專利名稱：：基因或藥物遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于遞送活性劑的組合物和方法，更具體地，涉及使用超聲和微泡組合受控地、局部遞送活性劑。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)報(bào)導(dǎo)陽離子脂質(zhì)體可應(yīng)用于在體外和體內(nèi)遞送大分子到靶細(xì)胞。美國專利號4,897,355、美國專利號5,334,761和美國專利號6，034，137公開了使用陽離子脂質(zhì)團(tuán)聚體如脂質(zhì)體、單層脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體和微團(tuán)的組合物和方法，所述陽離子脂質(zhì)團(tuán)聚體結(jié)合帶負(fù)電荷的大分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小化合物并且當(dāng)與靶細(xì)胞接觸時(shí)，將大分子遞送到靶細(xì)胞內(nèi)部或者靶細(xì)胞膜上。在基因轉(zhuǎn)染中，據(jù)報(bào)導(dǎo)用脂質(zhì)體遞送的轉(zhuǎn)染效率在體外很高但是在體內(nèi)很低。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)超聲介導(dǎo)的微泡破壞為用于將藥物、蛋白質(zhì)、信號分子或基因(包括質(zhì)粒栽體或者病毒載體)遞送到特定組織的體外或體內(nèi)方法(美國專利號5，580，757):將經(jīng)標(biāo)記的紅細(xì)胞和聚合物微球體遞送到大鼠骨骼肌(Skyba，等人1"8;和Price,等人1"8);寡核苷酸遞送到狗腎(Porter，等人1996);狗心肌(Wei，等人1997);和具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的培養(yǎng)的HeLa、NIH/JT3和C12"細(xì)胞(Unger，等人199"7)。在一個(gè)研究中，將含有處于組成型啟動子控制下的P-半乳糖苷酶的重組腺病毒轉(zhuǎn)基因附著到白蛋白包被的、全氟丙烷填充的微泡的表面，并通過超聲介導(dǎo)的微泡破壞將微泡遞送到大鼠心肌，導(dǎo)致與對照動物相比，P-半乳糖苷酶活性增加10倍(Shohet，等人2000)。在超聲定向的微泡破壞的報(bào)導(dǎo)中，生物活性劑用油懸浮劑捕獲在微泡核心中或者通過化學(xué)、靜電或者機(jī)械手段附著到微泡外殼。微泡的直徑通常為約2-4微米并且為球形。它們含有包裹在外殼內(nèi)的氣體核心，其中氣體通常是全氟化碳，但是也已經(jīng)使用了空氣、氮?dú)饣蛘吡?。微泡的外殼由白蛋白、磷脂或者聚合物制造。根?jù)電子顯微鏡檢查，通常的微泡外殼約30-50nm厚，具有網(wǎng)狀、可塑特征，其當(dāng)暴露于正或者負(fù)壓波，如超聲波時(shí)發(fā)生振動。取決于所應(yīng)用的超聲波的振幅和頻率，微泡經(jīng)歷空化作用，釋放被微泡外殼包裹或者附著到微泡外殼的生物活性劑。盡管已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了活性成分向靶位點(diǎn)的脂質(zhì)體或者微泡遞送，但是這些方法在體內(nèi)還沒有所希望的那么有效。對于遞送生物活性DNA的情況，有幾種因素限制轉(zhuǎn)染效率，所以限制了它的有效性。附著到微泡的生物活性DNA可以被循環(huán)的脫氧核糖核酸酶(DNA酶)中和。當(dāng)從脂質(zhì)微泡釋放時(shí)，DNA在靶器官內(nèi)是游離的，但是可能不進(jìn)入細(xì)胞膜或者核膜。而且，部分微泡外殼將保持附著到DNA分子并且從而阻止它的翻譯。在遞送中，其他類型的生物活性劑同樣對于蛋白酶、脂肪酶、糖類切割酶和其他降解途徑敏感。發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)活性成分如藥物、肽、遺傳物質(zhì)或者化學(xué)治療劑可以以比迄今報(bào)導(dǎo)的更高的效率遞送到靶標(biāo)部位，如哺乳動物中的特定器官或者組織。描述了活性劑遞送系統(tǒng)，其包括在微泡和包括預(yù)先裝配到脂質(zhì)體的活性劑的復(fù)合體之間形成的復(fù)合體。脂質(zhì)體復(fù)合體可以在所希望的時(shí)間點(diǎn)被破壞以允許在靶標(biāo)部位釋放活性成分。本發(fā)明還包括通過使用超聲定向的微泡破壞(UTMD)向靶器官或者組織體內(nèi)遞送生物活性劑的方法，其中電中性的脂類微泡已經(jīng)裝載納球體(nanospheric)陽離子脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體裝載生物活性劑。本發(fā)明包括用于體內(nèi)遞送一種或多種活性劑的組合物和方法，其包括步驟將靶器官或者組織與微泡包裹的活性劑接觸，其中該微泡具有電中性的脂類微泡，該脂類微泡包含預(yù)先裝載的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包含一種或多種活性劑；并通過在靶標(biāo)處將微泡暴露于超聲選擇性釋放活性劑，其中活性劑在微泡中保持受保護(hù)，直到在靶標(biāo)選擇性釋放?；钚詣┛梢园ㄒ环N或多種分子，例如，處于組織特異性啟動子控制下的核酸區(qū)段。其他實(shí)例包括具有組織特異性基因的核酸區(qū)段，所述基因處于組織特異性啟動子控制下、處于可活化的啟動子控制下、處于可活化的啟動子的控制下，該啟動子驅(qū)動導(dǎo)致凋亡的基因的表達(dá)?；钚詣┑钠渌麑?shí)例包括一種或多種核酸區(qū)段，其編碼選自由激素、生長因子、酶、載脂蛋白凝固因子、腫瘤抑制因子、腫瘤抗原、病毒蛋白、細(xì)菌表面蛋白，和寄生蟲細(xì)胞表面蛋白組成的組的基因。通常，微泡在藥學(xué)上可接受的載體中分布。活性劑可以是可表達(dá)的基因，其選自由例如，突變或野生型的p53、p16、p21、MMAC1、p73、zacl、C國CAM、BRCAI、Rb、Harakiri、AdElB、ICE-CED3蛋白酶、IL國2、IL畫3、IL-4、IL畫5、IL陽6、IL-7、IL畫8、IL-9、IL國IO、IL國ll、IL-12、IL畫13、IL-14、IL誦15、TNF、GMCSF、|3-干擾素、y-干擾素、VEGF、EGF、PDGF、CFTR、EGFR、VEGFR、IL畫2受體、雄激素受體、Bcl畫2或Bcl國xL、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、abl、p53、p16、p21、MMAC1、p73、zacl、BRCAI、BRCAII、Rb、生長激素、神經(jīng)生長因子、胰島素、促腎上腺皮質(zhì)激素、曱狀旁腺激素、促卵泡激素、黃體生成素和促甲狀腺激素組成的組。這些活性劑還可以包括啟動子和處于該啟動子控制下的基因，該啟動子選自由CMVIE、LTR、SV40IE、HSVtk、p-肌動蛋白、胰烏素、人珠蛋白a、人珠蛋白(3和人珠蛋白Y啟動子組成的組。多種超聲裝置以及遞送和使用的方法、頻率、方式、能量等等可以用于本發(fā)明。例如，超聲可以以脈沖或者聚焦方式應(yīng)用。超聲可以以超諧波方式等應(yīng)用。微泡的實(shí)例包括本領(lǐng)域公知的那些，在一個(gè)實(shí)例中，微泡可以是生物可降解的聚合物、生物相容的兩親性材料、具有外殼的微泡，該外殼包含生物相容的兩親性材料的外層和生物可降解的聚合物的內(nèi)層，和/或由選自膠原、明膠、白蛋白或者球蛋白的兩親性材料制成的微泡。在一組特定實(shí)例中，活性劑可以是包含處于胰島素啟動子控制下的己糖激酶的核酸載體，或者甚至是包含處于RIP啟動子控制下的己糖激酶基因I的核酸栽體。使用本文教導(dǎo)的組合物和方法遞送的活性劑的另一實(shí)例包括包含hVEGF蛋白質(zhì)、hVEGFmRNA或者h(yuǎn)VEGF蛋白質(zhì)和hVEGFmRNA兩者的核酸載體，或者甚至包含hVEGF165蛋白質(zhì)、hVEGF165mRNA或者h(yuǎn)VEGF^蛋白質(zhì)和hVEGF165mRNA兩者的核酸載體。用于制備脂質(zhì)體的脂類和它們的裝載是本領(lǐng)域公知的并且可以包括一種或多種下面的例如，與載體和/或質(zhì)粒混合的1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷脂?；憠A和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂?；掖及犯视?。多種通過商業(yè)途徑可獲得的脂類、混合物、試劑盒等等是公知的并且可以獲得。本發(fā)明還包括治療需要此類治療的哺乳動物的方法，其包括向哺乳動物施用有效量的組合物并使用超聲向哺乳動物釋放生物活性劑，其中所述組合物具有電中性的脂質(zhì)微泡，該微泡裝載預(yù)先裝載一種或多種生物活性劑的陽離子脂質(zhì)體。哺乳動物可以是患者，可以對患者提供藥學(xué)上可接受的載體中的微泡并將微泡暴露于聚焦在用于遞送的部位的超聲能量。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于在靶標(biāo)部位超聲定向的微泡破壞的藥物遞送組合物，其包括在微泡內(nèi)部和周圍預(yù)先裝配的脂質(zhì)體-核酸復(fù)合體。脂質(zhì)體-核酸復(fù)合體可以包括陽離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)或者其混合物和組合。裝載的微泡通常在藥學(xué)上可接受的載體中處置，如以液體或者干燥形式。微泡可以重懸浮在藥學(xué)上可接受的載體，例如鹽水中。當(dāng)以干燥形式和作為例如試劑盒的部分提供時(shí)，干燥粉劑可以與一個(gè)或多個(gè)用完扔掉的一次或多次使用的容器和遞送系統(tǒng)，例如，注射器和/或針頭一起提供，并且可以還包括使用說明。通常，試劑盒組分將預(yù)先消毒。預(yù)先裝載的微泡可以用于治療需要這種治療的哺乳動物的方法中，該方法包括提供有效量的組合物，該組合物具有電中性的脂質(zhì)微泡，該微泡裝載了用生物活性劑預(yù)先裝載的納米球陽離子脂質(zhì)體，并在耙標(biāo)部位使用超聲定向的微泡破壞來破壞微泡?；钚猿煞值膶?shí)例包括例如，原子或者小藥物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、糖、多糖、維生素、礦物質(zhì)和其組合和混合物。核酸的實(shí)例可以包括核糖核酸、脫氧核糖核酸，它們?yōu)檎x或者反義方向、線性或環(huán)狀、作為載體的部分，該載體具有例如組成型和/或組織特異的啟動子、增強(qiáng)子、沉默子、同源重組位點(diǎn)等等。可以包括的肽為例如，T細(xì)胞活化抗原、激素、遞質(zhì)等等。蛋白質(zhì)可以是前體蛋白質(zhì)、抗原、抗體、融合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)道分子、可檢測的標(biāo)記、酶(例如，蛋白酶、核酸酶、激酶、磷酸酶、代謝酶)、趨化因子、淋巴因子、干擾素、白介素、激動劑、拮抗劑、受體、traps和其混合物和組合。脂類可以是遞質(zhì)、膜組分、能量來源、激動劑、拮抗劑、趨化因子等等。還可以使用本發(fā)明遞送營養(yǎng)補(bǔ)劑，例如，營養(yǎng)有效量的DNA、蛋白質(zhì)、脂類、糖前體、維生素、礦物質(zhì)等等。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于超聲定向微泡破壞的遞送組合物，該組合物包括電中性的脂質(zhì)微泡，該微泡裝載了用生物活性劑裝載的納米球陽離子脂質(zhì)體。附圖簡述為了更完全地理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在參考本發(fā)明的詳細(xì)描述和附圖，并且附圖中圖1包括四個(gè)小圖，上部小圖是來自對照大鼠(左)和UTMD處理的大鼠(右)的顯微鏡切片(100X)。原位PCR雜交用于染色LacZ質(zhì)粒DNA，其在所處理的胰腺各處可見?？梢郧宄乜吹揭葹?箭頭)。底部小圖來自對照大鼠(左)和使用RIP-LacZ用UTMD處理的大鼠的切片(400X)。原位PCR雜交用于染色LacZmRNA，其定位于胰烏中心。圖2包括在高倍共焦顯微鏡(400X)下看到的胰腺的冷凍切片的六個(gè)小圖，顯示了用在RIP啟動子下的DsRed質(zhì)粒通過UTMD處理的胰島。頂部小圖來自相同胰島的圖像，使用不同的濾光設(shè)置以鑒定相對于(3細(xì)胞的DsRed蛋白質(zhì)。左上小圖胰島中存在DsRed。中上小圖使用綠色濾光器，針對胰島素的熒光抗體鑒定了胰島中心的P細(xì)胞。右上小圖共焦圖像證實(shí)DsRed表達(dá)與p細(xì)胞的共定位。底部小圖來自相同胰島的相鄰切片的圖像，使用不同的濾光器設(shè)置以鑒定相對于ot細(xì)胞的DsRed蛋白質(zhì)。左下小圖胰島中存在DsRed。中下小圖使用綠色濾光器，針對胰高血糖素的熒光抗體鑒定了沿著胰島周圍的a細(xì)胞。右下小圖共焦圖像證實(shí)DsRed表達(dá)不共定位于a細(xì)胞。圖3顯示了用CMV-luc(斷面線條形)、RIP-熒光素酶(白色條形)或者RIP-熒光素酶加上UTMD后20%葡萄糖飼養(yǎng)4天處理(黑色條形)的大鼠中完整胰腺熒光素酶活性。葡萄糖飼養(yǎng)導(dǎo)致與僅RIP相比，RIP-熒光素酶表達(dá)上調(diào)4倍。注意到熒光素酶表達(dá)的顯著的胰腺特異性。在肝臟和脾臟中僅注意到沿著超聲路徑的輕微活性。左腎也在超聲束的路徑上，顯示出比胰腺小得多的活性，但是具有RIP-熒光素酶的可調(diào)節(jié)的表達(dá)。右腎在超聲路徑的外面，沒有顯示出熒光素酶表達(dá)。每組有3只大鼠。通過ANOVA分析，器官之間熒光素酶活性的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=74.86，p<0.0001)。質(zhì)粒(CMV對RIP對RIP與葡萄糖飼養(yǎng))中的差異也是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=42.36，p<0.0001)。圖4顯示了RIP-熒光素酶表達(dá)的時(shí)間過程。熒光素酶活性在第4天時(shí)從其峰值下降并且到第28天時(shí)可以忽略不計(jì)。通過ANOVA分析，熒光素酶活性在時(shí)間上的下降也是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=236.4，p<0.0001)。圖5包括頂部小圖蛋白質(zhì)印跡，顯示了用UTMD處理后，在正常對照和DsRed處理的對照中，分離的大鼠胰腺中證明己糖激酶-1活性。左下通過UTMD用己糖激酶處理、通過UTMD用DsRed對照處理和假手術(shù)對照處理的大鼠中的血清胰島素水平。通過反復(fù)測量ANOVA，組差異在p=0.0033時(shí)是顯著的，由事后檢定(post-hoc)Scheffe檢驗(yàn)表明在第5和10天時(shí)的顯著差異。右下小圖顯示了通過UTMD用己糖激酶I處理、通過UTMD用DsRed對照處理和通過假手術(shù)對照處理的大鼠中的血清葡萄糖水平。通過反復(fù)測量ANOVA，組差異在p=0.0005時(shí)是顯著的，由事后檢定Scheffe檢驗(yàn)表明在第5和10天時(shí)的顯著差異。數(shù)據(jù)顯示為平均值士一標(biāo)準(zhǔn)差，11=每組6(UTMD己糖激酶)，3(UTMD對照)和3(正常對照)只大鼠。圖6通過免疫印跡顯示了在來自大鼠心肌的組織勻漿中hVEGF165蛋白質(zhì)的存在。在第10天時(shí)，在用UTMD-hVEGF!65處理的所有三只大鼠中都看到與hVEGF165—致的明顯帶，但是在對照大鼠(僅UTMD,僅hVEGF165質(zhì)粒，或者鹽水)中僅有微弱帶。還顯示了陽性對照帶(+C)。圖7顯示了來自大鼠心肌的組織勻漿中人VEGF16SmRNA(頂部小圖)和大鼠VEGF165mRNA(底部小圖)的存在的PT-PCR結(jié)果。在用UTMD處理的3只大鼠中在笫5天(#1-3)和第10天(#7-9)，和用UTMD處理的1只大鼠(#14)中在第30天(#13-15)中看到hVEGF165mRNA帶，但是在任何對照大鼠(#4-6，10-12，16-18)中都沒有看到hVEGF165mRNA帶。為了顯示的目的，每個(gè)時(shí)間期限僅顯示了來自3個(gè)對照組的每一組的僅1只大鼠。在所有實(shí)驗(yàn)大鼠中都看到大鼠VEGF165mRNA靶定的帶(底部小圖)。圖8a-8d是UTMD處理后10天心肌的組織學(xué)切片。8a是低倍(lOOx)蘇木精伊紅染色，顯示了心肌的超細(xì)胞區(qū)。8b是用抗-VEGF抗體染色的超細(xì)胞區(qū)的低倍U00x)圖像，證實(shí)在超細(xì)胞區(qū)中存在VEGF;8c是用BS-凝集素染色的超細(xì)胞區(qū)的高倍圖像(400X)。紅色箭頭描繪了毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞中明顯的細(xì)胞核，與血管發(fā)生相一致。還有紊亂的肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與輕微炎癥相一致；8d是用平滑肌a-肌動蛋白染色的超細(xì)胞區(qū)的高倍(400X)圖像。紅色箭頭指向覆蓋新血管的周細(xì)胞。黃色箭頭指向微動脈平滑肌細(xì)胞上突出的細(xì)胞核。條線表示100|um。圖9是組織學(xué)和曲線圖的合成圖，顯示了處理后大鼠心肌毛細(xì)血管密度的改變。頂部小圖顯示了在200X下用BS-凝集素染色的代表性切片。與對照心肌(左邊小圖)比較，用UTMD-VEGF-處理的心肌的毛細(xì)血管密度增加(右邊小圖)。底部小圖顯示了UTMD處理后毛細(xì)血管密度(凝集素+血管〈10^im)隨時(shí)間的平均值。毛細(xì)血管密度的平均值在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在所有對照中非常穩(wěn)定。然而，在UTMD-VEGF-處理的大鼠中，毛細(xì)血管密度在第5天和10天時(shí)顯著增加。誤差線代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。圖IO是組織學(xué)和曲線圖的合成圖，顯示了處理后大鼠心肌微動脈密度的改變。頂部小圖顯示了在100X下用平滑肌a-肌動蛋白染色的切片。與對照(左邊)比較，微動脈密度增加(右邊)。底部小圖顯示了UTMD處理后微動脈密度(平滑肌a-肌動蛋白+血管〉30)im)隨時(shí)間的平均值。微動脈密度的平均值在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在對照中沒有顯著不同。然而，在UTMD-VEGF-處理的大鼠中，微動脈密度在第5、10和30天時(shí)顯著增加。誤差線代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。發(fā)明詳述盡管下面詳細(xì)討論了做出和使用本發(fā)明的多種實(shí)施方案，但是將理解本發(fā)明提供了許多可應(yīng)用的發(fā)明性概念，其可以在多種特定背景下被具體化。本文討論的特定實(shí)施方案僅僅闡明做出和使用本發(fā)明的特定方法并且不限制本發(fā)明的范圍。為了方便理解本發(fā)明，下面定義許多術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語如"一個(gè)，，和"這個(gè)"不意在僅僅指單數(shù)實(shí)體，而是包括特定實(shí)例可以用于闡明的一類實(shí)體。本文的術(shù)語用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是它們的用法不限定本發(fā)明，本發(fā)明只受到權(quán)利要求的限定。在本說明書全文中，使用下面的縮寫TF，轉(zhuǎn)錄因子；ORF，開放閱讀框；kb，千堿基(對)；UTR，非翻譯區(qū)；kD，千道爾頓；PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；RT,逆轉(zhuǎn)錄酶。術(shù)語"基因"用于指功能蛋白質(zhì)、多肽或者肽編碼單位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，該功能術(shù)語包括基因組序列、cDNA序列、其片段和/或組合，以及基因產(chǎn)物，包括通過人工改變的基因產(chǎn)物。純化的基因、核酸、蛋白質(zhì)等等用于指這樣的實(shí)體，它們被鑒定并且與它通常結(jié)合的至少一種污染性核酸或者蛋白質(zhì)分離。本文所用的術(shù)語"載體"用于指核酸分子，其將DNA區(qū)段從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。載體還可以定義為經(jīng)設(shè)計(jì)用以增殖基因序列的載體，或者表達(dá)載體，其包括可操作地連接基因序列的啟動子，或者經(jīng)設(shè)計(jì)以導(dǎo)致導(dǎo)入這種啟動子的栽體。栽體可以以獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體的狀態(tài)存在，或者可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。本文所用的術(shù)語"啟動子"指RNA聚合酶結(jié)合的DNA鏈上的識別位點(diǎn)。啟動子通常是帽位點(diǎn)或者轉(zhuǎn)錄啟動開始位點(diǎn)上游5'側(cè)翼DNA中約100到200個(gè)堿基對(bp)的DNA片段。啟動子與RNA聚合酶形成起始復(fù)合體以啟動和驅(qū)動轉(zhuǎn)錄活性。復(fù)合體可以通過稱作"增強(qiáng)子"的激活序列或者稱作"沉默子"的抑制序列修飾。通常，特定調(diào)節(jié)序列或者元件內(nèi)嵌在DNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)鄰近處或者內(nèi)部。位置與該基因相鄰的元件稱作順式作用元件。這些信號被其他可擴(kuò)散的反式生物分子識別以加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。這些生物分子被稱作反式作用因子。反式作用因子和順式作用元件的存在促進(jìn)基因的定時(shí)和發(fā)育表達(dá)模式。通常認(rèn)為順式作用元件是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的元件并且發(fā)現(xiàn)位于啟動子區(qū)和其他上游DNA側(cè)翼序列內(nèi)部。如本文所用的術(shù)語"前導(dǎo)序列"指在結(jié)構(gòu)基因的5，末端的DNA序列，其與基因一起轉(zhuǎn)錄。前導(dǎo)序列通常導(dǎo)致具有N-末端肽延伸(有時(shí)稱作前序列(pro-sequence))的蛋白質(zhì)。對于最終分泌到細(xì)胞外基質(zhì)或者膜的蛋白質(zhì)，該信號序列(主要是疏水的)指導(dǎo)該蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，該蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排出到合適的目的地。如本文所用的術(shù)語"內(nèi)含子"指在基因的中部發(fā)生的DNA的部分，其不編碼基因產(chǎn)物中的氨基酸。內(nèi)含子的前體RNA被切除并且因此不轉(zhuǎn)錄成mRNA，也不翻譯成蛋白質(zhì)。術(shù)語"表達(dá)盒"指本發(fā)明的序列，其含有將表達(dá)的核酸序列。表達(dá)盒在概念上與盒式磁帶相似。每個(gè)表達(dá)盒將具有其自己的序列。從而，通過互換表達(dá)盒，載體將表達(dá)不同的序列。因?yàn)樵?，和3，末端的限制性位點(diǎn)，表達(dá)盒可以容易地插入、除去或者用另一表達(dá)盒替換。本文所用的術(shù)語"3，非翻譯區(qū)"或者"3，UTR"指在結(jié)構(gòu)基因的3，末端的序列，其通常隨著基因轉(zhuǎn)錄。該3，UTR區(qū)通常含有多聚A序列。盡管3，UTR從DNA轉(zhuǎn)錄，但是它在翻譯成蛋白質(zhì)前被切除。在本發(fā)明中，它優(yōu)選具有肌原性特異的3，UTR。這使得在肌原性組織中具有特異穩(wěn)定性。本文所用的術(shù)語"非編碼區(qū)"或者"NCR"指與結(jié)構(gòu)基因的3，UTR區(qū)連續(xù)的區(qū)域。NCR區(qū)含有轉(zhuǎn)錄終止信號。本文所用的術(shù)語"限制性位點(diǎn)"指限制性內(nèi)切酶的序列特異切割位點(diǎn)。本文所用的術(shù)語"載體，，指某種工具，DNA片段通過它可以導(dǎo)入宿主生物或者宿主組織。有多種類型的載體，包括質(zhì)粒、噬菌體和粘粒。本文所用的術(shù)語"有效量"指活性劑的量，例如，UTMD遞送到耙組織或者細(xì)胞，例如，胰腺的P細(xì)胞、肌原性組織或者培養(yǎng)物、血管生成細(xì)胞等以產(chǎn)生足夠水平的多肽的基因或者啟動子與基因的組合的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到該實(shí)際水平將取決于MVS的使用。該水平在處理、疫苗產(chǎn)生或者接種中將不同。"質(zhì)粒，，通過小寫字母p表示，該字母的前面和/或后面跟著大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?？赏ㄟ^商業(yè)途徑獲得，可以不受限制地公開獲得，或者可以按照公布的方法從此類可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，其他等同質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且將是普通技術(shù)人員顯而易見的。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因，，在本文用于描述可以人工插入哺乳動物基因組，例如，活動物的哺乳動物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因動物"在本文用于描述非人動物，通常為哺乳動物，其具有非內(nèi)源(即異源)核酸序列，該序列作為細(xì)胞的部分中的染色體外元件存在或者穩(wěn)定整合到它的種系DNA(即，在多數(shù)或者所有它的細(xì)胞的基因組序列中)中。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，通過例如，宿主動物的胚胎或者胚胎干細(xì)胞的遺傳操作向此類轉(zhuǎn)基因動物的種系中導(dǎo)入異源核酸。本文所用的術(shù)語"敲除(knock-out)，，包括例如，條件敲除，其中靶基因的改變可以如下激活將動物暴露于促進(jìn)耙基因改變的物質(zhì)，導(dǎo)入促進(jìn)靶基因位點(diǎn)的重組的酶(例如，Cre-lox系統(tǒng)中的Cre)，或者其他的用于指導(dǎo)靶基因改變的方法。本文所用的術(shù)語"敲入(knock-in)"指宿主細(xì)胞基因組中導(dǎo)致靶基因的改變的表達(dá)(例如，增加或者減少的表達(dá))的改變，例如，通過導(dǎo)入靶基因的額外拷貝，或者通過可操作地插入調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列提供靶基因的內(nèi)源拷貝的增強(qiáng)的表達(dá)。敲入轉(zhuǎn)基因包括靶基因的雜合敲入或者靶基因的純合敲入并且包括額外的敲入。一方面，本發(fā)明是通過使用超聲定向的微泡破壞(UTMD),使用裝栽含有生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體，向靶器官或者組織體內(nèi)遞送生物活性劑的方法。示例性微泡包含但不限于，適于體內(nèi)超聲定向的微泡破壞的電中性的脂類、聚合物、金屬，或者丙烯酸殼。在一個(gè)實(shí)施方案中，將生物活性劑首先包裹在納米顆粒大小(10-60nm)的小陽離子脂質(zhì)體內(nèi)或者附著到該脂質(zhì)體上(下文中，"裝載，，或者"包括"生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體指包裹在脂質(zhì)體(如陽離子脂質(zhì)體)內(nèi)或者附著到脂質(zhì)體上的任何生物活性劑)，然后將該脂質(zhì)體附著到電中性的脂類包被或者白蛋白包被的微泡上，該微泡填充了適于超聲微泡破壞技術(shù)的氣體，例如，全氟丙烷。脂質(zhì)體可以附著到微泡殼的外表面，摻入微泡殼中和/或包裹在微泡殼的內(nèi)部。在本發(fā)明中，一種或多種生物活性劑可以通過超聲定向微泡破壞，使用裝載含有生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂類微泡同時(shí)地或者先后地遞送。在另一方面，本發(fā)明是治療需要此類治療的哺乳動物的方法，其包括通過超聲定向微泡破壞施用有效量的組合物，該組合物包含裝載含有生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂類微泡。適于本發(fā)明的生物活性劑的實(shí)例包括藥物制劑和藥物、生物活性的合成有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、多肽、維生素、類固醇、聚陰離子劑、遺傳物質(zhì)和診斷試劑。生物活性維生素、類固醇、蛋白質(zhì)、肽和多肽可以是天然來源或者合成的。示例性聚陰離子劑包括但不限于硫酸化多糖、帶負(fù)電荷的血清白蛋白和奶蛋白質(zhì)、合成的硫酸化聚合物、聚合的陰離子表面活性劑和多磷酸鹽。合適的診斷試劑包括但不限于與患者的磁共振成像、超聲或者計(jì)算機(jī)化斷層顯象結(jié)合使用的柒料和造影劑。合適的遺傳物質(zhì)包括核酸、核苷、核苷酸和多核苷酸，它們可以是分離的基因組的、合成的或者重組物質(zhì)；單鏈或者雙鏈的；和正義或者反義方向，有或者沒有對堿基、糖類殘基或者磷酸二酯鍵的修飾。遺傳物質(zhì)的示例性來源包括但不限于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、短干擾RNA(siRNA)、核酶和RNA和DNA的混合的雙鏈體和三鏈體。遺傳物質(zhì)是在表達(dá)載體上攜帶的基因，所示表達(dá)載體包括但不限于輔助病毒、質(zhì)粒、噬菌粒，粘粒和酵母人工染色體。適于本發(fā)明的遺傳物質(zhì)能夠編碼治療性、調(diào)節(jié)和/或診斷蛋白質(zhì)的至少一部分。此外，遺傳物質(zhì)可以優(yōu)選編碼一種以上類型的蛋白質(zhì)。例如，生物活性劑可以包含質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA包含編碼治療蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)和用于監(jiān)視質(zhì)粒DNA的遞送的選擇標(biāo)記或者診斷標(biāo)記，例如，pDsRed-人胰島素啟動子。此類蛋白質(zhì)包括但不限于組織相容性抗原、細(xì)胞粘附分子、生長因子、凝血因子、激素、胰島素、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體、抗體片段、細(xì)胞受體、細(xì)胞內(nèi)酶、轉(zhuǎn)錄因子、能夠除去患病或者惡性細(xì)胞的毒性肽?？梢酝ㄟ^該技術(shù)遞送的其他遺傳物質(zhì)包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、RNA、siRNA或者選擇性打開或者關(guān)閉特定基因的化學(xué)品，如聚酰胺或者肽片段。對野生型蛋白質(zhì)的修飾得到野生型變體的激動劑或者拮抗劑，所述修飾落入本發(fā)明的范圍。遺傳物質(zhì)還可以包含組織特異性啟動子或者表達(dá)控制序列，如轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、操縱基因或者其他控制序列。本發(fā)明使用的活性劑的實(shí)例包括預(yù)先裝載到脂質(zhì)體并且與微泡結(jié)合的一種或多種下面的治療劑，包括，但不限于，激素產(chǎn)品，如加壓素和催產(chǎn)素和它們的衍生物、胰高血糖素和甲狀腺劑，如含碘產(chǎn)品和抗甲狀腺劑；心血管產(chǎn)品，如螯合劑和汞利尿劑和強(qiáng)心苷；呼吸產(chǎn)品如黃嘌呤衍生物(茶堿和氨茶堿)；抗感染劑，如氨基糖苷類、抗真菌劑(例如，兩性霉素)、青霉素和頭孢菌素抗生素、抗病毒劑(例如，齊多夫定、利巴韋林、金剛烷胺、阿糖腺苷和阿昔洛維)、驅(qū)蟲藥、抗癡藥和抗結(jié)核病藥；生物制品如抗體(例如，抗毒素和抗蛇毒素)、疫苗抗原(例如，細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、類毒素)；抗腫瘤藥(例如，亞硝脲、氮芥、抗代謝物(氟尿嘧啶、激素、黃體酮和雌激素激動劑和/或拮抗劑)；有絲分裂抑制劑(例如，依托泊苦和/或長春花生物堿)、放射性藥物(例如，放射性碘和磷產(chǎn)品)；和干擾素、羥基脲、曱基節(jié)肼、達(dá)卡巴嗪、曼托坦、天冬酰胺酶和環(huán)孢菌素，包括它們的混合物和組合。其他合適的治療劑包括，但不限于血栓溶解劑，如尿激酶；促凝劑，如凝血酶；抗腫瘤藥，如鉑化合物(例如，順螺鉑、順柏和卡鉑)、氨甲喋呤、阿霉素、紫杉醇、絲裂霉素、柄型菌素、博來霉素、阿糖胞苷、arabinosyladsnine、巰基聚賴氨酸、長春新堿、白消安、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥(例如，PAM、L-PAM或者苯丙氨酸氮芥)、巰嘌呤、曼托坦、鹽酸甲基芐肼、更生霉素(放線菌素D)、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、絲裂霉素、普卡霉素(光輝霉素)、氨魯米特、雌氮芥磷酸鈉、氟他米特、醋酸亮丙瑞林、醋酸曱地孕酮、枸櫞酸他莫昔芬、睪內(nèi)酯、曲洛司坦、胺苯吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L畫天冬酰胺酶)、Erwinaasparaginase、依托泊苦(VP-16)、干擾素a-2a、干擾素a-2b、替尼泊苷(VM-26)、硫酸長春堿(VLB)、硫酸長春新堿、博來霉素、硫酸博來霉素、氨甲喋呤、阿霉素，和阿拉伯糖(arabinosyl);血液制品，如腸胃外鐵、氯高鐵血紅素；生物應(yīng)答修飾劑，如胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、微生物細(xì)胞壁組分、淋巴因子(例如，細(xì)菌內(nèi)毒素，如脂多糖、巨噬細(xì)胞活化因子)、細(xì)菌(如分枝桿菌、棒桿菌)的亞基、合成二肽N-乙?；?胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷醜胺；抗真菌劑，如酮康唑、利霉菌素、灰黃霉素、氟胞嘧啶(5-&)、咪康唑、兩性霉素B、蓖麻毒蛋白，和P-內(nèi)酰胺抗生素(例如，青霉素、氨芐青霉素、磺酰胺菌素)；激素，如生長激素、PDGF、EGF、CSF、GM-CSF、促黑素細(xì)胞激素、雌二醇、倍氯美松雙丙酸酯、倍他米松、醋酸倍他米松和倍他米松磷酸酉旨鈉、vetamethasonedisodi腿phosphate、vetamethasonesodiumphosphate、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米+>、地塞米松磷酸鈉、flunsolide、皮質(zhì)醇、氫化可的*>、氫化可的松環(huán)戊丙酸酯、氫可松磷酯鈉、氫化可的松琥珀酸鈉酯、甲基氫化潑尼松、醋酸甲基氫化潑尼松、曱潑尼龍、醋酸對氟米松、潑尼松龍、氫化潑尼松、強(qiáng)的松龍褲酸鈉、prednisolonerebutate、潑尼松、氫羥強(qiáng)的松龍、輕氫化潑尼松縮丙酮、去炎松、己酸丙炎松和醋酸氟氫可的松；維生素，如維生素C、E、A、K、ascyanocobalamin、neinoicacid、類視黃醇和衍生物，如棕櫚酸維生素A，和a-生育酴；肽(例如，T細(xì)胞表位，如MAGE、GAGE、DAGE等等)；蛋白質(zhì)，如錳超氧化物歧化酶、醇脫氫酶、一氧化氮合酶；酶，如堿性磷酸酶；抗過敏劑，如amelexanox;抗凝劑，如苯丙香豆素和肝素；循環(huán)藥物，如普萘洛爾；代謝增強(qiáng)劑，如谷胱甘肽；抗結(jié)核藥，如對氨基水楊酸、異煙肼、硫酸巻曲霉素、環(huán)絲氨酸、鹽酸乙胺丁醇、乙硫異煙胺、吡溱酰胺、利福平，和硫酸鏈霉素；抗病毒劑，如阿昔洛維、金剛烷胺、疊氮胸苷(AZT或者疊氮胸苷)、利巴韋林和一水合阿糖胞苷(阿糖腺苷，ara-A);抗心絞痛藥，如地爾硫卓、硝苯地平、維拉帕米、赤鮮醇四硝酸酯、硝酸異山梨酯、硝化甘油(三硝酸甘油酯)和硝酸戊四醇酯；抗凝劑，如苯丙香豆素、肝素；抗生素，如氨苯砜、氯霉素、新霉素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢菌素IV、泛捷復(fù)、紅霉素、克林霉素、林可霉素、阿莫西林、氨芐西林、巴氨西林、羧芐青霉素、雙氯青霉素、環(huán)青霉素、picloxacillin、縮酮氯卡青霉素、曱氧苯青霉素、乙氧萘胺青霉素、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、替卡西林、利福平和四環(huán)素；抗炎劑，如二氟苯水楊酸、布洛芬、吲哚美辛、甲氯芬那酸、曱芬那酸、曱氧萘丙酸、羥基保泰松、苯丁唑酮、吡羅昔康、舒林酸、托美汀、阿司匹林和水楊酸；抗原生動物藥，如氯喹、羥氯喹、甲硝唑、奎寧和銻酸葡胺；抗風(fēng)濕劑，如青霉胺；麻醉藥，如止痛藥；阿片制劑，如可待因、海洛因、美沙酮、嗎啡和鴉片；強(qiáng)心苷，如去乙酰毛花甙、洋地黃毒苷、地高辛、洋地黃甙和洋地黃；神經(jīng)肌肉阻滯劑，如卡肌寧、弛肌碘、己芴溴銨、碘甲筒箭毒、潘庫溴銨、氯化琥珀膽堿(氯化琥珀膽堿)、氯化筒箭毒堿和維庫羅寧；鎮(zhèn)靜藥(安眠藥)，如異戊巴比妥、異戊巴比妥鈉、阿普比妥、布塔巴比妥鈉、水合氯醛、乙氯維諾、炔己蟻胺、鹽酸氟西泮、格魯米特、鹽酸左美丙"秦、曱乙哌酮、鹽酸咪達(dá)唑、副醛、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、苯巴比妥鈉、司可巴比妥鈉、他布酮、羥基安定和三唑侖；局部麻醉藥，如鹽酸布比卡因、鹽酸氯普魯卡因、鹽酸依替卡因、鹽酸利多卡因、鹽酸曱哌卡因、鹽酸普魯卡因和鹽酸丁卡因；全身麻醉藥，如達(dá)哌啶醇、依托咪酯、枸櫞酸芬太尼與達(dá)哌啶醇、鹽酸氯胺酮、甲己炔巴比妥鈉和硫噴妥鈉；和放射性顆?；蛘唠x子，如鍶、碘化錸和釔，和它們的組合和混合物。前藥可以在附著到微泡之前預(yù)先裝載到脂質(zhì)體中。前藥是本領(lǐng)域公知的并且可以包括無活性藥物前體，其經(jīng)代謝而形成活性藥物。技術(shù)人員將認(rèn)識到如Sinkula，etal"J.Pharm.Sci.197564，181-210中描述的合適的前藥(和如果必要，它們的鹽形式)，將所述文獻(xiàn)的相關(guān)部分引入本文作為參考。例如，前藥可以包括活性藥物的無活性形式，其中化學(xué)基團(tuán)存在于前藥上，該化學(xué)基團(tuán)使得藥物無活性和/或賦予藥物的可溶性或者一些其他性質(zhì)。在該形式中，前藥通常是無活性的，但是一旦通過熱、空化作用、壓力和/或通過周圍環(huán)境中的酶或者其他方式從前藥切割了所述化學(xué)基團(tuán)，就產(chǎn)生了活性藥物。此類前藥在本領(lǐng)域中充分描述，并且包括通過鍵結(jié)合到化學(xué)基團(tuán)的多種藥物，所述鍵為諸如酯到短、中等或者長鏈脂肪族碳酸酯、有機(jī)磷酸酯的半酯、焦磷酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、偶氮鍵、氨基曱酸酯、磷酰胺、葡糖苷酸酯、N-乙酰葡糖胺和!3-葡糖苷。藥物與親本分子和可逆修飾或者鍵的實(shí)例如下鈴蘭毒甙與縮酮、乙內(nèi)酰脲和烷基酯、氯丙炔碘與甘氨酸或者丙氨酸酯、對乙酰氨基酚與咖啡因絡(luò)合物、阿司匹林與THAM鹽、阿司匹林與乙酰胺基苯基酯、納洛酮與硫酸酯、15-曱基前列腺素F2與甲酯、普魯卡因與聚乙二醇、紅霉素與烷基酯、克林霉素與烷基酯或者磷酸酯、四環(huán)素與內(nèi)銨鹽、7-酰基氨基先鋒霉素類與環(huán)取代的酰氧基卡基酯、諾龍與苯基丙酸酯、硅酸酯、雌二醇與烯醇醚乙縮醛、甲基潑尼松龍與乙酸酯、睪酮與正乙?；被咸擒掌咸烟擒账?三曱基甲硅烷基)醚、氫化可的松或者潑尼松龍或者地塞米松與21-磷酸酯。前藥還可以設(shè)計(jì)為可逆的藥物衍生物并用作修飾劑來增強(qiáng)藥物向位點(diǎn)特異組織的轉(zhuǎn)運(yùn)。具有用于影響向位點(diǎn)特異組織的轉(zhuǎn)運(yùn)或者用于增強(qiáng)的治療效果的可逆修飾或鍵的載體分子的實(shí)例包括異氰酸酯與囟代烷基硝基脲、睪酮與丙酸酯、氨甲喋呤(3-5，-二氯甲氨蝶呤-e)與二氨基酯、阿糖胞苷與5，-?；a(chǎn)物、氮芥(2，2，-二氯-N-曱基二乙基胺)、氮芥與氨基甲基四環(huán)素、氮芥與膽固醇或者雌二醇或者脫氫表雄酮酯和氮芥與偶氮苯。技術(shù)人員將認(rèn)識到可以選擇可以在任一給定藥物中修飾的特定化學(xué)基團(tuán)以影響藥物向微泡的殼或者內(nèi)部的分配。所選的將化學(xué)基團(tuán)連接到藥物的鍵可以經(jīng)選擇以在微泡釋放后具有所希望的代謝速率，例如，對于血清酯酶存在下的酯鍵，所述代謝為水解。此外，可以選擇具體化學(xué)基團(tuán)來影響用于微泡中的藥物的生物分布，例如，N，N-二U-氯代乙基)-phosphorodiamidicacid與環(huán)狀碌跣胺用于卵巢腺癌。此外，用于微泡內(nèi)的前藥可以設(shè)計(jì)成含有可逆衍生物，其用作活性持續(xù)時(shí)間的修飾劑以提供、延長或者積蓄作用效果。例如，煙酸可以用葡聚糖和羧甲基葡聚糖酯修飾，鏈霉素用藻酸鹽修飾，雙氬鏈霉素用雙羥萘酸鹽修飾，阿糖胞普(ara-C)用5，-adamantoats酉旨子務(wù)飾，ara-腺苦(ara-A)用5陽palmirate和5,-笨甲酸酉旨修飾，兩性霉素B用甲酯修飾，睪酮用17-p-烷基酯修飾，雌二醇用甲酸酯修飾，前列腺素用2-(4-咪唑基)乙胺鹽修飾，多巴胺用氨基酸酰胺修飾，氯霉素用單-和二(三甲基曱硅烷基)醚修飾，環(huán)氯胍用雙羥萘酸鹽修飾。在該形式中，長效藥物的貯庫或者貯存庫可以在體內(nèi)從帶有前藥的微泡釋放?？梢赃x擇或者修飾治療劑的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)所希望的溶解性，從而治療劑裝載到脂質(zhì)體后附著或裝載到微泡內(nèi)部、外部或者周圍。類似地，其他治療劑可以用在結(jié)構(gòu)上為芳族或者甾醇的疏水基團(tuán)配制以摻入微泡的表面。適宜用于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)體包含一種或多種單陽離子或者聚陽離子脂質(zhì)，任選地與一種或多種中性或者輔助脂質(zhì)組合。適于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)可以通過商業(yè)途徑得到或者可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。適于形成陽離子脂質(zhì)體的陽離子脂質(zhì)是本領(lǐng)域公知的并且包括但不限于任何鱗脂相關(guān)的物質(zhì)，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、腦磷脂、心磚脂、磷脂酸、腦苷脂、磷酸十六烷酯、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺5-carboxyspermylamide(DPPES)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、棕櫚酰油酰磷脂乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰-乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸(DOPE-mal)。額外的非含磷脂類包括但不限于硬脂酰胺、十二烷基胺、十六烷基胺、棕櫚酸乙酰酯、荒麻油酸甘油酯、硬脂酸十六酯、十四烷酸異丙酯、兩性丙烯酸脂聚合物、三乙醇胺-硫酸月桂酯、烷基-芳基硫酸聚氧乙烯化脂肪酸酰胺、二(十八烷基)二甲基溴化銨和類固醇，如膽固醇、麥角固醇、麥角固醇B1、B2和B3、雄甾鯛、膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、石膽酸、N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基l-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、1，2-二(油酰氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)、和5-carboxyspermylglycine二(十/\烷基)酰胺(DOGS)。優(yōu)選的脂質(zhì)體制劑包含(3:1，w/w)的聚陽離子脂質(zhì)2，3-二油酰氧基-N-P-(sperminecarboxaido)乙基卜N，N-二曱基-l-丙烷三氟乙酸銨(DOSPA)和中性脂質(zhì)二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)at(3:1，w/w)，和它們的混合物和組合。在本發(fā)明的方法中，陽離子脂質(zhì)體裝栽生物活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶解在一種或多種有機(jī)溶劑中的一種或多種脂類的陽離子脂類制劑首先干燥或凍干以除去有機(jī)溶劑，得到脂類膜。僅僅在使用前，將脂類膜與適于本發(fā)明的懸浮在合適的水性介質(zhì)中的生物活性劑混合以從干燥的脂類膜形成脂質(zhì)體。例如，水、水性緩沖溶液、或者組織培養(yǎng)基可以用于脂類膜的再水化。合適的緩沖液是磷酸緩沖鹽水，即0，90/。NaCl中的pH7.4的10mM磷酸鉀。再另一實(shí)施方案中，將干燥的脂類膜用合適的水性介質(zhì)再水化以在加入活性劑前形成脂質(zhì)體。當(dāng)生物活性劑包含遺傳物質(zhì)時(shí)，該方法是優(yōu)選的。生物活性劑向陽離子脂質(zhì)體的摻入通常在約0到301C范圍的溫度，例如，在室溫下進(jìn)行約5、10-20分鐘。在本發(fā)明的方法中，具有附著的生物活性劑的陽離子脂質(zhì)體通常裝載到電中性的微泡上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這通過如下步驟完成向具有附著的生物活性劑的陽離子脂質(zhì)體加入適于制備微泡殼的脂類組合物，充分混合，然后加入合適的氣體用于由微泡殼包裹，然后劇烈振動約5到60秒，優(yōu)選約20秒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在加入具有附著的生物活性劑的陽離子脂質(zhì)體之前，脂類組合物保持在約0到30"C。為了形成微泡殼，預(yù)期已知用于超聲定向的微泡破壞的天然或者合成來源的任何生物相容的脂類為本發(fā)明的部分。示例性脂類可以見國際申請?zhí)朩O2000/45856并且包括但不限于脂肪酸、磷脂、糖脂、糖鞘脂類、鞘脂、脂肪族醇、脂肪族蠟、萜類、倍半萜和類固醇。優(yōu)選的脂類是磷酸膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇。更優(yōu)選的脂類是1，2-棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿或者1，2-棕櫚酰-sn-甘油-磷脂酰乙醇胺。最優(yōu)選的是L-l，2-棕櫚酰-sn-甘油J-磷酸膽堿和L-1，2_棕櫚酰-sn-甘油-磷脂酰乙醇胺。適于本發(fā)明的氣體通常是惰性的和生物相容的，包括但不限于空氣；二氧化碳；氮?dú)?；氧氣；氟；惰性氣體如氦、氖、氬和氙；基于硫的氣體；氟化氣體；和其混合物。氣體可以是全氟丙烷，例如，八氟丙烷。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，靶定配體可以附著到微泡以賦予額外的組織特異性。此類配體可以包括單克隆抗體、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、激素或激素類似物、單糖、多糖、類固醇或者類固醇類似物、維生素、細(xì)胞因子，或者核苷酸。本發(fā)明的遞送方法包括裝栽含有一種或多種生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的微泡，所述方法提供了超聲定向微泡遞送系統(tǒng)的所有優(yōu)點(diǎn)以及脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的所有優(yōu)點(diǎn)。超聲定向微泡遞送系統(tǒng)允許向特定器官或者組織遞送藥物/基因生物活性劑，而使得其他器官或者組織最小地暴露于生物活性劑。在遞送期間，一種或多種生物活性劑保持在保護(hù)性陽離子脂質(zhì)體內(nèi)，所述脂質(zhì)體保護(hù)生物活性劑免于蛋白酶、核酸酶、酯酶、糖類切割酶、自由基的破壞或者其他化學(xué)改變。該方法增加了生物活性劑的遞送和其對靶組織的生物利用率。例如，在裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的微泡的遞送中，耙位點(diǎn)處基因表達(dá)的水平增加到高于使用相同質(zhì)粒DNA的微泡遞送或者脂質(zhì)體遞送得到的可能的表達(dá)水平。在一方面，本發(fā)明是治療需要此類治療的哺乳動物的方法，其包括通過超聲定向的微泡破壞施用有效量的組合物，該組合物包含裝載含有生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂類微泡。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法施用包含裝載含有生物活性劑的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂類微泡的組合物和這些微泡的超聲定向的微泡破壞以釋放所述生物活性劑。重復(fù)施用微泡是可能的，尤其用于延長治療效果的持續(xù)時(shí)間。例如，已經(jīng)表明通過超聲定向的微泡破壞重復(fù)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞可以將心臟中熒光素酶活性的峰值持續(xù)時(shí)間從4天延長到12天(Bekeredjianetal，2003)。這可能允許將基因或者藥物遞送的持續(xù)時(shí)間根據(jù)特定生物學(xué)或者醫(yī)學(xué)需要調(diào)整。本發(fā)明的組合物和使用方法在下面提供的實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)闡明，但是不認(rèn)為這些實(shí)施例以任何方式限制本發(fā)明的范圍。盡管這些實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是理解對組合物和方法的修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)，并且認(rèn)為此類修飾在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例l:裝載生物活性成分的陽離子脂質(zhì)體溶液的制備為了制備裝載質(zhì)粒DNApCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體溶液，僅在使用前向50微升陽離子脂質(zhì)體溶液(Lipofectamine2000;Invitrogen，Carlsbad,California)加入含有2亳克質(zhì)粒DNA的50-100微升溶液并在室溫下溫育10-20分鐘。所得脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA并且直徑為大概250納米。將脂質(zhì)體保存在-20lC備用。實(shí)施例2:制備含有質(zhì)粒DNA的微泡配方根據(jù)Unger等人(Unger，等人1997."Ultrasoundenhancesgeneexpressionofliposomaltransfection，，，InvestRadiol32:723-727;美國專利號6，521，211)以前描述的方法的改進(jìn)方法制備在微泡外殼內(nèi)摻入質(zhì)粒DNApCMV-luc的微泡配方(下文稱作"配方2")。簡言之，在可密封管中，將溶解在PBS并且預(yù)熱到421C的250微升2%1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(C16)與1毫克質(zhì)粒DNApCMV-luc混合并在40r溫育30分鐘。如需要，加入PBS以實(shí)現(xiàn)500微升的最終總體積。然后將管裝入八氟代丙烷并在牙科攪拌機(jī)(VIALMIX;Briston-MyersSquibbMedicalImaging,Inc.,NorthBillerica，MA)中劇烈振動20秒。除去并丟棄包含未附著的DNApCMV-luc的液體下層清液，留下脂質(zhì)包被的微泡懸浮液的乳白色上清液層。然后在輸注前將所得微泡懸浮液用PBS以1:1稀釋。實(shí)施例3:制備裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂質(zhì)微泡如下制備裝載陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電中性脂質(zhì)微泡(下文稱作"配方1")。向含有50微升如實(shí)施例1制備的裝載的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的管中加入2S0微升2%1，2-二棕櫚?；?sn-甘油畫^磷酸膽堿(C16)(預(yù)熱到42*C)與5微升10%白蛋白溶液和50微升甘油。用移液器充分但是溫和地混合混合物。如需要，加入PBS以實(shí)現(xiàn)500微升的最終總體積。然后將含有混合物的管裝入八氟代丙烷并在牙科攪拌機(jī)(VIALMIX)中0-4TC下劇烈振動15-35秒。在該過程中，質(zhì)粒DNA首先包裹在陽離子脂質(zhì)體內(nèi)，然后裝載的陽離子脂質(zhì)體附著到微泡外殼。然后在輸注前將所得微泡懸浮液用PBS以1:1稀釋。實(shí)施例4:比較裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂質(zhì)微泡(配方2)和含有質(zhì)粒DNA的微泡配方(配方1)將根據(jù)實(shí)施例3的方法制備的裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的微泡("配方1")和根據(jù)實(shí)施例2制備的含有質(zhì)粒DNA的微泡配方2("配方2")的物理特征進(jìn)行比較。通過Coulter計(jì)教器測量微泡的泡大小和濃度。為了測量微泡的DNA裝載量，將每種配方用PBS洗滌3次以除去未附著的DNApCMV-luc。用氯仿苯酚異丙醇(25:24:1)從微泡萃取DNA;通過260nm波長下的光密度測量DNA濃度；通過凝膠電泳證實(shí)DNA的完整性。對于配方2微泡，使用熒光標(biāo)記的質(zhì)粒的共焦顯微術(shù)用于證實(shí)質(zhì)粒DNA摻入到微泡的磚脂外殼。對于配方1，使用熒光標(biāo)記的質(zhì)粒的共焦顯微術(shù)用于證實(shí)質(zhì)粒DNA摻入到附著到微泡的磷脂外殼的脂質(zhì)體。根據(jù)表I中概述的結(jié)果，與裝載到含有質(zhì)粒DNA的微泡(配方2)中的DNA的量相比，裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的微泡(配方l)的DNA的量有顯著提高。表l:微泡制劑的物理特征<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例5:大鼠中的體內(nèi)研究裝載含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性脂質(zhì)微泡(配方1)或者含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的微泡配方(配方2)的遞送使用重為200-300g的Sprague-Dawley雄性大鼠，檢查了超聲介導(dǎo)的微泡破壞對質(zhì)粒DNA的體內(nèi)遞送。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，基因遞送載體是根據(jù)實(shí)施例3中的步驟制備的裝栽含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性脂質(zhì)微泡。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，基因遞送載體是根據(jù)實(shí)施例2中的步驟制備的裝載質(zhì)粒DNApCMV-luc的微泡配方。對每個(gè)實(shí)驗(yàn)組，用每組三只大鼠進(jìn)行下面的步驟。將重為200-300克的大鼠用2-3ml4X阿佛丁(2克2，2，2-三溴乙醇和1.24ml2-曱基-2-丁醇溶于38.76mlH20)腹膜內(nèi)麻醉。一旦麻醉，除去大鼠的胸和頸上的所有毛。在頸的中間外側(cè)的頸靜脈上方產(chǎn)生5mm切口，并通過切開向頸靜脈加入導(dǎo)管。EKG探頭附著到三只爪子用于監(jiān)視，向胸部涂敷l-2厘米聲耦合凝膠，并將S3轉(zhuǎn)換器夾在胸部聲耦合凝膠上。用S12轉(zhuǎn)換器進(jìn)行超聲心動圖(Sonos5500，PhilipsUltrasound,Andover，MA)以定位心臟和以中短軸視圖記錄左心室功能，心肌和腔明顯可以區(qū)分。使用連接導(dǎo)管的輸注泵將1毫升微泡懸浮液以3mL/h的恒定速率在15-20分鐘內(nèi)注入大鼠的頸靜脈。在微泡注入期間，夾住大鼠胸部的S3轉(zhuǎn)換器以超諧波模式運(yùn)行(設(shè)置傳輸1/3MHz;接收3.6MHz;機(jī)械指數(shù)1.6;深度3cm;在每笫四次心搏引發(fā)成像；R波峰值后延遲80ms;所有部分增益為0;接收增益為50;壓縮為75;和線性處理后曲線)以將微泡破壞靶向心臟。在高機(jī)械指數(shù)超聲前后每第四次心跳時(shí)監(jiān)測大鼠左心室。示例性讀數(shù)以中短軸視圖顯示了微泡輸注期間引發(fā)的諧波模式下大鼠的左心室，左視圖顯示了高機(jī)械指數(shù)超聲前的左心室，右視圖顯示了高機(jī)械指數(shù)超聲后的左心室(數(shù)據(jù)未顯示)。通過心肌渾濁化的降1'氐表明微泡的破壞。研究后，除去導(dǎo)管，縫合切口并讓動物蘇醒。4天后，將大鼠處死；收獲心房、肝臟、肺和后肢骨骼肌作為陽性和陰性對照。通過小心解剖分離左心室，然后將其分成前后部分。所有組織都用液氮快速冷凍并在-70lC下保存直到用于測定熒光素酶活性。實(shí)施例6:大鼠中的體內(nèi)研究裝載含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性脂質(zhì)微泡(配方1)和含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的微泡配方(S&方2)的熒光素酶活性比較使用以前描述的熒光素酶測定法(Chen，2003)，對如實(shí)施例5中給出的分離的每種組織前左心室、后左心室、心房、肝臟、肺和后肢骨骼肌測定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。將每種組織用研缽和研杵粉碎然后在熒光素酶裂解緩沖液(0.1%NP-40,0.5%脫氧膽酸和蛋白酶抑制劑，PromegaCorp.，Madison，WI)中用Polytron破壞。所得勻漿以10,000g離心IO分鐘，向20微升澄清上清液加入100微升熒光素酶反應(yīng)緩沖液(Promega)。通過發(fā)光計(jì)(TD20/20，TurnerDesigns,Inc.,Sunnyvale,CA)以每分鐘相對光單位(RLU)測量光發(fā)射。使用商業(yè)試劑盒(PierceEndogen;Rockford,IL)通過Lowry方法的改進(jìn)方法(Brown，l卵9)測定總蛋白質(zhì)含量。如表II中所述，結(jié)果表明使用裝栽含有質(zhì)粒DNA的陽離子脂質(zhì)體的微泡，質(zhì)粒DNA向心房、前左心室、后左心室和肺的遞送增加。在肝臟和肌肉中觀察到基本無遞送，表明超聲定向的微泡破壞技術(shù)實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA的器官特異性。實(shí)施例7:制備和表征裝載含有質(zhì)粒DNA的納米球陽離子脂質(zhì)體的多種電中性脂質(zhì)微泡使用實(shí)施例3中給出的步驟，用2%1，2-二苯酰基-sn-甘油-磷酸膽堿(配方1-C12)、2°/。1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-磷酸膽堿(配方1-C16)、或者2%1，2-二癸?；?sn-甘油-磷酸膽堿(配方1-C20)制備裝載陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電中性脂質(zhì)微泡。表2:裝載含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體的微泡和含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的微泡配方的熒光素酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>配方1=如實(shí)施例3中制備的裝載含有pCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體的微泡；配方2-如實(shí)施例2制備的含有pCMV-luc的微泡配方；LV=左心室。如實(shí)施例4中所述測量相應(yīng)微泡的物理特征并在表III中概述。所有三種配方的泡大小和每毫升濃度都是相似的。每個(gè)微泡的DNA量隨著碳數(shù)目的增加而增加C20>C16>C12。根據(jù)實(shí)施例5中給出的步驟對大鼠施用每種微泡配方，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有2只大鼠。根據(jù)實(shí)施例6的步驟對收獲的組織進(jìn)行熒光素酶測定，結(jié)果在表IV中給出。用配方1-C16處理導(dǎo)致質(zhì)粒DNA更多地遞送到耙組織。表3:微泡制劑的物理特征<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4:裝載含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體的微泡配方的熒光素酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>配方l-C12-裝載用2%1，2-二苯?；?sn-甘油-磷酸膽堿(C12)制備的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電中性脂質(zhì)微泡；配方l-C16-裝載用2%1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-磷酸膽堿(C16)制備的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電中性脂質(zhì)微泡；配方l-C20-裝載用2%1，2-二癸?；?sn-甘油-磷酸膽堿(C20)制備的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電中性脂質(zhì)微泡；LV-左心室實(shí)施例8:制備和表征裝載載有脂質(zhì)體DNApCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體的OPTISON如下制備裝栽陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復(fù)合體的OPTISONtm(AmershamHealth，Princeton，NJ)微泡(下文稱作"OptisonFormula")。向1.5ml離心管加入1.5mlOPTISONtm悉浮液(每毫升OPTISONtm含有5.0到8.0xl()8人白蛋白微球體；10mg人白蛋白，USP;0.22±0.11mg/mL八氟代丙烷；0.2mgN-乙跣色氨酸；和0.12-mg辛酸溶于0.9%氯化鈉水溶液)。將OPTISONTM懸浮液以1000rpm離心1分鐘，除去并丟棄下清液。臨使用前，將2毫克質(zhì)粒DNApCMV-luc加入100微升陽離子脂質(zhì)體溶液(Lipofectamine2000;Invitrogen，Carlsbad,California)并在室溫溫育15分鐘。向OPTISONTM上清液加入所得的陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復(fù)合體，并使用移液管充分但是溫和地混合混合物。將含有混合物的管裝入八氟代丙烷氣體并用牙科混合器劇烈振動20秒。所得OptisonFormula具有附著到白蛋白外殼的含有DNA的脂質(zhì)體。根據(jù)實(shí)施例5中給出的步驟將OptisonFormula施用于大鼠，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組三只大鼠。根據(jù)實(shí)施例6的步驟對收獲的組織進(jìn)行熒光素酶測定，結(jié)果在表V中給出。用配方1-C16處理導(dǎo)致質(zhì)粒DNA更多地遞送到靶組織。在靶組織中得到增加的蛋白質(zhì)表達(dá)，盡管表達(dá)水平?jīng)]有達(dá)到用磷脂制備的微泡觀察到的表達(dá)水平。實(shí)施例9:裝栽含有質(zhì)粒DNApDsRed-RIP的納米球陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂質(zhì)微泡的制備和活性根據(jù)實(shí)施例3的步驟，更換質(zhì)粒DNA，制備裝載含有pDsRed-RIP的陽離子脂質(zhì)體的電中性的脂質(zhì)微泡。表5:裝載含有質(zhì)粒DNApCMV-luc的陽離子脂質(zhì)體的OPTISONtm微泡配方的熒光素酶活性每種分離的組織的熒光素酶活性RLU/mg.蛋白質(zhì)/分鐘<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>LV＝左心室使用在實(shí)施例5中概述的超聲定向的微泡破壞技術(shù)的改進(jìn)形式，將新的配方遞送到大鼠胰腺。所過表明胰腺中胰島的70%的轉(zhuǎn)染并且該轉(zhuǎn)染是P細(xì)胞(產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞)特異的。實(shí)施例9:用超聲微泡破壞技術(shù)向胰島的有效基因遞送該實(shí)施例描述了通過超聲定向的微泡破壞(UTMD)技術(shù)向成年活動物的胰島的基因遞送的新方法。該技術(shù)包括在裝栽充氣微泡前向磷脂外殼摻入質(zhì)粒。然后將復(fù)合體輸注到大鼠體內(nèi)并用超聲破壞胰腺微循環(huán)中的復(fù)合體。通過UTMD向胰島P細(xì)胞進(jìn)行基因特異遞送通過使用含有大鼠胰島素啟動子(MP)的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)，報(bào)道基因表達(dá)受到接受RIP-熒光素酶質(zhì)粒的動物中葡萄糖的適當(dāng)調(diào)節(jié)。為了闡明生物學(xué)功效，用UTMD遞送RIP-己糖激酶I質(zhì)粒。這導(dǎo)致胰島中己糖激酶I蛋白質(zhì)表達(dá)的明顯增加、血液中胰島素水平增加，和循環(huán)的葡萄糖水平降低?？傊?，本文描述的UTMD小泡和構(gòu)建體允許以足夠效率將基因特異遞送到胰島以調(diào)節(jié)活動物中的I3細(xì)胞功能。糖尿病的兩種主要形式都涉及P細(xì)胞破壞和機(jī)能障礙。I型糖尿病折磨美國約1百萬患者\(yùn)是產(chǎn)生胰島素的胰島(3細(xì)胞的自身免疫破壞引起的完全胰島素缺乏的疾病。2型糖尿病折磨1千6百萬美國人、并且當(dāng)胰島素分泌能力不再能補(bǔ)償外周胰島素抗性時(shí)，發(fā)生與該疾病有關(guān)的高血糖癥。如果可能將基因或者其他分子負(fù)荷遞送到胰島以增強(qiáng)胰島素分泌或者I3細(xì)胞存活，那么可以開發(fā)兩種形式的糖尿病的潛在新的治療2。盡管病毒載體已經(jīng)用于離體(exvivo)將基因有效轉(zhuǎn)移到胰島3，4，但是由于難以穿越內(nèi)皮屏障，體內(nèi)靶向(3細(xì)胞還沒有成功。此外，多數(shù)病毒基因轉(zhuǎn)移栽體5受到肝臟毒性、免疫原性性質(zhì)、炎癥、和低組織特異性，以及產(chǎn)生大量純的病毒的困難和費(fèi)用的限制。使用棵DNA或者脂質(zhì)體載體具有低轉(zhuǎn)染效率和需要通過直接注射的侵入性遞送的缺點(diǎn)。開發(fā)了使用超聲定向的微泡破壞(UTMD)向特定組織遞送基因或者藥物的新技術(shù)。6"簡言之，將基因摻入到陽離子脂質(zhì)體然后附著或者裝載到充氣微泡的磷脂或者白蛋白外殼以形成遞送載體-微泡復(fù)合體。然后將遞送載體-微泡復(fù)合體靜脈內(nèi)注射到靶器官并通過超聲在靶器官的微脈管系統(tǒng)內(nèi)破壞所述復(fù)合體。本文教導(dǎo)的組合物和方法也用于增強(qiáng)組織特異性(見其他實(shí)施例)，如用細(xì)胞特異性配體修飾微泡12，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建中使用細(xì)胞特異性"或者病理特異性"啟動子，和通過基于導(dǎo)管的方法15，16或者直接注射17"9物理置換靶組織中的載體。UTMD已經(jīng)用于將報(bào)道基因和VEGF介導(dǎo)的血管生成靶向大鼠心肌(見下面的實(shí)施例)。"本發(fā)明闡明了報(bào)道基因向胰島的安全和成功的靶向，使用大鼠胰島素啟動子實(shí)現(xiàn)高水平的胰島和(3細(xì)胞特異性，以及通過葡萄糖喂飼調(diào)節(jié)胰島內(nèi)所遞送的轉(zhuǎn)基因。此外，UTMD對己糖激酶-l基因的P細(xì)胞特異遞送導(dǎo)致增加的胰島素分泌。這些數(shù)據(jù)表明UTMD將轉(zhuǎn)基因以足夠(3細(xì)胞功能的水平遞送到成年活動物的胰島P細(xì)胞，從而提供將治療劑靶向糖尿病背景中的胰島的可能手段。簡言之，向陽離子脂質(zhì)體摻入質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA具有處于CMV或者RIP啟動子調(diào)節(jié)下的報(bào)道基因LacZ、DsRed、或者熒光素酶或者己糖激酶-1基因，所述陽離子脂質(zhì)體然后附著到在磷脂外殼內(nèi)含有全氟丙烷的微泡。微泡的平均直徑和濃度分別為1.9±0.21im和5.2±0.3x109個(gè)泡/11。吸附到微泡的質(zhì)粒的量為250±10jug/ml。經(jīng)由麻醉的Sprague-Dawley大鼠(250g)的右頸內(nèi)靜脈在20分鐘內(nèi)輸注1毫升質(zhì)粒-微泡溶液或者對照(沒有質(zhì)粒的微泡)。超聲指向胰腺以破壞胰腺微循環(huán)內(nèi)的這些微泡；不用超聲的微泡輸注也用作對照。質(zhì)粒DNA的原位PCR。圖1(上方小圖)顯示了針對質(zhì)粒DNA的原位PCR的結(jié)果。在整個(gè)胰腺(包括胰島)中看到核模式的質(zhì)粒DNA。在超聲束內(nèi)的左腎、脾臟、肝臟部分內(nèi)觀察到質(zhì)粒的均勻核組織定位的類似模式。在超聲束外的器官右腎或者骨骼肌中不存在質(zhì)粒。對于含有CMV或者RIP啟動子和LacZ或DsRed標(biāo)記基因的質(zhì)粒都是這種情況。對照(沒有質(zhì)粒的微泡或者沒有超聲的質(zhì)粒-微泡)沒有顯示出胰腺內(nèi)存在質(zhì)粒的跡象。這些圖表明超聲處理在胰腺及其緊鄰的附近釋放質(zhì)粒。mRNA的原位RT-PCR。為了賦予胰島特異性表達(dá)，通過UTMD遞送大鼠胰島素啟動子(RIP)驅(qū)動的報(bào)道子構(gòu)建體。圖1(底部小圖)顯示了針對對應(yīng)于在RIP啟動子控制下表達(dá)的DsRed轉(zhuǎn)錄物的mRNA的原位RT-PCR的代表性實(shí)例。在整個(gè)胰島中看到DsRedmRNA，但是在胰腺實(shí)質(zhì)中沒有看到DsRedmRNA，表明RIP啟動子指導(dǎo)UTMD遞送的DsRedmRNA僅在內(nèi)分泌胰腺中轉(zhuǎn)錄。在對照中沒有檢測到信號，所述對照包括沒有質(zhì)粒的微泡、LacZ質(zhì)粒-微泡或者沒有超聲的DsRed質(zhì)粒-微泡。通過共焦顯微術(shù)闡明DsRed向胰島(3細(xì)胞的特異靶向。接著檢查DsRed蛋白質(zhì)的表達(dá)以確定表達(dá)是否局限于胰島內(nèi)產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞。圖2圖解了胰島細(xì)胞的中部核心內(nèi)DsRed蛋白質(zhì)的表達(dá)，與大鼠胰島內(nèi)P細(xì)胞的已知定位一致。用紅色濾光器在568nm的激發(fā)波長和590-610nm的發(fā)射波長下鑒定DsRed蛋白質(zhì)(左邊小圖，頂部)。通過用針對胰烏素的熒光標(biāo)記的抗體免疫組織化學(xué)染色，在488nm的激發(fā)波長和490-540nm的發(fā)射波長特異鑒定P細(xì)胞(中間小圖，頂部)。DsRed和胰島素信號的共定位(右邊小圖，頂部)證明DsRed質(zhì)粒表達(dá)存在于胰島(3細(xì)胞中。DsRed信號僅僅存在于用抗-胰島素共同染色的胰島組織內(nèi)，表明高度j3細(xì)胞特異性。此外，通過胰島素染色鑒定了不顯示出DsRed表達(dá)的胰島。來自用對照微泡(沒有質(zhì)粒)或者對照質(zhì)粒(LacZ)輸入的大鼠的切片檢查沒有顯示出任何可檢測到的DsRed信號(數(shù)據(jù)未顯示)。DsRed表達(dá)相對于產(chǎn)生胰高血糖素的a細(xì)胞的定位也在圖2中顯示(底部小圖)。使用紅色濾光器，在左下小圖中顯示了DsRed蛋白質(zhì)。通過用針對胰高血糖素的熒光抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在胰島外周鑒定了a細(xì)胞(亮綠色信號，中間小圖，底部)。共焦顯微術(shù)(右邊小圖，底部)表明DsRed信號從不與胰高血糖素信號共定位，胰高血糖素信號保持亮綠色并且位于胰島外周。通過將DsRed陽性胰島數(shù)除以胰烏(抗胰鳥素陽性)總數(shù)xlOO來計(jì)算胰島轉(zhuǎn)染的效率。結(jié)果在表l中顯示。與CMV-DsRed質(zhì)粒相比，用RIP-DsRed處理的胰島的轉(zhuǎn)染效率顯著更高(67±7%對20±5%，F(xiàn)-235.1,p<0.0001)。如上面提到的，用對照微泡(無質(zhì)粒或者LacZ質(zhì)粒)處理的胰島不顯示出任何可檢測到的轉(zhuǎn)染。表6.以DsRed陽性胰島數(shù)/抗胰島素陽性胰烏數(shù)X100確定的胰島的轉(zhuǎn)染率<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>一起考慮，這些數(shù)據(jù)表明UTMD與其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)受到RIP的控制的質(zhì)粒的偶聯(lián)導(dǎo)致基因以高度定向的(如果不是唯一的方式)有效遞送到活的大鼠中的胰島P細(xì)胞。定量熒光素酶基因表達(dá)。還將胰腺中定量的基因表達(dá)與超聲束內(nèi)(左腎、脾臟、肝臟)和超聲束外(右腎、后肢骨骼肌)的其他器官相比較。UTMD后4天處死大鼠并測量每種器官中的熒光素酶活性并對蛋白質(zhì)含量表示為RLU/mg蛋白質(zhì)。圖3顯示了為三組大鼠(每組n=3只大鼠)進(jìn)行的這些器官中熒光素酶活性的比較。該研究中包括三組大鼠接受CMV-熒光素酶微泡并用正常食物和水飼養(yǎng)的動物；接受RIP熒光素酶微泡并用正常食物和水祠養(yǎng)的動物；和接受RIP熒光素酶微泡并用正常食物和補(bǔ)充20%葡萄糖的水飼養(yǎng)的動物。對動物提供這些飲食4天后處死。在接受CMV-熒光素酶的動物中，在超聲束內(nèi)的所有器官中檢測到低水平的活性。在超聲束外的骨骼肌或者右腎中沒有檢測到活性。通過ANOVA，器官之間胰腺熒光素酶活性的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=42.4，p<0.0001)，因?yàn)榕c其他器官相比，胰腺中具有明顯更高的活性。尤其重要的是，與肝臟相比，RIP-熒光素酶質(zhì)粒將胰腺活性增加了100倍(298±168RLU/mg蛋白質(zhì)對2.9±0.8RLU/mg蛋白質(zhì))，表明該技術(shù)避免了用病毒載體看到的肝臟攝入的問題。3與CMV-熒光素酶相比，RIP-焚光素酶質(zhì)粒將胰腺熒光素酶活性增強(qiáng)4倍(298±168RLU/mg蛋白質(zhì)對68±34RLU/mg蛋白質(zhì)，p<0.0001)。與僅有RIP-焚光素酶相比，葡萄糖喂飼進(jìn)一步將胰腺熒光素酶活性增強(qiáng)3.5倍(1084±192RLU/mg蛋白質(zhì)對298±168RLU/mg蛋白質(zhì)，p<0,0001)，表明被UTMD遞送到胰島后，RIP熒光素酶轉(zhuǎn)基因受到葡萄糖的合適的調(diào)節(jié)。令人驚奇地，與僅有RIP-熒光素酶相比，葡萄糖喂飼還導(dǎo)致左腎中熒光素酶表達(dá)的調(diào)節(jié)(n2士102RLU/mg蛋白質(zhì)對53土23RLU/mg蛋白質(zhì)，p=0.0057)，提示大鼠胰島素啟動子甚至當(dāng)定位于腎時(shí)也應(yīng)答葡萄糖。同樣地，本發(fā)明可以用于在一種以上的器官中提供受控的表達(dá)。通過TUMD的基因表達(dá)的時(shí)程。在單獨(dú)的大鼠組中，使用RIP-熒光素酶質(zhì)粒測量了基因表達(dá)的時(shí)程。在UTMD后4、7、14、21和28天，通過每次處死3只大鼠測量熒光素酶活性。如圖4中所示，從第4天到第7天，熒光素酶活性下降一半，到第21天時(shí)幾乎檢測不到(F=234，p<0.0001)。通過己糖激酶-l基因的UTMD介導(dǎo)的遞送調(diào)節(jié)胰島素分泌和循環(huán)的葡萄糖水平。以前的研究已經(jīng)表明由于在低葡萄糖下增加的刺激物/分泌偶聯(lián)，低Km己糖激酶(例如，己糖激酶l)的過表達(dá)導(dǎo)致胰烏素分泌的葡萄糖劑量應(yīng)答左移。3'2"因此，己糖激酶I基因用于確定通過UTMD向胰島(3細(xì)胞的基因遞送是否以足夠允許在完整動物背景中胰島素功能的可辨別的改變的效率發(fā)生。對六只大鼠輸注微泡，其含有具有處于RIP啟動子控制下的己糖激酶I基因的質(zhì)粒。對照包括用含有RIP-DsRed的微泡輸注的大鼠(n=3)和假手術(shù)正常大鼠(n=3)。在基線和UTMD后第5和10天得到葡萄糖和胰島素的血清測量。如圖5中所示，在RIP-DsRed或者假手術(shù)對照組中，血清胰烏素或者葡萄糖水平隨時(shí)間沒有顯著改變。相比，在RIP-己糖激酶I處理組中，血清胰島素到第5天時(shí)增加4倍并且到第10天時(shí)保持升高(F=11.5，p=0.0033，通過重復(fù)測量ANOVA，處理組對比對照)。與胰島素的增加相關(guān)，在第5天，RIP-己糖激酶I-處理的大鼠中血清葡萄糖水平降低接近30%(F=19.8，p^.0005通過重復(fù)測量ANOVA，處理組對比對照)，然后直到第IO天都保持低水平。通過第10天時(shí)分離的胰島中己糖激酶I蛋白質(zhì)水平的免疫印跡分析提供了通過UTMD向胰島高度有效遞送己糖激酶I基因的進(jìn)一步證據(jù)。這些數(shù)據(jù)表明在相對于對照組，用RIP-己糖激酶I質(zhì)粒進(jìn)行UTMD的3只大鼠的胰島中，可免疫檢測到的己糖激酶I蛋白質(zhì)明顯增加。總之，圖5的數(shù)據(jù)清楚地表明UTMD的使用將基因高效率遞送到活動物的胰島(3細(xì)胞。UTMD的安全性。胰腺的組織切片沒有揭示UTMD后的任何炎癥或者壞死證據(jù)。在4只大鼠中，在基線、UTMD后1小時(shí)和24小時(shí)測量血清淀粉酶和脂肪酶；值是正常的并且不隨著UTMD增加。進(jìn)行UTMD的大鼠體重正常增長并且沒有表現(xiàn)出異常行為。此外，接受RIP-DsRed質(zhì)粒的大鼠的循環(huán)葡萄糖或者胰島素水平?jīng)]有經(jīng)歷顯著改變，提示維持了正常的代謝穩(wěn)態(tài)。該實(shí)施例描述了用于將基因有效遞送到胰島的新方法。顯示了質(zhì)粒DNA的遞送并通過針對質(zhì)粒和其mRNA的原位PCR和原位RT-PCR顯示了質(zhì)粒DNA的隨后表達(dá)。此外，當(dāng)UTMD與其中用RIP指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的質(zhì)粒結(jié)合應(yīng)用時(shí)，胰腺中的基因表達(dá)限制在P細(xì)胞中。此外，已經(jīng)闡明RIP-焚光素酶質(zhì)粒在通過UTMD遞送到胰島后保持對生理信號的應(yīng)答，因?yàn)槠咸烟俏顾艑?dǎo)致報(bào)道基因活性的明顯增加。盡管有通過受精胚胎的微注射實(shí)現(xiàn)嚙齒動物的胰島中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的實(shí)例，21-27但是這是體內(nèi)基因遞送到活的成年動物的胰島的第一個(gè)實(shí)例。確定UTMD方法遞送基因的功效以表明(3細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。為該目的選擇己糖激酶I基因。胰島p細(xì)胞通常表達(dá)己糖激酶iv(也稱作葡萄糖激酶)作為它們的主要的葡萄糖磷酸化酶，該酶對葡萄糖的高So.s(約6mM)允許其調(diào)節(jié)葡萄糖代謝速率和在生理葡萄糖濃度下控制葡萄糖刺激的胰島素分泌。相比，己糖激酶I對葡萄糖具有低S。.5(約0.5mM)。相比，已知大鼠胰島中己糖激酶I的腺病毒介導(dǎo)的表達(dá)導(dǎo)致糖酵解和葡萄糖刺激的胰島素分泌中依賴葡萄糖濃度的改變的左移。2G此外，已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因小鼠的P細(xì)胞中低Km酵母己糖激酶的表達(dá)導(dǎo)致高胰島素癥和低血糖癥?；谶@些觀察，正如通過高胰島素癥和低血糖癥的相似表型所證實(shí)的，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明通過UTMD有效地將己糖激酶I遞送到P細(xì)胞，如所觀察到的和在圖5中概述的。該實(shí)施例還描述了DNA構(gòu)建體向p細(xì)胞的安全和有效的遞送，其具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1)有效基因轉(zhuǎn)移不需要病毒栽體，減少了對炎性應(yīng)答或者插入誘變的擔(dān)心；52)在這些質(zhì)粒構(gòu)建體中使用RIP啟動子提供了胰島內(nèi)明顯程度的(3細(xì)胞特異性，DsRed報(bào)道基因在產(chǎn)生胰高血糖素的a細(xì)胞中表達(dá)很少或者無表達(dá)；3)裝載質(zhì)粒的微泡可以通過全身循環(huán)遞送，消除了對侵入性手術(shù)(如局部遞送到胰腺脈管所需要的)的需要；和4)沒有證據(jù)表明由于微泡輸注和胰腺中局部應(yīng)用超聲引起的胰腺損傷。與該技術(shù)的這些非常積極的特征相平衡的是一個(gè)未預(yù)料的發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)在腎臟中，在RIP啟動子控制下實(shí)現(xiàn)了熒光素酶轉(zhuǎn)基因的顯著表達(dá)，當(dāng)定向到胰臟時(shí)，所述腎臟不可避免地處于超聲束的路徑中。此外，發(fā)現(xiàn)腎臟報(bào)道基因表達(dá)應(yīng)答葡萄糖。已經(jīng)顯示增強(qiáng)的大鼠胰島素啟動子在小鼠的腦、胸腺和腎臟中表達(dá)人生長激素(hGH)。28已知胰島素影響腎臟中腺苷29和血管緊張素原39的表達(dá)。使用本發(fā)明，還可以將基因和基因遞送(例如，RIP增強(qiáng)的腎臟基因表達(dá))靶向腎臟。為了減小或者避免腎臟表達(dá)，聚焦的超聲換能器可以用于將微泡破壞局限于預(yù)先指定的目的區(qū)域。在這些研究中，可以使用為臨床超聲心動術(shù)開發(fā)的換能器，其中在超聲束的整個(gè)長度、厚度和寬度發(fā)生微泡破壞。備選地，可以修飾或者截短RIP啟動子從而在腎臟中不存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)保持(3細(xì)胞表達(dá)。該實(shí)施例中描述的組合物和方法可以用于治療主要形式的糖尿病，并且還代表評估內(nèi)分泌胰腺中候選疾病基因的相關(guān)性的方法。l型糖尿病涉及胰島P細(xì)胞的自身免疫破壞。已經(jīng)提出一些方法用于保護(hù)P細(xì)胞免于免疫介導(dǎo)的破壞，包括通過防止細(xì)胞/細(xì)胞相互作用阻斷T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的破壞，或者備選地，注射可以保護(hù)免于炎性細(xì)胞因子或者活性氧種類導(dǎo)致的損害的基因。2然而，這些方法的測試局限于在移植之前胰烏的轉(zhuǎn)基因(種系)操作或者離體工程化。該實(shí)施例中教導(dǎo)的方法提供了胰島的原位基因工程化，從而可以在1型糖尿病的動物模型中在前期糖尿病期測試用于增強(qiáng)胰島存活的多種策略。本文教導(dǎo)的組合物和方法還可以用于2型糖尿病。在該疾病中，|3細(xì)胞似乎遭受功能不足和細(xì)胞質(zhì)量的逐漸(但不是完全)減小的雙重?fù)p害。"涉及(3細(xì)胞機(jī)能障礙的發(fā)展和2型糖尿病中p細(xì)胞質(zhì)量的損失的機(jī)理還沒有完全理解，但是已經(jīng)發(fā)展了關(guān)于慢性高脂血癥和P細(xì)胞中脂類過量積累("脂毒性")的潛在作用，32，33以及慢性暴露于葡萄糖的損害效果("葡萄糖毒性，，)34的理論。本文教導(dǎo)的技術(shù)使得可以將調(diào)節(jié)脂類或者葡萄糖代謝的基因遞送到2型糖尿病模型的胰島中。此夕卜，已知為青春晚期糖尿病(MaturityOnsetDiabetesoftheYoung(MODY))的一組疾病似乎包括涉及控制(3細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子或者代謝酶的一組單基因突變。35本發(fā)明允許快速測試在成年動物背景下從人遺傳研究出現(xiàn)的I3細(xì)胞候選基因的方法。最后，隨著用于抑制基因表達(dá)的技術(shù)如小干擾RNA(siRNA)的出現(xiàn)和它們應(yīng)用于胰島，36'37含有siRNA的質(zhì)粒的UTMD介導(dǎo)的遞送可以用于控制(上調(diào)、下調(diào))活動物中(3細(xì)胞功能和存活中的特定基因。大鼠UTMD方案。將Sprague-Dawley大鼠(250-350g)用腹膜內(nèi)氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉。通過切開將聚乙烯管(PE50,BectonDickinson,MD)插入右頸內(nèi)靜脈。將外腹部剃毛并放置S3探頭(So麵5500，PhilipsUltrasound,Andover,MA)以對左腎和脾臟成像，可以容易地鑒定左腎和脾臟。胰腺位于它們之間，因此調(diào)節(jié)探頭以定向胰腺并夾在適當(dāng)位置。使用輸注泵在加分鐘內(nèi)以3ml/h的恒定速率輸注lml微泡溶液。在整個(gè)輸注期間，使用超諧波模式(傳輸1.3MHz/接收3.6MHz)以1.2-1.4的機(jī)械指數(shù)和4cm的深度實(shí)現(xiàn)微泡破壞。用ECG引發(fā)(R波峰后以80ms)超聲脈沖以每4次心搏周期遞送4幀超聲爆發(fā)。以前已經(jīng)表明這些設(shè)置是使用UTMD進(jìn)行基因遞送的最佳超聲參數(shù)。5在每個(gè)研究結(jié)束時(shí)，將頸靜脈打結(jié)并封閉皮膚。實(shí)驗(yàn)后監(jiān)視所有大鼠的正常行為。4天后處死大鼠并收獲胰腺。含有質(zhì)粒的脂類穩(wěn)定的微泡的生產(chǎn)。如本發(fā)明人前面描繪的制備某些脂類穩(wěn)定的微泡。5'6在本發(fā)明中，將DPPC(1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿，Sigma,St.Louis，MO)2.5mg/ml;DPPE(l，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，Sigma,St.Louis，MO)0.5mg/ml和10%甘油的溶液與2mg質(zhì)粒溶液以2:1的比例混合。將該磷脂-質(zhì)粒溶液的0.5ml等分試樣置于1.5ml透明小瓶中；剩余的頂部空間裝入全氟丙烷氣體(AirProducts,Inc，Allentown，PA)。每瓶在40TC溫育30分鐘然后通過牙科混合器(VialmixTM，Bristol-MyersSquibbMedicalImaging,N.Billerica，MA)機(jī)械振動20秒。脂類穩(wěn)定的微泡呈現(xiàn)為漂浮在含有未附著的質(zhì)粒DNA的液體層上方的乳白色懸浮體。丟棄下層清液并用PBS洗滌微泡三次以除去未附著的質(zhì)粒DNA。通過顆粒計(jì)數(shù)器(BeckmanCoulterMultisizerIII)測量上層中微泡的平均直徑和濃度。質(zhì)粒構(gòu)建體。用QIAampBlood試劑盒(QiagenInc，Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從大鼠外周血提取大鼠基因組DNA。通過使用在5，末端含有限制性位點(diǎn)的下面的PCR引物從Sprague-Dawley大鼠DNA通過PCR擴(kuò)增含有大鼠胰島素I啟動子(RIP)、外顯子1、內(nèi)含子1(僅內(nèi)含子)和外顯子2(從-412到+165)的5，末端的3bp(GTC)的DNA片段(限制性位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)引物1(Xhol)5，-CAACTCGAGGCTGAGCTAAGAATCCAG-3,(SEQIDNO.:l);引物2(EcoRI)5，-GCAGAAllCCTGCTTGCTGATGGTCTA-3，(SEQIDNO.:2)。對應(yīng)的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并通過QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN)純化。為了證實(shí)該序列，用dRhodamineTerminatorCycleSequencing試劑盒(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)在ABI3100基因組分析儀(GenomicAnalyzer)上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接測序。將PCR擴(kuò)增的片段用Xhol和EcoRI消化并連接到pDsRed曙Express國l的XhoI-EcoRI位點(diǎn)，pDsRed-Express國l是無啟動子的Discosomasp.紅色熒光蛋白質(zhì)(DsRed)質(zhì)粒(BDBiosciences)。在20)ul的20mMTris-HCL,0.5mMATP，2mM二硫蘇糖醇和1單位的T4DNA連接酶中進(jìn)行連接反應(yīng)。通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行該質(zhì)粒的克隆、分離和純化，并再次測序以證實(shí)不存在人為突變。如下制備表達(dá)處于RIP啟動子的己糖激酶1基因的質(zhì)粒用QIAamp試劑盒(QiagenInc，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從Sprague-Dawley大鼠胰腺提取總RNA。然后用RT-PCR試劑盒的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過使用在5，末端含有限制性位點(diǎn)的下面的PCR引物通過PCR擴(kuò)增己糖激酶1cDNA的全長cDNA(限制性位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)引物1(EcoRI)5，-AAAGAATTCATGATCGCCGCGCAACTACTGGCCTAT國3，(SEQIDNO.:3);引物2(NotI)5，-AAAGCGGCCGCTTAGGCGATCGAAGGGTCTCCTCT-3，(SEQIDNO.:4)通過測序證實(shí)產(chǎn)物。將DNA用EcoRI和Notl消化然后連接到pRIP3.1載體的對應(yīng)的位點(diǎn)。通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行該質(zhì)粒的克隆、分離和純化，并再次測序以證明不存在人為突變。用于檢測DsRedDNA的原位PCR。DsRed引物。使用針對DsRedDNA的一對DsRed引物；它們?yōu)镈sRed125+(5，-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3，)(SEQIDNO.:5)和DsRed690(5，-TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG誦3，)(SEQIDNO.:6)。處死后，立即通過200ml動脈內(nèi)冷卻的鹽水從大鼠除去血液并用100ml2%多聚甲醛和0.4%戊二醛進(jìn)行灌注固定。將胰腺切割成0.5cm小塊并置于20%蔗糖溶液在410過夜，然后置入-86lC的OTC模子。將厚為5pm的冷凍切片置于硅烷包被的切片并在4%多聚甲醛中4TC下固定15分鐘，用PBS中的10mM甘氨酸淬滅5分鐘，用PBS沖洗，用PBS中的0.5%TritonX-100透化10分鐘，并用PBS沖洗10分鐘。使用PCRDIGProbSynthesis試劑盒(RocheCo.;Cat.NO:1636090)。在一邊用一滴指甲油固定蓋玻片。然后將載玻片直接置于熱循環(huán)儀的區(qū)的鋁"舟皿(boat)"中。將50|ulPCR反應(yīng)溶液(0.8單位TaqDNA聚合酶，2inlDsRed引物，3|ulDIG陽dNTP，5|ul10x緩沖液和40jul水)加入每個(gè)載玻片并使用AssemblyTool(PerkinElmer)才艮據(jù)生產(chǎn)商的使用說明通過AmpliCoverDisc和Clips覆蓋。用Perkin-ElmerGeneAmp系統(tǒng)1000如下進(jìn)行原位PCR:最初保持在94n(1分鐘)后，PCR進(jìn)行11個(gè)循環(huán)(941C1分鐘，54X:1分鐘和721C2分鐘)。擴(kuò)增后，將載玻片浸入2xSSC10分鐘和0.5。/。多聚甲搭5分鐘并浸入PBS5分鐘兩次。用用于DIG檢測(Roche)的熒光抗體增強(qiáng)劑組檢測摻入洋地黃毒苷的DNA片段，然后進(jìn)行組織化學(xué)染色。首先，將切片用封閉溶液溫育30分鐘以降低抗體與胰腺組織的非特異結(jié)合。然后，將切片與50pl抗-DIG溶液(1:25)在濕室中37"C下溫育1小時(shí)。然后搖動下用PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘。然后將載玻片用50pl抗曙小鼠-IgG洋地黃毒苷抗體溶液(1:25)在37TC溫育1小時(shí)。再次搖動下用PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘。栽玻片用50pl抗-DIG-熒光溶液(1:25)在37TC溫育1小時(shí)。再次搖動下用PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘。最后，將切片在70%EtOH、95%EtOH和100%EtOH中脫水，每次2分鐘，用二甲苯透明化并蓋片。用于檢測DsRedmRNA的原位RT-PCR。DsRed引物。使用針對DsRedcDNA的一對DsRed引物，它們是DsRed125+(5，-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3，)(SEQIDNO.:7)和DsRed690(5，畫TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG陽3，)(SEQIDNO.:8)。如上述制備灌注固定的冰凍切片。在每個(gè)栽玻片上用50inl混合物溶液(Invitrogen)(5julDNaseI，5pl10xDNase緩沖液，和40pl水)進(jìn)行DNA酶處理，蓋片，在251C溫育過夜，然后用PBS洗滌2次，每次5分鐘。逆轉(zhuǎn)錄在每個(gè)載玻片上在50)Lil總體積中用50pl混合物溶液(用于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)，Invitrogen試劑盒#11904-018)(1|ulDsRed727引物(5'隱GATGGTGATGTCCTCGTTGTG-3，)(SEQIDNO.:9)，5ixlDTT溶液，2.5)uldNTP，5|ul10x緩沖液，5|ul25mMMgCl，29jul水和2.5|tilSuperscriptIIRT)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。放置蓋玻片并將載玻片在421C溫育2小時(shí)；用PBS洗滌2次，每次5分鐘，用100"/。ETOH漂洗1分鐘并干燥。用于檢測DsRed蛋白質(zhì)、胰島素和胰高血糖素的免疫組織化學(xué)。將5jum厚的恒冷箱切片在4。/。多聚甲搭中4TC下固定15分鐘并用PBS中的10mM甘氨酸淬滅5分鐘。將切片用PBS漂洗3分鐘，并用PBS中的0.5%TritonX-100透化10分鐘。切片用10%山羊血清在371C封閉1小時(shí)并用PBS洗滌3次。加入一級抗體(SigmaCo.)(在封閉溶液中的l:50稀釋液)并在4TC溫育過夜。用PBS洗滌三次，每次5分鐘后，加入二級抗體(SigmaCo.，綴合FITC的抗小鼠IgG)(封閉溶液中的l:50稀釋液)并在37TC溫育1小時(shí)。將切片用PBS漂洗10分鐘，5次，然后封固。熒光素酶測定法。為了定量熒光素酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，將胰腺、腎臟、脾臟和骨骼肌用Polytron粉碎并用熒光素酶裂解緩沖液(PromegaCo，)，0.1%NP-40，和0.5%脫氧膽酸鹽和蛋白酶抑制劑溫育。所得勻漿以10，000g離心10分鐘，并向20nl透明上清液加入100iul熒光素酶反應(yīng)緩沖液(Promega)。通過發(fā)光計(jì)(TD-20/20,TurnerDesignsCo.)以RLU(相對光單位)測量光發(fā)射。通過Lowry方法(BCA蛋白質(zhì)測定試劑，PierceCo.)從每個(gè)樣品的等分試樣測定總蛋白質(zhì)含量。熒光素酶活性表達(dá)為RLU/mg蛋白質(zhì)。己糖激酶I蛋白質(zhì)印跡。在處死時(shí)(UTMD基因遞送后IO分鐘)從每只大鼠收獲完整胰腺的切片并用Tris緩沖液勻漿。來自這些組織勻漿物的等量蛋白質(zhì)用12MBioRad凝膠進(jìn)行電泳，封閉，并用小鼠抗-己糖激酶I抗體溫育。用化學(xué)發(fā)光底物(ECL，Amersham，Piscataway,NJ，USA)顯示免疫反應(yīng)帶。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過雙向ANOVA比較實(shí)驗(yàn)組之間的熒光素酶活性的差異。用重復(fù)測量ANOVA評估時(shí)程實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。用雙向重復(fù)測量ANOVA評估己糖激酶1處理的大鼠和對照組之間血清胰島素和葡萄糖的暫時(shí)改變。認(rèn)為p值O.05是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。僅當(dāng)ANOVAF值是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的時(shí)候，進(jìn)行事后檢定Scheffe檢驗(yàn)。實(shí)施例10用微泡的超聲破壞將VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生靶向大鼠心肌使用已知為超聲定向的微泡破壞(UTMD)的體內(nèi)定向基因遞送系統(tǒng)在大鼠心肌中促進(jìn)通過人VEGF165cDNA介導(dǎo)的心肌血管發(fā)生。在心肌內(nèi)微泡的超聲破壞期間靜脈內(nèi)輸入攜帶編碼hVEGF165的質(zhì)粒的微泡，或者對照溶液。在UTMD后5、10和30分鐘進(jìn)行基因表達(dá)和血管發(fā)生的生物化學(xué)和組織學(xué)評估。UTMD處理的心肌含有hVEGF165蛋白質(zhì)和mRNA。UTMD-處理的動物的心肌顯示出與hVEGF165表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)的細(xì)胞過多病灶。UTMD處理的毛細(xì)血管密度在5天時(shí)增加18%,在10天時(shí)增加33%,在30天時(shí)返回到對照水平(p<0.0001)。類似地，微動脈密度在5天時(shí)增加22%，在10天時(shí)增加86%，在30天時(shí)增加31%(p<0.0001)。從而，通過UTMD將hVEGF165向大鼠心肌的非侵入遞送導(dǎo)致心肌毛細(xì)血管和微動脈密度的顯著增加。已經(jīng)提出通過血管生長因子和/或表達(dá)它們的基因?qū)π卵苌L刺激作為心肌局部缺血的潛在治療。38-41盡管在理解血管發(fā)生(新毛細(xì)血管的發(fā)育)和動脈生成(含有內(nèi)膜、介質(zhì)和外膜的較大血管的發(fā)育)中已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是還沒有發(fā)生基礎(chǔ)科學(xué)向臨床上有用的療法的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)指出最近血管生長療法的臨床試驗(yàn)的很令人失望的結(jié)果42-52可以通過多種因素解釋，這些因素包括患者選擇、對最佳的血管生成劑或者其組合的不完全理解、治療的有限時(shí)程(通常是單一固定劑量)，和亞最佳遞送技術(shù)。后兩個(gè)問題相互關(guān)聯(lián)，因?yàn)楫?dāng)前遞送血管生成劑的方法局限于直接心肌注射或者冠狀動脈內(nèi)注入，它們是侵入性技術(shù)，不能很好地適于重復(fù)治療。該實(shí)施例闡明了非侵入性方法超聲定向的微泡破壞(UTMD)，其允許將基因治療特異定向到心臟。簡言之，將含有質(zhì)粒DNA的陽離子脂質(zhì)體附著到直徑為2-4|Lim的充氣微泡的磷脂外殼。這些微泡-脂質(zhì)體復(fù)合體靜脈內(nèi)輸注并通過低頻率超聲在心肌微循環(huán)內(nèi)破壞。如上文顯示的，UTMD可以用于將報(bào)道基因選擇性遞送到胰腺和腎臟。已經(jīng)顯示了遞送到心臟的其他實(shí)例；；53-55然而，還沒有報(bào)導(dǎo)其用于實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)。UTMD通過將人血管內(nèi)皮生長因子165(hVEGF165)表達(dá)構(gòu)建體非侵入性遞送到大鼠心肌用于促進(jìn)血管發(fā)生。雄性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)歷用含有編碼hVEGF165基因的質(zhì)粒的微泡、或三種不同的對照沒有微泡的hVEGFws質(zhì)粒、沒有質(zhì)粒的微泡或者鹽水進(jìn)行的大鼠UTMD處理。所有大鼠都耐受UTMD程序而沒有并發(fā)癥并且在該程序后存活到它們的指定的在5、10或30天時(shí)的處死。在UTMD處理的或者對照大鼠之間左心室質(zhì)量和部分區(qū)域縮短沒有顯示出顯著差異(表7)，提示沒有發(fā)生由于UTMD引起的左心室肥大或者收縮期機(jī)能障礙。處死時(shí)，動物在活力或喂飼方面沒有顯示出改變，并且缺少水腫、血管瘤或者其他腫瘤的證據(jù)。大鼠心肌中hVEGFws的存在。免疫印跡揭示處理后10天在心臟組織的勻漿中與hVEGFw5—致的顯著的37kDa帶(圖6)。在對照動物中看到可能代表內(nèi)源VEGF的弱帶。hVEGF165蛋白質(zhì)的增加局限于UTMD定向的組織。與超聲定向的區(qū)域相鄰但是在該區(qū)域外的器官(如肝臟、肺和脾臟)的勻漿沒有顯示出hVEGFw5蛋白質(zhì)的相似增加。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)局限于超聲化區(qū)域的外源血管發(fā)生基因的組織特異性。在任何對照動物中都沒有檢測到hVEGF165。表7.處理動物對比對照動物中左心室(LV)縮短分?jǐn)?shù)和質(zhì)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>與蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果一致的是，RT-PCR揭示了在笫5天組和第IO天組以及第30天組中一只大鼠中hVEGFi65的表達(dá)(圖7)，但是在對照組中沒有hVEGF^的表達(dá)。為了避免任何交叉污染，PCR陽性對照不用于hVEGF165。通過測序證實(shí)人VEGF^RT-PCR產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。在處理后10天，組織學(xué)揭示了UTMD處理的動物(圖8)但不在對照動物中的細(xì)胞過多病灶。這些細(xì)胞過多病灶顯示出用抗-VEGF抗體的染色，證明了外源血管生成基因的成功轉(zhuǎn)移和表達(dá)。此外，這些病灶顯示出用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CD-31和BS-I凝集素的染色。這些區(qū)域中內(nèi)皮細(xì)胞顯示出突出的細(xì)胞核和偶然的有絲分裂像。平滑肌a-肌動蛋白染色顯示出覆蓋血管的周細(xì)胞，其是血管發(fā)生的進(jìn)一步證據(jù)。嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞明顯稀少并且沒有肌細(xì)胞壞死。然而，存在成纖維細(xì)胞增殖與肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞，與輕微炎癥相一致。到第30天時(shí)，這些病灶顯示出炎癥的消退。在對照動物中都不存在這些細(xì)胞過多病灶。使用BS-1凝集素染色組織學(xué)評估心肌毛細(xì)血管密度(圖9頂部小圖)。在所有三個(gè)時(shí)間期間，三個(gè)對照組中毛細(xì)血管密度明顯相似，平均為2606±150/mm2(圖9，底部小圖)。在UTMD-處理的大鼠中，在笫5天時(shí)毛細(xì)血管密度增加18%(3079±86/mm2)，笫10天時(shí)增加33%(3465士283毛細(xì)血管/mm2)，但是在笫30天時(shí)返回到對照水平(2683±145/mm2)。通過ANOVA，這些處理組之間毛細(xì)血管密度的改變是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=l9.25,pO.0001)。使用平滑肌a-肌動蛋白(sm-a-肌動蛋白)染色評估微動脈密度(圖IO頂部小圖)。在研究的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處，對照組之間的微動脈密度沒有顯著差異，平均為71±10/mm2(圖10，底部小圖)。在UTMD處理的大鼠中，微動脈密度在第5天時(shí)增加23%(87±3/mm2)，第10天時(shí)增加86%(132±43/mm2),第30天時(shí)增加31%(93±7/mm2)。通過ANOVA，處理組之間微動脈密度的改變是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(F=11.05，p<0.0001)。該實(shí)施例闡明血管發(fā)生基因可以非侵入性地耙向心臟，并改變心肌微脈管系統(tǒng)。特別地，毛細(xì)血管密度有暫時(shí)升高，微動脈密度有更持續(xù)的升高。值得注意的，這是首次證據(jù)證明轉(zhuǎn)基因向心臟的非侵入遞送具有治療潛力，因?yàn)樗鼘?dǎo)致導(dǎo)致心肌中基因表達(dá)和生物學(xué)改變。闡明了hVEGF165質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移后在心肌中增加的毛細(xì)血管和微動脈密度。有限的質(zhì)粒表達(dá)(僅在基因遞送后io天在所有治療大鼠中檢測到hVEGF^蛋白質(zhì))在治療后10天增加了毛細(xì)血管和微動脈密度。然而，到第30天時(shí)，觀察到毛細(xì)血管回復(fù)到基線水平。可能這是由于質(zhì)粒表達(dá)的暫時(shí)性質(zhì)或者在正常而不是局部缺血心肌背景中隨后的毛細(xì)血管去募集。微動脈也從第10天時(shí)的峰值下降到處理后30天。然而，30天時(shí)的微動脈密度仍然顯著高于對照，表明hVEGF16S治療后持續(xù)動脈生成。這是重要的新發(fā)現(xiàn)，其可能涉及UTMD后比直接注射或者冠狀動脈內(nèi)灌注更長的hVEGF^表達(dá)。在VEGF的條件轉(zhuǎn)換的小鼠模型中，短暫暴露于VEGF導(dǎo)致血管的暫時(shí)生長，其在VEGF撤除后消失。56相比，10-14天的VEGF刺激產(chǎn)生了血管生成應(yīng)答，其中成熟血管不消溶。56在該實(shí)例中，UTMD在處理后IO天在大鼠心肌中產(chǎn)生了通過蛋白質(zhì)印跡可以容易地檢測的hVEGF^5蛋白質(zhì)。使用UTMD延長hVEGF165表達(dá)的持續(xù)時(shí)間也可以促進(jìn)以前描述的平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用對新近形成的微循環(huán)的保護(hù)效應(yīng)和它在血管重建中的重要作用。57-60僅用hVEGF165質(zhì)?；蛘邇H用微泡破壞都觀察不到毛細(xì)血管或者微動脈密度的增加。并不驚奇的是靜脈內(nèi)VEGF不促進(jìn)血管發(fā)生，這是因?yàn)檠h(huán)DNA酶的影響和不存在循環(huán)質(zhì)粒穿過內(nèi)皮屏障的機(jī)制。然而，Song等人61闡明靜脈內(nèi)注射白蛋白微泡后暴露于低頻超聲的大鼠骨骼肌中的動脈生成，提示微泡破壞可能促進(jìn)血管重建。已知超聲微泡破壞導(dǎo)致空化、熱效應(yīng)、微束和自由基產(chǎn)生，它們是將可能與內(nèi)皮細(xì)胞潛在地相互作用而導(dǎo)致它們的活化的因素。62_65而且，微脈管系統(tǒng)內(nèi)微泡的機(jī)械破壞產(chǎn)生毛細(xì)血管破裂；66，67這些破裂部位的愈合可能促進(jìn)了它們的模型中動脈生成的某個(gè)方面。該研究中僅使用UTMD時(shí)血管生成效應(yīng)的缺乏可以是由于與骨骼肌相比在心肌中對微泡破壞的不同應(yīng)答、白蛋白和脂類微泡外殼之間的差異，或者其他未知的實(shí)驗(yàn)變量。在UTMD組中注意到的輕微炎癥和肌細(xì)胞的破壞可能是UTMD的VEGF介導(dǎo)的血管發(fā)生的結(jié)果。已知VEGF通過一些機(jī)制促進(jìn)炎癥，所述機(jī)制包括內(nèi)皮細(xì)胞粘附標(biāo)記、基質(zhì)金屬蛋白酶，和a-防衛(wèi)素。68—7°在對照組中沒有這些組織學(xué)發(fā)現(xiàn)表明僅僅微泡的簡單破壞不足以導(dǎo)致炎癥，灌注沒有微泡載體而僅僅VEGF質(zhì)粒也不足以導(dǎo)致炎癥。然而，VEGF質(zhì)粒和微泡破壞的組合可能在產(chǎn)生炎性應(yīng)答中是協(xié)同的。重要的是注意到炎性應(yīng)答不導(dǎo)致左心室肥大或者收縮期機(jī)能障礙，證實(shí)了來自本發(fā)明人以前對心臟中微泡破壞的顯著生物效應(yīng)的缺乏的研究的結(jié)果。71該實(shí)施例還表明在這里使用的相似微泡濃度和超聲功率下，微泡破壞不在體內(nèi)誘導(dǎo)心臟基因表達(dá)。72最后，在使用通過UTMD遞送到心臟的報(bào)道基因的以前研究中，我們通過組織學(xué)71或者基因表達(dá)72沒有發(fā)現(xiàn)任何炎癥證據(jù)。hVEGF165的表達(dá)構(gòu)建體的UTMD遞送用于刺激正常心肌中的毛細(xì)血管和微動脈生長。由于對組織學(xué)評估的需要，UTMD的效應(yīng)僅僅是對三個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)一第5、10和30天時(shí)的血管生長。技術(shù)人員使用本文教導(dǎo)的組合物和方法而不用過多實(shí)驗(yàn)就可以確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)程或最大量的確立，如可以確定中間時(shí)間點(diǎn)的毛細(xì)血管或者微動脈應(yīng)答的最大量一樣。類似地，可以觀察更長的時(shí)幀，例如，30天后，以確定微動脈密度是否返回到基線水平或者低氧條件是否可以維持如Hershey等人在兔后肢局部缺血模型中描述的動脈生成過程。72心臟中報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建體的表達(dá)可以通過重復(fù)應(yīng)用UTMD延長。72通過現(xiàn)存小毛細(xì)血管74的生長或者新的微動脈75的從頭形成可以引起動脈生成。有許多其他已知的血管生成因子，如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、angiopoetin-2、或者低氧可誘導(dǎo)的因子l-a(HIF-la)，76其可以用UTMD產(chǎn)生優(yōu)良的血管生成或者動脈生成應(yīng)答，可能沒有VGEF的一些炎性后果。還應(yīng)該指出血管滋養(yǎng)管中的血管發(fā)生可以促進(jìn)或促使動脈粥樣硬化，，77-81其是在該研究中沒有處理的VEGF基因治療的潛在不利效果。UTMD可以用于將基因成功地遞送到更大哺乳動物(如人、猴、狗或者豬)的心臟中。大鼠的小尺寸使得它們更適于UTMD，因?yàn)樾呐K足夠小而完全被超聲束的寬度包圍和因?yàn)橛休^少的組織弱化或者肺干擾。超聲定向的微泡破壞(UTMD)將hVEGF16S表達(dá)定向到大鼠心肌，導(dǎo)致毛細(xì)血管和微動脈密度的增加。該方法是非侵入性的并且允許基因表達(dá)特異靶向心臟和其他器官。還似乎對LV功能是安全的，沒有有害效果。通過UTMD的心肌轉(zhuǎn)染的確切分子機(jī)制仍然未確定。動物制備和基因遞送。根據(jù)NIH推薦和公共機(jī)構(gòu)的動物研究委員會(institutionalanimalresearchcommittee)的批準(zhǔn)進(jìn)行動物研究。將雄性SpragueDawley大鼠(200到250g，Harlan)用腹膜內(nèi)氯胺酮(60mg/kg)和甲苯噻"秦(5mg/kg)麻醉。從心前區(qū)和頸剔除毛發(fā)，并將聚乙烯管(PE50，BectonDickinson,MD)通過切斷插入右頸內(nèi)靜脈。大鼠接受四種治療之一裝載編碼處于增強(qiáng)的CMV的啟動子下的hVEGF^5基因的質(zhì)粒的微泡(0.6mgDNA/kg)，未附著到微泡的這些相同質(zhì)粒(0.6mgDNA/kg)，沒有附著的質(zhì)粒的單獨(dú)的微泡，或者生理鹽水。接受泡溶液的動物在20分鐘內(nèi)通過泵(Genie，KentScientific)輸注與0.5mlPBS混合的0.5ml泡。1ml無泡質(zhì)?；蛘啕}水溶液在20分鐘內(nèi)不加稀釋以總共1ml類似地輸入。在輸入期間，用通過商業(yè)途徑可獲得的換能器(S3，Sonos5500,PhilipsUltrasound,Bothell，WA)將超聲定向到心臟。得到心臟的中間心室、短軸視圖并且優(yōu)化像平面后，將探針夾在合適位置。然后以超諧波模式(傳輸1.3MHz/接收3.6MHz)以1.6的機(jī)械指數(shù)應(yīng)用超聲。使用R波峰值后45-70ms延遲，通過ECG將超聲的四次爆發(fā)引發(fā)到每笫四次收縮末期。已經(jīng)表明這些設(shè)置對于使用該儀器通過UTMD進(jìn)行質(zhì)粒遞送是最優(yōu)的。54泡破壞在所有大鼠中在視覺上是明顯的。在心肌中到第四次搏動時(shí)，在視覺上看不到回波-對比信號。UTMD后，將頸靜脈打結(jié)，封閉皮膚，并允許動物恢復(fù)。UTMD后使用超劑量的戊巴比妥鈉(120mg/kg)在第5天(n=12)、第10天時(shí)(n=12)和第30天(n=12)時(shí)處死動物。基于發(fā)明人以前的對UTMD后報(bào)道基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)選擇這些時(shí)間點(diǎn)。.54，55收獲心臟、肺、肝、脾臟和腎用于組織學(xué)和通過蛋白質(zhì)印跡評估hVEGF^5蛋白質(zhì)，通過RT-PCR評估m(xù)RNA。免疫組織化學(xué)。收獲的組織在methylcarnosyl中固定然后在70%乙醇中固定并用石蠟包埋。得到5pm切片、脫蠟，并通過在0.01M檸檬酸鈉，pH6.0中通過微波以900W加熱20分鐘進(jìn)行CD31、hVEGFw5和平滑肌a-肌動蛋白的抗原回收。將切片用10%山羊血清封閉并用甲醇中的0.3%11202淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦用一級單克隆抗體溫育切片l:50稀釋度的抗-CD31、l:20稀釋度的抗平滑肌a-肌動蛋白，和1:100稀釋度的抗人VEGF-165，接著是生物素化的二級抗體CD31和平滑肌ot-肌動蛋白的抗-小鼠IgG和VEGF的抗山羊IgG。用Griffoniasimplicifolia凝集素I:BS-I凝集素生物素化的抗體(Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)進(jìn)4亍凝集素染色，用10%山羊血清封閉后不進(jìn)行抗原回收并如上淬滅。所有染色都用HRP-鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行然后用DAB色原顯影，然后用蘇木精復(fù)染。RT-PCR。用RNeasyMini試劑盒(QIAGEN)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從標(biāo)本制備總RNA。用SensiscriptRT試劑盒(QIAGEN)在總共20|ul反應(yīng)液中用30ng總RNA進(jìn)行cDNA合成。用GeneAmpPCRSystem9700(PEABI)在50(id體積中對所有樣品進(jìn)行PCR，所述50|ul體積含有2picDNA,25|tilHotStarTaqMasterMix(QIAGEN)和20pmol每種引物5，GGAGGAGGGCAGAATCATCAC3，(正義XSEQIDNO.:IO);5，CGCTCTGAGCAAGGCCCACAGG3，(反義)(SEQIDNO.:ll)，所述PCR在下面的條件下進(jìn)行最初加熱到941C10分鐘，然后48個(gè)循環(huán)的941C20秒，561C20秒，72*C30秒；然后72X:5分鐘。然后在2%瓊脂糖凝膠上分析RT-PCR產(chǎn)物。使用大鼠VEGF引物5，ACAGAAGGGGAGCAGAAAGCCCAT3，(正義引物)(SEQIDNO.:12);5，CGCTCTGACCAAGGCTCACAGT3，(反義引物)(SEQIDNO.:13)的PCR反應(yīng)作為陽性對照。VEGF蛋白質(zhì)印跡。在基因遞送后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(5、10和30天)將從組織勻漿收獲的等量蛋白質(zhì)通過12%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon，Millipore，Billerica，MA，USA)，封閉，并用抗-人-VEGF抗體溫育。用化學(xué)發(fā)光底物(ECL，Amersham，Piscataway，NJ,USA)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)帶。毛細(xì)血管和微動脈密度測量。認(rèn)為通過免疫組織化學(xué)顯示具有<10直徑的BS-I凝集素陽性血管和直徑〉30|um的平滑肌a-肌動蛋白陽性血管分別是毛細(xì)血管和微動脈。使用光學(xué)顯微術(shù)在400X放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)毛細(xì)血管。從每個(gè)載玻片照5張顯微照片并在每個(gè)顯微照片上放置網(wǎng)格。使用隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器，從每個(gè)網(wǎng)格的選擇5個(gè)切片用于計(jì)數(shù)，每只得到大鼠總共25個(gè)視野。毛細(xì)血管密度表達(dá)為每1111112數(shù)目。僅僅計(jì)數(shù)與血管垂直取向的切片。以相似的方式用200X放大倍數(shù)計(jì)數(shù)微動脈密度，因?yàn)槲用}血管比毛細(xì)血管數(shù)目少得多。讀取毛細(xì)血管或者微動脈密度的研究人員對于治療組和處死時(shí)間是未知的。超聲波心動描記法。用從12MHz寬帶換能器(SU探頭，PhilipsUltrasound,Bothell，WA)獲得的數(shù)字圖像得到LV質(zhì)量和部分區(qū)域縮短的超聲心動圖測量。通過面積-長度方法如下計(jì)算LV質(zhì)量<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中Al-心外膜面積并且A2-在舒張末期從短軸視圖得到的心內(nèi)膜面積；L-在舒張末期長軸視圖得到的從LV頂點(diǎn)到二尖瓣環(huán)的中央的左心室(LV)長度；t-從短軸腔區(qū)反過來計(jì)算的心肌厚度。從下面的公式評估部分區(qū)域縮短FS=(LVEDA-LVESA)/LVEDA，其中LVEDA-左心室舒張末期面積(cm2)并且LVESA-左心室收縮末期面積(cm2)。數(shù)據(jù)分析。用Statview軟件(SAS，Cary，NC)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表達(dá)為平均值土l標(biāo)準(zhǔn)差。通過ANOVA用Fisher的事后檢定分析差異并認(rèn)為p<0.05時(shí)是顯著的。含有質(zhì)粒的脂類穩(wěn)定化的微泡的生產(chǎn)。如本發(fā)明人以前描述的54，55制備脂類穩(wěn)定化的微泡。簡言之，將DPPC(1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿，Sigma,St.Louis，MO)2.5mg/ml;DPPE(1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，Sigma,St.Louis，MO)0.5mg/ml;和10%甘油的溶液置于1.5ml透明小瓶中；剩余的頂部空間裝入全氟丙烷氣體(AirProducts,Inc，Allentown，PA)。每瓶在室溫溫育30分鐘然后通過牙科混合器(VialmixTM，Bristol-MyersSquibbMedicalImaging,N.Billerica，MA)機(jī)械振動20秒。脂類穩(wěn)定的微泡呈現(xiàn)為液體層的上方漂浮的乳白色懸浮體。丟棄下層清液并用顆粒計(jì)數(shù)器(BeckmanCoulterMultisizerIII)測量上層中微泡的平均直徑和濃度。通過用2mg質(zhì)粒DNA與50陽離子脂質(zhì)體溶液(lipofectamine2000，Invitrogen)混合并在室溫溫育15分鐘來制備含有質(zhì)粒DNA的陽離子脂質(zhì)體。這形成了納米球大小的陽離子脂質(zhì)體復(fù)合體，其包裹質(zhì)粒DNA。79如上通過向250pi磷脂包被的微泡加入50pi脂質(zhì)體并在混合器中室溫下?lián)u動20秒，用全氟丙烷氣體填充小瓶的頂部空間來制備具有陽離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體的微泡。質(zhì)粒構(gòu)建和DNA制備。如下制備處于增強(qiáng)的CMV啟動子下的具有內(nèi)含子的表達(dá)hVEGF165基因的質(zhì)粒用QIAampBlood試劑盒(Qiagenlnc，Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從健康志愿者血液提取總mRNA。然后用用于RT-PCR試劑盒(Invitrogen)的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用下面的PCR引物通過PCR擴(kuò)增hVEGF16ScDNA的全長cDNA，所述引物在5，末端含有限制性位點(diǎn)(限制性位點(diǎn)加下劃線)引物1(XhoI)5，畫TTCCTCGAGAATGAACTTTCTGCTGCTGTCTTG-3，(SEQIDNO.:14);引物2(Smal)5，-AAACCCGGGTCACCGCCTCGGCTTGTCA-3，(SEQIDNO.:15).通過測序證實(shí)產(chǎn)物。將DNA用Xhol和Smal消化然后連接到pCI-neo(Promega)的對應(yīng)位點(diǎn)中。該質(zhì)粒的克隆、分離和純化通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，8°并再次測序以證實(shí)不存在人為突變。將理解本文描述的具體實(shí)施方案通過闡明進(jìn)行說明并且不作為本發(fā)明的限制。本發(fā)明的主要特征可以用于多種實(shí)施方案而不背離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到或者使用僅僅常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定本文描述的特定步驟的許多等同方案。認(rèn)為此類等同方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且本權(quán)利要求覆蓋。說明書中提到的所有出版物和專利申請指出本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，就好像每個(gè)單獨(dú)的出版物或者專利申請都特別并單獨(dú)指出引入作為參考一樣。在權(quán)利要求中，所有過渡短語如"包含，，、"包括，，、"攜帶"、"具有，，、"含有，，、"包括"等等都理解為是開放的，即表示包括但不限于。僅僅過渡短語"由…組成"和"基本由…組成"分別將是封閉或半封閉的過渡短語。本文公開和要求保護(hù)的所有組合物/或方法都可以按照本公開做出和實(shí)施而不用過多實(shí)驗(yàn)。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)按照優(yōu)選實(shí)施方案描繪，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是變通方案可以應(yīng)用而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特別地，將顯而易見的是，化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的一些試劑可以代替本文描述的試劑而將實(shí)現(xiàn)相同或相似結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類相似的替代和修飾都被認(rèn)為在如通過所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻(xiàn)1.King,H.，Aubert，R.E.&Herman,W.H.Globalburdenofdiabetes,1995-2025:prevalence,numericalestimates,andprojections.DiabetesCare21,1414-31(1998).2.Yamaoka，T.Genetherapyfordiabetesmellitus.CurrMolMed1，325-37(2001)3.Becker,T.，BeltrandelRio，H.，Noel,R.丄，Johnson，J.H，，&Newgard,C.B.OverexpressionofHexokinaseIinIsolatedIsletsofLangerhansviaRecombinantAdenovirus:EnhancementofGlucoseMetabolismandInsulinSecretionatBasalbutnotStimulatoryGlucoseLevels.J.Biol.Chem.269，21234-21238(1994).4.FlotteT,AgarwalA，WangJ，SongS，F(xiàn)enjvesES，InverardiL，ChesnutK，AfioneS，LoilerS，WasserfallC,KapturczakM,EllisT，NickH，AtkinsonM:Efficientexvivotransductionofpancreaticisletcellswithrecombinantadenoassociatedvirusvectors.Diabetes50:515-520，20015.Isner，J.M.Myocardialgenetherapy.Nature415，234-239(2002).6.Shohet，R.V.等人Echocardiographydestructionofalbuminmicrobubblesdirectsgenedeliverytothemyocardium.Circulation101，2554-2556(2000).7.Chen,S.Y.，Shohet，R.V.,Bekeredjian，R.，F(xiàn)renkel，P.A.&Grayburn,P.A.Optimizationofultrasoundparametersforcardiacgenedeliveryofadenoviralandplasmiddeoxyribonucleicacidbyultrasound-targetedmicrobubbledestruction.J.Am.Coll.Cardiol,42，301-8(2003).8.Bekeredjian,R"Chen,S-Y.，F(xiàn)renkel，P.，Grayburn,P.A.&Shohet，R.V.Ultrasoundtargetedmicrobubbledestructioncanrepeatedlydirecthighlyspecificplasmidexpressiontotheheart.Circulation108,1022-26(2003).9.KorpantyG.等人TargetingofVEGF-mediatedangiogenesistoratmyocardiumusingultrasonicdestructionofmicrobubbles.GeneTher.Inpress(2005).10.BekeredjianR.，GrayburnP.A.，&ShohetR.V.Useofultrasoundcontrastagentsforgeneordrugdeliveryincardiovascularmedicine.J.Am.Coll.Cardiol.45，329-35(2005).11.Frenkel，P.A.，Chen,S-Y,，Thai,T.，Shohet，R.V.&Grayburn，P.A.DNA國loadedalbuminmicrobubblesenhanceultrasound-mediatedtransfectioninvitro.UltrasoundMed.Biol.28，817-22(2002).12.Wickham，T.J.Targetingadenovirus.GeneTher.20007，110-114(2000).13.Reynolds，P.N.等人Combinedtransductionalandtranscriptionaltargetingimprovesthespecificityoftransgeneexpressioninvivo.Nat.Biotechnol.19,838-842(2001).14.Boast,K.等人Characterizationofphysiologicallyregulatedvectorsforthetreatmentofischemicdisease.Hum.GeneTher，10，2197-2208(1999)15.Shah，A.S.等人Intracoronaryadenovirus-mediateddeliveryandoverexpressionofthebeta(2)-adrenergicreceptorintheheart:prospectsformolecularventricularassistance.Circulation101，408-414(2000).16.Logeart，D.等人Howtooptimizeinvivogenetransfertocardiacmyocytes:mechanicalorpharmacologicalproceduresHum.GeneTher.12，1601-1610(2001).17.French,B.A.等人Directinvivogenetransferintoporcinemyocardiumusingreplication-deficientadenoviralvectors.Circulation90，2414-2424(1994).18.Tio,R.A.等人IntramyocardialgenetherapywithnakedDNAencodingvascularendothelialgrowthfactorimprovescollateralflowtoischemicmyocardium.Hum.GeneTher.10，2953-2960(1999).19.Vincent,K.A.等人AngiogenesisisinducedinarabbitmodelofhindlimbischemiabynakedDNAencodinganHIF-lalpha/VP16hybridtranscriptionfactor.Circulation102，2255-2261(2000).20.EpsteinP.N.，BoscheroA，C,，AtwaterI"CaiX.，&OverbeekP.A.Expressionofyeasthexokinaseinpancreaticbetacellsoftransgenicmicereducesbloodglucose,enhancesinsulinsecretion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的基因，該啟動子選自由CMVIE、LTR、SV40IE、HSV汰、(3-肌動蛋白、胰烏素、人珠蛋白a、人珠蛋白p和人珠蛋白Y啟動子組成的組。10.如權(quán)利要求l的方法，其中該超聲以脈沖和聚焦模式應(yīng)用。11.如權(quán)利要求l的方法，其中該超聲以超諧波模式應(yīng)用。12.如權(quán)利要求l的方法，其中該微泡包含生物可降解的聚合物。13.如權(quán)利要求1的方法，其中該微泡包含生物相容性兩親性物質(zhì)。14.如權(quán)利要求l的方法，其中該微泡包含具有外殼的微泡，所述外殼包含生物相容性兩親性物質(zhì)的外層和生物可降解的聚合物的內(nèi)層。15.如權(quán)利要求1的方法，其中該微泡兩親性物質(zhì)選自膠原、明膠、白蛋白或者球蛋白。16.如權(quán)利要求l的方法，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含處于胰島素啟動子控制下的己糖激酶基因。17.如權(quán)利要求l的方法，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含處于RIP啟動子控制下的己糖激酶基因I。18.如權(quán)利要求l的方法，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含hVEGF蛋白質(zhì)、hVEGFmRNA或者h(yuǎn)VEGF蛋白質(zhì)和hVEGFmRNA兩者。19.如權(quán)利要求l的方法，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含hVEGF165蛋白質(zhì)、hVEGF165mRNA或者h(yuǎn)VEGF165蛋白質(zhì)和hVEGF165mRNA兩者。20.如權(quán)利要求l的方法，其中該脂質(zhì)體包含與質(zhì)粒混合的1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺甘油。21.治療需要此類治療的哺乳動物的方法，其包括對該哺乳動物施用有效量的組合物并使用超聲向該哺乳動物釋放生物活性劑，所述組合物包含裝載含有一種或多種生物活性劑的陽離子脂質(zhì)體的電中性脂類微泡。22.如權(quán)利要求21的方法，其中為患者提供藥學(xué)上可接受的載體中的微泡并且將超聲聚焦于遞送部位。23.用于超聲定向的微泡破壞的藥物遞送組合物，其包含微泡內(nèi)和周圍的預(yù)先裝配的脂質(zhì)體-核酸復(fù)合體。24.如權(quán)利要求23的組合物，該脂質(zhì)體-核酸復(fù)合體包含陽離子脂類、陰離子脂類或者其混合物和組合。25.如權(quán)利要求23的組合物，其中該微泡分布在藥學(xué)上可接受的載體中。26.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含可表達(dá)基因，該基因選自由p53、p16、p21、MMAC1、p73、zacl、C-CAM、BRCAI、Rb、Harakiri、AdElB、ICE-CED3蛋白酶、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-1O、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、(3-干擾素、y-干擾素、VEGF、EGF、PDGF、CFTR、EGFR、VEGFR、IL-2受體、雌激素受體、Bcl-2或Bcl-xL、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、abl、p53、p16、p21、MMAC1、p73、zacl、BRCAI、BRCAII、Rb、生長激素、神經(jīng)生長因子、胰島素、促腎上腺皮質(zhì)激素、曱狀旁腺激素、促卵泡激素、黃體生成素和促甲狀腺激素組成的組。27.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含啟動子和處于該啟動子控制下的基因，該啟動子選自由CMVIE、LTR、SV40IE、HSVtk、p-肌動蛋白、胰島素、人珠蛋白a、人珠蛋白P和人珠蛋白y啟動子組成的組。28.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含處于胰島素啟動子控制下的己糖激酶基因。29.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含處于RIP啟動子控制下的己糖激酶基因I。30.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含hVEGF蛋白質(zhì)、hVEGFmRNA或者h(yuǎn)VEGF蛋白質(zhì)和hVEGFmRNA兩者。31.如權(quán)利要求23的組合物，其中該活性劑包含核酸載體，該載體包含hVEGFi65蛋白質(zhì)、hVEGF165mRNA或者h(yuǎn)VEGF165蛋白質(zhì)和hVEGF165mRNA兩者。32.如權(quán)利要求23的組合物，其中該脂質(zhì)體包含與質(zhì)?；旌系?，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺甘油。33.如權(quán)利要求23的組合物，其還包含包衣。34.如權(quán)利要求23的組合物，其還包含一種或多種含鐵試劑。全文摘要本發(fā)明包括用于體內(nèi)遞送一種或多種活性劑的組合物和方法，通過將靶器官或者組織與微泡包裹的活性劑接觸并通過將微泡在靶標(biāo)處暴露于超聲而在所述靶標(biāo)選擇性釋放活性劑實(shí)現(xiàn)所述遞送，所述微泡包含電中性的脂類微泡，其裝載包含一種或多種活性劑的陽離子脂質(zhì)體，其中活性劑保持在微泡中受到保護(hù)直到在靶標(biāo)處選擇性釋放。文檔編號A61B8/00GK101389273SQ200580026511公開日2009年3月18日申請日期2005年8月5日優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日發(fā)明者P·A·格雷伯恩,S·陳申請人:貝勒研究院;得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評議會