhǔn)備受試者的方法;以及在已接種疫苗的受試者中改善感染性攻擊后的臨床結(jié)果的方法。本發(fā)明的具體實施方案涉及在向需要疫苗接種的受試者遞送疫苗之前或與之相伴地將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中,其中GHRH在受試者體內(nèi)表達(dá)并且受試者包括人、豬、牛、鳥或接受疫苗的其他任何動物種類。本發(fā)明的一個方面包括準(zhǔn)備需要接種疫苗的受試者的方法。這個方法包括將編碼體內(nèi)表達(dá)的GHRH的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中。本發(fā)明的優(yōu)選GHRH包括與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的序列,并且優(yōu)選的核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。本發(fā)明涵蓋的疫苗包括被殺死的微生物;活的減弱的生物;亞基抗原;類毒素抗原;綴合物抗原或當(dāng)導(dǎo)入受試者體內(nèi)時通過引起免疫系統(tǒng)的激活、抗體形成和/或造成T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞應(yīng)答而產(chǎn)生對于特定疾病的免疫性的其他類型疫苗。然而,本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括的疫苗接種包含牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體(Leptospiracanicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(Leptospiragrippotyphosa)、哈德焦鉤端螺旋體(Leptospirahardjo)、出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那鉤端螺旋體(LeptospiraPomona)bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumonia)或其組合。一般地,核酸表達(dá)構(gòu)建體可以在受試者進(jìn)行疫苗接種前最多1年遞送到受試者中,然而,這個時間可以改變。例如,在一個優(yōu)選實施方案中,核酸表達(dá)構(gòu)建體在受試者進(jìn)行疫苗接種前約0-約14天遞送。將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者組織中的一個優(yōu)選方法包括組織電穿孔。組織電穿孔的許多方法在以前已得到描述,然而,一個優(yōu)選的組織電穿孔方法包括用多個針狀電極穿透受試者的組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列并且所述受試者的組織包括肌細(xì)胞;以約0.01-5mg的量將核酸表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述多個針狀電極之間的組織中;以及對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜。另外,核酸表達(dá)構(gòu)建體還可包括促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽或帶電荷的多肽(例如,聚L-谷氨酸)。本發(fā)明的第二個方面是對受試者進(jìn)行疫苗接種的方法。這個方法包括將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中;并隨后以對于誘導(dǎo)受試者中抗疫苗抗體來說有效的量向受試者提供疫苗。優(yōu)選的GHRH表達(dá)構(gòu)建體如上所述。疫苗可以與將GHRH核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送給受試者相伴地提供或者在構(gòu)建體遞送后一段時間之后提供。在優(yōu)選實施方案中,疫苗在遞送GHRH核酸表達(dá)構(gòu)建體后最多1年遞送。本發(fā)明涵蓋的疫苗包括被殺死的微生物;活的減弱的生物;亞基抗原;類毒素抗原;綴合物抗原或當(dāng)導(dǎo)入受試者體內(nèi)時通過引起免疫系統(tǒng)的激活、抗體形成和/或造成T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞應(yīng)答而產(chǎn)生對于特定疾病的免疫性的其他類型疫苗。然而,本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括上述疫苗接種。在更優(yōu)選的實施方案中,疫苗在遞送GHRH核酸表達(dá)構(gòu)建體后約7天-約14天遞送。在另一優(yōu)選實施方案中,利用組織電穿孔將GHRH核酸表達(dá)構(gòu)建體與促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽一起遞送。本發(fā)明的第三個方面包括改善具有關(guān)節(jié)炎并接種了疫苗的受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果的方法。該方法包括用多個針狀電極穿透受試者的肌肉組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列;將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的肌肉組織中,從而使得表達(dá)的GHRH的量能有效增強疫苗接種應(yīng)答;以及對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜。將優(yōu)選范圍的0.01-5mg的核酸表達(dá)構(gòu)建體與指定濃度的聚L-谷氨酸多肽一起遞送到受試者的肌肉組織中,并且所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列。優(yōu)選的核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。優(yōu)選的疫苗包括被殺死的微生物;活的減弱的生物;亞基抗原;類毒素抗原;綴合物抗原或當(dāng)導(dǎo)入受試者體內(nèi)時通過引起免疫系統(tǒng)的激活、抗體形成和/或造成T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞應(yīng)答而產(chǎn)生對于特定疾病的免疫性的其他類型疫苗。本發(fā)明的第四個方面包括含有編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體和疫苗的組合物。優(yōu)選的核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。優(yōu)選的疫苗包括被殺死的微生物;活的減弱的生物;亞基抗原;類毒素抗原;綴合物抗原或當(dāng)導(dǎo)入受試者體內(nèi)時通過引起免疫系統(tǒng)的激活、抗體形成和/或造成T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞應(yīng)答而產(chǎn)生對于特定疾病的免疫性的其他類型疫苗。附圖簡述圖1顯示了用不同濃度的表達(dá)SEAP的質(zhì)粒注射豬后分泌型堿性磷酸酶(“SEAP”)蛋白質(zhì)的血漿水平。圖2顯示了在對照和經(jīng)pSP-HV-GHRH處理的動物中的葡萄糖和胰島素水平。圖3的圖版A和圖版B顯示了處理后第0和18天時CD2+細(xì)胞和CD4+CD45R+幼稚T細(xì)胞的百分比,圖版C顯示了在處理后300天時CD45R+/CD45R-幼稚T細(xì)胞的比率,其中值以平均值±SEM表示,*P<0.001。圖4顯示在接受了GHRH質(zhì)粒的牛中用Surround-9way疫苗(Biocor)進(jìn)行疫苗接種14天后,與對照動物相比,CD4+/CD8+比率顯著增加,所述對照動物在相同時間段中CD4+/CD8+比率下降,P<0.05。圖5顯示在接受了GHRH質(zhì)粒的動物中于Surround9-way(Biocor)疫苗接種14天后,與對照動物相比,幼稚T細(xì)胞的相對比例增加,P<0.05。圖6顯示了在60至80DIM時用pSP-HV-GHRH處理的小母牛與對照比較的身體狀況得分。身體狀況得分在處理組之間不同,P<0.0001。圖7顯示了用表達(dá)pSP-HV-GHRH的質(zhì)粒處理的動物在注射后不同時間點上與對照比較的體重。圖8顯示了pAV0224表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖9顯示了pAV0225表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖10顯示了pAV0235表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖11顯示了pAV0236表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖12顯示了pAV0238表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖13顯示了pAV0239表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖14顯示了pAV0240表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖15顯示了pAV0241表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖16顯示了pAV0249表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。圖17顯示了pAV0226表達(dá)質(zhì)粒的限制性圖譜。優(yōu)選實施方案的詳述對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,顯而易見的是,可以對此處所公開的本發(fā)明進(jìn)行各種替代和修改而不背離本發(fā)明的范圍和精神。如本文說明書中所使用的,術(shù)語“a”或“an”可以指一個或多個。如本文權(quán)利要求中所使用的,當(dāng)與詞語“包括或者包含”結(jié)合使用時,詞語“a”或“an”可以指一個或超過一個。如本文所使用的,“另一個”可以指至少第二個或更多。如本文所使用的,術(shù)語“類似物”包括GHRH的任何突變體,或者合成的或天然發(fā)生的GHRH肽片段,例如HV-GHRH(SEQID#1)、豬-GHRH(SEQID#2)、牛-GHRH(SEQID#3)、犬-GHRH(SEQID#4)、貓-GHRH(SEQID#5)、TI-GHRH(SEQID#6)、羊-GHRH(SEQID#7)、雞-GHRH(SEQID#8)、馬-GHRH(SEQID#9)、TV-GHRH(SEQID#11)、15/27/28-GHRH(SEQID#12)、人GHRH(1-44)NH2(SEQID#13)、人GHRH(1-40)OH(SEQID#10)形式,或不少于(1-29)個氨基酸的任何更短的形式。如本文所使用的,術(shù)語“體脂肪比例”被定義為軀體脂肪質(zhì)量除以總體重。如本文所使用的,術(shù)語“身體狀況得分”(BCS)被定義為評估馬或任何其他家畜的總體營養(yǎng)和管理的方法。如本文所使用的,術(shù)語“盒”被定義為一個或多個轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。如本文所使用的,術(shù)語“細(xì)胞轉(zhuǎn)染脈沖”被定義為導(dǎo)致載體例如線性DNA片段轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的力量傳輸。在一些實施方案中,力量來自電,如在電穿孔中,或者力量來自血管壓力。如本文所使用的,術(shù)語“編碼區(qū)”指被轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)并隨后被翻譯為具有特定多肽特征的氨基酸序列的DNA序列的任何部分。如本文所使用的,術(shù)語“遞送”被定義為在有壓力下或無壓力的情況下通過化學(xué)或生物方法、注射、混合、電穿孔、聲波穿孔或其組合,將材料導(dǎo)入組織、受試者、細(xì)胞或任何受者中的手段。如本文所使用的,術(shù)語“患有慢性疾病的”被定義為具有下述病狀的患者例如慢性阻塞性肺病、慢性心力衰竭、中風(fēng)、癡呆、髖骨骨折后的恢原、慢性腎衰竭、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、以及老年人中的多重病癥,所述病狀一個月一次由醫(yī)生出診和/或住院治療,持續(xù)至少2年。如本文所使用的,術(shù)語“供體受試者”指動物界中的任何物種,其中細(xì)胞被取出并且在受試者體外以有生活力的狀態(tài)維持任何一段時間。如本文所使用的,術(shù)語“供體細(xì)胞”指被取出并在供體受試者體外以有生活力的狀態(tài)維持任何一段時間的細(xì)胞。如本文所使用的,術(shù)語“電穿孔”指利用電脈沖將核酸序列遞送入細(xì)胞內(nèi)的方法。如本文所使用的,術(shù)語“電脈沖”和“電穿孔”指對組織或細(xì)胞施加電流以便將核酸分子攝入細(xì)胞內(nèi)。技術(shù)人員將認(rèn)識到,這些術(shù)語與術(shù)語“脈沖電場”、“脈沖電流裝置”和“脈沖電壓裝置”相關(guān)。技術(shù)人員將認(rèn)識到,電脈沖的量和持續(xù)時間取決于受者受試者的組織、大小和總體健康狀態(tài),并且進(jìn)一步知道如何憑經(jīng)驗確定此類參數(shù)。如本文所使用的,術(shù)語“編碼的GHRH”是生長激素釋放激素的有生物學(xué)活性的多肽。如本文所使用的,術(shù)語“增強的疫苗接種應(yīng)答”包括通過允許免疫系統(tǒng)的更快激活、抗體的更快形成、更高的抗體滴度、T-細(xì)胞應(yīng)答增強和/或B-細(xì)胞應(yīng)答增強而獲得的增強了的對于特定疾病的免疫力。如本文所使用的,術(shù)語GHRH的“功能性生物學(xué)等價物”是這樣的多肽,其具有與野生型GHRH多肽不同的氨基酸序列,而同時具有當(dāng)與GHRH多肽相比較時類似或改進(jìn)的生物學(xué)活性。功能性生物學(xué)等價物可以是天然發(fā)生的或者它可以是被個別修飾的。技術(shù)人員將認(rèn)識到,如本文所使用的,類似或改進(jìn)的生物學(xué)活性指促進(jìn)和/或釋放生長激素或其他垂體激素。技術(shù)人員將認(rèn)識到,在一些實施方案中,編碼的GHRH功能性生物學(xué)等價物是這樣的多肽,其已被改造為含有不同的氨基酸序列,而同時具有當(dāng)與GHRH多肽相比較時類似或改進(jìn)的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域已知的用于改造此類序列的方法包括定點誘變。如本文所使用的,術(shù)語“生長激素”(“GH”)被定義為與生長相關(guān)并且作為化學(xué)信使以對靶細(xì)胞發(fā)揮其作用的激素。在一個具體的實施方案中,生長激素通過生長激素釋放激素的作用而得到釋放。如本文所使用的,術(shù)語“生長激素釋放激素”(“GHRH”)被定義為促進(jìn)或刺激生長激素釋放的激素,并且以小得多的范圍來說為其他垂體激素例如催乳素。如本文所使用的,術(shù)語“異源核酸序列”被定義為包括不同調(diào)節(jié)和表達(dá)元件的DNA序列。如本文所使用的,術(shù)語“免疫療法”指促進(jìn)或增強機體免疫系統(tǒng)以形成保護(hù)性抗體的任何治療,它將減少醫(yī)學(xué)病狀的癥狀、阻止感染性病狀在受試者中的發(fā)展和/或減少對于藥物治療的需要。如本文所使用的,術(shù)語“修飾的細(xì)胞”被定義為來自受試者且含有導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的另外核酸序列的細(xì)胞。如本文所使用的,術(shù)語“修飾的供體細(xì)胞”指已具有被遞送的編碼GHRH的核酸序列的任何供體細(xì)胞。如本文所使用的,術(shù)語“分子開關(guān)”指可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的被遞送到受試者中的分子。如本文所使用的,術(shù)語“核酸表達(dá)構(gòu)建體”指任何類型的分離的基因構(gòu)建體,其包含編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸。術(shù)語“表達(dá)載體”在本文還可以互換使用。在具體實施方案中,分離的核酸表達(dá)構(gòu)建體包含啟動子;目的核苷酸序列;以及3’非翻譯區(qū);其中啟動子、目的核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)是有效連接的;并且目的核苷酸序列的體內(nèi)表達(dá)由啟動子調(diào)節(jié)。如本文所使用的,術(shù)語“DNA片段”指基本上為雙鏈的DNA分子。盡管片段可以通過本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手段來產(chǎn)生,但在一些實施方案中,DNA片段或表達(dá)構(gòu)建體通過親本DNA分子的限制性消化來產(chǎn)生。術(shù)語“表達(dá)載體”、“表達(dá)盒”或“表達(dá)質(zhì)?!币部苫Q使用。盡管親本分子可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)DNA試劑,但在一些實施方案中,親本DNA分子是質(zhì)粒。如本文所使用的,術(shù)語“有效連接的”指核酸序列中的元件或結(jié)構(gòu)通過操作能力而不是物理位置進(jìn)行連接。元件或結(jié)構(gòu)能夠完成所需操作或以完成所需操作為特征。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到,核酸序列中的元件或結(jié)構(gòu)不必以串連或鄰接順序來有效連接。如本文所使用的,術(shù)語“聚L-谷氨酸(“PLG”)指L-谷氨酸的生物可降解聚合物,其適合用作通過利用或不利用電穿孔將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的載體或佐劑。如本文所使用的,術(shù)語“注射后”指這樣的時間段,其位于將包含編碼GHRH或其生物學(xué)等價物的異源核酸序列的核酸盒導(dǎo)入受試者細(xì)胞內(nèi)之后,并允許編碼的基因進(jìn)行表達(dá)而修飾的細(xì)胞仍在活生物體內(nèi)。如本文所使用的,術(shù)語“質(zhì)粒”一般指可以不依賴染色體DNA進(jìn)行復(fù)制的包含染色體外遺傳物質(zhì)(通常為DNA環(huán)狀雙鏈體)的構(gòu)建物。質(zhì)粒或其片段可以用作載體。質(zhì)粒是存在于或來源于細(xì)菌以及(罕有地)其他微生物的雙鏈DNA分子。然而,線粒體和葉綠體DNA、酵母殺手(yeastkiller)以及其他情況通常被排除在外。如本文所使用的,術(shù)語“質(zhì)粒介導(dǎo)的基因補充給藥法”指在體內(nèi)通過利用核酸表達(dá)構(gòu)建體而允許受試者延長暴露于治療范圍的治療蛋白質(zhì)的方法。如本文所使用的,術(shù)語“脈沖電壓裝置”或“脈沖電壓注射裝置”涉及通過向細(xì)胞發(fā)射局部化的電脈沖而能夠?qū)е禄驅(qū)е潞怂岱肿訑z入生物體細(xì)胞內(nèi)的設(shè)備。隨后,細(xì)胞膜變得不穩(wěn)定,形成通道或孔。這種類型的常規(guī)裝置被標(biāo)準(zhǔn)化以允許人們選擇或調(diào)整所需的電壓幅度和脈沖電壓的持續(xù)時間。脈沖電壓裝置的主要作用是該裝置促進(jìn)將本發(fā)明的組合物特別是線性DNA片段遞送到生物體細(xì)胞內(nèi)的能力。如本文所使用的,術(shù)語“質(zhì)粒骨架”指通常包含細(xì)菌復(fù)制起點和細(xì)菌抗生素選擇基因(其是只有轉(zhuǎn)化了適當(dāng)質(zhì)粒的細(xì)菌的特異生長所必需的)的DNA序列。然而,存在被稱為小環(huán)(mini-circle)的質(zhì)粒,其缺少抗生素抗性基因和復(fù)制起點(Darquet等人,1997;Darquet等人,1999;Soubrier等人,1999)。體外擴增的表達(dá)質(zhì)粒DNA(即非病毒表達(dá)系統(tǒng))的使用避免了與病毒載體相關(guān)的風(fēng)險。由于使用“物種特異性”組分用于基因遞送,所以非病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物一般具有低毒性,這使得通常與病毒載體相關(guān)的免疫原性風(fēng)險降至最低。本發(fā)明的一個方面是質(zhì)粒骨架不包含病毒核苷酸序列。如本文所使用的,術(shù)語“啟動子”指指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子可以指導(dǎo)原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是“誘導(dǎo)型的”,其對于誘導(dǎo)劑作出響應(yīng)而起始轉(zhuǎn)錄,或者,相反地,啟動子可以是“組成型的”,由此誘導(dǎo)劑無法調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速度。啟動子可以以組織特異性或組織優(yōu)先的方式進(jìn)行調(diào)節(jié),從而使得它只在轉(zhuǎn)錄特定組織類型中的有效連接的編碼區(qū)時才是有活性的。如本文所使用的,術(shù)語“生活質(zhì)量”或“健康相關(guān)的生活質(zhì)量”指被患者及其監(jiān)護(hù)者重視的那些性質(zhì),包括他們綜合的舒適和安康;他們能夠維持適當(dāng)?shù)纳眢w、感情和智力功能的程度;他們保持其參與家庭內(nèi)、工作場所中以及社區(qū)中有價值活動的能力的程度。如本文所使用的,術(shù)語受試者的“幸?!敝赋蔀榛蜃龅煤芎?,在功能水平執(zhí)行任務(wù)和活動的狀態(tài);健康、快樂和舒適的情況;安康;順利。如本文所使用的,術(shù)語“復(fù)制元件”包含將會導(dǎo)致質(zhì)粒在特定宿主中復(fù)制的核酸序列。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到,復(fù)制元件可以包括,但不限于,選擇性標(biāo)記基因啟動子、核糖體結(jié)合位點、選擇性標(biāo)記基因序列和復(fù)制起點。如本文所使用的,術(shù)語“殘留的線性質(zhì)粒骨架”包括在使得核酸表達(dá)質(zhì)粒變成線性的過程結(jié)束時留下的質(zhì)粒骨架的任何片段。如本文所使用的,術(shù)語“受者受試者”指可以從供體受試者將修飾的供體細(xì)胞導(dǎo)入其中的動物界的任何物種。如本文所使用的,術(shù)語“調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)”指可以用于控制基因表達(dá)并且對于誘導(dǎo)劑作出響應(yīng)而增加轉(zhuǎn)錄速度的任何蛋白質(zhì)。如本文所使用的,術(shù)語“促分泌素”指刺激分泌的藥劑。例如,生長激素促分泌素是當(dāng)遞送到動物內(nèi)時刺激垂體釋放生長激素的任何分子。生長激素釋放激素是生長激素促分泌素。如本文所使用的,術(shù)語“受試者”或“動物”指動物界中的任何物種。在優(yōu)選實施方案中,它更具體地指人和馴養(yǎng)動物,所述馴養(yǎng)動物用于寵物(例如貓、犬等);工作(例如馬等);食物(牛、雞、魚、羊、豬等);以及本領(lǐng)域已知的所有其他用途。如本文所使用的,術(shù)語“組織”指類似細(xì)胞和它們周圍的細(xì)胞間物質(zhì)的集合。技術(shù)人員將認(rèn)識到,組織是用于執(zhí)行特殊功能的類似地特化的細(xì)胞的聚集體。對于本發(fā)明的范圍,術(shù)語組織不指細(xì)胞系、細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個具體的實施方案中,組織在體內(nèi)進(jìn)行電穿孔。在另一實施方案中,組織不是植物組織。技術(shù)人員將認(rèn)識到,機體內(nèi)存在4種基本組織1)上皮組織;2)結(jié)締組織,包括血液、骨和軟骨;3)肌肉組織;以及4)神經(jīng)組織。在一個具體的實施方案中,方法和組合物旨在通過電穿孔將線性DNA轉(zhuǎn)移到肌肉組織中。如本文所使用的,術(shù)語“治療元件”包括將會導(dǎo)致所編碼的基因產(chǎn)物的體內(nèi)表達(dá)的核酸序列。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到,治療元件可以包括,但不限于,啟動子序列、轉(zhuǎn)基因、polyA序列或者3’或5’UTR。如本文所使用的,術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)。在一些實施方案中,細(xì)胞不是植物組織或者酵母細(xì)胞。如本文所使用的,術(shù)語“載體”指將核酸遞送到細(xì)胞或生物體中的任何媒介物。實例包括質(zhì)粒載體、病毒載體、脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)。該術(shù)語還指包括遺傳物質(zhì)的構(gòu)建物,其設(shè)計為通過將核酸序列遞送到細(xì)胞內(nèi)來直接轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞。載體可以包含與其他必需元件在位置上和順序上定向的多個基因元件,從而使得內(nèi)含的核酸盒可以在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并且當(dāng)需要時進(jìn)行翻譯。這些元件是有效連接的。術(shù)語“表達(dá)載體”指包含對于在異源細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)所需的所有信息的DNA質(zhì)粒。如本文所使用的,術(shù)語“病毒性骨架”指不包含啟動子、基因和3’polyA信號或非翻譯區(qū),但包含下述元件的核酸序列,所述元件包括但不限于,位點特異性基因組整合Rep和反向末端重復(fù)(“ITRs”)或用于逆轉(zhuǎn)錄的tRNA引物的結(jié)合位點,或當(dāng)在體內(nèi)插入時誘導(dǎo)病毒免疫原性應(yīng)答、允許整合、影響組織特異型啟動子的特異性和活性、導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默或?qū)κ茉囌咴斐砂踩L(fēng)險的核酸序列組分。術(shù)語“血管壓力脈沖”指來自大容積液體的壓力脈沖以促進(jìn)載體攝入細(xì)胞內(nèi)。技術(shù)人員將認(rèn)識到,血管壓力脈沖的量和持續(xù)時間取決于受者動物的組織、大小和總體健康狀態(tài),并且進(jìn)一步知道如何憑經(jīng)驗確定此類參數(shù)。如本文所使用的,術(shù)語“疫苗”指被殺死的微生物,活的減弱的生物,亞基抗原,類毒素抗原,綴合物抗原或當(dāng)導(dǎo)入受試者體內(nèi)時通過引起免疫系統(tǒng)的激活、抗體形成和/或造成T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞應(yīng)答而產(chǎn)生對于特定疾病的免疫性的其他類型抗原分子的任何制劑。一般地,針對微生物的疫苗指向病毒、細(xì)菌、寄生蟲、支原體或其他傳染劑的至少一部分。對于特定病原體的疫苗接種或免疫接種的功效以及在感染性攻擊后的臨床結(jié)果對于人和動物醫(yī)學(xué)具有特別的重要性。本發(fā)明的一個具體實施方案是增強對于疫苗接種的應(yīng)答的方法。該方法包括用多個針狀電極穿透受試者的肌肉組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列;將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的肌肉組織中,從而使得表達(dá)的GHRH的量能有效增強對于特定疫苗接種的應(yīng)答;以及對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜。將0.01-5mg的核酸表達(dá)構(gòu)建體與指定濃度的聚L-谷氨酸多肽一起遞送到受試者的肌肉組織中,并且所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列。優(yōu)選的受試者包括人、反芻動物、食物動物、馬或工作動物。雖然存在對于疫苗接種的應(yīng)答得到增強的許多指標(biāo),但少數(shù)實例包括特異性抗體滴度增加、在感染性攻擊后應(yīng)答更快速、臨床結(jié)果改善或其組合。本發(fā)明的其他具體實施方案涵蓋了將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者組織中的各種方式(例如,電穿孔法,病毒載體,與承載體(carrier)相結(jié)合,通過腸胃外途徑,或其組合)。第二個優(yōu)選的實施方案包括以單劑量遞送核酸表達(dá)構(gòu)建體,并且所述單劑量包含總量約0.01-5mg的核酸表達(dá)構(gòu)建體。一般地,將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中,包括二倍體細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)。在第三個具體實施方案中,用于轉(zhuǎn)染的核酸表達(dá)構(gòu)建體包括wt-豬-GHRH質(zhì)粒(SEQID#26)。其他具體實施方案利用其他核酸表達(dá)構(gòu)建體(例如,優(yōu)化的牛GHRH質(zhì)粒,pAV0236(SEQID#28);TI-GHRH質(zhì)粒,pAV0239(SEQID#30);HV-GHRH質(zhì)粒,pAV0224(SEQID#25);羊GHRH質(zhì)粒,pAV0240(SEQID#31);雞GHRH質(zhì)粒,pAV0241(SEQID#32);犬GHRH質(zhì)粒,pAV0235(SEQID#27);貓GHRH質(zhì)粒,pAV0238(SEQID#29);馬GHRH質(zhì)粒,pAV0249(SEQID#33);人GHRH質(zhì)粒,pAV0226(SEQID#34)。在第四個具體實施方案中,核酸表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包括促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽(例如帶電荷的多肽,或聚L-谷氨酸)。將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者組織中后,編碼的GHRH或其功能性生物學(xué)等價物開始進(jìn)行表達(dá)。編碼的GHRH包括生物學(xué)活性多肽;并且編碼的GHRH功能性生物學(xué)等價物是這樣的多肽,其已被改造為含有不同的氨基酸序列,而同時具有當(dāng)與GHRH多肽相比較時類似或改進(jìn)的生物學(xué)活性。具體的編碼的GHRH或其功能性生物學(xué)等價物的一個實施方案具有式(SEQID#14)。動物包括人、食物動物、工作動物(例如豬、牛、綿羊、山羊或雞)、或?qū)櫸?例如犬、貓、馬)。本發(fā)明還涉及用于改善患者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果的方法。本發(fā)明的一般方法包括用質(zhì)粒介導(dǎo)的基因補充給藥法治療受試者。該方法包括將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)或其功能性生物學(xué)等價物的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織例如肌肉中。本發(fā)明的具體實施方案旨在通過質(zhì)粒介導(dǎo)的GHRH補充給藥法來改善被治療的受試者中的疫苗接種應(yīng)答。質(zhì)粒注射可以在特定疫苗接種之前進(jìn)行或與其相伴進(jìn)行。GHRH或其生物學(xué)等價物隨后在受試者中的體內(nèi)表達(dá)足以改善疫苗接種應(yīng)答。因此,如果感染性攻擊發(fā)生在較后的日期,那么臨床結(jié)果明顯得到改善。通過將多個電極放置在所選擇的組織中,隨后將核酸表達(dá)構(gòu)建體在介于所述多個電極之間的區(qū)域中遞送給所選組織,并在其中遞送了核酸表達(dá)構(gòu)建體的所選組織的區(qū)域中向所選組織施加細(xì)胞轉(zhuǎn)染脈沖(例如電脈沖),還可以增強這種方法。但是,細(xì)胞轉(zhuǎn)染脈沖不必是電脈沖,也可利用一種不同的方法例如血管壓力脈沖。電穿孔、直接注射、基因槍或金顆粒轟擊也可在具體實施方案中用于將編碼GHRH或生物學(xué)等價物的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者中。在本發(fā)明中的受試者包括動物(例如,人、豬、馬、牛、小鼠、大鼠、猴、綿羊、山羊、犬或貓)。重組GH替代療法廣泛用于農(nóng)業(yè)和臨床中,具有有利的作用,但一般而言,劑量是超生理學(xué)的。此類劑量提高的重組GH與有害的副作用相關(guān),例如,高達(dá)30%的經(jīng)重組GH治療的患者以較高頻率形成了胰島素耐受性(Gopinath和Etherton,1989a;Gopinath和Etherton,1989b;Verhelst等人,1997)或在兒科患者中加速的骨骺生長和閉合(Blethen和Rundle,1996)。此外,循環(huán)性GH的分子異質(zhì)性在生長和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中可能具有重要的關(guān)聯(lián)(Satozawa等人,2000;Tsunekawa等人,1999;Wada等人,1998)。不希望的副作用是由于用重組外源性GH蛋白質(zhì)進(jìn)行治療提高了GH的基礎(chǔ)水平并且消除了自然的GH偶發(fā)性脈動。與此相反,沒有關(guān)于重組GHRH療法的副作用的報道。垂體門脈循環(huán)中的GHRH的正常水平為約150-800pg/ml,而該激素的全身性循環(huán)值最多為約100-500pg/ml。具有由顱外腫瘤引起的肢端肥大癥的一些患者具有將近高100倍的水平(例如50ng/ml的免疫反應(yīng)性GHRH)(Thorner等人,1984)。在兒童和老年人中使用重組GHRH療法的長期研究(1-5年)已顯示沒有傳統(tǒng)的GH副作用,例如空腹葡萄糖濃度的改變,或者在兒科患者中加速的骨骺生長和閉合或首股骨骺滑脫(Chevalier等人,2000)(Duck等人,1992;Vittone等人,1997)。人、綿羊或豬中的研究顯示,重組GHRH蛋白質(zhì)的連續(xù)輸注恢復(fù)了正常GH模式,而不會使GHRH受體脫敏或消耗GH供應(yīng)(Dubreuil等人,1990)。因為這個系統(tǒng)具有一定程度的反饋,這在GH療法中被消除,所以GHRH重組蛋白質(zhì)療法可能比GH療法更符合生理學(xué)??墒牵捎贕HRH在體內(nèi)短暫的半衰期,頻繁的(一天1-3次)靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)(要求高300倍的劑量)施用是必需的(Evans等人,1985;Thorner等人,1986b)。因此,作為長期療法,重組GHRH蛋白質(zhì)施用不可行。然而,質(zhì)粒介導(dǎo)的補充給藥法可以克服這種對于GHRH使用的局限。選擇GHRH用于基因治療應(yīng)用由下述事實支持對于人、豬、牛和其他物種已表征了該基因、cDNA以及天然的和幾種突變的分子(Bohlen等人,1983;Guillemin等人,1982);貓、犬和馬特異性GHRH的cDNA已被分離。治療效果的測量是簡單明了且明確的。在用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的非病毒技術(shù)中,將質(zhì)粒DNA直接注射到肌肉中是簡單、價廉且安全的。在簡單的直接注射后低效的DNA攝入肌纖維中導(dǎo)致相對低的表達(dá)水平(Prentice等人,1994;Wells等人,1997)。此外,轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時間是短暫的(Wolff等人,1990)。以前最成功的臨床應(yīng)用被限制于疫苗(Danko和Wolff,1994;Tsurumi等人,1996)。近來,利用電穿孔技術(shù)獲得了增強質(zhì)粒體內(nèi)遞送并隨后達(dá)到分泌型蛋白的生理學(xué)水平的重要進(jìn)展。電穿孔已非常成功地用于在質(zhì)粒注射后轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(Lucas等人,2002;Matsubara等人,2001)或用于在人中將抗腫瘤藥物博來霉素遞送給皮膚和皮下腫瘤(Gehl等人,1998;Heller等人,1996)。電穿孔還在小鼠(Lesbordes等人,2002;Lucas等人,2001;Vilquin等人,2001)、大鼠(Terada等人,2001;Yasui等人,2001)和犬(Fewell等人,2001)中廣泛用于遞送編碼各種激素、細(xì)胞因子或酶的治療性基因。我們利用生長激素釋放激素(GHRH)所進(jìn)行的先前研究顯示,使用電穿孔的質(zhì)粒療法是可擴縮的并且代表了在大型動物和人中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和受調(diào)節(jié)的分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人,1999;Draghia-Akli等人,2002c)。電穿孔還已經(jīng)廣泛用于嚙齒動物和其他小型動物中(Bettan等人,2000;Yin和Tang,2001)。已觀察到電極構(gòu)造影響電場分布以及后續(xù)結(jié)果(Gehl等人,1999;Miklavcic等人,1998)。初步實驗指出,對于大型動物或人,針狀電極一致地產(chǎn)生比外部鉗狀電極更好的可重復(fù)的結(jié)果。如上所述,電穿孔增強質(zhì)粒攝入骨骼肌的能力已被充分證明。此外,已觀察到用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)配制的質(zhì)粒在小鼠、大鼠和犬的骨骼肌中使基因轉(zhuǎn)染并從而使基因表達(dá)增至高達(dá)10倍(Fewell等人,2001;Mumper等人,1998)。盡管不希望被理論束縛,但PLG將會增加電穿孔過程中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,不僅通過穩(wěn)定質(zhì)粒DNA以及促進(jìn)經(jīng)過膜孔的胞內(nèi)運輸,還通過活性機制。例如,細(xì)胞上帶正電荷的表面蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而與連接至質(zhì)粒DNA的帶負(fù)電荷的PLG復(fù)合。當(dāng)施加電場時,表面蛋白質(zhì)倒轉(zhuǎn)方向并且活躍地內(nèi)在化DNA分子,這個過程實質(zhì)上增加了轉(zhuǎn)染效率。盡管不希望被理論束縛,但本文所描述的用于增強疫苗接種應(yīng)答并且改善患者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果的質(zhì)粒補充給藥法提供了超越直接注射重組GH或GHRH蛋白質(zhì)的局限的優(yōu)點。GHRH或GHRH的新型生物學(xué)等價物的表達(dá)可以通過由合成的肌肉特異性啟動子控制的表達(dá)質(zhì)粒來指導(dǎo)。此類GHRH或其生物學(xué)等價物的表達(dá)引發(fā)了受試者中的高GH和IGF-I水平,所述受試者已通過肌內(nèi)注射或體內(nèi)電穿孔而將編碼序列遞送到細(xì)胞中。盡管體內(nèi)電穿孔是將異源核酸編碼系統(tǒng)導(dǎo)入受試者細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)選方法,但存在其他方法且應(yīng)當(dāng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員了解(例如電穿孔、lipofectamine、磷酸鈣、離體轉(zhuǎn)化、直接注射、DEAE葡聚糖、超聲處理加載、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊等)。例如,還可以通過下列步驟將編碼GHRH或其功能性生物學(xué)等價物的核酸序列直接導(dǎo)入受試者的細(xì)胞中首先從受試者或供體的機體取出細(xì)胞,將細(xì)胞維持在培養(yǎng)物中,隨后通過各種方法(例如電穿孔、lipofectamine、磷酸鈣、離體轉(zhuǎn)化、直接注射、DEAE葡聚糖、超聲處理加載、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊等)導(dǎo)入該核酸編碼系統(tǒng),最后將修飾的細(xì)胞再次導(dǎo)入最初的受試者或其他宿主受試者中(離體方法)。GHRH序列可以被克隆到腺病毒載體或腺相關(guān)載體中,并通過簡單的肌內(nèi)注射或經(jīng)靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)遞送。攜帶GHRH序列的質(zhì)粒DNA可以與陽離子脂質(zhì)或脂質(zhì)體復(fù)合,并經(jīng)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下遞送。如本文所使用的,施用指將DNA的載體或承載體導(dǎo)入機體內(nèi)的途徑。施用可以直接至靶組織或在全身施用后通過對靶組織的靶向遞送而至靶組織。特別地,本發(fā)明可以用于通過將載體施用于機體來改善受試者中的疫苗接種應(yīng)答,所述載體的施用是為了建立對于質(zhì)粒介導(dǎo)的補充給藥法有用的任何特定核酸序列在組織中在一定水平上的受控表達(dá)。用于施用載體的優(yōu)選手段和用于遞送的制劑的應(yīng)用在上文中得到描述。在以溶液、懸浮液或膠體形式簡單注射DNA顆粒到肌肉內(nèi)后,肌細(xì)胞具有從細(xì)胞外間隙攝入DNA的獨特能力。通過這種方法表達(dá)DNA可以持續(xù)數(shù)月。DNA攝入肌細(xì)胞內(nèi)可通過利用體內(nèi)電穿孔而被進(jìn)一步增強。所配制的DNA載體的遞送包括將DNA整合到大分子復(fù)合物中,所述大分子復(fù)合物經(jīng)歷靶細(xì)胞的胞吞作用。此類復(fù)合物可以包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、合成的有機化合物或無機化合物。用載體形成的復(fù)合物的特征(大小、電荷、表面特征、組成)決定了載體在機體內(nèi)的生物利用率。制劑的其他成份用作與細(xì)胞表面上或內(nèi)部的特異性受體相互作用的配體。制劑的其他成份用于增強進(jìn)入細(xì)胞、從內(nèi)體中釋放和進(jìn)入細(xì)胞核。遞送還可以通過DNA轉(zhuǎn)運體的使用。DNA轉(zhuǎn)運體指與DNA載體結(jié)合并能夠被表皮細(xì)胞吸收的分子。DNA轉(zhuǎn)運體包含能夠與DNA非共價結(jié)合且有效將DNA轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的分子復(fù)合物。優(yōu)選地,轉(zhuǎn)運體還將DNA轉(zhuǎn)運通過核膜。參見,例如,下述申請,所有這些申請(包括附圖)引入本文作為參考(1)Woo等人,標(biāo)題為″ADNATransporterSystemandMethodofUse″的美國專利號6,150,168;(2)Woo等人,于1993年3月19日提交、標(biāo)題為″ADNATransporterSystemandmethodofUse″的PCT/US93/02725;(3)Woo等人,美國專利號6,177,554,″NucleicAcidTransporterSystemsandMethodsofUse″;(4)Szoka等人,標(biāo)題為″Self-AssemblingPolynucleotideDeliverySystem″的美國專利號5,955,365;以及(5)Szoka等人,于1993年4月5日提交、標(biāo)題為″Self-AssemblingPolynucleotideDeliverySystem″的PCT/US93/03406。另一種遞送方法牽涉DNA轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)。DNA轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)由包含幾種成份的顆粒組成,所述成份獨立地且非共價地與DNA結(jié)合。每個成份由識別特異性受體的配體或其他功能性基團(tuán)例如與結(jié)合DNA的陽離子基團(tuán)復(fù)合的蛋白質(zhì)組成。可以使用的陽離子的例子有精胺、精胺衍生物、組蛋白、陽離子肽和/或聚賴氨酸;一個成份能夠與DNA載體以及靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體結(jié)合。此類成份的例子是與脫唾液酸糖蛋白受體、葉酸受體、甘露糖-6-磷酸受體或肉堿受體相互作用的有機化合物。第二個成份能夠與DNA載體以及核膜上的受體結(jié)合。核配體能夠識別并將轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)運輸通過核膜。此類配體的一個例子是來自SV40大T抗原或組蛋白的核靶向序列。第三個成份能夠與DNA載體以及誘導(dǎo)游離體裂解的成份結(jié)合。實例包括滅活的病毒顆粒例如腺病毒、與流感病毒血凝素相關(guān)的肽、或上文引用的Skoka專利中描述的GALA肽。施用還可涉及脂質(zhì)。脂質(zhì)可以形成脂質(zhì)體,它是中空球狀囊泡,由以單層、雙層或多層形式排列的脂質(zhì)以及用于捕獲水溶性化合物例如DNA的內(nèi)部含水空間組成,直徑大小為0.05微米至數(shù)微米。脂質(zhì)不形成脂質(zhì)體也可以是有用的。具體例子包括陽離子脂質(zhì)和包含DOPE的復(fù)合物的使用,其與DNA以及與靶細(xì)胞的膜相互作用以促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?;蜻f送還可通過移植經(jīng)基因改造的細(xì)胞來完成。例如,被稱為成肌細(xì)胞的未成熟的肌細(xì)胞可以用于攜帶基因進(jìn)入肌纖維。經(jīng)基因改造為表達(dá)重組人生長激素的成肌細(xì)胞可以將生長激素分泌到動物血液中。整合的基因的分泌可以持續(xù)高達(dá)3個月的時間段。成肌細(xì)胞最終分化并融合為現(xiàn)有的肌肉組織。因為細(xì)胞被整合入現(xiàn)有結(jié)構(gòu)中,所以它不僅是被耐受的而且是被培養(yǎng)的。通過提取來自需要質(zhì)粒介導(dǎo)的補充給藥法的個體的肌肉組織可以容易地獲得成肌細(xì)胞,并且經(jīng)基因改造的細(xì)胞還可以容易地放回去而不引起患者肌肉損傷。類似地,角質(zhì)形成細(xì)胞可以用于將基因遞送給組織。大量的角質(zhì)形成細(xì)胞可以通過小活組織檢查物的培養(yǎng)來產(chǎn)生。培養(yǎng)物可以制備為成層的薄片,并且當(dāng)移植給人時產(chǎn)生表皮,所述表皮持續(xù)改善組織質(zhì)量許多年。在培養(yǎng)時通過用合適的載體轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞而對角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行基因改造。盡管角質(zhì)形成細(xì)胞通過將表皮與真皮分開的基底膜而與循環(huán)分隔開,但人角質(zhì)形成細(xì)胞將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌到循環(huán)中。遞送還可涉及病毒載體的使用。例如,通過用本發(fā)明中所述的載體元件(包括啟動子、5’UTR,3’UTR和核酸盒)替代病毒基因組的E1和E3區(qū),并將這個重組基因組導(dǎo)入293細(xì)胞中,可以構(gòu)建腺病毒載體,所述293細(xì)胞將把這個基因包裝入感染性病毒顆粒。來自這種細(xì)胞的病毒隨后可以用于感染離體或體內(nèi)組織以將該載體導(dǎo)入組織中,導(dǎo)致核酸盒中的基因的表達(dá)。載體術(shù)語“載體”用于指可以向其中插入核酸序列以導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的承載體核酸分子,在一些實施方案中,它可以在所述細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。核酸序列對于動物可以是天然的,或者它可以是“外源的”,這表示它對于將向其中導(dǎo)入載體的細(xì)胞來說是外來的,或者表示該序列與細(xì)胞中的序列是同源的,但位于在那里通常找不到該序列的宿主細(xì)胞核酸內(nèi)位置處。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)、線性DNA片段以及人工染色體(例如,YACs、BACs),盡管在一個優(yōu)選實施方案中,載體基本上不包含病毒序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會是經(jīng)良好訓(xùn)練的,以通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來構(gòu)建載體。術(shù)語“表達(dá)載體”指任何類型的基因構(gòu)建體,它包括編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸。在某些情況下,RNA分子隨后被翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其他情況下,這些序列是不翻譯的,例如在產(chǎn)生反義分子或核酶的情況下。表達(dá)載體可以包含各種“控制序列”,這指對于有效連接的編碼序列在特定宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了管理轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列外,載體和表達(dá)載體還可包含也用作其他功能的核酸序列,其在下文中進(jìn)行描述。質(zhì)粒載體在某些實施方案中,考慮將來自質(zhì)粒載體的線性DNA片段用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,特別是哺乳動物細(xì)胞。一般而言,包含復(fù)制子和來源于與宿主細(xì)胞相容的物種的控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主結(jié)合使用。載體通常攜帶復(fù)制位點以及標(biāo)記序列,所述標(biāo)記序列在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中能夠提供表型選擇。在非限制性例子中,大腸桿菌(E.coli)通常利用pBR322或pUC(來源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒)的衍生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。pBR322包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因,因此提供了用于鑒別經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的簡便手段。其他質(zhì)粒包含卡那霉素或新霉素基因,或具有非抗生素選擇機制。pBR質(zhì)?;蚱渌⑸镔|(zhì)?;蚴删w還應(yīng)當(dāng)包含,或經(jīng)修飾而包含,例如可以被微生物體用于表達(dá)其自身蛋白質(zhì)的啟動子。技術(shù)人員將認(rèn)識到,本領(lǐng)域的任何質(zhì)粒均可進(jìn)行修飾以用于本發(fā)明的方法中。在一個具體實施方案中,例如,用于治療應(yīng)用的GHRH載體是合成產(chǎn)生的并且具有卡那霉素抗性基因。此外,包含復(fù)制子和與宿主微生物相容的控制序列的噬菌體載體可以用作與這些宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)化載體。例如,噬菌體λGEMTM-11可以用于制備能夠用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如大腸桿菌LE392的重組噬菌體載體。其他有用的質(zhì)粒載體包括pIN載體(Inouye等人,1985);和pGEX載體,其用于產(chǎn)生谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可溶性融合蛋白以用于隨后的純化和分離或切割。其他合適的融合蛋白是具有β-半乳糖苷酶、泛素等的那些。包含表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞例如大腸桿菌生長在許多種合適的培養(yǎng)基中的任何一種之中,例如LB。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的,某些載體中的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)可以如此進(jìn)行誘導(dǎo),即通過將宿主細(xì)胞與對某些啟動子特異的試劑接觸,例如向培養(yǎng)基中加入IPTG,或?qū)⒎跤D(zhuǎn)為更高的溫度。將細(xì)菌進(jìn)一步培養(yǎng)一段時間(一般為2-24小時)后,通過離心收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌以去除殘留的培養(yǎng)基。啟動子和增強子啟動子是控制序列,所述控制序列是在此處控制基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄的起始和速度的核酸序列區(qū)域。它可以包含這樣的基因元件,在所述基因元件處調(diào)節(jié)蛋白和分子可以結(jié)合例如RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子以起始核酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄。短語“有效定位”、“有效連接”、“在控制下”以及“在轉(zhuǎn)錄控制下”表示,啟動子處于對于核酸序列來說正確的功能位置和/或定位中以控制那個序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。啟動子一般包括用于定位關(guān)于RNA合成的起始位點的序列。啟動子最有名的例子是TATA框,但在某些啟動子中缺少TATA框,例如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子以及SV40晚期基因的啟動子,覆蓋起始位點本身的分立元件幫助固定起始位置。另外的啟動子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常,這些定位在起始位點上游30-110bp區(qū)域內(nèi),盡管已顯示許多啟動子在起始位點下游也包含功能性元件。為了產(chǎn)生在啟動子控制下的編碼序列,將轉(zhuǎn)錄閱讀框的轉(zhuǎn)錄起始位點的5’端定位在所選啟動子的下游(即3’端)。“上游”啟動子刺激DNA的轉(zhuǎn)錄并且促進(jìn)編碼的RNA的表達(dá)。啟動子元件之間的間隔常常是可變的,因此當(dāng)元件相對于彼此倒置或進(jìn)行移動時啟動子功能被保留。在胸苷激酶(timidinekinase)(tk)啟動子中,在活性開始減退前啟動子元件之間的間隔可以增至相距50bp。取決于啟動子,看起來單個元件可以合作或獨立地發(fā)揮作用以激活轉(zhuǎn)錄。啟動子可以與“增強子”結(jié)合或不結(jié)合使用,增強子指參與核酸序列的轉(zhuǎn)錄激活的順式作用調(diào)節(jié)序列。啟動子可以是與核酸序列天然聯(lián)合的,如可以通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而獲得。此類啟動子可以被稱為“內(nèi)源的”。類似地,增強子可以是與核酸序列天然聯(lián)合的,位于那個序列的下游或上游??商娲兀ㄟ^將編碼性核酸區(qū)段置于重組、合成或異源啟動子的控制下將得到一定的好處,所述重組、合成或異源啟動子指在其自然環(huán)境中通常不與核酸序列聯(lián)合的啟動子。重組、合成或異源增強子同樣也指在其自然環(huán)境中通常不與核酸序列聯(lián)合的增強子。此樣的啟動子或增強子可以包括其他基因的啟動子或增強子,以及從任何其他病毒或者原核或真核細(xì)胞分離出的啟動子或增強子,以及非“天然發(fā)生的”啟動子或增強子(即包含不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的不同元件和/或改變表達(dá)的突變)。例如,在重組DNA構(gòu)建中最常使用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)。除了合成產(chǎn)生啟動子和增強子的核酸序列外,與本文所公開的組合物有關(guān)地,利用重組克隆和/或核酸擴增技術(shù)包括PCRTM也可以產(chǎn)生序列(參見美國專利號4,683,202和5,928,906,每一個均引入本文作為參考)。此外,考慮了還可采用在非核細(xì)胞器例如線粒體、葉綠體等內(nèi)指導(dǎo)序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控制序列。自然,采用有效指導(dǎo)DNA片段在選擇用于表達(dá)的細(xì)胞器、細(xì)胞類型、組織、器官或生物體中的表達(dá)的啟動子和/或增強子將是重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道用于蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子、增強子和細(xì)胞類型組合的使用。所采用的啟動子可以是組成型的、組織特異性的、誘導(dǎo)型的和/或在適當(dāng)條件下可用于指導(dǎo)所導(dǎo)入的DNA區(qū)段高水平表達(dá)的,例如在重組蛋白質(zhì)和/或肽的大規(guī)模生產(chǎn)中是有利的。啟動子可以是異源的或內(nèi)源的。另外,任何啟動子/增強子組合(按照例如EukaryoticPromoterDataBase,EPDB,http://www.epd.isb-sib.ch/)也可以用于驅(qū)動表達(dá)。使用T3、T7或SP6胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是另一種可能的實施方案。如果合適的細(xì)菌聚合酶作為遞送復(fù)合物的一部分或作為另外的基因表達(dá)構(gòu)建體來提供,則真核細(xì)胞可以支持從某些細(xì)菌啟動子的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。表1和2列出了在本發(fā)明范圍內(nèi)可以用于調(diào)節(jié)RNA表達(dá)的元件/啟動子的非限制性例子。表2提供了誘導(dǎo)型元件的非限制性例子,所述誘導(dǎo)型元件是可以響應(yīng)特定刺激而被激活的核酸序列的區(qū)域。組織特異性啟動子或元件的鑒定,以及表征其活性的測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此類區(qū)域的非限制性例子包括人LIMK2基因(Nomoto等人,1999)、促生長激抑制素受體2基因(Kraus等人,1998)、鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等人,1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人,1998)、小鼠α2(XI)膠原(Liu等人,2000;Tsumaki等人,1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee等人,1997)、胰島素樣生長因子II(Dai等人,2001;Wu等人,1997)、以及人血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Almendro等人,1996)。在一個優(yōu)選實施方案中,利用合成的肌啟動子,例如SPc5-12(Li等人,1999),它包含來鄰近的自骨骼α-肌動蛋白的血清效應(yīng)元件(“SRE”)、多個MEF-2位點、MEF-1位點和TEF-1結(jié)合位點,并且極大地超過了天然肌原性啟動子的轉(zhuǎn)錄能力。此類合成啟動子的獨特性是超過例如下列所頒發(fā)的專利的重要改進(jìn),涉及肌原性啟動子及其用途的專利(例如,美國專利號5,374,544)或涉及用于核酸序列的肌原性表達(dá)的系統(tǒng)的專利(例如,美國專利號5,298,422)。在一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明中采用的啟動子不通過內(nèi)源性細(xì)胞機制或因素而明顯關(guān)閉或降低活性。依照本發(fā)明的這個實施方案可以使用其他元件,包括反式作用因子結(jié)合位點和增強子。在一個可選擇的實施方案中,采用天然的肌原性啟動子,并且技術(shù)人員知道如何從數(shù)據(jù)庫中獲得這樣的啟動子序列,所述數(shù)據(jù)庫包括NationalCenterforBiotechnologyInformation(“NCBI”)GenBank數(shù)據(jù)庫或NCBIPubMed網(wǎng)站。技術(shù)人員知道這些數(shù)據(jù)庫可以用于獲得與本發(fā)明有關(guān)的序列或相關(guān)文獻(xiàn)。起始信號和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點特異性的起始信號也可以是編碼序列的有效翻譯所必需的。這些信號包括ATG起始密碼子或鄰接序列??赡苄枰峁┩庠葱苑g控制信號,包括ATG起始密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠容易地確定這一點并提供必需的信號。眾所周知,起始密碼子應(yīng)當(dāng)是在所需編碼序列的閱讀框的“框內(nèi)的”,以確保整個插入片段的翻譯。外源性翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然的或合成的。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強子元件可以增強表達(dá)的效率。在本發(fā)明的某些實施方案中,內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(“IRES”)元件的用途是用于形成多基因或多順反子信息。IRES元件能夠繞過5’甲基化帽依賴性翻譯的核糖體掃描模式并且在內(nèi)部位點上開始翻譯(Pelletier和Sonenberg,1988)。已經(jīng)描述了來自小RNA病毒科的兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,1988)以及來自哺乳動物信息的IRES(Macejak和Sarnow,1991)。IRES元件可以與異源的開放閱讀框連接。多個開放閱讀框可以一起轉(zhuǎn)錄,每個由IRES隔開,產(chǎn)生多順反子信息。借助于IRES元件,每個開放閱讀框?qū)τ诤颂求w來說是可接近的以有效翻譯。多基因可以利用單個啟動子/增強子來有效表達(dá)以轉(zhuǎn)錄單個信息(參見美國專利號5,925,565和5,935,819,每個引入本文作為參考)。多克隆位點載體可以包括MCS,這是包含多個限制性內(nèi)切酶位點的核酸區(qū)域,它們中的任何一個均可與標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)結(jié)合使用以消化載體(參見,例如(Carbonelli等人,1999;Cocea,1997;Levenson等人,1998),引入本文作為參考)。“限制性內(nèi)切酶消化”指用只在核酸分子的特定位置處起作用的酶來催化切割核酸分子。這些限制性內(nèi)切酶中的許多是市售的。此類酶的用途被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛了解。通常,利用在MCS內(nèi)切割的限制性內(nèi)切酶將載體線性化或片段化,以使得外源序列能夠與載體連接?!斑B接(ligation)”指在兩個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程,所述核酸片段可以是或不是互相鄰近的。涉及限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組
技術(shù)領(lǐng)域
的技術(shù)人員眾所周知的。剪接位點大多數(shù)轉(zhuǎn)錄出的真核RNA分子將經(jīng)歷RNA剪接以從初級轉(zhuǎn)錄物中去除內(nèi)含子。包含基因組真核序列的載體可能需要供體和/或接受體剪接位點以確保用于蛋白質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的正確加工(參見,例如(Chandler等人,1997))。終止信號本發(fā)明的載體或構(gòu)建體將一般包括至少一個終止信號?!敖K止信號”或“終止子”包括在RNA轉(zhuǎn)錄物被RNA聚合酶特異性終止中所牽涉的DNA序列。因此,在某些實施方案中,考慮了結(jié)束RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生的終止信號。終止子在體內(nèi)可能是必需的以達(dá)到所需的信息水平。在真核系統(tǒng)中,終止子區(qū)域還可包括特定的DNA序列,其允許新轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行位點特異性切割以便暴露多腺苷酸化位點。這用信號告知專有的內(nèi)源性聚合酶將約200個A殘基(“polyA”)的延伸片段加到轉(zhuǎn)錄物的3’末端。用這種polyA尾修飾的RNA分子表現(xiàn)得更穩(wěn)定且更有效地進(jìn)行翻譯。因此,在涉及真核生物的其他實施方案中,優(yōu)選地,終止子包括用于RNA的切割的信號,并且更優(yōu)選地,終止子信號促進(jìn)信息的多腺苷酸化。終止子和/或多腺苷酸化位點元件可以用于增強信息水平并且使從盒閱讀到其他序列的情況減到最小??紤]用于本發(fā)明的終止子包括本文所描述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何已知轉(zhuǎn)錄終止子,包括但不限于,例如,基因的終止序列,例如牛生長激素終止子或病毒的終止序列,例如SV40終止子。在某些實施方案中,終止信號可以缺少可轉(zhuǎn)錄的或可翻譯的序列,例如由于序列截短。多腺苷酸化信號在表達(dá)中,特別是在真核生物表達(dá)中,一般將包括多腺苷酸化信號以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物的正確多腺苷酸化。不認(rèn)為多腺苷酸化信號的性質(zhì)是成功實踐本發(fā)明的關(guān)鍵,并且可以采用任何這樣的序列。優(yōu)選的實施方案包括方便且已知在各種靶細(xì)胞中作用良好的SV40多腺苷酸化信號、骨骼α肌動蛋白3’UTR、或者人或牛生長激素多腺苷酸化信號。多腺苷酸化可以增加轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性或可以促進(jìn)胞質(zhì)運輸。復(fù)制起點為了在宿主細(xì)胞中繁殖載體,它可以包含一個或多個復(fù)制起始位點(通常稱為“ori”),這是于此處起始復(fù)制的特定核酸序列??商娲?,如果宿主細(xì)胞是酵母,則可以采用自主復(fù)制序列(“ARS”)。可選擇的和可篩選的標(biāo)記在本發(fā)明的某些實施方案中,包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞通過在表達(dá)載體中包含標(biāo)記而可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行鑒定。此類標(biāo)記將賦予細(xì)胞可鑒定的改變,允許容易地鑒定包含該表達(dá)載體的細(xì)胞。一般地,選擇標(biāo)記是賦予允許進(jìn)行選擇的特性的標(biāo)記。正選擇標(biāo)記是其中標(biāo)記的存在允許它的選擇的標(biāo)記,而負(fù)選擇標(biāo)記是其中它的存在妨礙它的選擇的標(biāo)記。正選擇標(biāo)記的例子是藥物抗性標(biāo)記,例如卡那霉素。通常,包含藥物選擇標(biāo)記可幫助克隆和鑒定轉(zhuǎn)化體,例如,賦予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇抗性的基因是有用的選擇標(biāo)記。除了賦予允許基于條件的實現(xiàn)來區(qū)分轉(zhuǎn)化體的表型的標(biāo)記之外,還考慮了其他類型的標(biāo)記,包括可篩選標(biāo)記例如GFP,GFP的基礎(chǔ)是比色分析。可替代地,可以采用可篩選的酶例如單純皰疹病毒胸苷激酶(“tk”)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知道如何采用免疫學(xué)標(biāo)記,其可能與FACS分析相結(jié)合。不認(rèn)為所用的標(biāo)記是重要的,只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達(dá)。可選擇的和可篩選的標(biāo)記的進(jìn)一步例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。誘變當(dāng)采用時,通過各種標(biāo)準(zhǔn)的導(dǎo)致誘變的操作過程來完成誘變。突變是這樣的過程,即通過此過程在生物體的量或結(jié)構(gòu)方面發(fā)生改變。突變可以包括單基因、基因群或整條染色體的核苷酸序列的修飾。單基因中的改變可以是點突變的結(jié)果,所述點突變包括DNA序列中的單個核苷酸堿基的去除、添加或置換,或者它們可以是涉及大量核苷酸插入或刪除的改變的結(jié)果。突變可以作為事件的結(jié)果而自發(fā)地發(fā)生,所述事件例如為在DNA復(fù)制保真度或轉(zhuǎn)座遺傳因子(轉(zhuǎn)座子)于基因組內(nèi)移動方面的錯誤。它們還在暴露于化學(xué)或物理誘變因素之后而被誘導(dǎo)。此類誘導(dǎo)突變的因素包括電離輻射、紫外線以及各種系列的化學(xué)制品,例如烷化劑和多環(huán)芳烴,所有這些均能夠與核酸直接地或間接地(一般通過某些代謝性生物轉(zhuǎn)化)相互作用。當(dāng)受影響的DNA進(jìn)行復(fù)制或修復(fù)時,由這樣的環(huán)境因素誘導(dǎo)的DNA損傷可以導(dǎo)致堿基序列的修飾,并因此導(dǎo)致突變。通過使用特殊的靶向方法,突變還可以是定點的。定點誘變結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的位點特異性誘變代表了用于剖析和改造蛋白質(zhì)-配體相互作用的有力工具(Wells,1996,Braisted等人,1996)。該技術(shù)為通過將一個或多個核苷酸序列改變導(dǎo)入所選DNA中來制備和測試序列變體作好了準(zhǔn)備。位點特異性誘變使用特異的寡核苷酸序列,它編碼具有所需突變以及足夠數(shù)量的鄰近且未修飾的核苷酸的DNA序列。以這種方式,提供了具有足夠大小和復(fù)雜性的引物序列以在被橫跨的缺失接點兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體。長度為約17-25個核苷酸的引物是優(yōu)選的,在被改變的序列的接點兩側(cè)有約5-10個殘基。該技術(shù)一般采用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。在定點誘變中有用的載體包括諸如M13噬菌體的載體。這些噬菌體載體是市售的,并且它們的使用一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。雙鏈質(zhì)粒也經(jīng)常用于定點誘變,它消除了將目的基因從噬菌體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒的步驟。一般而言,首先獲得單鏈載體,或?qū)㈦p鏈載體的兩條鏈解開,它在其序列中包括編碼所需蛋白質(zhì)或基因元件的DNA序列。隨后將合成制備的且具有所需突變序列的寡核苷酸引物與單鏈DNA制備物一起進(jìn)行退火,當(dāng)選擇雜交條件時考慮錯配程度。對雜交產(chǎn)物施用DNA聚合酶例如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)以便完成具有突變的鏈的合成。因此,形成了異源雙鏈體,其中一條鏈編碼原始的無突變的序列,和第二條鏈具有所需突變。這個異源雙鏈載體隨后用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞,例如大腸桿菌細(xì)胞,并且選擇出包括具有突變的序列排列的重組載體的克隆。通過其中檢查所有19種氨基酸置換的飽和誘變可以最好地獲得關(guān)于蛋白質(zhì)給定殘基的功能重要性和信息含量的全面信息。這種方法的缺點是多殘基飽和誘變的邏輯是使人畏縮的(Warren等人,1996,Brown等人,1996;Zeng等人,1996;Burton和Barbas,1994;Yelton等人,1995;Jackson等人,1995;Short等人,1995;Wong等人,1996;Hilton等人,1996)。應(yīng)當(dāng)要研究成百個并且可能甚至是上千個位點特異性突變體。然而,改進(jìn)的技術(shù)使得突變體的產(chǎn)生和快速篩選要簡單得多。還可參見,美國專利號5,798,208和5,830,650,關(guān)于“模糊(walk-through)”誘變的描述。定點誘變的其他方法公開于美國專利5,220,007;5,284,760;5,354,670;5,366,878;5,389,514;5,635,377;和5,789,166。電穿孔在本發(fā)明的某些實施方案中,通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)。電穿孔涉及使細(xì)胞和DNA的懸浮液暴露于高電壓放電。在這個方法的某些變化形式中,采用某些降解細(xì)胞壁的酶例如降解果膠的酶以使靶受者細(xì)胞比未經(jīng)處理的細(xì)胞更易通過電穿孔而進(jìn)行轉(zhuǎn)化(美國專利號5,384,253,引入本文作為參考)??商娲兀ㄟ^機械創(chuàng)傷及本領(lǐng)域已知的其他方法可以使受者細(xì)胞變得更易轉(zhuǎn)化。利用電穿孔轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞已經(jīng)相當(dāng)成功。通過這種方式已用人κ-免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)染了小鼠前B淋巴細(xì)胞(Potter等人,1984),和已用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細(xì)胞(Tur-Kaspa等人,1986)。認(rèn)為電穿孔的基礎(chǔ)現(xiàn)象在所有情況下都是相同的,但造成所觀察到的效應(yīng)的確切機制仍未闡明。盡管不希望被理論束縛,但電穿孔效應(yīng)的明顯表現(xiàn)是,在細(xì)胞暴露于電脈沖后細(xì)胞膜變得暫時能透過大分子。存在穿過細(xì)胞壁的管道,它在正常情況下通過允許雙向離子遷移而維持大約90mV的靜息跨膜電位。盡管不希望被理論束縛,但電穿孔利用相同的結(jié)構(gòu),通過強迫高離子通量穿過這些結(jié)構(gòu)并打開或擴大這些管道。在現(xiàn)有技術(shù)中,將金屬電極與組織接觸放置,并且將與電極之間的距離成比例的預(yù)定電壓施加在它們上。根據(jù)公式E=V/d,其中(“E”)為電場、(“V”)為所施加的電壓和(“d”)為電極之間的距離,用于電穿孔的方案在所得到的場強方面被限定。當(dāng)制定用于將藥物或大分子遞送到受試者細(xì)胞內(nèi)的電穿孔方案時,在現(xiàn)有技術(shù)中電場強度E是非常重要的值。因此,通過施加與電極之間的距離成比例的預(yù)定電壓的脈沖可以計算出用于各種方案的任何電場強度。然而,要注意的是電場可以用絕緣電極在組織中產(chǎn)生(即離子流不是產(chǎn)生電場所必需的)。盡管不希望被理論束縛,但正是電流而不是電場本身是成功的電穿孔所必需的。在電穿孔過程中,所產(chǎn)生的熱量是電極間阻抗、電流的平方和脈沖持續(xù)時間的乘積。熱量是在電穿孔的過程中在組織中產(chǎn)生的,并且可以作為電極間電流、電壓和脈沖持續(xù)時間的乘積而獲得。目前描述的關(guān)于電穿孔的方案在所得到的場強E方面是被限定的,E取決于未知電流的短電壓脈沖。因此,無法確定組織中產(chǎn)生的電阻或熱量,這導(dǎo)致用預(yù)定電壓的不同脈沖電壓電穿孔方案的不同成果。限制越過電極對細(xì)胞進(jìn)行加熱的能力可以增加任何給定電穿孔電壓脈沖方案的有效性。例如,現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了6個針狀電極的陣列的使用,其利用越過相對電極對的預(yù)定電壓脈沖。這種情況在電穿孔事件過程中在形成適當(dāng)且相互交錯的重疊點的區(qū)域中建立了集中模式。沿著電穿孔途徑的細(xì)胞和組織的過度發(fā)熱將殺死細(xì)胞,并限制方案的有效性。然而,沒有相對的對的對稱排列的針狀電極在電穿孔事件中在不能形成適當(dāng)電穿孔重疊點的區(qū)域中可以產(chǎn)生分散模式。對電極間電流的控制允許確定細(xì)胞的相對發(fā)熱。因此,正是電流而不是越過電極的電壓決定了任何給定脈沖方案的后續(xù)有效性。預(yù)定電壓不產(chǎn)生預(yù)定電流,并且現(xiàn)有技術(shù)沒有提供確定電流的確切量的方法,這限制了該技術(shù)的有用性。因此,與預(yù)定電壓脈沖相比較時,將組織中兩個電極間的電流控制和維持在閾值之下將允許改變脈沖條件,減少細(xì)胞發(fā)熱,產(chǎn)生更少的細(xì)胞死亡,和更有效地將大分子整合入細(xì)胞中。通過提供有效控制遞送給電極間空間中的細(xì)胞的電量的手段可以克服上述問題,所述手段通過精確控制沖擊細(xì)胞膜中的管道的離子通量。給組織的精確電量可以作為電流水平、脈沖長度和所遞送的脈沖數(shù)目的乘積而計算出來。因此,本發(fā)明的一個具體實施方案可以沿著多個途徑將電穿孔電流遞送給一定體積的組織而不會在任何一個位置引起過量濃度的累積電流,從而避免了由于組織過熱而引起的細(xì)胞死亡。盡管不希望被理論束縛,但待產(chǎn)生的電壓脈沖的性質(zhì)由組織的性質(zhì)、所選組織的大小以及電極間的距離決定。希望電壓脈沖盡可能是同質(zhì)的并且具有正確的振幅。過量的場強導(dǎo)致細(xì)胞裂解,而較低的場強導(dǎo)致電穿孔效率降低。一些電穿孔裝置利用電極間的距離來計算用于電穿孔的電場強度和預(yù)定電壓脈沖。對于知曉電極間距離的這種依賴是電極設(shè)計的限制。因為可編程的電流脈沖控制器將決定在電極間一定體積的組織的阻抗,所以電極間的距離不是決定合適電流脈沖的關(guān)鍵因素。因此,針狀電極陣列設(shè)計的可選擇的實施方案將是不對稱的實施方案。此外,在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想出任何數(shù)量的合適的對稱和不對稱的針狀電極陣列。陣列中每個單個電極在所需組織中的深度可以隨相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果而改變。此外,大分子的多個注射位點可以加到針狀電極陣列中??梢杂糜谟行Т龠M(jìn)大分子導(dǎo)入所選受試者組織的細(xì)胞中的電穿孔裝置的一個實例描述于美國專利申請10/657,725中,所述專利申請于2003年9月8日提交,標(biāo)題為“ConstantCurrentElectroporationDeviceAndMethodsOfUse”,Smith等人列為發(fā)明人,其整體引入本文作為參考。電穿孔裝置包括電動裝置(“EKD”),其操作由軟件或固件來具體制定。EKD基于脈沖參數(shù)的用戶控制和輸入在陣列中的電極之間產(chǎn)生一系列可編程的恒流脈沖模式,并允許儲存和獲得電流波形數(shù)據(jù)。電穿孔裝置還包括具有針狀電極陣列的可替換的電極盤、用于注射針的中心注射通道以及可移動的導(dǎo)向盤。限制性內(nèi)切酶在本發(fā)明的一些實施方案中,通過限制性內(nèi)切酶消化親本DNA分子而產(chǎn)生線性DNA片段。下文提供了限制性內(nèi)切酶的例子。名稱識別序列AatIIGACGTCAcc65IGGTACCAccIGTMKACAciICCGCAclIAACGTTAfeIAGCGCTAflIICTTAAGAflIIIACRYGTAgeIACCGGTAluIAGCTAlwIGGATCAlwNICAGNNNCTGApaIGGGCCCApaLIGTGCACApoIRAATTYAscIGGCGCGCCAseIATTAATAvaICYCGRGAvaIIGGWCCAvrIICCTAGGBamHIGGATCCBanIGGYRCCBanIIGRGCYCBbsIGAAGACBbvIGCAGCBbvCICCTCAGCBciVIGTATCCBclITGATCABfaICTAGBglIGCCNNNNNGGCBglIIAGATCTBlpIGCTNAGCBmrIACTGGGBpmICTGGAGBsaAIYACGTRBsaBIGATNNNNATCBsaHIGRCGYCBsaIGGTCTCBsaJICCNNGGBsaWIWCCGGWBseRIGAGGAGBsgIGTGCAGBsiEICGRYCGBsiHKAIGWGCWCBsiWICGTACGBsmAIGTCTCBsmBICGTCTCBsmFIGGGACBsmIGAATGCBsoBICYCGRGBsp1286IGDGCHCBspDIATCGATBspEITCCGGABspHITCATGABspMIACCTGCBsrBICCGCTCBsrDIGCAATGBsrFIRCCGGYBsrGITGTACABsrIACTGGBssHIIGCGCGCBssKICCNGGBst4CIACNGTBssSICACGAGBstBITTCGAABstEIIGGTNACCBstF5IGGATGNNBstNICCWGGBstUICGCGBstYIRGATCYBstZ17IGTATACBsu36ICCTNAGGBtgICCPuPyGGBtrICACGTGCac8IGCNNGCClaIATCGATDdeICTNAGDpnIGATCDpnIIGATCDraITTTAAAEaeIYGGCCREagICGGCCGEarICTCTTCEciIGGCGGAEco0109IRGGNCCYEcoRIGAATTCEcoRVGATATCFauICCCGCNNNNFnu4HIGCNGCFokIGGATGFseIGGCCGGCCFspITGCGCAHaeIIRGCGCYHaeIIIGGCCHgaIGACGCHhaIGCGCHincIIGTYRACHindIIIAAGCTTHinfIGANTCHinP1IGCGCHpaIGTTAACHpaIICCGGHphIGGTGAKasIGGCGCCKpnIGGTACCMboIGATCMboIIGAAGAMfeICAATTGMluIACGCGTMnlICCTCMscITGGCCAMseITTAAMspA1ICMGCKGMspICCGGNaeIGCCGGCNarIGGCGCCNciICCSGGNcoICCATGGNdeICATATGNgoMIVGCCGGCNheIGCTAGCNlaIIICATGNlaIVGGNNCCNotIGCGGCCGCNruITCGCGANsiIATGCATNspIRCATGYPacITTAATTAAPaeR7ICTCGAGPciIACATGTPleIGAGTCPmeIGTTTAAACPmlICACGTGPpuMIRGGWCCYPsiITTATAAPspGICCWGGPspOMIGGGCCCPstICTGCAGPvuICGATCGPvuIICAGCTGRsaIGTACRsrIICGGWCCGSacIGAGCTCSacIICCGCGGSalIGTCGACSapIGCTCTTCSau3AIGATCSau96IGGNCCSbfICCTGCAGGScaIAGTACTScrFICCNGGSexAIACCWGGTSfaNIGCATCSfcICTRYAGSfoIGGCGCCSgrAICRCCGGYGSmaICCCGGGSmlICTYRAGSnaBITACGTASpeIACTAGTSphIGCATGCSspIAATATTStuIAGGCCTStyICCWWGGSwaIATTTAAATTaqITCGATfiIGAWTCTliICTCGAGTseIGCWGCTsp45IGTSACTsp509IAATTTspRICAGTGTth111IGACNNNGTCXbaITCTAGAXhoICTCGAGXmaICCCGGGXmnIGAANNNNTTC如本文所使用的,術(shù)語DNA的“限制性內(nèi)切酶消化”指用只在DNA的某些位置處起作用的酶來催化切割DNA。這樣的酶被稱為限制性內(nèi)切核酸酶,并且每一種酶所特異性針對的位點被稱為限制性位點。本文所使用的各種限制性內(nèi)切酶都是市售的,并且使用由酶供應(yīng)商所制定的其反應(yīng)條件、輔助因子及其他要求。限制性內(nèi)切酶通常由縮寫來標(biāo)示,所述縮寫的組成為一個大寫字母,隨后為代表每種限制性內(nèi)切酶最初從其中獲得的微生物的其他字母,以及隨后為指明特定酶的數(shù)字。一般而言,在約20μl緩沖液中使用約1μg的質(zhì)?;駾NA片段和約1-2個單位的酶。廠商詳細(xì)說明了對于特定的限制性內(nèi)切酶來說合適的緩沖液和底物量。使用限制性內(nèi)切酶以確保質(zhì)粒的完整性和正確性。實施例包括了下述實施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,下文實施例中所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實踐中作用良好的技術(shù),因而可以被視為構(gòu)成其實踐的優(yōu)選模式。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解,在公開的具體實施方案中可以進(jìn)行許多改變并且仍獲得同樣或相似的結(jié)果,而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1DNA載體的構(gòu)建和在動物受試者中的方法DNA構(gòu)建體為了增強疫苗接種應(yīng)答并改善受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果,首先必需設(shè)計幾種GHRH構(gòu)建體。簡言之,質(zhì)粒載體包含連接在野生型物種特異性或類似的GHRH上的肌肉特異性合成啟動子SPc5-12(SEQID#15)(Li等人,1999)。一些野生型GHRH序列在我們實驗室中進(jìn)行克隆(犬、貓和馬);其他的(雞、羊、牛、豬、人)根據(jù)專門的文獻(xiàn)進(jìn)行合成。如所描述的(Draghia-Akli等人,1999),通過定點誘變產(chǎn)生類似的GHRH序列。簡言之,通過GHRHcDNA的定點誘變產(chǎn)生哺乳動物GHRH類似物cDNA(SEQID#18)(AlteredSitesIIinvitroMutagenesisSystem,Promega,Madison,WI),并將其克隆到pSPc5-12的BamHI/HindIII位點內(nèi),以產(chǎn)生特異的GHRH構(gòu)建體。將生長激素的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)克隆到GHRHcDNA的下游。所得到的質(zhì)粒包含類似的哺乳動物GHRH編碼序列,并且所得到的氨基酸序列在哺乳動物中不是天然存在的。盡管不希望被理論束縛,但增強疫苗接種應(yīng)答并改善受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果最終由GHRH激素的循環(huán)水平?jīng)Q定。幾種不同的質(zhì)粒編碼GHRH或其功能性生物學(xué)等價物的不同的突變型或野生型氨基酸序列,例如質(zhì)粒編碼的氨基酸序列HV-GHRH(SEQID#1)HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH豬-GHRH(SEQID#2)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OH牛-GHRH(SEQID#3)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGA-OH犬-GHRH(SEQID#4)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGA-OH貓-GHRH(SEQID#5)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OHTI-GHRH(SEQID#6)YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH羊-GHRH(SEQID#7)YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGA-OH雞-GHRH(SEQID#8)HADGIFSKAYRKLLGQLSARNYLHSLMAKRVGSGLGDEAEPLS-OH馬-GHRH(部分的)(SEQID#9)-ADAIFTNNYRKVLGQLSARKILQDIMSR-----------OH人-GHRH(SEQID#10)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA-OHTV-GHRH(SEQID#11)YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OHTA-15/27/28-GHRH(SEQID#12)YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH。一般而言,編碼的GHRH或其功能性生物學(xué)等價物的通式為-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGE-X6-N-X7-E-X8-GA-OH(SEQID#14),其中X1是選自酪氨酸(“Y”)或組氨酸(“H”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X2是選自丙氨酸(“A”)、纈氨酸(“V”)或異亮氨酸(“I”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X3是選自丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X4是選自甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X5是選自絲氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X6是選自精氨酸(“R”)或絲氨酸(“S”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;X7是選自精氨酸(“R”)或谷氨酰胺(“Q”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體;和X8是選自精氨酸(“R”)或谷氨酰胺(“Q”)的氨基酸的D-或L-異構(gòu)體。上述質(zhì)粒不包含多位點接頭、IGF-I基因、骨骼α-肌動蛋白啟動子或骨骼α肌動蛋白3’UTR/NCR。此外,如下所述通過肌肉注射以及隨后體內(nèi)電穿孔來導(dǎo)入這些質(zhì)粒。關(guān)于“功能性生物學(xué)等價物”,技術(shù)人員會很好地理解,對于改變數(shù)目具有限制這一觀念為“生物學(xué)上功能等價的”蛋白質(zhì)和/或多核苷酸的定義所固有,所述改變可以在分子的指定部分內(nèi)進(jìn)行而同時保留具有可接受水平的等價生物學(xué)活性的分子。因此,功能性生物學(xué)等價物在本文中被定義為所選氨基酸(或密碼子)可以被置換的那些蛋白質(zhì)(和多核苷酸)。包含GHRH的功能性生物學(xué)等價物的肽是這樣的多肽,其已被改造為含有不同的氨基酸序列,而同時具有當(dāng)與GHRH相比較時類似或改進(jìn)的生物學(xué)活性。例如,GHRH的一種生物學(xué)活性是促進(jìn)受試者中的GH分泌。優(yōu)化的質(zhì)粒骨架。本發(fā)明的一個方面是優(yōu)化的質(zhì)粒骨架。下文提出的合成的質(zhì)粒包含被對于物種特異性哺乳動物轉(zhuǎn)錄來說經(jīng)合成優(yōu)化的真核序列。合成優(yōu)化現(xiàn)有的pSP-HV-GHRH質(zhì)粒(“pAV0125”)(SEQID#22)以形成新質(zhì)粒(SEQID#25)。質(zhì)粒pAV0125描述于美國專利6,551,996,所述專利于2003年4月22日頒發(fā),標(biāo)題為“Super-activeporcinegrowthhormonereleasinghormoneanalog”,Schwartz等人列為發(fā)明人(“theSchwartz‘996Patent”),它教導(dǎo)了包含突變的GHRH類似物的應(yīng)用,所述突變提高引起生長激素釋放的能力。這種3,534bp的質(zhì)粒pAV0125(SEQID#22)包含具有來自不同市售質(zhì)粒的各種組分的質(zhì)粒骨架,例如,合成啟動子SPc5-12(SEQID#15)、經(jīng)修飾的豬GHRH序列(SEQID#18)和人生長激素的3’末端(SEQID#38)。優(yōu)化的合成質(zhì)粒的其他具體例子包括優(yōu)化的wt-豬GHRH質(zhì)粒,pAV0225(SEQID#26),圖8;犬GHRH質(zhì)粒,pAV0235(SEQID#27),圖9;牛GHRH質(zhì)粒,pAV0236(SEQID#28),圖10;貓GHRH質(zhì)粒,pAV0238(SEQID#29),圖11;TI-GHRH質(zhì)粒,pAV0239(SEQID#30),圖12;羊GHRH質(zhì)粒,pAV0240(SEQID#31),圖13;雞GHRH質(zhì)粒,pAV0241(SEQID#32),圖14;馬GHRH質(zhì)粒,pAV0249(SEQID#33),圖15;人GHRH質(zhì)粒(SEQID#34)。對于此類優(yōu)化質(zhì)粒的治療性編碼基因還可包括編碼經(jīng)修飾的GHRH分子或其功能性生物學(xué)等價物的優(yōu)化的核酸序列。實施例2質(zhì)粒注射和電穿孔可以用于向大型動物遞送抗原使用混合性別、年齡為3-6周、體重為15-40kg的年幼雜種豬(n=6-7/組/實驗)。將動物成組養(yǎng)在圍欄里,隨意獲取24%蛋白質(zhì)飲食(ProducersCooperativeAssociation,Bryan,TX)和水。利用市售試劑盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)獲得質(zhì)粒。如由KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)所測量的,內(nèi)毒素水平低于0.01EU/μg。質(zhì)粒制劑在無菌水中進(jìn)行稀釋,并用聚L-谷氨酸鈉鹽(MW=10.5kDa,平均值)(Sigma,St.Louis,MO)配制為1%重量/重量。在實驗的第0天,用手制住動物,并在5針電極陣列的中心利用21號針將表達(dá)分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的質(zhì)粒溶液通過完整無損的皮膚直接注射到半膜肌內(nèi)。在尋找合適的注射位點時避開所有主要的表面血管。在質(zhì)粒注射后以預(yù)定的時間間隔,在我們的情況下為80毫秒,開始電穿孔5次脈沖,長度為52毫秒,電場強度為0.4-1Amp,脈沖間隔為1秒。根據(jù)NIH、USDA和AnimalWelfareAct指導(dǎo)方針來飼養(yǎng)動物。血液收集在每次實驗的第0、3、7和10天,在8:30AM對動物進(jìn)行稱重并且通過頸靜脈穿刺將血液收集到MICROTAINER血清分離管中。允許血液在室溫下凝結(jié)10-15分鐘并隨后于3000×g離心10分鐘,并將血清儲存在-80℃直至進(jìn)一步分析。分泌型胚胎堿性磷酸酶測定法將血清樣品解凍,并利用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems,Bedford,MA)根據(jù)廠商說明分析50μL血清樣品的SEAP活性。該測定法的檢測下限是3pg/mL。在SEAP活性測定前將較濃的血清樣品在小鼠血清中進(jìn)行1∶10稀釋。所有樣品利用LUMIstarGalaxyluminometer(BMGLabtechnologies,Offenburg,Germany)進(jìn)行讀數(shù)。SEAP蛋白在豬中是具有免疫原性的,并且當(dāng)使用直接肌肉注射并隨后電穿孔時,在質(zhì)粒遞送后10-14天內(nèi)發(fā)生免疫介導(dǎo)的對該蛋白質(zhì)的清除(圖1)。因此,SEAP的表達(dá)水平只能在2周的時間段內(nèi)進(jìn)行研究,并被認(rèn)為是肌內(nèi)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后基因表達(dá)的可靠量度。然而,該技術(shù)可以用于遞送特異性增強受試者中的免疫功能的其他類型分子。因為可測量的疫苗接種應(yīng)答通常發(fā)生在疫苗接種后大約14天,所以合理的是,使用免疫調(diào)節(jié)劑如GHRH的處理可以在疫苗接種前或與疫苗接種操作相伴發(fā)生。實施例3在牛中的GHRH施用年齡為18-20個月、平均體重為547±43kg的32頭初產(chǎn)Holstein牛在妊娠期的最后三個月期間用2.5mgpSP-HV-GHRH處理一次,并被標(biāo)示為處理組。類似地,來自相同來源、具有相同品種和年齡的20頭懷孕小母牛不接受質(zhì)粒處理而作為對照。動物在年齡為23個月±24天時產(chǎn)下小牛。牛養(yǎng)在自由的畜棚中并暴露在天然日光中,所述畜棚安裝有配備了水霧器(watermister)的鼓風(fēng)機用于蒸發(fā)性冷卻。每天兩次用基于青貯飼料的總混合配給量隨意喂養(yǎng)牛群。每頭牛配備有轉(zhuǎn)發(fā)器/計步器,這允許在進(jìn)入畜欄時進(jìn)行自動識別。在這次實驗結(jié)束時,以它們的組織不進(jìn)入食物鏈的方式處理所有用質(zhì)粒處理的動物。由處理動物產(chǎn)生的所有奶品和組織被銷毀并且不進(jìn)入人類的食物鏈。根據(jù)NationalResearchCouncil’sGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals來施行動物方案。肌內(nèi)注射質(zhì)粒DNA。將pSPc5-12-HV-GHRH的不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)制劑在水中稀釋為5mg/mL,并用聚L-谷氨酸配制為1%wt/wt。利用21G針(Becton-Dickinson,F(xiàn)ranklinLacks,NJ)在斜方肌中肌內(nèi)給予??偭繛?.5mg的pSP-HV-GHRH。注射2分鐘后,如所描述的(Draghia-Akli等人,2002b),利用Advisys’sEKD裝置并采用下述條件對經(jīng)注射的肌肉進(jìn)行電穿孔5次脈沖,1Amp,52毫秒/脈沖。在電穿孔過程中電壓隨組織電阻的改變而改變(以維持恒定電流),并且它被記錄為80-120V/cm。對于所有注射,將2cm的針頭通過皮膚插入肌肉中。在注射后立即和24小時之后觀察動物在電穿孔位點處的任何不良作用。體重、身體狀況和蹄的得分。在處理前,小母牛在相同的經(jīng)校準(zhǔn)的稱(與WeighTronix915A指示器和WP233打印機連接的Priefert牛擠壓滑運道(squeeze-chute),CentralCityScale,CentralCity,NE)上進(jìn)行稱重并隨機進(jìn)行分組。由對處理組不知情的2名獨立的乳品動物科學(xué)家(TexasA&MUniversity)在處理前、60-80DIM以及100-120DIM評估身體狀況得分。通過觀察和觸摸脊椎、腰部和臀部區(qū)域來對牛進(jìn)行評分(Rodenburg,1996),可能的BCS為1(非常瘦的牛)-5(極其超健壯的牛)。在質(zhì)粒-GHRH處理前和60DIM測量蹄得分。蹄得分包括每只足的0(沒有蹄問題)-4(嚴(yán)重的蹄問題)評價。每只蹄給予額外的2分,用于評估最終出現(xiàn)的膿腫(1分)和在任何給定時間的必需治療(1分)??赡艿奶愕梅譃?(沒有問題)-24(所有4只足上有嚴(yán)重的蹄問題,膿腫,并且每只蹄需要深切治療)。全血細(xì)胞計數(shù)和免疫標(biāo)記物。在處理前,和在處理后18和300天時,以及在疫苗接種攻擊后,將來自所有小母牛的全血收集在EDTA中并且進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)分析(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory,CollegeStation,TX)。血液學(xué)參數(shù)包括紅細(xì)胞計數(shù)、血細(xì)胞比容、血紅蛋白、總白細(xì)胞計數(shù)和不同的淋巴細(xì)胞計數(shù)(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)、血小板計數(shù)、平均紅細(xì)胞容量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度和纖維蛋白原。在第0和18天對所有經(jīng)處理的牛和對照,并在處理后300天和在Biocor-9疫苗接種攻擊后對20頭經(jīng)處理的和10頭對照的牛,測定免疫標(biāo)記物。利用Dr.Davis’實驗室(DepartmentofVeterinaryMicrobiology/Pathology,CVM,WashingtonStateUniversity,Pullman,Washington)開發(fā)的單克隆抗體(mAb)通過流式細(xì)胞術(shù)(FC)進(jìn)行分析。在3-色FC中使用mAb的組合來確定外周血中外周血單核細(xì)胞(PBMC)的不同群體的組成和頻率以及CD4和CD8alphabeta(αβ)T細(xì)胞和gammadelta(γδ)T細(xì)胞的功能狀態(tài)。在一些組合中使用特異性相同的兩種mAb以增加在CD4和CD8T細(xì)胞上的熒光信號的強度。在所示時間處獲得10mL血液并進(jìn)行處理以用于FC(Davis等人,1995)。血液在Tris緩沖的NH4Cl中進(jìn)行裂解,在含有酸性檸檬酸葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS/ACD)中進(jìn)行洗滌,并隨后分配在包含不同mAb組合的96孔圓錐形底部的組織培養(yǎng)板中。細(xì)胞在冰上孵育15分鐘,在PBS/ACD中洗滌3次,并與綴合有熒光素、藻紅蛋白或藻紅蛋白-Cy5的同種型特異性山羊抗-小鼠抗體(SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL,CaltagLaboratories,Burlingame,CA)的不同組合一起再孵育15分鐘。然后,將細(xì)胞洗滌2次并在PBS緩沖的2%甲醛中固定。將細(xì)胞保存在冰箱中直至檢查。在配備有CellQuest軟件的BectonDickinsonFACSort上檢查細(xì)胞。在FlowJo(TreeStar,Inc.,SanCarlos,CA)和FCSExpress(DeNovosoftware,Thornton,Ontario,Ca)軟件上分析數(shù)據(jù)。除非另有說明,數(shù)據(jù)表示為用特定的單克隆抗體或其組合測定的總?cè)后w的百分比(例如,總CD4+和CD4-細(xì)胞代表100%的被測定的細(xì)胞;總CD2-CD3-、CD2-CD3+、CD2+CD3-或CD2+CD3+代表100%的用CD2和CD3抗體測定的細(xì)胞,等)。生物化學(xué)和胰島素測量。在60和100DIM時收集血清樣品。將血清進(jìn)行等分用于RIA和生物化學(xué)分析,并在分析之前保存在-80℃。生物化學(xué)分析在血清收集后48小時內(nèi)發(fā)生(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory,CollegeStation,TX)。血清生物化學(xué)終點包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肌酸磷酸激酶、總膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、血液尿素氮、肌酸酐、磷、鈣和葡萄糖。在血清收集后90天內(nèi)進(jìn)行胰島素和IGF-1測定。由一個獨立的實驗室分析樣品的葡萄糖和胰島素水平(TexasVeterinaryMedicalDiagnosticLaboratory,CollegeStation,TX)。所有樣品在同一測定中進(jìn)行分析。胰島素測定的測定可變性為3.6%,而葡萄糖測定的測定可變性為4.4%。利用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定試劑盒測量血清樣品的總蛋白(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)。IGF-I的放射免疫測定。利用異源的人免疫放射分析試劑盒根據(jù)廠商的方案(DiagnosticSystemLabs,Webster,TX)來測量血清IGF-1。該試劑盒采用了提取步驟以消除結(jié)合蛋白的干擾。所有樣品在同一測定中進(jìn)行。測定內(nèi)可變性為4%。人IGF-I抗體對于牛IGF-1的交叉反應(yīng)性為100%。SurroundTM9疫苗接種在研究開始后的300天,利用被稱為SurroundTM9(Biocor)的9-way疫苗對參與本研究(用GHRH處理的和對照)的所有動物進(jìn)行疫苗接種。SurroundTM9是包含滅活、加以佐劑的、高抗原性的下述微生物株系的多價疫苗IBR(牛皰疹病毒-1)、BVD(牛病毒性腹瀉病毒)、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒(作為被殺死的病毒)、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體和波摩那鉤端螺旋體菌苗。所有級分都是滅活的并加以佐劑以維持最大的病毒抗原性。鉤端螺旋體血清變型在設(shè)計為確保最大生長和抗原性的培養(yǎng)基中產(chǎn)生。這種疫苗接種在牛中引起從腹瀉以及乳腺炎病因中所牽涉的病原體到呼吸系統(tǒng)疾病的大量致病狀況。在5mL溶液的一次注射中經(jīng)皮下或肌內(nèi)施用該疫苗。統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)由對處理組(經(jīng)處理的n=32,對照的n=20)采用不等的實驗單位配置在不同時間點進(jìn)行重復(fù)測量而得到的結(jié)果組成。當(dāng)檢測到顯著的(P<0.05)處理-x-天相互作用時,進(jìn)行額外的比較。使用采用SAS(簡單主要作用的分析)的混合模型來檢查在不同時間點上每個變量的組之間是否存在任何顯著的差異。通過ANOVA分析分類的數(shù)據(jù),例如發(fā)病率和死亡率、淘選率和蹄問題。數(shù)據(jù)用數(shù)值編碼從而使得可以執(zhí)行ANOVA。在這個參數(shù)的分析中使用每個動物的總蹄得分。對于死亡率,使用相當(dāng)?shù)脑u分系統(tǒng)活的=1,死的=0。對于重復(fù)測量,用ANOVA分析血清IGF-I。結(jié)果中呈現(xiàn)了用Studentst-檢驗、ANOVA或線性回歸進(jìn)行比較的值,將P<0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的水平。實施例4用GHRH質(zhì)粒療法處理并用多價疫苗進(jìn)行疫苗接種的牛的臨床應(yīng)答生物化學(xué)和CBC值總白細(xì)胞計數(shù)在組間是相似的。然而,在300天時循環(huán)淋巴細(xì)胞的百分比在用GHRH處理的動物中是增加的(47.4±3.3%,對照為37.8±5.3%,P<0.06)。在這個時間點上還觀察到血紅蛋白(用GHRH處理的為11.55±0.15g/dL,對照為10.9±0.15g/dL,P<0.02)和紅細(xì)胞(7.65±0.1百萬/mL,7.3±0.2百萬/mL,P<0.07)的生理學(xué)增加。在任何測試時間點上,在其他CBC或血清生物化學(xué)項目方面,組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。這些在對于牛來說的值的正常范圍內(nèi)。葡萄糖和胰島素水平在組間沒有不同(圖2)。免疫標(biāo)記物在第0天,白細(xì)胞總數(shù)、分類計數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)(FC)特性圖在組間是相似的。在處理后第18天時,CD2+值在經(jīng)處理的動物中增加了14%,但在對照中與基線值相比較時沒有改變用GHRH處理的牛中,43.4±1.7%對37.9±1.4%,P<0.004,和對照中,37.3±2.1%對38.8±1.8%)(圖3A)。CD4+/CD8+比率在經(jīng)處理的動物中增加(第18天-第0天=8±0.6%,P<0.04),主要是由于CD4+細(xì)胞的增加(第18天,29.1±0.7%,第0天,24.5±0.8%)。在相同時間段中,CD4+CD45R+幼稚淋巴細(xì)胞通過用GHRH處理增加了53%在用GHRH處理的動物中,第18天,11.1±0.4%,第0天,7.4±0.4%,P<0.016;以及在對照動物中,第18天,8±0.7%,第0天,7.2±0.8%)(圖3B)。CD25+CD4+細(xì)胞通過處理也明顯增加了在用GHRH處理的動物中,第18天,4.3±0.3%,第0天,1±0.1,P<0.001;以及在對照中,第18天,3.8±0.2%,第0天,1.7±0.2。在處理后的第300天,當(dāng)執(zhí)行更全面的項目時,CD45R+/CD45R0-幼稚淋巴細(xì)胞在經(jīng)處理的動物中(0.98±0.08)比在對照中(0.91±0.08)顯著(P<0.05)更多(圖3C)。CD2+CD3+γδ-細(xì)胞由于處理而變得更多所有CD2+細(xì)胞的68.5±1.4%,對照為60±5.6%,P<0.02。SurroundTM9-way疫苗接種(Biocor)后2周,當(dāng)執(zhí)行更全面的項目時,CD4+/CD8+比率在用GHRH處理的動物中顯著增加,而它在對照中是減少的在用GHRH處理的動物中,0.23±0.07;在對照中,-0.09±0.01,P<0.05(圖4)。SurroundTM9-way疫苗接種后2周,當(dāng)執(zhí)行更全面的項目時,與對照相比,CD25-CD4+CD45R0幼稚T淋巴細(xì)胞在用GHRH處理的動物中顯著增加,P<0.05(圖5)。經(jīng)處理的動物中的死亡率小母牛的死亡率(不自主淘選率(involuntarycullrate))在用GHRH處理的動物和對照之間是不同的。在360天的研究過程中,沒有一頭經(jīng)處理的小母牛死亡,而20%的對照小母牛不得不被淘汰(P<0.003)。死亡原因如下一頭為約內(nèi)病,一頭為由于蹄病狀和受感染的切口而引起的全身感染,一頭具有并發(fā)后腿麻痹的嚴(yán)重蹄問題,和一頭為嚴(yán)重的乳腺炎病例。一頭經(jīng)處理的動物由于意外被淘汰。在120天的泌乳天數(shù)(DIM)前的總不自主淘選率通過處理而增加了40%。通過GHRH-質(zhì)粒介導(dǎo)的處理增加了疫苗接種后針對環(huán)境病原體的保護(hù)。體重和身體狀況得分在應(yīng)激和負(fù)能量平衡時、在60-80DIM時,小母牛的身體狀況得分(BCS)在組間是不同的。在60-80DIM,用pSP-HV-GHRH處理的小母牛顯示出BCS的改善(P<0.0001,圖6)。在第一個100DIM期間,經(jīng)處理的動物損失了3.5kg的平均重量(總體重的0.06%)(P<0.02,圖7),而對照牛損失了26.4kg的平均重量(4.6%的在60DIM時的總體重)。較佳的BCS與血清IGF-I水平增加相關(guān)對于用GHRH處理的小母牛,第100天-第60天=22.4±4ng/mL(第100天為119.7±6.9ng/mL,第60天為97.3±6.6ng/mL);對于對照,8±7.4ng/mL(第100天為99.8±3.9ng/mL,第60天為91.8±6.8ng/mL)(P<0.04)。發(fā)病率在質(zhì)粒施用前在研究開始時牛群具有明顯的蹄病理狀態(tài)。足部問題,最可能是細(xì)菌起因的(Murray等人,1996),在本研究的整個過程中也是這些動物發(fā)病的主要原因之一。構(gòu)成主要蹄病理狀態(tài)的趾部皮炎損傷通過GHRH處理而減弱。研究已顯示,多達(dá)29%的乳牛和4%的肉牛具有十分明顯的趾部皮炎損傷,并且在超過60%的情況下涉及螺旋體(Brown等人,2000)。對螺旋體的免疫應(yīng)答具有較短的持續(xù)時間(Trott等人,2003),因此為了減少感染負(fù)荷,穩(wěn)定的長期治療將是優(yōu)選的。疫苗接種和GHRH處理的組合經(jīng)證明對于被處理的動物是有利的。與經(jīng)處理的動物相比較時,對于對照來說在本研究的過程中自始至終具有惡化的足部問題的動物的比例高40%32只用GHRH處理的動物中的7只;20只對照中的7只。由于對照組中動物間的高可變性,總蹄得分的改善沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.4)。與用可以產(chǎn)生不希望的副作用(例如,出血性潰瘍、肝和腎的液泡化或甚至是動物死亡(Smith等人,1991))的豬重組促生長素(rpST)或bST進(jìn)行注射相反,質(zhì)粒介導(dǎo)的GHRH基因補充給藥法是被良好耐受的,在動物中沒有觀察到副作用。包含受調(diào)節(jié)的組織/纖維型特異性hGH的質(zhì)粒先前已在家畜和GH缺乏宿主中用于GH的遞送和穩(wěn)定生產(chǎn)。用于遞送包含hGH的質(zhì)粒的方法包括基因轉(zhuǎn)移、成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或脂質(zhì)體介導(dǎo)的靜脈內(nèi)注射(Barr和Leiden,1991;Dahler等人,1994;Pursel等人,1990)。然而,這些技術(shù)具有明顯的缺點,即要將它們從以大規(guī)模運作進(jìn)行使用和/或用于食物動物中排除,包括1)與脂質(zhì)體遞送相關(guān)的可能的毒性或免疫應(yīng)答;2)在經(jīng)轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞方法中需要大量離體操作;和/或3)在基因轉(zhuǎn)移中重大副作用或無效的風(fēng)險(Dhawan等人,1991;Miller等人,1989)。與這些技術(shù)相比,質(zhì)粒介導(dǎo)的基因補充給藥法和DNA注射是簡單且有效的,沒有與遞送系統(tǒng)或過量表達(dá)相關(guān)的并發(fā)癥。本文所提供的實施方案舉例說明了,在注射有GHRH質(zhì)粒的哺乳動物中產(chǎn)生了增強的疫苗接種應(yīng)答和改善的臨床結(jié)果。經(jīng)處理的受試者在受試者對于感染性攻擊的應(yīng)答能力方面顯示出明顯的改善。經(jīng)處理的受試者沒有經(jīng)歷來自該療法的任何副作用,包括相關(guān)的病理狀態(tài)或死亡。盡管不希望被理論束縛,但疫苗接種應(yīng)答的增強表明,肌原性GHRH載體的異位表達(dá)將可能以生理學(xué)上更合適的方式刺激GH軸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易意識到,本發(fā)明非常適合于實現(xiàn)這些目的并獲得所提到的以及那些其中所固有的目標(biāo)和優(yōu)點。本文所描述的生長激素、生長激素釋放激素、類似物、質(zhì)粒、載體、藥物組合物、治療、方法、操作過程和技術(shù)目前代表了優(yōu)選的實施方案,并且希望是示例性的而不希望作為范圍的限制。另外,包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合的疫苗希望是示例性的而不希望作為范圍的限制。因此,對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,將會存在其改變和其他用途,它們包括在本發(fā)明的精神之內(nèi)或由未決的權(quán)利要求的范圍所限定。所引用的參考文獻(xiàn)下述美國專利文件和公開的參考文獻(xiàn)中每一個的完整內(nèi)容引入本文作為參考。美國專利文件于1998年12月8日頒發(fā)、Coy等人列為發(fā)明人的美國專利號5,847,066。于1998年12月8日頒發(fā)、Felix等人列為發(fā)明人的美國專利號5,846,936。于1998年8月11日頒發(fā)、Schally等人列為發(fā)明人的美國專利號5,792,747。于1998年7月7日頒發(fā)、Bowers等人列為發(fā)明人的美國專利號5,776,901。于1998年5月26日頒發(fā)、Schwartz等人列為發(fā)明人的美國專利號5,756,264。于1997年12月9日頒發(fā)、Felix等人列為發(fā)明人的美國專利號5,696,089。于1996年1月23日頒發(fā)、Bowers等人列為發(fā)明人的美國專利號5,486,505。于1994年3月8日頒發(fā)、Boyd等人列為發(fā)明人的美國專利號5,292,721。于1992年8月11日頒發(fā)、Seely等人列為發(fā)明人的美國專利號5,137,872。于1992年7月28日頒發(fā)、Boyd等人列為發(fā)明人的美國專利號5,134,210。于1992年1月28日頒發(fā)、Felix等人列為發(fā)明人的美國專利號5,084,442。于1991年10月29日頒發(fā)、Kann等人列為發(fā)明人的美國專利號5,061,690。于1991年7月30日頒發(fā)、Thorner列為發(fā)明人的美國專利號5,036,045。于1991年6月11日頒發(fā)、Kovacs等人列為發(fā)明人的美國專利號5,023,322。于1989年6月13日頒發(fā)、Bowers等人列為發(fā)明人的美國專利號4,839,344。于1983年10月18日頒發(fā)、Bowers等人列為發(fā)明人的美國專利號4,410,512。于1991年9月24日頒發(fā)、Drengler列為發(fā)明人的美國專利號RE33,699。于1989年5月23日頒發(fā)、Grosvenor等人列為發(fā)明人的美國專利號4,833,166。于1980年10月14日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,228,158。于1980年10月14日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,228,156。于1980年10月7日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,226,857。于1980年9月23日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,224,316。于1980年9月16日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,223,021。于1980年9月16日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,223,020。于1980年9月16日頒發(fā)、Momany等人列為發(fā)明人的美國專利號4,223,019。于1997年12月30日頒發(fā)、標(biāo)題為“Needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”、Hofmann等人列為發(fā)明人的美國專利號5,702,359。于1995年8月8日頒發(fā)、標(biāo)題為“Electroporationsystemwithvoltagecontrolfeedbackforclinicalapplications”、Hofmann列為發(fā)明人的美國專利號5,439,440。于1996年5月5日公開、標(biāo)題為“ElectroporeticGeneandDrugTherapybyInducedElectricFields”、Hofmann等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/96/12520。于1996年4月25日公開、標(biāo)題為“FlowThroughElectroporationApparatusandMethod”、Hofmann等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/96/12006。于1995年7月27日公開、標(biāo)題為“ElectroporationandIontophoresisApparatusandMethodForinsertionofDrugsandgenesintoCells”、Hofmann列為發(fā)明人的PCT申請WO/95/19805。于1997年3月6日公開、標(biāo)題為“InVivoElectroporationofCells”、Nicolau等人列為發(fā)明人的PCT申請WO/97/07826。參考文獻(xiàn)列表Acsadi,G.,G.Dickson,D.R.Love,A.Jani,F(xiàn).S.Walsh,A.Gurusinghe,Wolff,JA,andK.E.Davies.1991.HumandystrophinexpressioninmdxmiceafterintramuscularinjectionofDNAconstructs.Nature352815-818.Aihara,H.andJ.Miyazaki.1998.Genetransferintomusclebyelectroporationinvivo.Nat.Biotechnol.16867-870.Almendro,N.,T.Bellon,C.Rius,P.Lastres,C.Langa,A.Corbi,andC.Bernabeu.1996.Cloningofthehumanplateletendothelialcelladhesionmolecule-lpromoteranditstissue-specificexpression.Structuralandfunctionalcharacterization.J.Immunol.1575411-5421.Alpdogan,O.,S.J.Muriglan,B.J.Kappel,E.Doubrovina,C.Schmaltz,R.Schiro,J.M.Eng,A.S.Greenberg,L.M.Willis,J.A.Rotolo,R.J.O′Reilly,andM.R.vandenBrink.2003.Insulin-likegrowthfactor-Ienhanceslymphoidandmyeloidreconstitutionafterallogeneicbonemarrowtransplantation.Transplantation751977-1983.Aratani,Y.,R.Okazaki,andH.Koyama.1992.Endextensionrepairofintroducedtargetingvectorsmediatedbyhomologousrecombinationinmammaliancells.NucleicAcidsRes.204795-4801.Babiuk,L.A.,R.Pontarollo,S.Babiuk,B.Loehr,andvanDrunenLittel-vandenHurk.2003.InductionofimmuneresponsesbyDNAvaccinesinla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11>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是羊GHRH的氨基酸序列<400>7TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysIleLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>8<211>43<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是雞GHRH的氨基酸序列<400>8HisAlaAspGlyIlePheSerLysAlaTyrArgLysLeuLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgAsnTyrLeuHisSerLeuMetAlaLysArgValGly202530SerGlyLeuGlyAspGluAlaGluProLeuSer3540<210>9<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是馬GHRH的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>″X″可以是任何AA序列<220><221>misc_feature<222>(30)..(40)<223>″X″可以是任何AA序列<400>9XaaAlaAspAlaIlePheThrAsnAsnTyrArgLysValLeuGlyGlnl51015LeuSerAlaArgLysIleLeuGlnAspIleMetSerArgXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa3540<210>10<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是人(1-40)-GHRH的氨基酸序列<400>10TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluSerAsnGlnGluArgGlyAla3540<210>11<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是TV-生長激素釋放激素(“GHRH”)類似物<400>11TyrValAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuAlaGlnl51015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleLeuAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>12<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是TA-生長激素釋放激素(“GHRH”)類似物<400>12TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuAlaGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleLeuAsnArgGlnGlnGly202530GluArgAsnGlnGluGlnGlyAla3540<210>13<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是人(1-44)生長激素釋放激素(″GHRH″)<400>13TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluSerAsnGlnGluArgGlyAlaArgAlaArgLeu3540<210>14<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>這是GHRH(1-40)OH的人工序列<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa可以是酪氨酸或組氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa可以是丙氨酸、纈氨酸或異亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa可以是丙氨酸、纈氨酸或異亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>第27位的Xaa可以是甲硫氨酸或亮氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa可以是絲氨酸或天冬酰胺<220><221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>第34位的Xaa可以是精氨酸或絲氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>第36位的Xaa可以是精氨酸或谷氨酰胺<220><221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>第38位的Xaa可以是精氨酸或谷氨酰胺<400>14XaaXaaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuXaaGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleXaaXaaArgGlnGlnGly202530GluXaaAsnXaaGluXaaGlyAla3540<210>15<211>323<212>DNA<213>人工序列<220><223>這是真核啟動子c5-12的核酸序列<400>15cggccgtccgccctcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatg60gtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctcta120aaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcga180cggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctggg240ggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacga300gctacccggaggagcgggaggcg323<210>16<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生長激素polyA尾的核酸序列<400>16gggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcca60gtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtcc120ttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagaca180acctgtaggg190<210>17<211>795<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗生素抗性基因卡那霉素的核酸序列<400>17atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca120gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540ggcgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780gacgagttcttctga795<210>18<211>219<212>DNA<2t3>人工序列<220><223>類似的豬GHRH序列的序列<400>18atggtgctctgggtgttcttctttgtgatcctcaccctcagcaacagctcccactgctcc60ccacctccccctttgaccctcaggatgcggcggcacgtagatgccatcttcaccaacagc120taccggaaggtgctggcccagctgtccgcccgcaagctgctccaggacatcctgaacagg180cagcagggagagaggaaccaagagcaaggagcataatga219<210>19<211>246<212>DNA<213>人工序列<220><223>類似的小鼠GHRH序列的序列<400>19gccatggtgctctgggtgctctttgtgatcctcatcctcaccagcggcagccactgcagc60ctgcctcccagccctcccttcaggatgcagaggcacgtggacgccatcttcaccaccaac120tacaggaagctgctgagccagctgtacgccaggaaggtgatccaggacatcatgaacaag180cagggcgagaggatccaggagcagagggccaggctgagctgataagcttgcgatgagttc240ttctaa246<210>20<211>234<212>DNA<213>人工序列<220><223>類似的大鼠GHRH序列的序列<400>20gccatggccctgtgggtgttcttcgtgctgctgaccctgaccagcggaagccactgcagc60ctgcctcccagccctcccttcagggtgcgccggcacgccgacgccatcttcaccagcagc120tacaggaggatcctgggccagctgtacgctaggaagctcctgcacgagatcatgaacagg180cagcagggcgagaggaaccaggagcagaggagcaggttcaactgataagcttgc234<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>原核PNEO啟動子的核酸序列<400>21accttaccagagggcgccccagctggcaa29<210>22<211>3534<212>DNA<213>人工序列<220><223>具有類似的GHRH序列的質(zhì)粒載體<400>22gttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactatagggcgaattggagctcc60accgcggtggcggccgtccgccctcggcaccatcctcacgacacccaaatatgg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ggtgctctttgtgatcctcatcctcaccagcggcagccactgcagc60ctgcctcccagccctcccttcaggatgcagaggcacgtggacgccatcttcaccaccaac120tacaggaagctgctgagccagctgtacgccaggaaggtgatccaggacatcatgaacaag180cagggcgagaggatccaggagcagagggccaggctgagctgataagcttgcgatgagttc240ttctaa246<210>38<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生長激素polyA尾的核酸序列<400>38gggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcca60gtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtcc120ttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagaca180acctgtaggg190<210>39<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人生長激素5’UTR的核酸序列<400>39caaggcccaactccccgaaccactcagggtcctgtggacagctcacctagctgcc55<210>40<211>782<212>DNA<213>人工序列<220><223>質(zhì)粒pUC-18復(fù)制起點的核酸序列<400>40tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta60tcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaag120aacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg180tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg240tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg300cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga360agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc420tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt480aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact540ggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg600cctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt660accttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggt720ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcct780tt782<210>41<211>5<212>DNA<213>人工序列<220><223>這是NEO核糖體結(jié)合位點<400>41tcctc權(quán)利要求1.一種準(zhǔn)備需要接種疫苗的受試者的方法,其包括將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中,其中GHRH在受試者體內(nèi)表達(dá)。2.權(quán)利要求1的方法,其中核酸表達(dá)構(gòu)建體的遞送發(fā)生在受試者接種疫苗前最多約1年。3.權(quán)利要求2的方法,其中核酸表達(dá)構(gòu)建體的遞送發(fā)生在受試者接種疫苗前約0-約14天。4.權(quán)利要求1的方法,其中將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中包括組織電穿孔。5.權(quán)利要求4的方法,其中組織電穿孔包括(a)用多個針狀電極穿透受試者的組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列并且所述受試者的組織包括肌細(xì)胞;(b)以約0.01-5mg的量將核酸表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述多個針狀電極之間的組織中;以及(c)對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜。6.權(quán)利要求5的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包括促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽或帶電荷的多肽。7.權(quán)利要求6的方法,其中所述促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽或帶電荷的多肽包括聚L-谷氨酸。8.權(quán)利要求1的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列。9.權(quán)利要求1的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。10.權(quán)利要求1的方法,其中所述接種疫苗包括微生物、傳染劑或類毒素的至少部分。11.權(quán)利要求10的方法,其中所述微生物包括病毒、細(xì)菌、支原體或寄生蟲。12.權(quán)利要求10的方法,其中所述微生物包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合。13.權(quán)利要求1的方法,其中所述受試者包括人、反芻動物、食物動物或工作動物。14.一種對受試者進(jìn)行疫苗接種的方法,其包括(a)將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中;以及(b)以對于誘導(dǎo)受試者中抗疫苗抗體來說有效的量向受試者提供疫苗;其中GHRH在受試者體內(nèi)表達(dá),并且當(dāng)與沒有遞送GHRH表達(dá)構(gòu)建體的對照受試者相比較時,疫苗接種應(yīng)答得到增強。15.權(quán)利要求14的方法,其中核酸表達(dá)構(gòu)建體的遞送與向受試者提供疫苗相伴發(fā)生。16.權(quán)利要求14的方法,其進(jìn)一步包括在將編碼GHRH的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者中之后,但在提供疫苗之前等待一段時間。17.權(quán)利要求16的方法,其中所述時間段為最多約1年。18.權(quán)利要求17的方法,其中所述時間段為約7天-約14天。19.權(quán)利要求14的方法,其中將核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中包括組織電穿孔。20.權(quán)利要求19的方法,其中組織電穿孔包括用多個針狀電極穿透受試者的組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列并且所述受試者的組織包括肌細(xì)胞;以約0.01-5mg的量將核酸表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述多個針狀電極之間的組織中;以及對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜。21.權(quán)利要求20的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包括促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽或帶電荷的多肽。22.權(quán)利要求21的方法,其中所述促進(jìn)轉(zhuǎn)染的多肽或帶電荷的多肽包括聚L-谷氨酸。23.權(quán)利要求14的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列。24.權(quán)利要求14的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。25.權(quán)利要求14的方法,其中所述疫苗包括微生物、傳染劑或類毒素的至少部分。26.權(quán)利要求25的方法,其中所述微生物包括病毒、細(xì)菌、支原體或寄生蟲。27.權(quán)利要求25的方法,其中所述微生物包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合。28.權(quán)利要求14的方法,其中所述受試者包括人、反芻動物、食物動物或工作動物。29.一種改善具有關(guān)節(jié)炎并接種了疫苗的受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果的方法,其包括(a)用多個針狀電極穿透受試者的肌肉組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列;(b)將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的肌肉組織中,從而使得表達(dá)的GHRH的量能有效增強疫苗接種應(yīng)答;以及(c)對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜,其中,將0.01-5mg的核酸表達(dá)構(gòu)建體與指定濃度的聚L-谷氨酸多肽一起遞送到受試者的肌肉組織中,并且所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列;并且所述受試者包括人、反芻動物、食物動物或工作動物。30.權(quán)利要求29的方法,其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括與小鼠pAV0202(SEQID#23);大鼠pAV0203(SEQID#24);HV-GHRHpAV0224(SEQID#25);豬-wt-GHRHpAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛pAV0236(SEQID#28);貓pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊pAV0240(SEQID#31);雞pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33);或人pAV0226(SEQID#34)至少97%同一的序列。31.權(quán)利要求29的方法,其中所述受試者進(jìn)行疫苗接種以抗微生物、傳染劑或類毒素。32.權(quán)利要求31的方法,其中所述微生物包括病毒、細(xì)菌、支原體或寄生蟲。33.權(quán)利要求31的方法,其中所述微生物包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合。34.一種組合物,其包含(a)編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體;以及(b)疫苗;其中,GHRH在受試者體內(nèi)表達(dá)。35.權(quán)利要求34的方法,其中所述疫苗包括微生物、傳染劑或類毒素的至少部分。36.權(quán)利要求35的方法,其中所述微生物包括病毒、細(xì)菌、支原體或寄生蟲。37.權(quán)利要求35的方法,其中所述微生物包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合。38.一種對受試者進(jìn)行疫苗接種的方法,其包括(a)用多個針狀電極穿透受試者的組織,其中所述多個針狀電極以間隔關(guān)系排列并且所述受試者的組織包括肌細(xì)胞;(b)以約0.01-5mg的量將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述多個針狀電極之間的組織中;以及(c)對所述多個針狀電極施加電脈沖,其中所述電脈沖允許所述核酸表達(dá)構(gòu)建體穿過肌細(xì)胞膜;(d)以對于誘導(dǎo)受試者中針對疫苗的抗體來說有效的量向受試者提供疫苗;其中所述核酸表達(dá)構(gòu)建體包括編碼多肽的序列,所述多肽具有與SEQID#14編碼的GHRH至少90%同一的氨基酸序列;并且其中所述疫苗包括牛皰疹病毒-1(“IBR”)、牛病毒性腹瀉(“BVD”)病毒、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體bacterinsmycoplasmahyopneumonia、豬肺炎支原體或其組合的至少部分。全文摘要本發(fā)明公開了組合物和方法對受試者進(jìn)行疫苗接種;增強接種疫苗的效率;在接種疫苗應(yīng)答前準(zhǔn)備受試者;以及改善已接種受試者在感染性攻擊后的臨床結(jié)果。更具體而言,本發(fā)明適合在給受試者遞送疫苗之前或相伴疫苗遞送將編碼生長激素釋放激素(“GHRH”)的核酸表達(dá)構(gòu)建體遞送到受試者的組織中,其中,GHRH表達(dá)在受試者體內(nèi),其中受試者包括人、豬、母牛、鳥、馬或接受疫苗的任何其他動物種類。文檔編號A61K39/39GK101027081SQ200580031764公開日2007年8月29日申請日期2005年7月21日優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日發(fā)明者R·德拉吉亞-阿克里,P·A·布朗,A·S·卡恩,W·C·戴維斯申請人:阿德維希斯公司
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