專利名稱：用于藥物輸送的脂質(zhì)體的制作方法
優(yōu)先權(quán)聲明本申請要求2004年5月3日提交的美國臨時專利申請第60/567,921號的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請以參考方式整體并入本文，用于所有目的。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明總體上涉及脂質(zhì)體領(lǐng)域，更具體地涉及用于輸送治療實體或診斷實體的脂質(zhì)體組合物。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體或脂雙層小泡已經(jīng)用于或被提議用于各種研究、工業(yè)和醫(yī)療的應用中，特別是體內(nèi)用作診斷化合物或治療化合物的載體。參見例如Lasic，D.Liposomesfrom physics to applications.Elsevier，Amsterdam，1993；Lasic，D和Papahadjopoulos，D.，eds.Medical Applications of Liposomes.Elsevier，Amsterdam，1998。脂質(zhì)體的通常特征是具有通過一個或多個雙層組成的膜與外部介質(zhì)隔開的內(nèi)部空間，形成顯微囊或小泡。脂質(zhì)體的雙層膜典型地由包含空間上隔開的親水性區(qū)域和疏性區(qū)域的脂質(zhì)，即合成的或天然來源的兩親性分子形成，參見Lasic D.，1993，見上文。脂質(zhì)體的雙層膜也可以由兩親性聚合物和表面活性劑(polymerosomes、niosomes(非離子表面活性劑囊泡))形成。脂質(zhì)體通常充當能夠擁有有用特性或發(fā)揮有用活性的各種實體的載體，這些實體不受限制地，例如是化學化合物、化合物的組合、合成或天然來源的超分子復合體、遺傳物質(zhì)、活生物體、其部分、或其衍生物。為了實現(xiàn)這一目的，制備脂質(zhì)體，以便以摻入脂質(zhì)體的形式(liposome-incorporated form)包含期望的實體。將期望的實體摻入脂質(zhì)體的過程常常稱為“裝載”。摻入脂質(zhì)體的實體可以完全或部分地位于脂質(zhì)體的內(nèi)部空間，在脂質(zhì)體的雙層膜內(nèi)，或與脂質(zhì)體膜的外表面結(jié)合。實體摻入脂質(zhì)體的過程也稱為包囊或包載。
這三個術(shù)語在本文中可替換使用，具有相同的意思。用脂質(zhì)體包囊實體的目的常常是為了保護實體免遭環(huán)境破壞，同時使包囊的實體主要在實體活性有利的位置或環(huán)境中發(fā)揮其活性，而在這種活性可能無用或不利的其他位置不大發(fā)揮其活性。該現(xiàn)象稱為輸送(delivery)。例如，脂質(zhì)體內(nèi)的藥物物質(zhì)可免遭體內(nèi)酶的破壞，但在疾病位置由脂質(zhì)體釋放出來并進行治療。
理想地，這樣的脂質(zhì)體可以被制備用于包含期望的化合物，具有下述特性 (i)高裝載效率，即與被帶入包囊過程的量相比，具有高百分比的包囊的實體；(ii)每單位脂質(zhì)體雙層物質(zhì)具有大量包囊的實體；(iii)高濃度的包囊實體，和(iv)穩(wěn)定的形式，即當儲存或通常在脂質(zhì)體出現(xiàn)在期盼脂質(zhì)體包埋的實體發(fā)揮其預期活性的位置或環(huán)境之前僅僅少量的包囊實體釋放(滲漏)。
因此，本領(lǐng)域要求提供可用于輸送各種化合物，尤其是治療實體、診斷實體或成像實體的各種脂質(zhì)體組合物。
發(fā)明概述
本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，取代的銨和聚陰離子可用于將實體裝入并保持在脂質(zhì)體中。因此，本發(fā)明提供了用于輸送各種實體的方法和脂質(zhì)體組合物，尤其是治療實體，即在活生物體如人、植物或動物中診斷、預后、測試、篩選、治療或預防不利狀態(tài)如疾病中有用的實體。
在一種實施方案中，本發(fā)明提供了含有處于介質(zhì)中的脂質(zhì)體的組合物，其中脂質(zhì)體里面含有取代的銨，
其中R1、R2、R3和R4中的每一個獨立地是氫或有機基團，具有總計達18個的碳原子，包括18個在內(nèi)，其中R1、R2、R3和R4中的至少一個是有機基團，其中該有機基團獨立地是具有可達8個碳原子的烴基，并且是烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、烯基或環(huán)烯基基團或其羥基-取代的衍生物，任選地，在它的烴鏈中包括S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺鍵，其中R1、R2、R3和R4中的至少三個是有機基團，或取代的銨是位阻銨(sterically hindered ammonium)，如，例如，其中有機基團中的至少一個具有直接連接到銨氮原子的仲碳原子或叔碳原子。優(yōu)選地，包囊入脂質(zhì)體的取代的銨化合物的酸性(去質(zhì)子化)解離常數(shù)的負對數(shù)(pKa)，至少約8.0、至少約8.5、至少約9.0、至少約9.5或至少約10.0，這是在環(huán)境溫度下于含水溶液中測定的。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含有處于介質(zhì)中的脂質(zhì)體的組合物，其中脂質(zhì)體的內(nèi)部空間含有聚陰離子，其中聚陰離子是聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖。脂質(zhì)體優(yōu)選地含有能夠?qū)嶓w裝載入脂質(zhì)體的跨膜梯度。在一種實施方案中，跨膜梯度是由銨、季銨、或取代的伯銨、仲銨或叔銨化合物構(gòu)成的梯度，所述取代的伯銨、仲銨或叔銨化合物在環(huán)境溫度下在稀釋的含水溶液中的酸性(去質(zhì)子化)解離常數(shù)(pKa)的負對數(shù)至少約8.0、至少約8.5、至少約9.0、至少約9.5或至少約10.0。脂質(zhì)體任選地含有包埋的實體，例如治療劑、可檢測標記、或球形陽離子有機分子。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供的組合物還包含包囊入本發(fā)明脂質(zhì)體的實體。優(yōu)選地，實體包囊入脂質(zhì)體的內(nèi)部空間內(nèi)。例如，脂質(zhì)體的內(nèi)部空間還包含抗腫瘤治療劑，其中組合物對對象的毒性水平至少等于或小于在不用組合物的情況下給予對象的抗腫瘤治療劑的毒性水平。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供的組合物是包含喜樹堿化合物的脂質(zhì)體組合物。該組合物的抗癌活性比在組合物不存在下同樣給藥的喜樹堿化合物的抗癌活性高至少2倍、4倍、或10倍，同時組合物的毒性不超過在組合物不存在下同樣給藥的喜樹堿化合物的毒性，要低至少2倍、或低至少4倍。在一種實施方案中，喜樹堿化合物是藥物前體，并以每1mg脂質(zhì)體膜物質(zhì)例如脂類，至少0.1mg、至少0.2mg、至少0.3mg、0.5mg或至少1mg的量包含在脂質(zhì)體中。喜樹堿化合物優(yōu)選包囊在脂質(zhì)體中，實質(zhì)上包囊在脂質(zhì)體的內(nèi)部空間。在一個例子中，喜樹堿化合物是伊立替康(irinotecan(CPT-11))。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供的組合物是長春花堿(vinca alkaliod)或其衍生物的脂質(zhì)體組合物。在體內(nèi)暴露于哺乳動物血液24小時后，該組合物在脂質(zhì)體內(nèi)24-小時時的藥物保持量為原始藥物裝載量的至少50％、至少60％或至少70％。長春花堿或其衍生物優(yōu)選包囊在脂質(zhì)體中，實質(zhì)上包囊在脂質(zhì)體的內(nèi)部空間。哺乳動物的例子是大鼠。示例性長春花堿及其衍生物是長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供了將實體包囊入脂質(zhì)體的方法。該方法包括將本發(fā)明的脂質(zhì)體與實體，例如治療實體或可檢測實體接觸。優(yōu)選地，在本發(fā)明取代的銨或聚陰離子在介質(zhì)中的濃度低于在脂質(zhì)體內(nèi)部空間中的濃度的條件下進行接觸。在一種實施方案中，脂質(zhì)體組合物與實體在含水介質(zhì)中接觸。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供了將實體包囊入脂質(zhì)體的方法。該方法包括將本發(fā)明含脂質(zhì)體的組合物與實體前體(pre-entity)接觸，其中實體前體能夠在一定條件下轉(zhuǎn)化為實體，并在脂質(zhì)體內(nèi)部提供將實體前體在脂質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為實體的條件。在一種情況下，實體是有機化合物，實體前體是其堿性衍生物。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備脂質(zhì)體包囊的實體的試劑盒。該試劑盒包含攜帶本發(fā)明脂質(zhì)體的容器，以及任選地包含含有實體的容器，和/或例如用于包囊實體的用戶說明書。
附圖簡述
圖1顯示了在將裝載CPT-11的脂質(zhì)體經(jīng)靜脈丸劑注射(i.v.bolus)給藥大鼠之后，脂質(zhì)體脂類(圓圈)和藥物(三角形)的血液藥物動力學。脂質(zhì)體使用TEA-Pn方法裝載(參見實施例9)。
圖2顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用用TEA-Pn方法裝載CPT-11的脂質(zhì)體后，在大鼠血液內(nèi)的體內(nèi)藥物-脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學(參見實施例9)。
圖3顯示了在裸鼠內(nèi)游離CPT-11和脂質(zhì)體CPT-11對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例10)。
圖4顯示了在用游離CPT-11或脂質(zhì)體CPT-11對攜帶BT-474腫瘤的裸鼠進行治療期間的動物體重動態(tài)學?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例10)。
圖5顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用用TEA-SOS方法裝載CPT-11的脂質(zhì)體后，在大鼠血液內(nèi)的體內(nèi)藥物-脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學(參見實施例14)。
圖6顯示了在裸鼠中游離CPT-11和脂質(zhì)體CPT-11對HT-29人結(jié)腸癌異種移植物的抗腫瘤功效。圖上的文字說明表示藥物裝載方法和每次注射的給藥劑量?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例15)。
圖7顯示了在用游離CPT-11或脂質(zhì)體CPT-11制劑對攜帶HT-29腫瘤的裸鼠進行治療期間的動物體重動態(tài)學。誤差條(error bars)代表了數(shù)據(jù)的標準偏差?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例15)。
圖8A顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射對大鼠施用裝載托泊特坎的脂質(zhì)體后，脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學。圖上說明文字表示藥物裝載方法和脂質(zhì)體的藥物含量(參見實施例24)。
圖8B顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用裝載托泊特坎的脂質(zhì)體后，在大鼠血液內(nèi)的體內(nèi)藥物-脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學。圖上說明文字表示藥物裝載方法和脂質(zhì)體的藥物含量(參見實施例24)。
圖9顯示了游離托泊特坎、脂質(zhì)體托泊特坎或HER2-定向免疫脂質(zhì)體托泊特坎(TEA-Pn方法)對SKBr-3乳腺癌細胞的體外細胞毒性(參見實施例27)。
圖10顯示了游離托泊特坎、脂質(zhì)體托泊特坎或HER2-定向免疫脂質(zhì)體托泊特坎(TEA-SOS方法)對SKBr-3乳腺癌細胞的體外細胞毒性(參見實施例32)。
圖11顯示了不同托泊特坎(TPT)制劑在裸鼠中對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例29)。
圖12顯示了用游離托泊特坎(TPT)、脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)或抗-HER2免疫脂質(zhì)體托泊特坎(F5 ILs-TPT)對含BT-474腫瘤的裸鼠進行治療期間動物體重的動態(tài)學?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例29)。
圖13A顯示了在裸鼠中托泊特坎制劑對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效。游離托泊特坎(游離TPT)或脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)以它們最大耐受劑量的八分之一給藥。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例31)。
圖13B顯示了在裸鼠中托泊特坎制劑對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效。游離托泊特坎(游離TPT)或脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)以它們最大耐受劑量的四分之一給藥。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例31)。
圖13C顯示了在裸鼠中托泊特坎制劑對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效。游離托泊特坎(游離TPT)或脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)以它們最大耐受劑量的二分之一給予。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差?！皩φ铡敝竷H用無藥物和脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例31)。
圖13D顯示了在裸鼠中托泊特坎制劑對BT-474人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效。游離托泊特坎(游離TPT)或脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)以它們的最大耐受劑量給藥。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差。“對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例31)。
圖14顯示了用以它們的最大耐受劑量給藥的游離托泊特坎(游離TPT)或脂質(zhì)體托泊特坎(Ls-TPT)對攜帶BT-474腫瘤的裸鼠治療期間的平均體重動力學?！皩φ铡敝竷H用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例31)。
圖15顯示了游離6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿(游離APE)、脂質(zhì)體6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿HER2-定向免疫脂質(zhì)體6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿(F5 ILs-AE))對BT-474乳腺癌細胞的體內(nèi)細胞毒性(參見實施例35)。
圖16顯示了游離6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿(游離APE)、脂質(zhì)體6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿或EGFR-定向免疫脂質(zhì)體6-(3-氨丙基)-玫瑰樹堿(C225-ILs-APE)對具有低(MCF-7)或高(MDA-MB468)EGF受體表達水平的乳腺癌細胞的體外細胞毒性(參見實施例36)。
圖17顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射將APE脂質(zhì)體給予大鼠后，脂質(zhì)體配制的6-(3-氨丙基)玫瑰樹堿(APE)的血液藥物動力學特性脂質(zhì)體脂類(圖A，空圓圈)、藥物(圖A，實心圓圈)的血液藥物動力學，和藥物-脂質(zhì)體比率的動態(tài)學(圖B)(參見實施例37)。
圖18顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射將長春瑞濱脂質(zhì)體給予大鼠后，長春瑞濱配制的脂質(zhì)體(Ls-VRB)和抗-HER2脂質(zhì)體(F5-ILs-VRB)的血液藥物動力學特性脂質(zhì)體脂類(圖A)、藥物(圖B)的血液藥物動力學，和藥物-脂質(zhì)體比率的動態(tài)學(圖C)(參見實施例43)。
圖19顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射將裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體給予大鼠后的脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學特性。脂質(zhì)體使用預先包載的糖酐酯三乙銨(DS-TEA)、糖酐酯銨(DS-A)或硫酸銨(S-A)裝載(參見實施例44)。
圖20顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用使用預先包載的糖酐酯三乙銨(DS-TEA)、糖酐酯銨(DS-A)或硫酸銨(S-A)裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體后，在體內(nèi)大鼠血液中的藥物-脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學(參見實施例44)。
圖21顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射將裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體給予大鼠之后脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學。脂質(zhì)體使用預先包載的蔗糖八硫酸銨(蔗糖八硫酸三乙銨(triethylammonium sucroseoctasulfate))(TEA-SOS)裝載，并具有如在圖上說明文字中所表示的平均大小(參見實施例45)。
圖22顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體之后，大鼠血液內(nèi)的體內(nèi)藥物-脂質(zhì)體脂類比率動態(tài)學。脂質(zhì)體使用預先包載的蔗糖八硫酸銨(TEA-SOS)裝載，并具有在如圖上說明文字中所表示的平均大小(參見實施例45)。
圖23顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用使用TEA-SOS方法配制入脂質(zhì)體(Ls-VRB)或抗-HER2免疫脂質(zhì)體(F5-ILs-VRB)的長春瑞濱后，大鼠內(nèi)脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學(參見實施例46)。
圖24顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用使用TEA-SOS方法配制入脂質(zhì)體(Ls-VRB)或抗-HER2免疫脂質(zhì)體(F5-ILs-VRB)的長春瑞濱后，大鼠血液內(nèi)的體內(nèi)藥物-脂質(zhì)體脂類比率的動力學(參見實施例46)。
圖25顯示了游離長春瑞濱(游離VRB)、脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls-VRB)或HER2-定向免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-Ils-VRB)對HER2-過量表達的人乳腺癌細胞MDA-MB-453的體外細胞毒性(參見實施例48)。
圖26顯示了游離長春瑞濱(游離VRB)、脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls-VRB)或HER2-定向免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-Ils-VRB)對HER2-過量表達的CaLu-3人非小細胞性肺癌細胞的體外細胞毒性(參見實施例49)。
圖27顯示了游離長春瑞濱(游離VRB)、脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls VRB/SOS-TEA)或HER2-定向免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-ILs VRB/SOS-TEA)對HER2-過量表達的人乳腺癌細胞SKBr-3的體外細胞毒性(參見實施例50)。
圖28顯示了在裸鼠中游離長春瑞濱(游離VRB)或脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls VRB)對HT-29人結(jié)腸癌異種移植物的抗腫瘤功效?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差(參見實施例51)。
圖29顯示了在用游離長春瑞濱(游離VRB)、脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls VRB)或用載體(鹽水)對攜帶HT-29腫瘤的裸鼠治療期間的平均體重動力學。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差(參見實施例51)。
圖30顯示了游離長春瑞濱(游離VRB)或脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls VRB)在同源C-26鼠結(jié)腸癌模型中的抗腫瘤功效。每次注射的藥物的劑量在圖上說明文字上示出。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差。“鹽水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例52)。
圖31顯示了在用不同劑量的游離長春瑞濱(游離VRB)、脂質(zhì)體長春瑞濱(Ls VRB)或僅用載體(鹽水)對攜帶同源C-26鼠結(jié)腸癌腫瘤的小鼠進行治療期間的平均體重的動態(tài)學。每次注射的藥物的劑量在圖上說明文字上示出(參見實施例52)。
圖32顯示了在裸鼠中，游離長春瑞濱(游離藥物)或利用TEA-SOS方法制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-ILs-VRB TEA-SOS)、通過TEA-Pn方法制備的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-ILs-VRB TEA-Pn)對HER2-過量表達的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的抗腫瘤功效?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例53)。
圖33顯示了在用游離長春瑞濱、使用TEA-SOS方法制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱、通過TEA-Pn方法制備的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱或僅用載體對攜帶HER2-過量表達的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的小鼠進行治療期間的平均體重的動力學。對符號的解釋，參見圖32的文字說明(也請參見實施例53)。
圖34顯示了在裸鼠中，游離長春瑞濱(游離藥物)或使用不同數(shù)量的PEG-脂類制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱對過量表達HER2的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的抗腫瘤功效。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準偏差。“載體對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例54)。
圖35顯示了在裸鼠中，游離長春瑞濱(游離NAV)、脂質(zhì)體長春瑞濱(NAV Lip)或FC225Fab′-連接的抗-EGFR-免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(C225-NAV Lip)對過量表達EGFR的人成膠質(zhì)細胞瘤(U87)異種移植物的抗腫瘤功效。“鹽水”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例55)。
圖36顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用使用硫酸三乙銨方法配制入脂質(zhì)體的阿霉素后，在大鼠血液內(nèi)的脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學和藥物／脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學(參見實施例56)。
圖37顯示了在裸鼠中，脂質(zhì)體阿霉素(Ls-Dox)或使用不同數(shù)量的PEG-脂類制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體阿霉素(F5 ILs-Dox)對HER2-過量表達的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的抗腫瘤功效。圖上面的文字說明顯示了用摩爾％的脂質(zhì)體磷脂表達的PEG-脂類的數(shù)量?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例57)。
圖38顯示了脂質(zhì)體長春堿在大鼠中的血液藥物動力學(參見實施例58)。
圖39顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用脂質(zhì)體長春堿后，大鼠血液內(nèi)藥物/脂質(zhì)體脂類比率的變化(參見實施例58)。
圖40顯示了游離長春新堿(游離VCR)、脂質(zhì)體長春新堿(Ls-VCR)或HER2-定向免疫脂質(zhì)體長春新堿(F5-ILs-VCR)對HER2-過量表達的人乳腺癌細胞SKBr-3的體外細胞毒性(參見實施例61)。
圖41顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用配制入不同平均大小(在圖上面的文字說明中示出)的脂質(zhì)體的長春新堿后，大鼠中脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學(參見實施例62)。
圖42顯示了經(jīng)靜脈丸劑注射施用配制入不同平均大小(在圖上面的文字說明中示出)的脂質(zhì)體的長春新堿后，大鼠血液中藥物/脂質(zhì)體脂類比率的動態(tài)學(參見實施例62)。
圖43顯示了在裸鼠中，游離長春新堿(游離VCR)、通過檸檬酸三乙銨方法制備的脂質(zhì)體長春新堿(Ls-VCR檸檬酸)、通過蔗糖八硫酸三乙銨(三乙銨sucrooctasulfate)方法制備的脂質(zhì)體長春新堿(Ls-VCR SOS)、或通過蔗糖八硫酸三乙銨方法制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春新堿(F5 ILs-VCR SOS)對HER2-過量表達的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的抗腫瘤功效?！胞}水對照”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例64)。
圖44顯示了在用游離長春新堿(游離VCR)、通過檸檬酸三乙銨方法制備的脂質(zhì)體長春新堿(Ls-VCR檸檬酸)、通過蔗糖八硫酸三乙銨方法制備的脂質(zhì)體長春新堿(Ls-VCR SOS)、通過蔗糖八硫酸三乙銨方法制備的scFv F5-連接的抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春新堿(F5 ILs-VCR SOS)或僅用載體(鹽水對照)對攜帶HER2-過量表達的人乳腺癌(BT-474)異種移植物的小鼠進行治療期間的平均體重動態(tài)學(參見實施例64)。
圖45顯示了游離長春新堿(長春新堿)、脂質(zhì)體長春新堿(nt-vcr)或C225 Fab′-連接的抗-EGFR免疫脂質(zhì)體長春新堿(C225-vcr)對裸鼠中的EGFRvlII-過量表達的人腦癌(U87)異種移植物的抗腫瘤功效?！胞}水”指僅用無藥物和無脂質(zhì)體的載體治療的小鼠(參見實施例65)。
圖46顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用脂質(zhì)體CPT-11后，大鼠血液中CPT-11的血液藥物動力學和以活性(內(nèi)酯)形式存在的CPT-11的百分比的動態(tài)學(參見實施例69)。
圖47顯示了在經(jīng)靜脈丸劑注射施用CPT-11溶液(游離CPT-11)后，大鼠血液中CPT-11的血液藥物動力學和以活性(內(nèi)酯)形式存在的CPT-11的百分比的動態(tài)學(參見實施例69)。
優(yōu)選實施方案詳述
本發(fā)明總體上涉及用于輸送各種實體，特別是治療劑和成像劑的方法和脂質(zhì)體組合物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)取代的銨和聚陰離子可用于將實體例如化合物裝載并保留在脂質(zhì)體內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了含有取代的銨和/或聚陰離子的脂質(zhì)體組合物和試劑盒以及制備這些脂質(zhì)體組合物的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個特征，提供了在內(nèi)部空間含有至少一個或多個取代的銨化合物的脂質(zhì)體組合物，該取代的銨化合物具有下式
其中，R1、R2、R3和R4中每一個獨立地是氫或有機基團，其中，R1、R2、R3和R4中至少一個是有機基團，例如烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、鏈烯基或環(huán)烯基基團，其羥基-取代的衍生物，任選地在它的烴鏈中包括S、O或N原子，例如在其上形成醚(包括乙縮醛或酮縮醛)、酯、硫化物(硫醚)、胺或酰胺鍵。如果R1、R2、R3和R4中三個以下是有機基因，那么根據(jù)本發(fā)明，至少一個，優(yōu)選兩個有機基團具有直接連接到銨的氮上的仲碳或叔碳原子(即碳原子分別具有2或3個碳碳鍵)，即取代的銨是位阻銨。一般而言，已經(jīng)知道，在本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)部空間中存在的可滴定銨如未取代的銨離子(NH4+)、以及伯和仲直鏈烷基銨離子，例如通過“活性”、“遠距離”或“跨膜梯度驅(qū)動”裝載的機理，賦予其對弱的兩親性堿增強的包囊能力。(Haran，et a1.，Biochim.Biophys.Acia，1993，v.1152，p.253-258；Maurer-Spurej，et a1.，Biochim.Biophys.Acta，1999，v.1416，p.1-10)。然而，這些氨化合物具有氫原子，氫原子容易發(fā)生親核取代反應，此外還與脂質(zhì)體-包載的實體發(fā)生化學反應，并因此能夠在脂質(zhì)體裝載(包載)期間或之后削弱實體的化學完整性。因此，所包載的取代的銨化合物在化學上更具惰性，缺少不穩(wěn)定的或容易與脂質(zhì)體成分發(fā)生反應的化學功能是期望的，其中所述脂質(zhì)體成分可以包括包囊的實體。意想不到地是，我們發(fā)現(xiàn)了這樣的脂質(zhì)體組合物不但顯示出突出的實體-裝載容量，也提高了脂質(zhì)體-包載的實體的穩(wěn)定性，例如在活體中藥物不會過早從脂質(zhì)體釋放，該脂質(zhì)體組合物在它們的內(nèi)部空間包含沒有取代氫的取代的叔銨和季銨，或位阻伯銨或仲銨，其中，通往銨氫原子的通道在空間上受阻于附近大的有機基團，如具有連接到銨氮的一個或兩個仲碳原子或叔碳原子的有機基團。
在一個實施方案中，脂質(zhì)體-包載的取代的銨化合物在藥學上是惰性的，也就是說，當給予活對象如人或動物時，并不帶來不利的生理應答，其量在脂質(zhì)體膜物質(zhì)足以輸送有效劑量的脂質(zhì)體包載的實體的量的范圍內(nèi)。在另一實施方案中，本發(fā)明取代的銨對于對象具有可接受的毒性水平。通常可接受的毒性水平指本發(fā)明取代的銨的毒性劑量，例如最大耐受劑量(MTD)，或?qū)е?0％死亡的劑量(LD50)比裝載在本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)的脂質(zhì)體-包載的實體如藥物的毒性劑量高至少兩倍、至少四倍、至少八倍或至少十倍。例如，硫酸三乙銨具有根據(jù)本發(fā)明可接受的毒性水平，因為它的LD50比阿霉素——一種抗癌藥物的LD50高約40倍。如果還不清楚的話，取代的銨以及感興趣的化學實體的毒性水平或生理應答可容易地用生物醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)確定。參見例如S.C.Gad.Drug SafetyEvaluation，Wiley，New York，2002。本文實施例16描述了對游離的藥物和/或脂質(zhì)體化配制藥物的毒性進行定量的一種方法。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R1、R2、R3或R4中取代的有機基團的大小和物化特性足以確保取代的銨在含水環(huán)境中基本上形成真(分子)溶液，而不是膠束、雙層或類似的自組裝結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明取代的銨優(yōu)選很少或基本上不分布入脂質(zhì)體的雙層部分中，因而使包載取代銨的脂質(zhì)體不穩(wěn)定、溶解或滲透的風險最小。
取代的銨的有機基團一般是烴，含有高達8個碳原子(包括8個碳原子)、高達6個碳原子(包括6個碳原子)或高達4個碳原子(包括4個碳原子)，并且取代基團總共包含性地含有高達18、高達16、高達12、或高達9個碳原子。這些取代性烴基團包括相互連接的伯碳、仲碳或叔碳原子的任何組合，以及末端直接連接到銨氮形成雜環(huán)的環(huán)烷基基團，或末端直接連接到銨氫-取代基團的碳原子上的環(huán)烷基基團。這些取代的烷基基團在它們的碳鏈中也可以包括雜原子，例如氧、氮或硫，形成功能基團，例如醚、乙縮醛、胺或硫化物基團，以及形成官能團，例如連接到烷基碳鏈的羥基。本發(fā)明有機基團的例子包括但是不限于烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、鏈烯基、環(huán)烯基或其羥基-取代的衍生物，例如羥基-取代的亞烷基，形成包括取代的銨中的N的環(huán)。
在另一實施方案中，取代的銨是雜環(huán)銨，即其中R1、R2，R3或R4中的至少兩個形成環(huán)的銨；位阻伯銨；或位阻仲銨。一般而言，位阻伯銨或位阻仲銨包括R1、R2、R3和R4中的一個或兩個被空間上使分子擁擠的烷基基團取代的任何取代的銨，例如R1、R2、R3和R4中的一個或兩個被一個或兩個環(huán)烷基基團或烷基基團取代的任何取代的銨，其中環(huán)烷基基團或烷基基團具有至少一個連接到取代的銨的氮的仲烷基碳原子或叔烷基碳原子。這種雜環(huán)的位阻伯銨和位阻仲銨不受限制地包括異丙基乙基銨、異丙基甲基銨、二異丙基銨、叔丁基乙基銨、二環(huán)己基銨、質(zhì)子化形式的嗎啉、嘧啶、哌啶、吡咯烷、哌嗪、叔丁胺、2-氨基-2-甲基丙醇-1，2-氨基-2-甲基-丙二醇-1，3和三-(羥乙基)-氨基甲烷。這些取代的銨化合物通常在商業(yè)上可以以各種鹽的形式獲得，或通過用酸中和由它們相應的胺制備而得。
在還有另一實施方案中，取代的銨是叔銨或季銨，包括但是不限于三甲銨、三乙銨、三丁銨、二乙基甲基銨、二異丙基乙基銨、三異丙銨、N-甲基嗎啉鎓(N-methylmorpholinium)、N-羥乙基哌啶鎓(N-hydroxyethylpiperidinium)、N-甲基吡咯烷鎓(N-methylpyrrolidinium)和N，N′-二甲基哌嗪鎓(N，N′-dimethylpiperazinium)、四甲基銨、四乙基銨和四丁基銨。這些取代的銨化合物通常在商業(yè)上可以以各種鹽的形式獲得，或通過用酸中和由它們相應的胺制備而得。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明取代的銨化合物是球形陽離子化合物，也就是說，在實體包囊條件下，一般是在pH為約pH2和約pH8之間的含水溶液中，帶有凈正電荷，例如這是對氮原子離子化(質(zhì)子化)的結(jié)果。
在還有另一實施方案中，包囊入脂質(zhì)體的取代的伯銨、仲銨或叔銨化合物的酸性(去質(zhì)子化)解離常數(shù)的負對數(shù)(pKa)至少約8.0、至少約8.5、至少約9.0、至少約9.5、至少約10.0，這是在環(huán)境溫度中(典型地25℃)稀釋的水溶液中測定的。參數(shù)pKa是銨化合物眾所周知的特征，通常表征它們的堿性強度，并且測定pKa的方法是本領(lǐng)域傳統(tǒng)的且常規(guī)的方法。許多胺和它們質(zhì)子化形式(銨)的pKa值在化學和藥理學參考書中以表格的形式列出。參見例如IUPAC Handbook ofPharmaceutical Salts，ed.by P.H.Stahl和C.G Wermuth，Wiley-VCH，2002；CRCHandbook of Chemistry and Physics，82nd Edition，ed.by D.R.Lide，CRC Press，F(xiàn)lorida，2001，p.8-44至8-56。一般而言，較高的pKa表征較強的堿。示范性取代的銨化合物以及未取代的銨(作為它們共軛的胺堿列出)具有如下pKa值吡咯烷，11.31；哌啶，11.12；二異丙胺，11.05；二乙胺，10.93；三乙胺，10.75；三甲胺，10.73；叔丁胺，10.68；環(huán)己胺，10.66；甲胺，10.66；乙胺，10.65；丙胺，10.54；異丙胺，10.53；N-乙基哌啶，10.45；二環(huán)己胺，10.4；N-甲基哌啶，10.38；二乙基甲胺，10.35；二甲基丙胺，10.15；三甲胺，9.8；哌嗪，9.73(I)，5.33(II)；2-氨基-2-甲基丙醇，9.69；N，N′-二甲基哌嗪，9.66(I)，5.2(II)；二乙基-(2-羥乙基)胺，9.58；乙醇胺，9.5；N-羥乙基吡咯烷，9.44；二乙醇胺，9.28；氨(ammonia)，9.27；二甲基-(2-羥乙基)胺，8.83；2-氨基-2-甲基丙二醇-1，3，8.8；嗎啉，8.5；三-(羥甲基)-氨基甲烷，8.3；N-甲基葡糖胺，8.03；三乙醇胺，7.76；N-乙基嗎啉，7.67；N-羥乙基嗎啉，7.39；咪唑，7.03；嘧啶，5.23。通常，烷基或環(huán)烷基基團取代銨化合物中的氫會增加pKa值。明顯地，與不含羥基或醚官能的類似的取代的氨相比，取代的烷基基團中的多羥基或醚官能，或在含氮雜環(huán)基團中存在的芳香性會減少pKa值。具有一個以上銨基團的化合物通常第二個或隨后的銨基團的pKa比第一個銨基團的pKa低得多。我們意想不到地發(fā)現(xiàn)，具有較高pKa值——即由較強的堿性胺形成的取代的銨在穩(wěn)定脂質(zhì)體中的藥物上比那些由弱胺形成的取代的銨更有效。例如，三乙銨(pKa＝10.75)的IHP和SOS鹽在體內(nèi)穩(wěn)定脂質(zhì)體中的伊立替康上比起三乙醇銨(pKa＝7.76)相應的鹽明顯更為有效(實施例73)。
包含在本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物中的取代的銨可以是任何合適的形式，例如鹽。合適的鹽包括藥學上可接受的鹽。參見例如，P.H.Stahl，C.G.Wermuth(eds)，Handbook of Pharmaceutical Salts，Wiley-VCH，Weinheim，2002。在一個實施方案中，取代的銨是含有一個或多個本發(fā)明的聚陰離子的鹽。理想地，本發(fā)明取代的銨鹽中的相反離子(陰離子)賦予鹽以水溶性，在藥學上是惰性的，當與治療劑或可檢測實體接觸時能夠形成沉淀或凝膠，和/或滲透通過脂質(zhì)體膜的能力小于取代的銨或它的非解離的胺形式。一般而言，本發(fā)明取代的銨鹽在脂質(zhì)體內(nèi)，例如在含水空間中形成真溶液，并不形成顯著量的凝聚相，如膠束、雙層、凝膠或晶體相。取代的銨和鹽-形成陰離子例如聚陰離子的相對量在化學當量點(point ofstiochiometric equivalency)或附近，通常pH在3-9范圍內(nèi)，更通常在pH4-8范圍，這例如取決于取代的銨離子的共軛堿的解離常數(shù)。
一般而言，取代的銨包含在內(nèi)部，也就是本發(fā)明脂質(zhì)體的內(nèi)部(inner)(內(nèi)部(interior))空間。在一個實施方案中，取代的銨部分地或基本上完全從脂質(zhì)體周圍的外部介質(zhì)中去除。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法可以去除取代的銨，例如稀釋、離子交換層析、尺寸排阻層析、透析、超濾、沉淀等。
根據(jù)本發(fā)明的另一特征，提供了包含聚陰離子的脂質(zhì)體組合物。本發(fā)明的聚陰離子可以是任何適宜的化學實體，該化學實體具有一個以上帶負電荷的基團，從而導致在脂質(zhì)體內(nèi)部例如含水空間中產(chǎn)生兩個以上單位的凈負離子電荷。本發(fā)明的聚陰離子可以是二價陰離子、三價陰離子、多價陰離子、聚合的多價陰離子、聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖。毫無限制地，硫酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、硼酸鹽和檸檬酸鹽是這種二價和三價陰離子的例子。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的聚陰離子是聚陰離子聚合物，具有有機(碳)或無機骨架，和許多陰離子官能團，即在中性含水溶液中可離子化成負電荷，并整合或附著到骨架的官能團。聚合物是天然或合成的化合物，通常具有高分子量，由重復的連接單元組成，每一個重復的連接單元是相對輕和簡單的分子。示范性的聚陰離子化的聚合物是聚磷酸鹽、聚乙烯基硫酸鹽、聚乙烯基磺酸鹽、陰離子化的聚丙烯酸聚合物、陰離子化的，例如多磺化聚胺(polysulfonatedpolyamines)，例如多磺化聚(乙烯亞胺)；多硫酸化、多羧化或多磷酸化多糖；酸性多氨基酸；多核苷酸；其他多磷酸化、多硫酸化、多磺化、多硼酸化、多羧化聚合物。這種多價陰離子和聚合物是本領(lǐng)域熟知的，許多可以通過商業(yè)渠道獲得。本發(fā)明的聚合物陰離子優(yōu)選是生物可降解的，也就是說，能夠在活的生物體內(nèi)降解成無毒的單位。示范性的生物可降解聚合物陰離子是聚磷酸鹽。
在另一優(yōu)選的實施方案，聚陰離子是聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖。多元醇是具有許多連接到例如線性、支鏈或環(huán)狀碳骨架上的羥基基團的有機分子。因此，多元醇可以用其他術(shù)語表征為多羥基化化合物。優(yōu)選地，多元醇上的多數(shù)碳原子是羥基化的。多元醇(多原子醇)是本領(lǐng)域熟知的分子。直鏈(線性或支鏈)和環(huán)狀多元醇都可以被使用。不受限制地，本發(fā)明示范性的多元醇是乙二醇；丙三醇、treitol、赤蘚醇、季戊四醇、甘露醇、葡萄糖醇、山梨醇、山梨聚糖、木糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、果糖醇(fructitol)和肌醇。在一組互連的多數(shù)羥基化的碳原子內(nèi)，糖通常包括環(huán)乙縮醛、環(huán)酮縮醛、酮或醛基團，或其加合物。糖常常是天然存在的化合物。糖在水介質(zhì)中水解產(chǎn)生稱為單糖的單元。典型地，在含水溶液中，五個或六個碳原子的單糖分子形成環(huán)狀半縮醛——環(huán)狀結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，本發(fā)明的糖是單糖或二糖，也就是由一個或兩個單糖單元組成，每一個單糖具有三到七個，優(yōu)選三到六個碳原子。不受限制地，本發(fā)明示例性的糖是單糖己糖，如葡萄糖(右旋糖)、半乳糖、甘露糖、果糖；單糖戊糖，如木糖、核糖、阿拉伯糖和二糖，如乳糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖。由若干個互連的糖單元構(gòu)成而形成環(huán)(環(huán)糊精)的化合物和它們的衍生物也可以使用。使糖還原是獲得多元醇的一種方法。優(yōu)選使用更穩(wěn)定的“非還原”和非可代謝二糖如蔗糖或海藻糖。各種多元醇、單糖和二糖可以通過商業(yè)渠道獲得。
聚陰離子化的多元醇或糖是羥基基團被完全或部分修飾或被陰離子基團取代(陰離子化的)的多元醇或糖。因此，聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖包含多元醇部分或糖部分以及連接到其上的陰離子基團。不受限制地，示例性陰離子基團包括羧酸鹽、碳酸鹽、硫代碳酸鹽、二硫代碳酸鹽、磷酸鹽、膦酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽和硼酸鹽。優(yōu)選地，聚陰離子化的糖或多元醇的至少一個陰離子基團是強陰離子基團，也就是說，當在含水介質(zhì)中，在寬pH范圍內(nèi)，例如pH3-12，優(yōu)選pH2-12，50％以上被離子化，或作為選擇，解離常數(shù)的對數(shù)(pKa)為3或更小，優(yōu)選2或更小?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的各種化學方法對多元醇或糖進行聚陰離子化。例如，多元醇和/或糖與三氧化硫或氯磺酸在嘧啶或2-甲基吡啶中的反應導致一些或所有羥基基團被硫酸殘基酯化(硫酸化)，得到多硫酸化糖或多元醇。本發(fā)明示例性的硫酸化糖是硫酸化的蔗糖，不受限制地包括六硫酸蔗糖、五硫酸蔗糖和八硫酸蔗糖(參見Ochi.K.，et al.，1980，Chem.Pharm.Bull.，v.28，p.638-641)。類似地，在堿性催化劑存在下，與氯化氧磷或二乙基磷酰氯的反應產(chǎn)生多磷酸化多元醇或糖。多磷酸化多元醇也可分離自天然來源。例如，肌醇多磷酸鹽如六磷酸肌醇(植酸)分離自玉米。適于實踐本發(fā)明的各種硫酸化、磺酸化和磷酸化的糖和多元醇公開于例如美國專利5,783,568和美國專利5,281,237中，這些專利并入本文作為參考。意想不到地發(fā)現(xiàn)，僅具有強酸解離步驟——例如pKa小于約3.0優(yōu)選小于約2.0的基團如硫酸鹽單酯(pKa1.0或更小)的聚陰離子化的多羥基化化合物，，比起還具有弱酸解離步驟如磷酸鹽單酯(步驟1，pKa約1.5；步驟2，pKa約6.7；參見Stahl and Wermuth，Op.cit.，2002)的聚陰離子化的多羥基化的化合物，提供了具有更好的藥物保留性的脂質(zhì)體包囊效果。下面的實施例73舉例說明了該發(fā)現(xiàn)。多元醇和/或糖與一個以上的硼酸分子的配位作用也產(chǎn)生聚陰離子化(多硼酸化)產(chǎn)物。多元醇和/或糖與二硫化碳在堿存在下的反應產(chǎn)生聚陰離子化的(多二硫代碳酸化、多黃原酸鹽)衍生物。聚陰離子化的多元醇或糖衍生物可以以游離酸的形式分離，或用合適的堿，例如用堿金屬氫氧化物、氫氧化銨、或優(yōu)選用取代的胺中和，取代的胺例如是對應于本發(fā)明取代的銨的胺，以純的形式或以取代的氫氧化銨的形式，從而提供本發(fā)明取代的銨的聚陰離子化鹽。作為選擇，用任何已知的方法，例如用離子交換方法，聚陰離子化的多元醇/糖的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋇鹽或錳鹽可以分離并轉(zhuǎn)化為適宜的形式，例如取代的銨鹽形式。
本發(fā)明的聚陰離子的電荷密度通常為每單元例如在碳鏈中每碳原子或環(huán)、或在糖中每單糖單元具有至少兩、三或四個帶負電荷的基團。本發(fā)明聚陰離子化的糖或環(huán)狀多元醇優(yōu)選至少75％可獲得的羥基基團被聚陰離子化的，更優(yōu)選100％可獲得的羥基基團被聚陰離子化。此外，在本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)部的聚陰離子化作用通常在這樣的水平，與在目的作用位置輸送并釋放包載在脂質(zhì)體內(nèi)的實體相容或者幫助在目的作用位置輸送并釋放包載在脂質(zhì)體內(nèi)的實體，但是減少在脂質(zhì)體到達它的目的作用位置之前過早釋放包載的實體。
根據(jù)本發(fā)明，脂質(zhì)體內(nèi)的聚陰離子化程度可以用于調(diào)控釋放特征，例如包載在脂質(zhì)體內(nèi)的實體的釋放速度和動力學。一般地，聚陰離子化程度可以基于陰離子化的糖或多元醇相對于陰離子總量量評估，或在聚陰離子是單一種類的陰離子的情況下，基于相對于本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)的聚陰離子如聚陰離子化的糖或多元醇或其混合物的總聚陰離子化容量的聚陰離子化百分比進行評估。在一種實施方案中，聚陰離子化的糖或多元醇與一種或多種其他陰離子混合，并且聚陰離子化的糖或多元醇相對于其他陰離子的數(shù)量越少，實體從脂質(zhì)體釋放的速度越快。
通常如果包載的實體在目的活性位置從脂質(zhì)體釋放的速度太慢，通過使用聚陰離子化的糖或多元醇與一種或多種其他單價或多價陰離子，例如氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽等的混合物，可以取得理想的實體釋放速度。作為選擇，可以使用具有各種聚陰離子化程度的聚陰離子化的糖或多元醇的混合物。在一個實施方案中，本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)的聚陰離子化程度，在脂質(zhì)體內(nèi)例如具有包載的實體的脂質(zhì)體內(nèi)，為總陰離子的0.1％至99％、10％至90％或20％至80％之間。
一般而言，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以含有任何適宜形式的一種或多種本發(fā)明的聚陰離子，例如包含聚陰離子和陽離子的酸或鹽形式。聚陰離子，例如聚陰離子化的糖或多元醇的數(shù)量可以在化學計量學上與陽離子的數(shù)量相同或不同。在一種實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物含有一種或多種陽離子的聚陰離子鹽，其中橫跨脂質(zhì)體膜具有陽離子濃度梯度或pH梯度。在另一實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物含有一種或多種本發(fā)明的取代的銨聚陰離子鹽。在還有另一實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在脂質(zhì)體中含有聚陰離子，而在含有脂質(zhì)體的介質(zhì)中的聚陰離子通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜的方法部分去除或基本上去除，例如稀釋、離子交換層析、尺寸排阻層析、透析、超濾、吸附、沉淀等方法。在還有另一實施方案中，具有包載的聚陰離子例如聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖的脂質(zhì)體也具有有效地將物質(zhì)保留在脂質(zhì)體中的跨膜梯度。這種跨膜梯度的例子是pH梯度、電化學勢梯度、銨離子梯度、取代的銨離子梯度或溶解性梯度。取代的銨梯度通常包括含有至少一個C-N鍵的取代形式的銨離子，如伯銨、仲銨、叔銨、季銨。產(chǎn)生跨膜梯度的方法是脂質(zhì)體領(lǐng)域常規(guī)的方法。
根據(jù)本發(fā)明的還有另一特征，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物含有一種或多種本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子和化學實體或生物實體，例如治療劑或可檢測實體。例如，包含在本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物中的實體可以是治療劑、墨、染料、磁性化合物、肥料、誘餌、生物催化劑、風味劑或氣味改性物質(zhì)、漂白劑、或用本領(lǐng)域已知的任何適宜的方法可以檢測的任何實體，適宜的方法例如磁共振成像(MRI)、光成像、熒光/發(fā)光成像或核成像技術(shù)。便利地，包含在或可裝載在本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物中的實體是弱堿性的并可以滲透膜的(親脂性的)實體，例如含胺實體或氮堿實體。
在另一實施方案中，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體是治療劑。
在另一實施方案中，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體是抗癌實體。一些公知的商業(yè)上批準的(或在積極開發(fā)中的)抗腫瘤劑的部分清單分類如下。
根據(jù)結(jié)構(gòu)進行分類氟嘧啶類——5-FU、氟脫氧尿苷、噴噻溴銨、5′-脫氧氟尿苷、UFT、S-1 Capecitabine；嘧啶核苷類——脫氧胞苷、阿糖胞苷、5-氮雜胞嘧啶、吉西他汀、5-氮雜胞嘧啶-阿拉伯糖苷；嘌呤類——6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、硫唑嘌啉、別嘌呤醇、克拉屈濱、氟達拉賓、噴司他丁、2-氯腺苷；鉑類似物——順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、依絡(luò)鉑(Tetraplatin)、鉑-DACH、奧馬鉑、CI-973、JM-216；葸環(huán)類抗生素/蒽酮——阿霉素、道諾霉素、表阿霉素、伊達比星、米托蒽醌；表鬼臼毒素——依托泊苷、替尼泊苷；喜樹堿——依立替康、托泊特坎、勒托替康(Lurtotecan)、Silatecan、9-氨基喜樹堿、10，11-亞甲二氧喜樹堿、9-硝基喜樹堿、TAS 103、7-(4-甲基-哌嗪-亞甲基)-10，11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-20(S)-喜樹堿；激素和激素類似物——己烯雌酚、它莫西芬、托瑞米芬、Tolmudex、Thymitaq、氟他胺、比卡魯胺、非那雄胺、雌二醇、曲西立濱、多洛昔芬、醋酸甲羥孕酮、甲地孕酮醋酸酯、氨魯米特、睪內(nèi)酯和其他物質(zhì)；酶、蛋白質(zhì)和抗生素——天冬酰胺酶、白細胞介素、干擾素、亮丙瑞林、培門冬酶和其他物質(zhì)；長春花堿——長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春酰胺；紫杉醇類——帕利它西、多烯紫杉醇(Docetaxel)。
根據(jù)機制進行分類抗激素——參見classification for Hormones andHormonal Analogues，Anastrozole抗葉酸類——甲氨喋呤、氨基喋呤、三甲曲沙、甲氧芐啶、Pyritrexim、乙胺嘧啶、依達曲沙、MDAM；抗微管劑——紫杉醇和長春花堿；烷化劑(經(jīng)典和非經(jīng)典)——氮芥類(雙氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥)、氧氮磷環(huán)類(Oxazaphosphorines)(異磷酰胺(Ifosfamide)、環(huán)磷酰胺、過磷酰胺、氯乙環(huán)磷酰胺(Trophosphamide))、烷基磺酸酯類(馬利蘭)、亞硝基脲類(卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲菌素)、塞替派、達卡巴嗪和其他物質(zhì)；抗代謝物類——嘌呤、嘧啶和核苷，如上所列；抗生素類——蒽環(huán)類抗生素/葸醌、博來霉素、放線菌素、絲裂霉素、普卡霉素、噴司他丁、鏈脲菌素；拓撲異構(gòu)酶抑制劑——喜樹堿(Topo I)、表鬼臼毒素、m-AMSA、玫瑰樹堿(Topo II)；抗病毒類——AZT、扎西他濱、吉西他汀、地丹諾幸和其他物質(zhì)；各種細胞毒性劑——羥基脲、米托坦、融合毒素、PZA、草苔毒素、視黃素、丁酸和衍生物、戊聚糖、煙曲霉素和其他物質(zhì)。
除了上述物質(zhì)之外，抗癌實體不受限制地包括任何拓撲異構(gòu)酶抑制劑；長春花堿，例如長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春氟寧和長春西??；微管解聚劑或微管去穩(wěn)定劑；微管穩(wěn)定劑，例如紫杉醇；帕利它西或多烯紫杉醇的氨烷基或氨?；愃莆铮?′-[3-(N，N-二乙基氨基)丙?；鵠帕利它西、7-(N，N-二甲基甘氨酰)帕利它西和7-L-丙氨酰帕利它西；烷化劑；受體結(jié)合劑；酪氨酸激酶抑制劑；磷酸酶抑制劑；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；酶抑制劑；極光蛋白激酶抑制劑；核苷酸、多核苷酸和法蘭基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
在另一實施方案中，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體是下述物質(zhì)治療劑蒽環(huán)類抗生索化合物或衍生物、喜樹堿化合物或衍生物、玫瑰樹堿化合物或衍生物、長春花堿或衍生物、渥曼青霉素及其類似物和衍生物、或具有極光蛋白激酶抑制特性的吡唑并嘧啶。
在還有另一實施方案中，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體是葸環(huán)類抗生素藥物，阿霉素、道諾霉素、絲裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、癌霉素、N-乙酰阿霉素、佐柔比星、5-亞氨道諾霉素、N-乙酰道諾霉素、daunoryline、米托葸醌；喜樹堿化合物，喜樹堿、9-氨基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、10，11-亞甲二氧喜樹堿、9-氨基-10，11-亞甲二氧喜樹堿、9-氯-10，11-亞甲二氧喜樹堿、伊立替康、托泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)(methylpiperazinomethylene)-10，11-亞乙二氧-20(S)-喜樹堿、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10，11-亞甲二氧-20(S)-喜樹堿、7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹堿；玫瑰樹堿化合物，玫瑰樹堿、6-3-氨丙基-玫瑰樹堿、2-二乙基氨基乙基-玫瑰樹堿鎓(ellipticinium)及其鹽、達替銨(datelliptium)、retelliptine。
在還有另一實施方案中，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體是藥物實體，不受限制地包括下述任何物質(zhì)抗組胺乙二胺衍生物(bromphenifamine、苯海拉明)；抗原生動物劑喹諾酮(雙碘喹啉)；脒(戊烷脒)；抗蠕蟲劑(噻嘧啶)；抗吸血蟲藥物(奧沙尼喹)；抗真菌三唑衍生物(fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑)；抗菌頭孢菌素(頭孢唑啉、頭孢尼西、頭孢噻肟、頭孢酰亞胺、頭孢呋辛)；抗菌β-內(nèi)酰胺衍生物(氨曲南、頭孢美唑、頭孢西丁)；紅霉素組抗菌劑(紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、竹桃霉素)；青霉菌類(芐青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、羧芐西林)；四環(huán)素類；其他抗菌抗生素、新生霉素、壯觀霉素、萬古霉素；抗分枝桿菌藥物氨基水楊酸(aminosalicyclc acid)、卷曲霉素、乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、氯法齊明；抗病毒金剛烷胺類金剛烷胺、金剛乙胺；奎尼丁衍生物類氯喹、羥氯喹、伯胺喹、qionone；抗菌qionolones環(huán)丙沙星、依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星；磺胺藥物類；尿道抗菌劑六亞甲基四胺、呋哺妥因、trimetoprim；硝基咪唑類甲硝唑；膽堿季銨化合物(ambethinium、新斯的明、毒扁豆堿)；抗-阿爾茨海默病氨基吖啶類(他克林)；抗帕金森藥物(苯扎托品、比哌立登、普環(huán)啶、苯海索)；抗毒蕈堿劑(可托品、莨菪堿、東莨菪堿、丙胺太林)；腎上腺素多巴胺(沙丁胺醇、多巴酚丁胺、麻黃堿、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、metaproperenol、氟替卡松、特布他林)；麥角胺衍生物類；肌肉松弛素(myorelaxant)或curane系列；中樞作用肌肉松弛素；巴氯酚、環(huán)苯并環(huán)庚三烯、苯芙海因；煙堿；β-腎上腺素阻斷劑(beta-adrenoblocker)(acebutil、胺碘酮)；地爾硫草(ditiazem)；抗心律失常藥(diisopyramide、恩卡尼)、局部麻醉劑序列——普魯卡因、普魯卡因酰胺、利多卡因、flecaimide)、奎尼丁；ACE抑制劑卡托普利、enelaprilat、福辛普利、喹那普利、雷米普利；抗脂類藥物(antilipidemics)氟伐他汀、吉非貝齊(gemfibrosil)、HMG-coA抑制劑(普伐他汀)；降壓藥劑可樂定、胍那芐、哌唑嗪(prazocin)、胍乙啶、granadril、肼苯噠嗪；和非冠狀血管擴張劑雙嘧達莫。
根據(jù)本發(fā)明，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的實體可以是實體前體(pre-entity)，例如前藥或能夠在如pH變化或酶切割不穩(wěn)定的鍵的條件下經(jīng)一步或多步轉(zhuǎn)化步驟轉(zhuǎn)化為期望的實體的藥劑。這種轉(zhuǎn)化可以在前藥從脂質(zhì)體內(nèi)部釋放在藥物/脂質(zhì)體作用的目的位置處后發(fā)生。然而，前藥可以在應用脂質(zhì)體作為輸送載體，例如給予患者之前，在本發(fā)明脂質(zhì)體內(nèi)部被轉(zhuǎn)化成期望的活性實體。例如，實體可以被修飾成前藥，以便于它更容易地被裝載入脂質(zhì)體中，然后一旦到達本發(fā)明的脂質(zhì)體內(nèi)時它可以被轉(zhuǎn)化回到期望的實體。用這種方式，根據(jù)本發(fā)明，通常不適于“活性”、“遠距離”或其他基于梯度的裝載方法的實體，可以以它們天然地、未修飾的形式，有效地被裝載入脂質(zhì)體，例如裝載入脂質(zhì)體內(nèi)部空間。
已知，球形陽離子化合物，即能夠在脂質(zhì)體裝載條件下獲得凈正離子電荷的化合物，特別是含有可滴定胺的化合物，有效地裝載入展示出跨膜離子梯度的脂質(zhì)體中。如果感興趣的實體是有機化合物，并且不是具有可滴定胺的球形陽離子化合物，那么其具有必要的離子特性的衍生物可以用合適的修飾方法制備而得，例如根據(jù)Woodle等在WO 96/25147中描述的方法。例如，通過用氨基酸酯化實體的羥基基團可以引入胺基團。作為選擇，疏水基團可以被引入水溶性化合物以幫助它分配入脂質(zhì)體膜以及隨后橫穿脂質(zhì)體膜進入脂質(zhì)體內(nèi)室，即進入脂質(zhì)體里面。產(chǎn)生脂質(zhì)體-可裝載的實體前體的另一有用的修飾是形成羰基加合物，例如腙、肟、乙縮醛或酮縮醛。在將修飾的化合物裝載入本發(fā)明的脂質(zhì)體后，修飾的含氨基基團可以從修飾的化合物水解或者用其他化學方法分裂出來。在脂質(zhì)體內(nèi)由實體前體重新產(chǎn)生實體的典型方法是水解、光分解、輻解、硫解、氨解、還原、取代、氧化或消除。這些方法可以不受限制地通過pH變化或酶作用實現(xiàn)。例如，非離子實體——帕利它西或多烯紫杉醇被轉(zhuǎn)化成它們的2′-(二乙基氨基丙?；?-7′-(二乙基氨基丙?；?酯，其是弱堿(實體前體)。在用任何已知的方法裝載入脂質(zhì)體后，通過將pH增加至pH7.0以上來刺激它的水解，使脂質(zhì)體內(nèi)的2′-(二乙基氨基丙?；?-帕利它西轉(zhuǎn)化成原始的帕利它西，所述裝載方法不受限制地包括“活性”、“遠距離”、“基于跨膜-梯度的”或“基于溶解性梯度的”方法，和/或本發(fā)明的方法。因此，將中性紫杉醇分子包囊在它內(nèi)部空間的脂質(zhì)體以每摩爾脂質(zhì)體脂類超過0.05摩爾的藥物/脂類比率獲得，無需紫杉醇分子的親水性共價修飾(例如通過附著PEG)、環(huán)糊精紫杉醇復合體或紫杉醇-增溶、膠束-形成表面活性劑的幫助。
根據(jù)本發(fā)明，包含在脂質(zhì)體組合物中的脂質(zhì)體可以是任何本領(lǐng)域已知或以后發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)體。一般而言，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以具有任何脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，例如具有通過一個或多個脂雙層與外部介質(zhì)隔開的內(nèi)部空間的結(jié)構(gòu)，或具有攜帶親脂性中心部分的半透性膜的任何微膠囊，在親脂性中心部分中膜將內(nèi)部隔離開來。脂雙層可以是具有親水部分(part)(親水部分(moiety))和疏水部分(疏水部分)的兩親性分子的任何排列。通常，雙層中的兩親性分子被排列成二維的片，其中疏水部分朝向片的里面，而親水部分朝向片的外面。形成本發(fā)明脂質(zhì)體的兩親性分子可以是本領(lǐng)域已知的或以后發(fā)現(xiàn)的任何兩親性分子，例如合成的或天然來源的脂類或生物相容性脂類。本發(fā)明的脂質(zhì)體也可以由兩親性聚合物和表面活性劑，例如polymerosomes和niosomes形成。對于本公開的目的而言，不受限制地，這些形成脂質(zhì)體的物質(zhì)也稱為“脂類”。
根據(jù)本發(fā)明，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的脂質(zhì)體也可以是導向脂質(zhì)體(targeting liposomes)，例如在脂質(zhì)體的表面上含有一個或多個導向部分或生物分布修飾劑的脂質(zhì)體。導向部分可以是能夠與期望的靶標特異性結(jié)合或相互作用的任何介質(zhì)。在一種實施方案中，導向部分是配體。根據(jù)本發(fā)明，配體優(yōu)選與細胞結(jié)合和/或內(nèi)化入細胞，在細胞中脂質(zhì)體包載的實體發(fā)揮其期望的效應(靶細胞)。配體通常是結(jié)合對的成員，其中第二成員存在于靶細胞上或靶細胞中，或存在于包含靶細胞的組織中。適宜用于本發(fā)明的配體的例子是葉酸、蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長因子、酶、肽、受體、抗體或抗體片段如Fab′、Fv、單鏈Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體，或包含抗體分子的抗原結(jié)合序列(CDRs)的任何其他多肽。其中導向部分是抗體或其靶抗原結(jié)合片段的配體定向脂質(zhì)體稱為免疫脂質(zhì)體。在優(yōu)選的實施方案中，攜帶導向部分例如配體的脂質(zhì)體被內(nèi)化入靶細胞。在還有另一實施方案中，導向部分是與酪氨酸激酶受體特異性相互作用的配體，例如，如EGFR、HER2、HER3、HER4、PD-GFR、VEGFR、bFGFR或IGFR受體。在還有另一實施方案中，導向部分與生長因子受體、血管生成因子受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、細胞粘附分子或維生素受體特異性相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物內(nèi)的脂質(zhì)體具有本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子的跨膜濃度梯度。優(yōu)選地，脂質(zhì)體內(nèi)部(內(nèi)部)空間中的濃度較高。此外，除了本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子產(chǎn)生的梯度之外，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以包括一個或多個跨膜梯度。例如，包含在本發(fā)明脂質(zhì)體組合物中的脂質(zhì)體可以額外地包括跨膜pH梯度、離子梯度、電化學勢梯度和/或溶解性梯度。
根據(jù)本發(fā)明的還有另一實施方案，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以以試劑盒提供，該試劑盒包含具有脂質(zhì)體的容器，任選地，具有實體和說明書的容器，例如關(guān)于在一種或多種應用中使用脂質(zhì)體組合物的程序或信息的說明書。這種說明書可以通過任何介質(zhì)提供，例如紙件復印件、電子介質(zhì)或含有說明書的數(shù)據(jù)庫或網(wǎng)址端口。
本發(fā)明的脂質(zhì)體膜組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或以后發(fā)現(xiàn)的任何適宜的方法制備。一般而言，各種脂類組分可以被用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體組分通常包括，但是不限于(1)不帶電荷的脂組分，例如膽固醇、神經(jīng)酰胺、二酰基丙三醇、?；?聚醚)或烷基聚(醚)；(2)中性磷脂，例如二?；字Ｄ憠A、鞘磷脂和二?；字Ｒ掖及?，(3)陰離子脂類，例如二酰基磷脂酰絲氨酸、二酰基磷脂酰丙三醇、二?；姿狨ァ⑿牧字?、二?；字＜〈?、二?；及腌晁狨?、二酰基丙三醇半戊二酸酯、膽甾醇半琥珀酸酯、膽甾醇半戊二酸酯和類似物；(4)聚合物-共軛脂類，例如N-[甲氧基-(聚(乙二醇)二?；字Ｒ掖及?、聚(乙二醇)-二?；肌⒕?乙二醇)-神經(jīng)酰胺；和(5)陽離子脂類，例如1，2，-二?；?3-三甲銨-丙烷(DOTAP)、二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)和1，2-二?；?sn-丙三醇-3-乙基磷酸膽堿。也可以利用這些脂類的單?；?取代的衍生物，以及二-和單烷基-類似物。
可以選擇各種脂類成分以滿足、修改或賦予一種或多種期望的功能。例如，磷脂可以被用作主要的小泡-形成脂類。包含膽固醇以用于維持膜的剛性并減少藥物滲漏。聚合物-共軛的脂類可用于脂質(zhì)體配方中，以通過減少脂質(zhì)體被肝臟和脾臟清除來增加循環(huán)壽命，或在缺少循環(huán)擴展效應的情況下提高存儲期間脂質(zhì)體針對聚集作用的穩(wěn)定性。盡管以脂質(zhì)體脂類的1摩爾％或更高的量包含PEG-脂類被認為具有延長若干倍的脂質(zhì)體血液循環(huán)時間(參見例如美國專利5,013,556)，但是我們驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體具有相當長的循環(huán)時間，而將PEG-脂類加入到脂質(zhì)體組合物僅僅將循環(huán)壽命延長不到兩倍，如果有的話。此外，電荷-調(diào)控(可滴定)脂類可以被用于通過幫助一些類型的實體規(guī)避內(nèi)體途經(jīng)的包圍，來幫助輸送脂質(zhì)體包囊的實體至細胞靶標或核靶標。
在一種實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體包括卵磷脂、膽固醇和兩親性聚合物。包含在本發(fā)明的脂質(zhì)體中的卵磷脂可以是天然卵磷脂、氫化的天然卵磷脂、合成的卵磷脂、1，2-二硬脂酰-卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二豆蔻酰卵磷脂、二油酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰卵磷脂或1-棕櫚酰-2-油酰卵磷脂，而兩親性聚合物可以是聚乙二醇-脂類衍生物例如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二?；肌⒒蚓垡叶?神經(jīng)酰胺衍生物，其中聚(乙二醇)部分的分子量約250至約20,000，最常見的約500至約5,000。在另一實施方案中，在本發(fā)明脂質(zhì)體中的卵磷脂和膽固醇的摩爾比約3∶2。在還有另一實施方案中，兩親性聚合物占本發(fā)明脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體形成脂類的至少0.1摩爾％。在還有另一實施方案中，兩親性聚合物的量在本發(fā)明脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體形成脂類的0.1摩爾％至1摩爾％之間。優(yōu)選地，兩親性聚合物是中性聚合物，即在藥物裝載條件下具有零凈離子電荷，例如PEG-二?；?、PEG-二烷基丙三醇或PEG-神經(jīng)酰胺。出人意料地發(fā)現(xiàn)，包含PEG-脂類含量可達總脂的約5.7摩爾％(摩爾百分比)的離子中性兩親性脂類使脂質(zhì)體高效率裝載例如長春花堿如長春瑞濱，而在陰離子帶電荷PEG-DSPE的情況下，在PEG-脂類含量為1.6摩爾％(摩爾百分比)或更高時，裝載效率顯著下降(實施例72)。
在還有另一實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體含有喜樹堿衍生物，例如喜樹堿前藥如伊立替康，并且該脂質(zhì)體以例如約3∶2的摩爾比包含卵磷脂和膽固醇，和例如以脂質(zhì)體形成脂類的至少0.1摩爾％或1％以下的量包含兩親性聚合物。
本發(fā)明的脂質(zhì)體可以通過本領(lǐng)域已知或?qū)赖娜魏畏椒ㄖ苽洹⒁娎鏕.Gregoriadis(編者)，Liposome Technology，vo1.1-3，第1版，1983；第2版，1993，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。適宜制備本發(fā)明脂質(zhì)體組合物的方法的例子包括擠出、反相蒸發(fā)、超聲波、溶劑(例如乙醇)注射、微流化作用、洗滌劑透析、醚注射和脫水/再水合。通過控制用于低壓擠出的膜孔大小或用于微流化作用的壓力或通過次數(shù)或任何其他適宜的方法可以控制脂質(zhì)體的大小。在一種實施方案中，期望的脂類首先通過薄膜水合作用或通過乙醇注射進行水合，隨后利用通過確定孔大小的膜進行擠出形成一定的尺寸，最常見的為0.05μm、0.08μm或0.1μm。
在脂質(zhì)體內(nèi)部含有本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子的脂質(zhì)體組合物可以用任何適宜的方法制備，例如，在例如以鹽形式的本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子存在下形成脂質(zhì)體?；蛘咴谥|(zhì)體形成之后，或者在裝載或包載期望的實體之前，可以將脂質(zhì)體外的取代的銨和/或聚陰離子去除或稀釋?？蛇x擇地，含有本發(fā)明取代的銨和/或聚陰離子的脂質(zhì)體組合物可以直接通過離子交換方法制備，或通過中間游離酸步驟制備，該中間游離酸步驟具有本發(fā)明取代的銨的梯度，例如取代的聚陰離子化的糖或多元醇的銨鹽。這種脂質(zhì)體可以用具有揮發(fā)酸的胺或它的鹽，例如碳酸鹽中和。所得的脂質(zhì)體溶液可以直接使用，或者作為選擇，如果需要，包含在其中的鹽可以被去除，例如通過蒸發(fā)和結(jié)晶去除，然后溶解在含水介質(zhì)中。
優(yōu)選地，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物具有取代的銨和/或聚陰離子跨膜濃度梯度，例如脂質(zhì)體內(nèi)的取代的銨和/或聚陰離子鹽的濃度通常比脂質(zhì)體外介質(zhì)中的取代的銨和/或聚陰離子的濃度高至少100倍。
在一種實施方案中，脂質(zhì)體內(nèi)的取代的銨和/或聚陰離子鹽的濃度比脂質(zhì)體外介質(zhì)中的取代的銨和/或聚陰離子鹽的濃度高至少100倍，并且濃度至少約10mM、50mM、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M、0.7M或1.0M，其中摩爾濃度根據(jù)取代的胺進行計算。在另一實施方案中，脂質(zhì)體內(nèi)的取代的銨和/或聚陰離子鹽的濃度比脂質(zhì)體外介質(zhì)中的取代的銨和/或聚陰離子鹽的濃度高至少100倍，并且濃度約0.65M或約1.0M。
此外，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物外部通常具有這樣的pH，該pH適宜于或有助于在裝載過程中維持期望實體的穩(wěn)定性，以及高裝載效率，例如90％以上的包載水平。例如，優(yōu)選pH在pH4-7或pH4.5-6.5范圍內(nèi)。特別地，根據(jù)本發(fā)明，對喜樹堿化合物例如托泊特坎或伊立替康的裝載，最好在外部介質(zhì)的pH在約4.0至約7.0范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在約pH5.0至pH6.5范圍內(nèi)完成。裝載長春花堿衍生物，例如長春新堿、長春瑞濱或長春堿，最好在pH約5.0-7.0，更優(yōu)選在pH約6.5下完成。
根據(jù)本發(fā)明，通過將期望的實體與本發(fā)明的脂質(zhì)體在含水介質(zhì)中于合適的溫度溫育，可以將期望的實體裝載或包載入脂質(zhì)體中，溫度例如在裝載期間高于脂類成分的相轉(zhuǎn)變溫度，在裝載實體之后低于相轉(zhuǎn)變溫度。溫育時間通常基于脂類成分的特性、裝載入脂質(zhì)體的實體和溫育溫度。典型地，溫育時間從幾分鐘至幾小時足夠。因為獲得85％以上的高包載效率，通常為90％以上，通常沒有必要去除未包載的實體。然而，如果有必要去除未包載的實體，未包載的實體可以用各種方法從組合物去除，方法如尺寸排阻層析、透析、超濾、吸附或沉淀。出人意料地發(fā)現(xiàn)，在將實體如特別是喜樹堿衍生物或長春花堿衍生物與本發(fā)明的脂質(zhì)體溫育期間，維持低離子強度，然后在溫育結(jié)束時增加離子強度，產(chǎn)生較高的裝載效率、更好地去除未包載的藥物以及脂質(zhì)體對聚集具有更好的穩(wěn)定性。典型地，在例如含水溶液中，在離子強度小于相當于50mM NaCl的離子強度，或更優(yōu)選地小于相當于30mM NaCl的離子強度下，進行溫育。溫育之后，可以加入濃鹽溶液，例如濃NaCl溶液，將離子強度提高到高于相當于50mM NaCl的離子強度，或更優(yōu)選地，高于100mM NaCl的離子強度。不受理論限制地，我們假設(shè)，離子強度的增加有助于實體從脂質(zhì)體膜的解離，使得基本上所有實體包囊在脂質(zhì)體內(nèi)部空間中。
一般而言，實體-脂類比率，例如在裝載實體時獲得的藥物裝載比率，取決于包載在脂質(zhì)體內(nèi)的實體量、包載的取代的銨和/或聚陰離子例如鹽的濃度、包載的實體的物化特性以及使用的相反離子(陰離子)例如聚陰離子的類型。因為在組合物中和/或通過本發(fā)明的方法獲得了高裝載效率，對于包載在脂質(zhì)體中的實體而言，實體-脂類比率為基于裝載過程中所用的實體和脂質(zhì)體脂類的量而計算出的實體-脂類比率的80％以上、90％以上，以及通常為95％以上(輸入比率)。事實上，實踐上100％(定量)的包囊水平是常見的。脂質(zhì)體中實體-脂類比率可以根據(jù)重量比(每重量或摩爾單位的脂質(zhì)體脂類的實體重量)或摩爾比(每重量或摩爾單位的脂質(zhì)體脂類的實體摩爾數(shù))表征。通過常規(guī)的計算方法，例如示例于下的常規(guī)的計算方法，一個單位的實體-脂類比率可以被轉(zhuǎn)化成其他單位。在本發(fā)明脂質(zhì)體中的實體的重量比典型為每mg脂類至少0.05、0.1、0.2、0.35、0.5或至少0.65mg實體。根據(jù)摩爾比，本發(fā)明的實體-脂類比率為每摩爾脂質(zhì)體脂類至少約0.02至約5、優(yōu)選至少0.1至約2、更優(yōu)選地約0.15至約1.5摩爾藥物。在一種實施方案中，實體-脂類比率，例如喜樹堿衍生物的藥物裝載比率為每一摩爾脂質(zhì)體脂類至少0.1摩爾例如0.1摩爾喜樹堿衍生物，優(yōu)選至少0.2摩爾。在另一實施方案中，實體-脂類比率，例如藥物裝載量，為每mg脂質(zhì)體形成脂類至少約300mg實體(例如長春花堿其衍生物)。在還有另一實施方案中，實體-脂類比率，例如藥物裝載量，為每mg脂質(zhì)體形成脂類至少約500mg實體(例如喜樹堿衍生物或喜樹堿前藥)。令人驚奇地，本發(fā)明提供穩(wěn)定和接近于定量的喜樹堿衍生藥物例如伊立替康的脂質(zhì)體包囊，，其中藥物-脂類比率為每1克脂質(zhì)體脂類超過0.8mmol實體，每1克脂質(zhì)體脂類超過1.3mmol實體，甚至為每1克脂質(zhì)體脂類超過1.7mmol實體(參見實施例74)。
如果脂質(zhì)體包含磷脂，方便地用每摩爾單位的脂質(zhì)體磷脂所具有的藥物重量(質(zhì)量)單位數(shù)來表示實體含量，例如mg藥物/mmol磷脂。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到藥物含量同樣可以以不依賴于脂質(zhì)體中磷脂的存在的方式來表示，此外，同樣可以根據(jù)每單位(質(zhì)量或摩爾)脂質(zhì)體脂類含量所具有的藥物的摩爾數(shù)來表示。例如，含有3摩爾份二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC，分子量790)、2摩爾份膽固醇(分子量387)和0.015摩爾份聚(乙二醇)-衍生化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，分子量2750)，和含有藥物/脂類比率為150mg/mmol磷脂的藥物阿霉素(分子量543.5)的脂質(zhì)體，相同的藥物含量可以等同地用mg藥物/mg總脂類表示如下 (a)通過組分的摩爾數(shù)量除以脂質(zhì)體磷脂總的摩爾數(shù)量，計算脂質(zhì)體脂類組分的摩爾數(shù)量，其被標準化為脂質(zhì)體磷脂(在該例子中是DSPC和PEG-DSPE)的摩爾單位 DSPC 3/(3+0.015)＝0.99502 膽固醇2/(3+0.015)＝0.66335 PG-DSPE 0.015/(3+0.015)＝0.00498 (b)計算與脂質(zhì)體磷脂的單位摩爾數(shù)量和組分分子量相對應的總脂類的質(zhì)量數(shù)量總脂類，mg/mmol磷脂＝0.99502×790+0.66335×387+0.00498×2750＝1056.48 (c)通過以每摩爾單位磷脂的質(zhì)量單位表示的藥物含量除以步驟(b)中獲得的數(shù)，計算每質(zhì)量單位總脂類的藥物質(zhì)量數(shù)量 阿霉素，mg/mg總脂類＝150/1056.48＝0.14198。
(d)通過步驟(c)中獲得的數(shù)除以藥物分子量(在該例子中為543.5)，計算每單位總脂類質(zhì)量所具有的藥物摩爾數(shù)。
阿霉素，mmol/g總脂類＝0.14198/543.5×1000＝0.261. (e)計算磷脂在脂質(zhì)體脂類基質(zhì)中所占的摩爾份數(shù) 磷脂摩爾份數(shù)＝(磷脂總摩爾數(shù))/(脂類總摩爾數(shù))＝(3+0.015)/(3+2+0.015)＝0.6012。
(f)計算阿霉素與總脂類的摩爾比。
阿霉素，mol/mol總脂類＝(磷脂摩爾份數(shù))×(阿霉素，g/mole磷脂)/(阿霉素分子量)＝0.6012×150/543.5＝0.166
因此，用各種單位表示的藥物-脂類和藥物-磷脂比率之間的關(guān)系容易建立。本文所使用的“脂類”不受限制地包括脂質(zhì)體膜中的任何膜形成成分，如聚合物和/或洗滌劑。
本發(fā)明脂質(zhì)體包載的取代的銨和/或聚陰離子鹽溶液通常具有這樣的滲透強度(同滲重摩)，該滲透強度幫助脂質(zhì)體對滲透破壞(膨脹和/或破裂)保持穩(wěn)定，而不犧牲脂質(zhì)體的裝載容量。在一種實施方案中，本發(fā)明脂質(zhì)體組合物的同滲重摩在0.1至1.5mol/kg范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.2至1.0mol/kg范圍內(nèi)。令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體對于高脂質(zhì)體內(nèi)滲透強度對藥物裝載的不利影響是穩(wěn)定的。高達0.727mol/kg的脂質(zhì)體內(nèi)同滲重摩被充分耐受，這導致藥物的實際定量裝載達到脂質(zhì)體內(nèi)取代的銨離子交換藥物分子的化學計量的最大理論值(在伊立替康的情況下，每一取代的銨離子為一個藥物單位)，即使對于藥物和脂質(zhì)體共溫育期間脂質(zhì)體外含水介質(zhì)的同滲重摩接近約0.3mol/kg的生理值也如此(實施例74)。
一般而言，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在保藏期間相當穩(wěn)定，這是例如從本發(fā)明脂質(zhì)體中的實體的初始裝載起的一段時間階段之后，由釋放在脂質(zhì)體外的包載的實體或依然保持在脂質(zhì)體內(nèi)的實體的百分比所測定的。例如，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在4℃中穩(wěn)定至少6個月，例如在最初裝載實體之后6個月，10％以下包載的實體釋放出來。在一種實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在4℃中穩(wěn)定至少2年，例如在最初裝載實體之后2年，20％以下包載的實體釋放出來。
直到脂質(zhì)體到達它的目的作用位置之前，例如在對并人施用脂質(zhì)體抗腫瘤藥物情況下，脂質(zhì)體到達腫瘤之前，脂質(zhì)體包載的實體一直保持包囊在脂質(zhì)體中是有利的。在體內(nèi)條件下，例如在哺乳動物血液中，本發(fā)明的脂質(zhì)體對于包載的實體的釋放(滲漏)顯示出驚人的穩(wěn)定性。在大鼠體內(nèi)血液中，50％包載的實體例如藥物從脂質(zhì)體釋放出來所需要的暴露時間(半釋放期)超過24小時。特別地，裝載有長春花堿藥物例如長春堿、長春新堿和長春瑞濱的脂質(zhì)體對體內(nèi)藥物滲漏顯示顯著的穩(wěn)定性，半釋放期至少24小時，或體內(nèi)血液中24小時之后保持包囊在脂質(zhì)體內(nèi)的實體的數(shù)量為給藥前值的至少約50％。典型地，觀察到半釋放期超過33小時，或體內(nèi)血液中24小時之后保持包囊在脂質(zhì)體內(nèi)的包囊的實體的數(shù)量至少約60％；甚至半釋放期超過46小時，或體內(nèi)血液中24小時之后保持包囊在脂質(zhì)體內(nèi)的包囊的實體的數(shù)量為給藥前值的至少約70％也是常見的。有時，包囊的藥物在體內(nèi)血液中的半釋放期超過93小時，甚至超過120小時。裝載喜樹堿衍生物如托泊特坎和伊立替康的脂質(zhì)體在體內(nèi)血液中也顯示出優(yōu)越的穩(wěn)定性，24小時之后79-85％的原始藥物裝載保持包囊在脂質(zhì)體中。引人注目地，盡管在血液循環(huán)中具有如此低的體內(nèi)藥物釋放速度，本發(fā)明的脂質(zhì)體顯示出超過游離藥物(即作為溶液施用的藥物)的重大的體內(nèi)抗腫瘤活性。
本發(fā)明的脂質(zhì)體意想不到地既提供了的包載治療劑的高功效，也提供了低毒性。一般而言，本發(fā)明包囊入脂質(zhì)體的治療劑實體在哺乳動物中的活性，例如喜樹堿衍生物的抗腫瘤活性，與以相同的數(shù)量通過其常規(guī)非脂質(zhì)體制劑，例如不使用本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的方式給藥的治療劑的活性相比，至少相等、高至少兩倍和高至少四倍，而包囊在脂質(zhì)體中的實體的毒性不超過以相同劑量和時間安排但是以游離的非包囊的形式給藥的相同的治療劑實體的毒性、低至少兩倍、至少三倍或低至少四倍。例如，一般地已知，通過其他公開的方法用脂質(zhì)體包囊抗癌癥喜樹堿衍生物導致毒性相比起未包囊的藥物有所增加(較低的最大耐受劑量，較低的50％致死劑量)。參見美國專利6,355,268；美國專利6,465,008；Colbern，et al.Clinical Cancer Res.1998，v.4，p.3077-3082；Tardi，et al.Cancer Res.，2000，v.60，p.3389-3393；Emerson，et al.Clinical Cancer Res.2000，v.6，p.2903-2912。經(jīng)體內(nèi)腫瘤模型評價，脂質(zhì)體包囊的喜樹堿前藥，如水溶性的伊立替康(CPT-11)、陽離子喜樹堿前藥衍生物，比缺少脂質(zhì)體制劑時的藥物例如游離(溶液)形式的藥物，具有高得多的抗腫瘤活性，例如高至少4倍、甚至10倍。因為治療劑化合物例如喜樹堿前藥需要酶作用，例如需要內(nèi)源性非特異性羧酸酯酶作用，但是根據(jù)本發(fā)明該酶被基本上包囊在脂質(zhì)體內(nèi)部空間內(nèi)，所以這甚至更為顯著。另一方面，令人驚奇地，本發(fā)明脂質(zhì)體形式的喜樹堿前藥如CPT-11(藥物/脂類質(zhì)量比率超過0.1，例如0.2-0.6或更多)的毒性，比游離的(未包囊的)前藥CPT-11的毒性低2倍以上、3倍以上和甚至4倍以上。此外，藥物體內(nèi)從CPT-11脂質(zhì)體釋放出的時間延長，在投入血流之后24小時，50％以上、甚至70％以上(79-86％)的原始藥物含量依然保留在脂質(zhì)體中，半釋放期超過24小時，典型地超過48小時。在體內(nèi)藥物保留在脂質(zhì)體內(nèi)的時間延長與較高的抗腫瘤效應相關(guān)。令人驚奇地，在含有低分子量的聚陰離子化的糖衍生物(八硫酸蔗糖)而不是聚合物陰離子(聚磷酸鹽)的脂質(zhì)體中觀察到最低的體內(nèi)CPT-11釋放和最高的抗腫瘤活性(實施例15)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以作為藥物組合物提供，該藥物組合物含有本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物，和載體例如藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體的例子是生理鹽水、等滲葡萄糖、等滲蔗糖、林格氏溶液和Hanks′溶液?？梢约尤刖彌_物質(zhì)以提供獲得保藏穩(wěn)定性的最優(yōu)pH。例如，約6.0至約7.5之間的pH，更優(yōu)選地約6.5的pH對于脂質(zhì)體膜脂類的穩(wěn)定性是最佳的，并提供對包載的實體優(yōu)異的保持力。典型地，2-20mM濃度的組氨酸、羥乙基哌嗪-乙基磺酸鹽(HEPES)、嗎啉代(morpholipo)-乙基磺酸鹽(MES)、琥珀酸鹽、酒石酸鹽和檸檬酸鹽是示范性緩沖物質(zhì)。其他適宜的載體包括例如水、緩沖水溶液、0.4％NaCl、0.3％甘氨酸和類似物?？梢约尤氲鞍踪|(zhì)、碳水化合物或聚合物穩(wěn)定劑和張力調(diào)節(jié)劑，例如凝膠、清蛋白、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮。組合物的張力可以用葡萄糖或更惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇或糊精調(diào)節(jié)至0.25-0.35mol/kg的生理水平。這些組合物可以通過傳統(tǒng)的、熟知的滅菌技術(shù)如通過過濾滅菌。所得的含水溶液可以包裝起來以便使用，或在無菌條件下過濾并凍干，凍干的制劑在給藥之前與無菌含水介質(zhì)混合。
如需要，藥物脂質(zhì)體組合物也可以含有其他藥學上可接受的輔助物質(zhì)，以接近生理條件，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑和類似物，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。此外，脂質(zhì)體懸浮液可以包括脂類保護劑，其保護脂類在保存時免遭自由基和脂類過氧化物破壞。親脂性自由基淬火劑，如α-生育酚和水溶性離子特異性如醯胺鐵(ferrioxamine)是適宜的。
在流體藥物制劑中本發(fā)明脂質(zhì)體的濃度可以在寬范圍內(nèi)變化，即按重量計算從通常約0.05％以下或至少約2-10％到多達30至50％，并主要通過流體體積、粘度等根據(jù)所選擇的特定的給藥方式進行選擇。例如，可以增加濃度以減少與治療相關(guān)的流體裝載。這在患有動脈粥樣硬化相關(guān)的充血性心力衰竭或嚴重高血壓的患者中可能特別有利。可選擇地，由刺激性脂類組成的脂質(zhì)體藥物組合物可以被稀釋到低濃度，以減少在給藥位置出現(xiàn)炎癥。
投藥的脂質(zhì)體藥物組合物的數(shù)量將取決于包載在脂質(zhì)體中的特定治療劑實體的數(shù)量、正被治療的疾病狀態(tài)、正被使用的脂質(zhì)體的類型以及醫(yī)師的判斷。一般而言，投藥的脂質(zhì)體藥物組合物的數(shù)量將足以輸送治療上有效劑量的特定的治療劑實體。
輸送治療上有效的劑量所必需的脂質(zhì)體藥物組合物的量可以通過藥物測試領(lǐng)域常見的常規(guī)的體外和體內(nèi)方法測定。參見例如D.B.Budman，A.H.Calvert，E.K.Rowinsky(編者).Handbook of Anticancer Drug′Development，LWW，2003。各種治療劑實體的治療上有效的劑量是本領(lǐng)域熟知的；根據(jù)本發(fā)明，通過本發(fā)明的藥物脂質(zhì)體組合物輸送的治療劑實體給出了與用其常規(guī)非脂質(zhì)體制劑給予相同數(shù)量的治療劑實體所獲得的活性至少相同或高2倍、4倍或10倍的活性。典型地，本發(fā)明脂質(zhì)體藥物組合物的劑量在每千克體重約0.005至約500mg治療劑實體之間的范圍內(nèi)，最經(jīng)常地，在每千克體重約0.1至約100mg治療劑實體之間的范圍內(nèi)。
典型地，本發(fā)明的脂質(zhì)體藥物組合作為局部物質(zhì)或可注射物質(zhì)制備，或者是液體溶液或者懸浮液。然而，也可以制備適于在注射之前溶于或懸浮于液體載體中的固體形式。組合物也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法配制成腸包覆的片劑或凝膠膠囊。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以用醫(yī)學上可接收的任何方式給藥，這取決于所治療的病癥和損傷?？赡艿慕o藥途經(jīng)包括注射，通過腸胃外途經(jīng)，如肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腦膜內(nèi)、鞘內(nèi)，或其他途經(jīng)；以及經(jīng)口、鼻、眼、直腸、陰道、局部或肺部，例如通過吸入的方法。對于將根據(jù)本發(fā)明配制的脂質(zhì)體藥物輸送至中央神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，緩慢而持續(xù)地將脂質(zhì)體直接顱內(nèi)輸注入腫瘤(對流加強傳送(convection enhanced delivery)或CED)是特別有利的。參見Saito，et al.，Cancer Research，voi.64，p.2572-2579，2004；Mamot，et al.，J.Neuro-Oncology，vol.68，p.1-9，2004。組合物也可以直接施用于組織的表面。持續(xù)釋放給藥、pH依賴性釋放給藥或其他特異性化學或環(huán)境條件介導的釋放給藥也明確包含在本發(fā)明中，例如通過諸如緩釋注射(depot injection)或可蝕性移植(erodibleimplant)這樣方法給藥。
實施例
下面的實施例旨在舉例說明本發(fā)明但不是以任何方式、形狀或形式或者明確地或者含蓄地限制本發(fā)明。盡管這些實施例是可能使用的實施例中的典型，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他步驟、方法或技術(shù)也可以選擇使用。
實施例1.取代的銨鹽溶液的制備
通過用水將硫酸稀釋至0.25M濃度，然后用眾多胺中的其中一種胺滴定硫酸溶液，制備用于將藥物(例如阿霉素)裝載入脂質(zhì)體的三烷基銨和二烷基銨硫酸鹽溶液。用于該實施例的取代的胺是三乙胺、三甲胺、二甲胺、二乙胺或二乙醇胺。加入胺之后，將所得溶液稀釋至0.2M的取代的銨鹽終濃度。使用露點滲透壓機(dew point osmometer)測定同滲重摩。所得的取代的烷基銨硫酸鹽溶液的特性在下表1中示出。
表1.各種二烷基銨和三烷基銨硫酸鹽溶液的特性 實施例2.含有包載的二烷基銨鹽和三烷基銨鹽的脂質(zhì)體的制備，和將物質(zhì)裝載入這些脂質(zhì)體
將二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇(Chol)和N-(甲氧基-聚(乙二醇)-氧羰基)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)(由聚(乙二醇)制備，分子量2,000)以3∶2∶0.015摩爾比共溶于氯仿，并在55-60℃通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿。干燥的脂膜然后在60℃于實施例1中列出的二烷基銨硫酸鹽或三烷基銨硫酸鹽的其中一種的溶液中水合30分鐘。脂懸浮液在壓力下被擠出通過孔徑為0.1μm的二疊層聚碳酸酯徑跡蝕刻膜過濾器(two stacked polycarbonate track-etched membrane filter)(CorningNuclepore)。通過準彈性光散射方法(quasielastic light scattering method)測定的脂質(zhì)體大小近似為110-120nm。通過凝膠過濾，使用交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-75，Amersham Pharmacia Biotechnology)柱，用pH7.2-7.4的HEPES-緩沖鹽水洗脫該柱，將未包囊的三烷基銨或二烷基銨鹽從脂質(zhì)體的外部介質(zhì)中去除，脂質(zhì)體收集在柱的孔隙體積部分。以150μg藥物/pmol脂質(zhì)體磷脂的濃度，將鹽酸阿霉素USP(凍干粉末，每1份阿霉素含有2重量份乳糖)加入到脂質(zhì)體中。混合物在55℃溫育45分鐘，冰上冷凍10分鐘，通過凝膠過濾層析，使用Sephadex G-75柱，用pH7.4的HEPES-緩沖鹽水洗脫，去除未包囊的藥物。游離阿霉素的存在(特征為出現(xiàn)較慢移動的紅色帶)無法通過視覺觀察到。分別根據(jù)實施例70和71(分光光度法)，分析純化的裝載阿霉素的脂質(zhì)體的磷脂和阿霉素。所得的藥物裝載效率在表2中示出。
表2.阿霉素裝載入含有包載的二烷基銨鹽溶液和三烷基銨鹽溶液的脂質(zhì)體。輸入藥物/磷脂比率150μg/μmol。
實施例3.含有各種二烷基-、三烷基-和雜環(huán)-取代銨硫酸鹽的脂質(zhì)體的制備，和阿霉素裝載入這些脂質(zhì)體。
如實施例1，使用商業(yè)上可獲得的烷基-取代的、羥烷基-取代的和雜環(huán)胺制備取代的銨的硫酸鹽溶液。如實施例1，形成脂質(zhì)體，除了替換脂膜水合步驟，將純脂類溶解在乙醇中(每50μmol磷脂，近似100μl乙醇)，并在60-65℃與取代的銨鹽溶液混合，以便得到的脂類分散液含有約10vol.％的乙醇。
通過將阿霉素溶液(2mg/ml，于pH6.5的HEPES-緩沖鹽水中)以155μg藥物/μmol脂質(zhì)體磷脂(PL)的比率加入到脂質(zhì)體，并在熱水浴中58℃加熱45分鐘，以裝載阿霉素。將所得的脂質(zhì)體與任何殘留的未包囊的阿霉素分離開來，并分析藥物和脂類含量，如實施例1所述。結(jié)果在表3中示出。
表3.阿霉素裝載入含有包載的空間受阻的取代的烷基、二烷基-、三烷基-和雜環(huán)銨鹽溶液的脂質(zhì)體中。
實施例4.三乙銨多磷酸鹽(TEA-Pn)溶液的制備
將每分子含有13-18磷酸鹽單元的線性多(磷酸)鈉(Phosphate glass；CALGON，得自Sigma Chemical Company)溶解入水中，獲得約1.3M磷酸鹽的濃度。將溶液通過填充有120mL氫形式的磺酸化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物陽離子交換樹脂珠(Dowex 50W×8-200，Dow Chemical Co.)的柱。該柱用含水的3-3.6M HCl預先平衡使得樹脂為氫形式，并用去離子水洗滌至中性pH。將15ml多磷酸鈉溶液應用到柱上，并用去離子水洗脫。使用傳導率檢測儀監(jiān)測柱洗脫劑。傳導率在峰值時的柱流出物用純?nèi)野返味ㄖ羛H5.5-6.0。使用鈉-敏感性玻璃電極通過電勢分析法分析溶液中殘留的鈉，使用無機磷酸鹽分析法分析磷酸鹽含量，如實施例1所述。將殘留鈉含量在1％以下的溶液稀釋至最終磷酸鹽濃度為0.55M。典型地，溶液的TEA濃度為0.52-0.55M、pH為5.5-6.0和同滲重摩為430-480mmol/kg。
實施例5.從脂質(zhì)體制劑去除未包囊的聚磷酸鹽
根據(jù)Kirpotin，et al.，Biochemistry 3666-75，1997，制備含有包載的熒光標記8-羥基芘三磺酸鹽的脂質(zhì)體(大小為120nm)，并與多磷酸鈉溶液混合。將混合物裝載在含有全部獲自Amersham Pharmacia的交聯(lián)葡聚糖珠(Sephadex G-75)、6％瓊脂糖珠(Sepharose 6B-CL)或4％瓊脂糖珠(Sepharose 4B-CL)的尺寸排阻柱上，并用MES-葡萄糖緩沖液(pH5.5)洗脫。使用Bartlett(1959)的磷酸鹽測定法分析流出物的磷酸鹽含量，通過熒光光譜法測定脂質(zhì)體含量。在研究的凝膠-層析載體中，Sepharose CL-6B能在樣品/柱床體積比為13時將聚磷酸鹽與脂質(zhì)體完全分開。
實施例6.制備三乙銨蔗糖八硫酸鹽(TEA-SOS)溶液
蔗糖八硫酸鈉(當量，144.8)是蔗糖衍生物的鈉鹽，其中所有羥基基團已經(jīng)形成硫酸酯。蔗糖八硫酸(SOS)鈉鹽購自Toronto Research Chemicals，Toronto，Canada，p/n S699020。將6克蔗糖八硫酸鈉溶解在16.57ml的去離子水中，得到約2.5N的硫酸鹽基團終濃度。溶液通過離子交換處理，如實施例4所述。然后用純?nèi)野返味ㄗ鳛殡x子交換柱流出物獲得的蔗糖八硫酸溶液，至pH5.7(中和點)，并測定溶液的pH和同滲重摩。所得溶液計算得到的三乙銨濃度為0.643M，pH5.7，同滲重摩為530mmol/kg。殘留鈉的存在用電勢分析法無法檢測到(0.1％以下)。
實施例7.用取代的銨鹽裝載有伊立替康(CPT-11)的脂質(zhì)體制備和在血漿存在下體外藥物釋放。
在本實施例中，硫酸鹽、檸檬酸鹽、焦磷酸鹽、三磷酸鹽和線性聚磷酸鹽(13-18mer)作為陰離子在脂質(zhì)體-包載的取代的銨鹽溶液中被研究。因為磷酸鹽聚合物具有生物可降解性和因為聚磷酸鹽在細胞中天然發(fā)現(xiàn)的緣故，選擇磷酸鹽聚合物，作為其他合成的聚合物陰離子(聚丙烯酸鹽、葡聚糖硫酸鹽和類似物)的對照。還有，低分子量的聚磷酸鹽溶液的粘性比其他聚合物的粘性低，這使得聚磷酸鹽更容易處理。
下面的物質(zhì)被用于制備鹽溶液 1.多磷酸鈉，NaO-[PO3Na]n-Na，n＝13-18，購自Sigma(產(chǎn)品編號P-8510，“磷酸鹽級(phosphate Glass)，實踐級(practical grade)”，也稱為六偏磷酸鈉或商標名CALGON)； 2.三多磷酸五鈉，Na5P3O10，購自Sigma(產(chǎn)品編號T-5883)； 3.十水焦磷酸四鈉，Na4P2O7·10H2O，購自Sigma(產(chǎn)品編號P-9146)。
4.購自Sigma的離子交換樹脂Dowex 50Wx4(4％交聯(lián)的磺酸化聚苯乙烯樹脂，100-200網(wǎng)孔)(產(chǎn)品編號50×4-200)，或購自Sigma的Dowex HCR-W2(8％交聯(lián)的磺酸化聚苯乙烯樹脂50-100網(wǎng)孔)(產(chǎn)品編號I-8880)可交換使用。按下面的傾析順序來洗滌樹脂用去離子水傾析三次，用1N HCl(體積超過樹脂3倍)傾析兩次，用水傾析三次，用1N NaOH傾析兩次，用水傾析三次，用1N HCl傾析三次，用水傾析三次。傾析之后，樹脂是H+形式。
5.三甲胺(TMA)，水溶液40％，購自Aldrich Chemical Co.(產(chǎn)品編號43,326-8)。通過酸滴定建立約5.9N的濃度。
6.三乙胺(TEA)，99％，HPLC級，來自Fisher(產(chǎn)品編號04884)。酸滴定濃度是6.9-7.1N。
通過反滲透、離子交換和有機去除法來純化水，獲得無有機“16-18MOhm”質(zhì)量(organic free“16-18MOhm”quality)。
通過離子交換方法制備焦磷酸鹽、三磷酸鹽和聚磷酸鹽的含水溶液。將多磷酸鈉(3g，于25mL水中)、焦磷酸鹽(4g，于27mL水中)或聚磷酸鹽(6.7g，30mL水中)裝載到含有100mL(床體積)如上制備的離子交換樹脂的柱上。用水洗脫柱，并收集級分。收集顯示酸性pH(pH＜3)的級分。用20mL水稀釋三份0.5mL等分含有磷酸的收集級分，并用0.100N NaOH滴定至pH4.5-5.0的終點(Fisher分析溶液)，來測定當量濃度。離子交換之后富集的級分用三甲胺滴定(以便獲得三甲銨鹽)至pH5.4-5.5。滴定之后，如果必要，稀釋溶液以便三甲銨的最終濃度接近0.5N。
通過用80mL水稀釋1.39mL濃硫酸(17.9M)，并用純?nèi)野坊蚝装吩趐H計控制下將稀釋的溶液滴定至等當點(pH5.1-5.5)，制備三甲銨和三乙銨硫酸鹽。用水將體積調(diào)整到100mL。
通過將獲自Sigma的1.572g一水檸檬酸ACS(產(chǎn)品編號C-1909)溶解在20mL水中，并用含水三甲胺將溶液滴定至等當點，制備三甲銨檸檬酸鹽溶液。用水將體積調(diào)整到25mL。
利用正壓，通過0.2-μm醋酸纖維素過濾器過濾該溶液。使用蒸汽壓滲透壓計和玻璃-甘汞電極pH計分別測量溶液的同滲重摩和pH。酸水解(5min，100℃，3N H2SO4)之后，通過磷鉬酸鹽分光光度分析法(參見實施例70)測定磷酸鹽溶液中陰離子的當量濃度。陰離子當量濃度僅僅考慮在pH5.5充分離子化的酸性官能團。根據(jù)加入的三烷基銨基本組分(base)測定陽離子當量濃度。獲得的溶液具有下述特性(表4) 表4.用于將CPT-11裝載入脂質(zhì)體的取代的銨鹽溶液的特性
膽固醇和DSPC購自Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama，USA。PEG-DSPE(PEG分子量2,000)購自Shearwater Polymers，Huntsville，AL，USA。將重量比為3∶1∶0.1(摩爾比約3∶2∶0.03)的DSPC、膽固醇和PEG-DSPE溶解在氯仿(Fisher；Optima grade，用戊烯穩(wěn)定)中，DSPC的濃度為60mg/mL。以每管30mg DSPC(0.5mL)將溶液分配到Pyrex管中，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃在減壓下緩慢蒸發(fā)。室溫下，真空中(100微米水銀，油泵)將脂膜干燥30-60分鐘。
通過在60℃在上面的含水鹽溶液中溫和搖動，將干燥的脂膜水合15-20分鐘。脂類形成乳白色的懸浮液(多層小泡)。該乳白色懸浮液進行下述5次循環(huán)在干冰和異丙醇(-80℃，3分鐘)的混合物中冷凍，在60℃水浴中解凍3分鐘。然后，使用在60℃加熱的手工操作的往復式擠出機(Avanti Polar Lipids)，將脂類懸浮液擠壓通過二疊層聚碳酸酯膜過濾器(Nucleopore，Whatman，孔徑0.1μm)10次(雙程)。
擠出的脂質(zhì)體保持在60℃中5分鐘，并在冰水(0-4℃)中淬火5分鐘。然后通過在Sephadex G-75上進行凝膠層析，將脂質(zhì)體從形成梯度的鹽溶液分離入裝載緩沖MES-葡萄糖(50g/L葡萄糖ACS、0.975g/L 2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸(MES)和足夠數(shù)量的5M NaOH，使pH至6.4)。脂質(zhì)體出現(xiàn)在孔隙體積部分(柱床體積的30％)。
將每1mg固體含有0.860mg CPT-11基本成分(base)的CPT-11(鹽酸伊立替康)制劑溶解于0.001N HCl，制備16.5mg/mLCPT-11基本成分的貯存液。將該溶液與MES-葡萄糖緩沖液中的脂質(zhì)體混合，獲得每1μmol脂質(zhì)體磷脂含150μgCPT-11的比率?；旌衔镌?5℃水浴中溫育30分鐘，偶爾溫和搖動一下(大約每分鐘一次)，然后在冰水(0-4℃)中迅速冷凍。使用MES-葡萄糖作為洗脫劑，通過在Sephadex G-75上進行凝膠層析，將脂質(zhì)體與未包囊的藥物分離開。包囊的藥物通過分光光度分析法測定(實施例71)，磷脂用抽取分析法(extraction assay)測定(實施例70)。
在50％人血漿存在下，在體外按照如下方法研究藥物從如此獲得的裝載CPT-11的脂質(zhì)體的釋放。冷凍的人供體血漿在37℃解凍，14,500g下離心10分鐘，并過濾通過0.45-μm醋酸纖維素注射過濾器。使裝載有CPT-11的脂質(zhì)體制劑通過0.2-μm無表面活性劑的醋酸纖維素(SFCA)無菌注射過濾器進行過濾。將0.5-mL的脂質(zhì)體與0.5mL血漿在無菌1.5-mL共聚物Eppendorf管中混合，密封，并在搖擺平臺上37℃中溫育24小時?？瞻讟悠泛?.5mL無菌MES-葡萄糖以替代脂質(zhì)體。使用144mM NaCl，5mM HEPES-Na，pH7.4緩沖液(HBS-5)，在珠狀交聯(lián)的2％瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-2B，Pharmacia；10mL床體積)上，通過凝膠層析分離脂質(zhì)體。脂質(zhì)體出現(xiàn)在孔隙體積部分中，而血漿蛋白和釋放的藥物(如果有)則保留在凝膠中。分析脂質(zhì)體餾分中的CPT-11和磷脂，并測定藥物/磷脂比率(輸出比)。含脂質(zhì)體樣品的讀數(shù)減去空白樣品(僅血漿)的讀數(shù)。通過輸出藥物/脂類比率除以輸入藥物/脂類比率(與血漿溫育之前的藥物/脂類比率)，測定溫育之后保留在脂質(zhì)體中的藥物百分比。表5概括了裝載和釋放的數(shù)據(jù)。
表5.CPT-11裝載入含有叔烷基銨鹽的脂質(zhì)體中，并在人血漿存在下的藥物體外釋放情況 實施例8.使用焦磷酸鹽、三磷酸鹽、聚磷酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽三烷基銨鹽裝載CPT-11的脂質(zhì)體的體內(nèi)穩(wěn)定性
盡管喜樹堿脂質(zhì)體可以在體外血漿中顯示出可接收的藥物滲漏現(xiàn)象，在體內(nèi)血液循環(huán)中藥物可能更快地滲漏出來。因此，在小鼠中使用單時間點分析方法，篩選一組CPT-11脂質(zhì)體制劑，分析體內(nèi)血液循環(huán)中的藥物穩(wěn)定性。
如實施例6所描述地，制備脂質(zhì)體并裝載CPT-11，有如下改動。代替使用Shearwater Polymers的PEG-DSPE，我們使用Avanti Polar Lipids的相似的PEG-DSPE。為了能對血液/組織樣品中的脂質(zhì)體脂類基質(zhì)進行定量，以0.25mCi/mmol磷脂的數(shù)量，將非可交換的放射性標記[3H]-膽甾醇十六烷基醚([3H]-CHE；(Amersham，USA))加入到脂類的氯仿溶液中。以12mg DSPC/管將脂溶液分配入Pyrex管，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)/真空干燥形成脂膜。脂膜在0.7mL形成梯度的取代的銨鹽溶液中水合。含有包載的含磷酸鹽的鹽的脂質(zhì)體中脂濃度通過放射性閃爍計數(shù)法測定。也測定無包載的含磷酸鹽的鹽的制劑中的磷脂，不進行萃取，如實施例70所述，并用作脂放射性標準。將制備用于裝載的脂質(zhì)體-藥物混合物部分收集起來并進行分析，以在裝載之前確定加入的CPT-11與脂質(zhì)體脂類的裝載前比率(“輸入比率”)。使用高斯模型，通過準彈性光散射法(QELS)測定體積平均值和脂質(zhì)體大小分布的標準偏差。表6概括了這些脂質(zhì)體的特性。
表6.用于體內(nèi)穩(wěn)定性研究的裝載CPT-11的[3H]-CHE標記的脂質(zhì)體的特征
六周齡的雌性CD-1小鼠(Charles River)以10mg/kg(0.2mg CPT-11/小鼠)的劑量通過尾靜脈注射這些脂質(zhì)體CPT-11制劑兩次。八小時之后，麻醉小鼠并通過開放性心臟穿刺放血。將血液收集到肝素化的注射器中(10-20μl，1000U/ml肝素USP)，并轉(zhuǎn)移入稱重的管中，并放置在冰中，其中該管含有0.4ml磷酸鹽緩沖液生理鹽水溶液(PBS)，該溶液中含有0.04％EDTA(Gibco BRL)。對管稱重以測定血液樣品的重量，通過在9,000g離心5分鐘分離血細胞，收集含有PBS-稀釋的血漿的上清液，用于藥物和脂質(zhì)體脂類分析。通過熒光分析法對CPT-11定量(實施例71)。通過淬火-校正放射性閃爍計數(shù)法對脂質(zhì)體脂類定量。與血漿樣品平行，對脂質(zhì)體和磷脂-放射性標準進行計數(shù)。通過血漿樣品中藥物/放射性比率除以注射的脂質(zhì)體的藥物/放射性比率，來計算保持包囊的藥物的百分比。由于游離CPT-11快速從血液中消除(參見實施例69)以及已知的[3H]-CHE對脂交換的穩(wěn)定性，試驗的讀數(shù)被認為指示了脂質(zhì)體CPT-11和脂類的血液含量。假設(shè)100％注射的藥丸進入循環(huán)；血液體積為小鼠體重的6.3％；血細胞比容45％，計算保持在循環(huán)中的注射的脂類劑量的百分比(％I.D.)。表7概述了這些結(jié)果。
表7.注射后單點時刻(8小時)小鼠中CPT-11包囊的體內(nèi)穩(wěn)定性和裝載CPT-11的脂質(zhì)體的循環(huán)壽命。％I.D.，注射劑量的％。
所有制劑顯示8小時后體內(nèi)血液中藥物包囊水平為注射前水平的70-80％，而含有聚磷酸鹽的脂質(zhì)體最穩(wěn)定(藥物包囊保持在約100％)。
實施例9.用三乙銨多磷酸鹽制備的CPT-11脂質(zhì)體的血液藥物動力學。
按照實施例3描述的方法制備使用三乙銨多磷酸鹽的脂質(zhì)體CPT-11制劑。脂類——DSPC、膽固醇和N-(甲氧基-聚(乙二醇)(分子量2000)-氧羰基)-DSPE(PEG-DSPE)(都來自Avanti Polar Lipids，Inc.)——作為干粉末以3∶2∶0.015摩爾比混合，并于62-65℃溶解在100％乙醇(USP級，大約0.15mL/100mg脂類)中。為了進行藥物動力學研究，以0.5mCi/mmol磷脂的數(shù)量，將3H-膽甾醇十六烷基醚([3H]-CHE，獲自Amersham Pharmacia)作為非可交換的放射性標記加入到脂類中。按照實施例4中的方法制備TEA-Pn(0.5M三乙銨，pH5.7-6.2)的含水溶液。將TEA-Pn溶液(10倍于加入的乙醇的體積)與脂類溶液在60-65℃混合，并在該溫度進行攪拌，直到形成均質(zhì)的乳白色多層囊。使用氬壓力擠出機(LipexBiomembranes)在60-65℃下，使懸浮液擠壓通過100nm孔徑的2疊層聚碳酸酯徑跡蝕刻過濾器(Coming Nuclepore)15次，所得的單層脂質(zhì)體迅速在冰上冷凍，然后放置在環(huán)境溫度下。通過在Sepharose CL-4B柱上進行凝膠層析，用MES-葡萄糖緩沖液(5mM MES、50g/L葡萄糖，pH用NaOH調(diào)節(jié)到6.5)洗脫，去除乙醇和未摻入的聚磷酸鹽。
將含有于水中的20mg/mL伊立替康基本成分的CPT-11(鹽酸伊立替康)貯存液以150-200mg/mmol磷脂的藥物/脂類比加入到脂質(zhì)體，混合物在60-62℃溫育45-60分鐘，偶爾攪拌一下。迅速冷卻溫育混合物，并在0℃溫育10分鐘，然后可以達到環(huán)境溫度。加入1/20體積的2.88M NaCl以調(diào)整生理離子強度，并提高膜-結(jié)合的CPT-11(相對于包囊在脂質(zhì)體內(nèi)部的藥物)的去除結(jié)果。通過在SephadexG-25或G-75柱(Amersham Pharmacia)進行凝膠層析，用HBS-6.5緩沖液(5mM2-(4-(2-羥乙基)-哌嗪)-乙基磺酸(HEPES)，144mM NaCl，pH6.5)洗脫，去除未包囊的藥物。合并在孔隙體積中洗脫的脂質(zhì)體級分，通過0.2微米過濾進行滅菌，并保存在4-6℃，直到使用。用脂類濃度、藥物濃度和顆粒大小對脂質(zhì)體表征，如實施例7所述。脂質(zhì)體的平均大小為108nm，CPT-11含量為每mmol磷脂139±18mgCPT-11基本成分。
體內(nèi)脂質(zhì)體脂類和脂質(zhì)體藥物在血液中的壽命以及藥物從脂質(zhì)體釋放的特征，在具有留置的中心靜脈插管的雌性Sprague-Dawley大鼠(190-210g)中進行研究。大鼠注射以0.2-0.3mL 3H-CHE-標記的伊立替康脂質(zhì)體(0.05mmol磷脂，或每kg體重為7-8mg CPT-11)丸劑。注射后使用經(jīng)肝素處理的注射器在各時間點獲取血樣(0.2-0.3mL)。提取的血液體積補充以磷酸鹽緩沖生理鹽水。血液樣品用0.3ml含有0.04％EDTA的冰冷PBS稀釋，稱重，通過離心分離血細胞。收集上清流體，用實施例71的熒光測定程序分析CPT-11，用常規(guī)方法通過閃爍放射性計數(shù)法分析脂質(zhì)體脂類標記。具有已知的藥物和3H-CHE-脂類濃度的脂質(zhì)體制劑用作標準。放射性標準含有相等數(shù)量的稀釋的大鼠血漿，以說明淬火效果。假設(shè)以ml計的血液體積是以克計的體重的6.5％，血細胞比容為40％，計算血液中CPT-11和脂質(zhì)體脂類的數(shù)量。血液中脂類和藥物的總數(shù)用注射劑量的％(％I.D.，％ID)表示，并針對注射后時間作圖。通過血液樣品中的藥物/脂類比率除以注射脂質(zhì)體的藥物/脂類比率(取100％)，計算保留在脂質(zhì)體中藥物的百分比。因為這些圖總體上顯示與單指數(shù)動力學(在半對數(shù)比例尺上是線性的)具有良好的一致性，使用MicrosoftEXCEL計算機程序(Microsoft Corp.，USA)的TREND選項，藥物、脂類的血液半衰期和藥物從脂質(zhì)體釋放的半衰期由數(shù)據(jù)與單指數(shù)衰變方程最佳擬合計算而得。結(jié)果顯示在圖1中。由最擬合參數(shù)得知，脂類和藥物的血液半衰期分別是16.4小時和6.61小時。這些條件下，游離的CPT-11迅速從循環(huán)中清除掉(參見實施例69)。
血液藥物/脂類比率顯示了CPT-11從脂質(zhì)體釋放的兩階段特征(圖2)。在第一個24小時，藥物釋放與時間是線性關(guān)系(R＝0.992)，這證明是零階釋放動力學。在24小時的時間點，約75％的藥物被釋放出來，進一步的釋放變?yōu)榉蔷€性的。在24小時里，脂質(zhì)體以每小時約起始載量的3.6％的恒定速率釋放藥物。因此，在近似14個小時的階段里，50％的藥物被釋放出來。在緩釋制劑中，藥物的零階釋放是吸引人的特性，這是因為藥物釋放速度隨時間保持恒定。
實施例10.在裸鼠中，用三乙銨多磷酸鹽制備的CPT-11脂質(zhì)體對乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效
CPT-11脂質(zhì)體的抗腫瘤功效在人乳腺癌BT-474模型中進行研究，人乳腺癌BT-474是過量表達C-ErbB2(HER2)受體的雌激素-依賴性導管腺癌。BT-474細胞獲自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。具有較高腫瘤生長速度的BT-474亞系由按下面描述的方法培養(yǎng)的快速生長異種移植物腫瘤節(jié)構(gòu)建而得。在T-150瓶中，細胞在含有10％胎牛血清、0.1mg/mL硫酸鏈霉素和100U/ml青霉素G的RPMI-1460培養(yǎng)基中體外增殖，每周以1∶3分裂。NCR nu/nu雌性小鼠(4-6周齡，Taconic Farms)皮下植入60天持續(xù)釋放的0.72-mg 17β-雌二醇小藥丸(Innovative Research of America，Inc.)，兩天后在上背區(qū)域皮下接種0.1mL含有于細胞生長培養(yǎng)基中的2×107 BT-474細胞的懸浮液。每周2次，通過觸診和測徑器測量腫瘤的最大(長度)和最小(寬度)軸來監(jiān)控腫瘤進展。使用下面的公式，通過測徑器測量數(shù)據(jù)，每周確定腫瘤大小兩次(Geran，R.I.，et al.，1972 CancerChemother.Rep.31-88) 腫瘤體積＝[(長)×(寬)2]/2
在接種后第13天，腫瘤達到200mm3的平均大小，并將動物隨機分配入三個組，每組13-15只動物。
如實施例8制備脂質(zhì)體CPT-11(藥物/磷脂比率192mg/mmol；平均脂質(zhì)體大小86.8nm)。用MES-葡萄糖載體將游離CPT-11和脂質(zhì)體CPT-11稀釋至5mg/ml的CPT-11基本成分。在腫瘤接種后第14、18、21和25天，動物通過尾靜脈注射游離CPT-11、脂質(zhì)體CPT-11或僅僅注射載體。含藥物的制劑以每次注射50mgCPT-11/kg的劑量給予，這是有關(guān)嚙齒動物腫瘤模型中進行CPT-11研究的文獻中報道的劑量的平均值。
為了評價與治療相關(guān)的毒性，也對動物每周兩次稱重。進行觀察直到接種后60天結(jié)束，在這時雌激素補充小藥丸被耗盡。將各個組的平均腫瘤體積對時間一起作圖并進行比較。如圖3所示，盡管游離CPT-11減慢腫瘤生長速度，但在接受脂質(zhì)體治療的組中腫瘤顯著消退。當在第36天對照組中腫瘤達到所允許的最大尺寸——平均3,500mm3，以及在第46天，在用游離藥物治療的組中，腫瘤平均約1,000mm3，而在同一時刻，在脂質(zhì)體治療的組中沒有動物具有可觸診的腫瘤。
用動物體重動力學來評價與治療相關(guān)的毒性(圖4)。沒有哪個組顯示出任何明顯的毒性。對照組動物的重量始終在增加。在最后治療日，接受脂質(zhì)體CPT-11的動物的平均體重微微減少約3.3％。然而該腫瘤減輕得到逆轉(zhuǎn)，并且所述動物達到它們期望的重量。與治療前重量相比，通過Student′s t-試驗，該平均體重的減少在統(tǒng)計學上并不顯著(p＝0.274)。因此，所有治療是可以忍受的，沒有顯著毒性。
因此，通過預先包載聚陰離子的生物可降解聚合物(聚磷酸鹽)的位阻取代銨鹽(三乙銨)的藥物裝載而獲得的CPT-11脂質(zhì)體制劑，在研究的腫瘤模型中顯示出延長的血液壽命期、緩釋特征和增加的抗腫瘤活性，而毒性上并無可測量的增加。
實施例11.對用預先包載的三乙銨鹽制備的裝載CPT-11的脂質(zhì)體的比較性評價脂質(zhì)體大小的影響、藥物/脂類比率、預先包載的陰離子的特性。
制備兩種裝載CPT-11的脂質(zhì)體的原型制劑，一種用具有預先包載的TEA-Pn的脂質(zhì)體，另一種用具有預先包載的TEA-SOS的脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體的制備包括下述生產(chǎn)步驟
1)通過在乙醇中共溶混合脂類。脂類基質(zhì)組合物由下述物質(zhì)組成1，2-二硬脂酰-SN-磷脂酰膽堿(DSPC)(分子量790)，3摩爾份(59.8摩爾％)；膽固醇(Chol)(分子量387)，2摩爾份(39.9摩爾％)；和N-(ω-甲氧基-聚(乙二醇)-氧羰基)-1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(分子量2787)(PEG-DSPE)，0.015摩爾份(約0.3摩爾％)。DSPC和PEG-DSPE購自Avanti Polar Lipids，Birmingham，Alabama。膽固醇(最高純度級)購自Calbiochem。在硼硅酸鹽玻璃容器中以±0.1mg的精度稱量干脂類，并以適合于下面的脂類分散步驟的比率與無水乙醇混合。因為DSPC具有高轉(zhuǎn)變穩(wěn)定(55℃)，通常在55-60℃下進行溶解，直到獲得澄清溶液。
2)制備TEA-Pn和TEA-SOS溶液。多磷酸鈉(n＝13-18)來自Sigma ChemicalCo.，p/n P8510。蔗糖八硫酸鈉購自Toronto Research Chemicals，Toronto，Canada，p/nS699020。稱取鹽，并溶解在水中，得到1.2-2.5N溶液。使用H+-形式的陰離子交換劑Dowex 50Wx8-200或Dowex HCR-W2(獲自Sigma)，將鈉鹽轉(zhuǎn)化為游離酸。在首次使用之前，樹脂如下洗滌用3體積的下述溶液攪拌，然后進行傾析(1)1.0-1.2M含水HCl2次；(2)水2次；(3)1.0-1.2M含水NaOH2次；(4)水2次；(5)1.0-1.2M含水HCL2次。將于水中的洗滌過的樹脂的懸浮液在重力流的作用下填充在合適的尺寸層析柱中，使每mL鈉鹽溶液至少具有8mL填充的樹脂。通過2柱體積的3.0-3.6M含水HCL，之后5柱體積的水或直到洗出液的傳導率低于1μS，進一步平衡樹脂。使用之后，通過順序通過下述物質(zhì)使柱再生，1.-1.2MHCl——3柱體積；3.0-3.6M HCl——2柱體積；水——至少5柱體積，或直到洗出液的傳導率低于1μS，并于室溫中保存在0.2μm過濾的水中。將Pn和SOS鈉鹽溶液施用于柱瀝干的表面上(每4ml填充的樹脂體積約1ml)，并在重力作用下以約1-2ml/min的速度流動，這是對于75-150mL的樹脂床尺寸而言。柱用水洗脫。測試洗出液的傳導率。收集具有10mS或更高傳導率的級分。如果需要更高濃度的多酸溶液，可以在20-50mS時開始收集，其代價是形成梯度的鹽喪失稍微較多。在多磷酸的情況下，收集的溶液保持冷凍(0-4℃)直到胺滴定步驟，這是因為在低pH時磷酸二酯鍵具有水解不穩(wěn)定性。收集的洗出液的pH將小于0.7(典型地約0.4)，傳導率約120-200mS。任選地，因為在低pH下聚磷酸鹽穩(wěn)定性的緣故，無延遲地進行胺滴定步驟。將來自Fisher，p/n 04884的HPLC-級三乙胺(99.5+％的純度)用于滴定由離子交換獲得的酸溶液。通過電位滴定分析測定純TEA的當量濃度。將0.100-mL等分TEA(0.100ml)加入20ml水中，三次。用0.1N HCl標準溶液滴定這些等分試樣，至5.5-6.0的pH終點(玻璃電極)。計算得到的當量濃度(7.07N)接近于理論值7.17N。測量的多磷酸(Pn)或蔗糖八硫酸(SOS)溶液的體積用純TEA在pH(玻璃)電極的控制下滴定。需要充分攪拌來分散胺。滴定終點是pH5.6-6.2。準確記錄加入的TEA的體積。測量滴定的溶液的體積，根據(jù)加入的TEA的體積和當量濃度計算TEA的濃度。如果必要，加入水來調(diào)節(jié)TEA濃度至所需的0.55±0.05N或0.65±0.03N，如下所示。使用鈉選擇性玻璃電極(Coming)，通過電勢分析法測定在所得到的TEA-Pn或TEA-SOS溶液中殘留鈉的量。用19mL水稀釋1mL溶液，并根據(jù)電極制造商的使用手冊，使用增量法測定鈉濃度。殘留鈉的量為1mM以下，典型地在0.5mM以下。使用正壓進料，使獲得的TEA-Pn或TEA-SOS溶液通過0.2μm醋酸纖維素無菌過濾器。測量并記錄溶液的最終pH和同滲重摩。我們使用pH甘汞微組合全玻璃電極測量pH，使用蒸汽壓/露點滲壓機測量同滲重摩。溶液被冷凍保存直到使用。
3).通過將脂類的乙醇溶液與梯度形成緩沖液混合，在梯度形成緩沖液中制備脂類分散液。用乙醇混合方法將脂類分散在形成梯度的鹽溶液中。所有步驟在60-65℃中進行。在耐化學性玻璃梨形瓶或管中，在約0.5-0.6M DSPC的濃度下，將脂類溶解在100％乙醇USP中。將形成梯度的鹽溶液(TEA-Pn或TEA-SOS)預加溫到60-65℃，并立即加入到乙醇脂溶液中，并通過旋轉(zhuǎn)和/或漩渦充分混合各成分。乙醇的最終量為約10體積％。對于磷脂超過0.1mmol級別的制劑，將所得的懸浮液于60-65℃置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，通過旋轉(zhuǎn)抽真空，直到乙醇停止產(chǎn)生，這以泡沫形成終止而示出。對于磷脂為0.1mmol或0.1mmol以下級別的制劑，在該步驟乙醇不從脂類分散液去除。所得脂類分散液保持在60-65℃，并立即用于擠出步驟。
4).脂類分散液連續(xù)擠壓通過孔徑確定的膜。對于體積達1mL的脂類懸浮液，我們使用手工操作的反復式擠出機，其由Avanti Polar Lipids提供。該擠出機安裝19mm徑跡蝕刻過濾膜，并根據(jù)金屬加熱模塊恒溫調(diào)節(jié)溫度。對于1至10mL的體積，我們使用恒溫的、氣壓操作的、單向流動擠出機，該擠出機來自LipexBiomembranes。該擠出機安裝25mm過濾膜。如果合適，使用手工進料或氬氣壓力，在60-65℃反復擠壓脂類懸浮液通過一系列2疊層聚碳酸酯膜過濾器(來自Corning-Nuclepore and Osmonics Corp.的過濾器同樣適合)，該膜過濾器具有100nm、80nm或50nm的公稱孔徑。當對脂質(zhì)體大小的效應感興趣時，擠壓在100nm、80nm或50nm步驟停止。對于每次試驗，所使用的過濾器的準確類型和擠壓次數(shù)表示如下。所擠出的脂質(zhì)體保持在60-65℃約15分鐘，并在冰浴中迅速冷卻到2-4℃。冰浴中約15分鐘之后，脂質(zhì)體允許達到室溫。
5).脂質(zhì)體外的梯度形成緩沖液的去除以及脂質(zhì)體向藥物裝載緩沖液的轉(zhuǎn)移。去除未包囊的梯度形成鹽，并使用尺寸排阻層析(SEC)將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移入藥物裝載緩沖液。其他可放大步驟的切線流過濾(Tangential flow filtration)、中空纖維透析(hollow fiber dialysis)可以用于放大生產(chǎn)(scale-up manufacture)。通過用陰離子交換樹脂(例如Dowex-1或Dowex-2季銨交聯(lián)聚苯乙烯珠)處理脂質(zhì)體以確保完全去除脂質(zhì)體外的聚陰離子是有利的。藥物裝載緩沖液含有50g/L無水葡萄糖USP和5mM水中的組織培養(yǎng)級(tissue culture certified)HEPES，并用NaOH將該緩沖液調(diào)節(jié)至pH6.5。該緩沖液被真空過濾通過0.2微米尼龍過濾器(Whatman)。擠出的脂質(zhì)體在Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上層析，并用該藥物裝載緩沖液洗脫。脂質(zhì)體出現(xiàn)在孔隙體積部分，并根據(jù)洗出液濁度以約2倍的所施用體積收集。根據(jù)實施例70，測定洗脫的脂質(zhì)體的磷脂濃度，通過QELS測定顆粒大小，并保存在4-6℃。
6)脂質(zhì)體與藥物溫育。在與脂質(zhì)體混合之前一刻，通過將鹽酸伊立替康溶解在水中以獲得20mg/mL藥物基本成分的濃度而制備CPT-11(鹽酸伊立替康)貯存液。溶液的pH在4.0至5.0之間。使用正壓使藥物溶液過濾通過0.2微米聚醚砜(PES)無菌過濾器。將上面步驟5中產(chǎn)生的藥物裝載緩沖液中的等分脂質(zhì)體在室溫中與貯存的伊立替康溶液混合，獲得每摩爾脂質(zhì)體磷脂0.15-0.55g藥物范圍內(nèi)的藥物/脂類輸入比。如果合適，將特定的輸入藥物/脂類比率表示于下。用1M NaOH將混合物的pH調(diào)節(jié)到6.5，玻璃瓶中的混合物在58-62℃恒溫水浴中溫育30-45min，同時緩慢攪拌，在冰浴(0-2℃)中迅速冷卻，并在該溫度放置15分鐘。然后將脂質(zhì)體加溫到室溫，用于下一步驟(去除未包囊的藥物并轉(zhuǎn)移入保存緩沖液)。在所研究的藥物/脂類比率的全部范圍內(nèi)，該步驟產(chǎn)生95％以上、典型地98-100％的包囊效率。
7).去除未包囊的CPT-11，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到保存緩沖液，最終過濾并保存。去除未包囊的藥物，利用尺寸排阻層析將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移入保存緩沖液。保存緩沖液含有于水中的20mM HEPES、135mM NaCl，pH6.5(用NaOH調(diào)節(jié))，在使用之前0.2-微米真空過濾?；旧习凑丈厦娌襟E2中描述的方法在Sephadex G-75(Amersham Pharmacia Biotech)上進行凝膠層析。測定從柱(孔隙體積部分)洗脫得到的CPT-11脂質(zhì)體的脂質(zhì)體磷脂和CPT-11(通過分光光度法，參見實施例70和71)，并通過QELS測定體積加權(quán)平均顆粒尺寸。如果必要，將藥物濃度調(diào)整到2.0-4.0mg/mL范圍內(nèi)。將脂質(zhì)體過濾通過0.2微米聚醚砜無菌過濾器，并在無菌條件下分配入無菌聚苯乙烯瓶(Corning Cryo-Vials)或PTFE襯里的螺紋帽(PTFE-linedscrew-cap)硼硅酸鹽4-mL玻璃瓶中，至瓶體積的大約70-80％。無菌條件下封閉瓶(空氣中)，作標記，并保存在4-6℃。
實施例12.藥物/脂類比率對藥物裝載效率和含TEA-Pn的脂質(zhì)體的體外藥物保持效果的影響。
根據(jù)實施例11的程序，制備含有包載的0.65N含水TEA-Pn溶液，pH6.1，同滲重摩531mmol/kg的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體分散液被10次擠壓通過二疊層100nm孔徑聚碳酸酯過濾器。脂質(zhì)體脂類基質(zhì)液還包含0.5mCi/mmol磷脂的[3H]-CHE。裝載藥物之前的脂質(zhì)體大小為98.5±34.3nm。脂質(zhì)體以200、300、400和500mgCPT-11/mmol磷脂的初始藥物-磷脂比率裝載。分別根據(jù)實施例71的分光光度法和根據(jù)實施例72的磷脂擠壓-消化-藍色(extraction-digestion-blue)磷鉬酸鹽分析方法測定脂質(zhì)體中藥物和磷脂的量。
為了評體內(nèi)藥物釋放速度，進行實施例8的方法。以5mg CPT-11/kg的劑量，將脂質(zhì)體通過尾靜脈注射入6周齡雌性Swiss Webster小鼠(體重18-22g)。在注射后8小時和24小時，麻醉3組小鼠，并通過開口心臟穿刺放血。將血液與0.4mL于PBS中的冰冷的0.04％EDTA混合，通過離心分離血細胞，通過實施例71中描述的熒光光度法測量CPT-11的血漿濃度。通過使用淬火-校正液體閃爍計數(shù)法測量[3H]-CHE的數(shù)量來測定脂類，并通過將測定的藥物/脂類比率除以注射的脂質(zhì)體中的藥物/脂類比率，計算保留在脂質(zhì)體中的藥物的量。因為游離CPT-11具有快速的血液清除特性，導致低血液水平，我們假設(shè)所有被測定的藥物是脂質(zhì)體形式的藥物。
結(jié)果呈現(xiàn)在表8中。各組藥物保留之間的差異在統(tǒng)計學上并不顯著。作為這些研究的結(jié)果，我們得出的結(jié)論是，將藥物裝載增加至500mg/mmol將不會不利地影響藥物裝載或體內(nèi)穩(wěn)定性。該比率被用于進一步的研究。
表8.藥物/脂類比率對伊立替康TEA-Pn脂質(zhì)體中藥物裝載和體內(nèi)藥物保留的影響(平均值±標準偏差)。
實施例13.CPT-11裝載入含TEA-SOS的脂質(zhì)體的藥物裝載效率脂質(zhì)體大小的影響和小鼠體內(nèi)藥物保留
如實施例11所述，使用具有0.643N TEA-SOS、pH5.7和530mmol/kg的同滲重摩的梯度形成溶液制備含有包載的溶液的脂質(zhì)體。使脂類分散液10次擠壓通過孔徑為50nm、80nm或100nm的二疊層聚碳酸酯過濾器。脂質(zhì)體脂類基質(zhì)液以1.5mCi/mmol脂質(zhì)體磷脂的濃度包括[3H]-CHE。通過動態(tài)光分散(dynamiclight scattering)測定脂質(zhì)體大小。脂質(zhì)體以大約550mg伊立替康/mmol磷脂的初始藥物-磷脂比率裝載CPT-11。通過QELS測定裝載藥物的脂質(zhì)體的大小，并如實施例70和71中描述地進行測定。
雌性Swiss Webster小鼠(8-10周，平均27-30克)通過尾靜脈以10mg/kg的藥物劑量注射這些CPT-11脂質(zhì)體制劑。24小時之后處死小鼠，收集血液，并分析CPT-11和脂質(zhì)體脂類，如實施例11所述。這些結(jié)果概述于表9中。
表9.TEA-SOS脂質(zhì)體中的伊立替康裝載和體內(nèi)藥物保留
令人驚奇地，與具有聚陰離子聚合物(聚磷酸鹽)的相似的脂質(zhì)體相比，具有八硫酸蔗糖的三乙銨鹽——非聚合的聚陰離子化的有機羥基化的有機化合物(糖)——的脂質(zhì)體，提供了明顯更好的(4-5倍)藥物在脂質(zhì)體中的體內(nèi)藥物保留效果。
實施例14.裝載CPT-11的SOS-TEA脂質(zhì)體在大鼠內(nèi)的血液藥物動力學
如實施例12中所述的方法制備脂質(zhì)體(100nm擠出膜孔徑)。以10mgCPT-11/kg(17.6μmol磷脂/kg)的劑量，將脂質(zhì)體經(jīng)靜脈內(nèi)給予兩只9周齡的具有留置的中心靜脈插管的雌性Sprague Dawley大鼠(Harlan)(體重約200g)。在規(guī)定的時間點獲取血液樣品，并分析藥物和脂質(zhì)體脂類的含量，如實施例9所述。數(shù)據(jù)用％注射的脂類劑量/ml血漿以及在每一時間點時保留在脂質(zhì)體中的藥物的％來表示，對注射后的時間作圖，并通過與單指數(shù)動態(tài)模型的最佳擬合計算脂質(zhì)體的半衰期以及藥物從脂質(zhì)體釋放的藥物釋放半衰期(圖5)。由裝載CPT-11的TEA-SOS脂質(zhì)體釋放的藥物釋放半衰期是56.8小時，大大長于相似的TEA-Pn脂質(zhì)體的半衰期。
實施例15.游離CPT-11、包囊入含TEA-Pn和TEA-SOS的脂質(zhì)體的CPT-11在具有人結(jié)腸癌(HT-29)皮下異種移植物的無胸腺裸鼠中的抗腫瘤活性。
如實施例11所述，使用TEA-Pn溶液或TEA-SOS溶液制備脂質(zhì)體，其中TEA-Pn溶液含有0.65M TEA，pH6.1和同滲重摩53lmmol/kg，TEA-SOS溶液含有0.643M TEA，pH5.7和同滲重摩530mmol/kg。擠出步驟包括10次通過孔徑為100nm的二疊層聚碳酸酯膜。所得的TEA-Pn和TEA-SOS 1脂質(zhì)體的大小分別為112.3±15.5nm和120.5+42.5(平均值±大小分布的SD)。脂質(zhì)體以500mg/mmol的輸入藥物/磷脂比率裝載CPT-11。對于TEA-Pn和TEA-SOS制劑，所得的脂質(zhì)體的藥物含量分別為465.6±26.5(93％裝載效率)CPT-11/mmol磷脂和499.9±22.5mg(100％裝載效率)CPT-11/mmol磷脂。
HT-29細胞獲自American Type Culture Collection，Rockville，MD，并根據(jù)供應者的建議，在37℃、5％CO2中，在補充有10％胎牛血清、50U/ml青霉素G和50μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中增殖。NCR nu/nu同型無胸腺雄性裸鼠(6周齡，體重至少16g)獲自Charles River。小鼠右腹皮下接種0.1mL含有懸浮于無抗生素生長培養(yǎng)基中的5×106細胞的懸浮液。11天后，根據(jù)下述方法將腫瘤大小在150mm3至350mm3之間的動物分配入治療組中。根據(jù)腫瘤大小對動物進行排列，并依據(jù)遞減的腫瘤大小分成6類別。通過從每一大小類別中隨機選擇一只動物，組成每組11只動物的6個治療組，這樣在每一治療組中相同地代表了所有的腫瘤大小。從第13天開始，每隔4天動物4次通過尾靜脈注射下述制劑1)對照(HEPES-緩沖鹽水pH6.5)；2)游離CPT-1150mg/kg，以非緩沖生理鹽水中的新鮮制備的5mg/mL溶液給藥；3)TEA-Pn脂質(zhì)體CPT-11，每次注射25mg/kg；4)TEA-Pn脂質(zhì)體CPT-11，每次注射50mg/kg；5)TEA-SOS脂質(zhì)體CPT-11，每次注射25mg/kg；6)TEA-SOS脂質(zhì)體CPT-11，每次注射50mg/kg。如實施例10所述，每周兩次監(jiān)控動物體重和腫瘤大小。動物稱得的重量減去腫瘤重量得到動物體重。腫瘤接種之后對動物觀察60天。當某組中腫瘤達到小鼠體重的20％時，對該組中的動物實施安樂死。在一些組中，腫瘤完全消退，并在研究結(jié)束時并無腫瘤再生長的跡象。收集這些動物中腫瘤接種位置處的組織，并進行保存以用于對殘留的腫瘤細胞進行病理學分析。
該研究的結(jié)果顯示在圖6和7中。游離CPT-11對腫瘤生長僅具有微小的效應。所有脂質(zhì)體都具有導致腫瘤消退的顯著的效應，之后在大部分動物中重新生長。在TEA-Pn和TEA-SOS CPT-11脂質(zhì)體中，50mg/kg的劑量都比25mg/kg劑量更有效。由腫瘤大小數(shù)據(jù)(圖7)計算得到的平均腫瘤大小加倍時間是對照——4.2天；游離藥物，50mg/kg——4.8天；TEA-Pn脂質(zhì)體藥物，25mg/mg——43.6天；TEA-Pn脂質(zhì)體藥物，50mg/kg——47.5天；TEA-SOS脂質(zhì)體藥物，25mg/kg——48.2天；和TEA-SOS脂質(zhì)體藥物，50mg/kg——超過56天(在第56天時腫瘤大小未加倍時間)。因此，在相同劑量和時間表下，根據(jù)本發(fā)明制備的脂質(zhì)體CPT-11比游離藥物的活性高至少10倍。出乎意料地，以相同劑量給藥時，TEA-SOS CPT-11脂質(zhì)體在減少腫瘤生長上比TEA-Pn CPT-11脂質(zhì)體明顯更為有效。而在用游離藥物和TES-Pn脂質(zhì)體藥物以每注射50mg/kg治療的組中，所有動物都出現(xiàn)腫瘤再生長現(xiàn)象；在接受25mg/kg每一脂質(zhì)體的組中，在研究結(jié)束時有一只動物(9.1％)無腫瘤；以及在接受50mg/kgTEA-SOS脂質(zhì)體CPT-11制劑的組中，在研究結(jié)束時有4只動物(36.4％)無腫瘤，也無再生長的跡象。
藥物出現(xiàn)某些毒性。接受游離CPT-11，但不接受脂質(zhì)體CPT-11的動物在藥物注射之后經(jīng)歷短暫的病態(tài)約1小時(喪失機敏性、駝背、皮膚起皺、活動能力減弱)。接受游離CPT-11的動物在治療期間經(jīng)受永久性的體重減輕，減輕約6％，并且沒有恢復。接受兩種脂質(zhì)體CPT-11制劑的動物在第二和第三次注射之間的期間經(jīng)歷短暫的重量減輕，平均重量減輕為治療前值的約5％(25mg/kg下)或約9％(50mg/kg下)，并最終獲得正常的重量。因此，脂質(zhì)體藥物的毒性不超過游離(非脂質(zhì)體)藥物的毒性，而脂質(zhì)體藥物的功效則高許多。當藥物治療結(jié)束時，重量減輕得到逆轉(zhuǎn)，并且所有動物恢復了它們的重量，未出現(xiàn)最終病態(tài)或毒性死亡現(xiàn)象。之后，隨同腫瘤消退，動物重量增加。在鹽水對照組中，發(fā)展有較大腫瘤的動物由于腫瘤-相關(guān)病態(tài)的緣故重量明顯減輕?？偟膩碚f，藥物被裝載入具有預先包載的聚陰離子化糖(八硫酸蔗糖)的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體藥物組合物，證明是最有效的，而毒性低于非脂質(zhì)體藥物。
實施例16.小鼠中游離和脂質(zhì)體CPT-11的毒性
通過在對正常(具免疫活性)小鼠單次靜脈注射后測定最大耐受劑量(MTD)，比較游離CPT-11和根據(jù)本發(fā)明制備的脂質(zhì)體包囊的CPT-11的急性毒性。
使用下述物質(zhì)
1)CPT-11(鹽酸伊立替康)制劑，經(jīng)HPLC分析具有98.9％鹽酸伊立替康，水分為7.6％。在該研究中，根據(jù)“原態(tài)”基礎(chǔ)(“as is”basis)，制備藥物制劑，不修正水分含量或伊立替康基本成分的含量。
2)根據(jù)實施例11制備脂質(zhì)體CPT-11(Ls-CPT-11)，使用如下物質(zhì)由DSPC200摩爾份、膽固醇133摩爾份、PEG-DSPE 1摩爾份組成的脂類基質(zhì)；含有0.65M TEA，pH6.4的包載的溶液TEA-SOS；裝載入脂質(zhì)體中的藥物，于5mM HEPES緩沖液，5％葡萄糖，pH6.5中，藥物以500mg藥物/mmol磷脂的輸入藥物/脂類比率，在60℃裝載30分鐘。裝載效率＞99％。脂質(zhì)體大小(體積平均值±標準偏差，由QELS測量)101±37nm。脂質(zhì)體在載體中配制，20mM HEPES-Na，135mMNaCI；pH6.5。注射的制劑中的藥物濃度在下表中描述。
3)游離CPT-11溶液。通過以22mg/mL的濃度將鹽酸伊立替康溶解在5％含水葡萄糖中，制備游離的藥物貯存液，并經(jīng)0.2μm過濾除菌。在注射之前該貯存液用無菌5％葡萄糖稀釋。
4)動物。雌性Swiss Webster小鼠，6-8周齡，來自Harlan，USA。
MTD測定一般遵照United States National Cancer Institute DevelopmentalTherapeutics Program采用的方案。該方案包括下述三個步驟
步驟1)范圍探索(Range-seeking)步驟，劑量遞增因子為1.8。由兩只動物組成的組在尾靜脈注射入劑量遞增的游離或脂質(zhì)體伊立替康，以劑量60mg/kg起始，以1.8的遞增因子持續(xù)進行，直到在所有動物中觀察到急性死亡或最終發(fā)病(terminal morbidity)(注射后＞1天內(nèi))。記錄死亡/最終發(fā)病劑量之下的一步的劑量。
步驟2)范圍探索(Range-seeking)步驟，劑量遞增因子為1.15。由兩只動物組成的組在尾靜脈注射入劑量遞增的游離或脂質(zhì)體伊立替康，以步驟1記錄的劑量起始，以1.15的遞增因子持續(xù)進行，直到在所有動物中觀察到急性死亡或最終發(fā)病(注射后＞1天內(nèi))。在試驗性MTD，記錄死亡/最終發(fā)病劑量之下的一步的劑量。
步驟3)確認步驟。由5只動物組成的組以步驟2中測定的試驗性MTD靜脈(尾靜脈)注射游離或脂質(zhì)體伊立替康。對動物追蹤7天，每周兩次記錄動物的體重，并與注射前重量比較。觀察一般健康狀況(機敏性、外表、喂食、排泄物、皮膚、毛發(fā)和粘膜狀況、移動、呼吸、體態(tài))。如果在觀察期間，沒有死亡、進行性發(fā)病或重量減輕超過注射前體重的15％這樣的現(xiàn)象，則該劑量被認為作為急性單次注射MTD得到確認。如果出現(xiàn)這些結(jié)果中的任何結(jié)果，那么以1.15的因子的下一較低劑量重復試驗。
為了獲得用于確認步驟的額外的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)，追蹤存活動物的體重動態(tài)學至注射后11天。因為濃度和注射體積的限制，324mg/kg以上的脂質(zhì)體伊立替康這樣的劑量不可能給予。結(jié)果呈現(xiàn)在表10中。
表10.小鼠中對CPT-11制劑的MTD探索研究。
結(jié)果 步驟1以因子1.8增加劑量 注射之后，所有用游離CPT-11治療的小鼠患病，呼氣不足約1小時，然后恢復； 注射之后，所有用Ls-CPT-11治療的小鼠正常。
nd未測定 步驟2以因子1.15增加劑量 步驟3確認
因此，當游離CPT-11的MTD為80mg/kg，脂質(zhì)體CPT-11的MTD令人驚奇地甚至最高給藥劑量324mg/kg時也未獲得。因此，根據(jù)本發(fā)明對CPT-11進行脂質(zhì)體包囊藥物毒性減少至少4倍。
實施例17.裝載CPT-11的TEA-SOS脂質(zhì)體藥物對滲漏的保存穩(wěn)定性
使用TEA-SOS方法(實施例11)，以500-550mg/mmol磷脂的藥物/脂類輸入比率制備5批脂質(zhì)體CPT-11。利用膜擠壓通過孔徑為80nm或100nm的聚碳酸酯膜，制備脂質(zhì)體，如下表所示。脂質(zhì)體經(jīng)0.2-μm過濾器除菌，并在4-8℃，以3.4-14.5mg/mL CPT-11的濃度保存在135mM NaCl，20mM HEPES-Na，pH6.5(保存緩沖液)中。指定的保存時間之后，通過使用保存緩沖液作為洗脫劑，在Sephadex G-75上進行凝膠層析，去除滲漏的藥物。如實施例70和71所述，分別使用分光光度法和酸消化藍磷鉬酸鹽方法，分析凝膠層析之前和之后脂質(zhì)體中藥物和磷脂的濃度。根據(jù)本發(fā)明制備的CPT-11脂質(zhì)體非常穩(wěn)定。在保存期間，在6個月時間中，CPT-11從這些脂質(zhì)體的滲漏低于5％(表10)。
表11.CPT-11脂質(zhì)體在保存期間的包囊穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)為平均值±SE) 實施例18.裝載托泊特坎的脂質(zhì)體
如實施例11制備含有包載的TEA-Pn溶液和TEA-SOS溶液的脂質(zhì)體。在與脂質(zhì)體混合之前一刻，通過將鹽酸托泊特坎以15-20mg/ml溶解在水中，制備鹽酸托泊特坎(GlaxoSmithKline，PA，USA)貯存液，并計算實際鹽酸托泊特坎含量。用1N HCl將pH調(diào)節(jié)到3.0。利用正壓，使藥物溶液過濾通過0.2微米聚醚砜(PES)無菌過濾器。將藥物裝載緩沖液中的含TEA-Pn或TEA-SOS脂質(zhì)體的等分試樣在室溫中與托泊特坎HCl貯存液混合，獲得0.15-0.45g/mmol脂質(zhì)體磷脂范圍內(nèi)的藥物/脂類輸入比。優(yōu)選比率是每mmol脂質(zhì)體磷脂含0.35g托泊特坎HCl。玻璃容器中的混合物在55-62℃恒溫水浴中溫育，并伴隨緩慢的攪拌，進行30-60min，在冰浴(0-2℃)中迅速冷卻，并放置在該溫度5-15min。這步驟產(chǎn)生89-90％(TEA-Pn梯度)或97-100％(TEA-SOS梯度)的包囊效率。使用尺寸排阻柱層析，去除未包囊的托泊特坎，并將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移入保存緩沖液。在施用到柱上之前，通過與1/20體積的2.88M含水氯化鈉混合，增加脂質(zhì)體制劑的離子強度，并將混合物溫育15分鐘。出乎意料地我們發(fā)現(xiàn)將脂質(zhì)體介質(zhì)的離子強度由裝載期間的低值(通常相當于20mM NaCl以下)調(diào)整到高于20mM NaCl的值，優(yōu)選地調(diào)整到50mM NaCl和更高值，提高未包囊藥物的去除效果，增加裝載托泊特坎的脂質(zhì)體對聚集的穩(wěn)定性，這可能通過幫助去除膜結(jié)合的托泊特坎而實現(xiàn)，其相對于包囊在脂質(zhì)體內(nèi)部的藥物而言。剩余的步驟遵照實施例11的步驟7進行。對于結(jié)果，參見下表12。
實施例19.托泊特坎的抗-HER2-免疫脂質(zhì)體制劑的制備
通過將托泊特坎脂質(zhì)體連接到選自嗜菌體展示文庫的抗-HER2單鏈人Fv抗體片段F5以用于將其高水平地內(nèi)化入表達HER2的細胞，制備可特異性地內(nèi)化入過量表達HER2(C-ErbB-2)表面受體酪氨酸激酶癌蛋白的癌細胞的托泊特坎免疫脂質(zhì)體(Poul，et al.，2000，J.Molecular Biology，v.301，p.1149-1161)。F5是以約150nM的親和力與HER2受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起快速內(nèi)化作用的27-KDa蛋白質(zhì)(Neve，et al.，2001，Biophys.Biochim.Res.Commun.v.280，p.274-279)。對于脂質(zhì)體連接，一般遵照美國專利6,210,707方法和Nielsen，et al.(2002)，Biochim.Biophys.Acta，v.1591，p.109-118的方法。首先制備F5親水性脂聚合物連接物。F5氨基酸鏈的C-末端具有加入的末端半胱氨酸基團(F5Cys)。F5Cys構(gòu)建物表達在大腸桿菌(E.coli)中，并通過蛋白質(zhì)A柱層析從細菌裂解物分離出來。將蛋白A洗脫的級分吸附到陰離子交換樹脂上以去除熱原質(zhì)和宿主DNA，并用硫醇還原劑處理以釋放末端半胱氨酸的硫醇基團。還原的F5Cys用SP Sepharose Fast Flow(Amersham Phannacia)通過離子交換層析進一步純化。將純化的蛋白連接到硫醇-反應性脂類-聚(乙二醇)接頭，N-(3-(N-酰亞胺)propyonylamido)-聚(氧乙烯)-氧羰基)-1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE)，其是分子量2,000的PEG的衍生物(圖4.1)，商業(yè)上由Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabama，USA生產(chǎn)。將蛋白與接頭在含水緩沖液中以1∶4摩爾比溫育，用1mM半胱氨酸淬火未反應的接頭。在反應期間，F(xiàn)5Cys的末端半胱氨酸與接頭的酰亞胺基團共價連接。所得的F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物是水溶性的膠束形式，具有高表觀分子量(500-850 KDa)，并通過尺寸排阻層析與未反應的蛋白(約25％)分離開來。純化的偶聯(lián)物中蛋白的數(shù)量通過UV分光光度法在280nm處測定，接頭的數(shù)量利用與用于磷脂定量的方法(參見實施例70)相同的分光光度方法分析。純化的F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物在水中是穩(wěn)定的，具有完全的免疫反應性，并在65℃至少1小時和37℃至少3月的時間里對變性和反應性喪失具有穩(wěn)定性。
為了制備抗-HER2免疫脂質(zhì)體托泊特坎，將實施例18中的裝載托泊特坎的脂質(zhì)體與F5-PEG-DSPE在含水鹽水緩沖液中以每1微摩爾磷脂為15微克蛋白的比率(每一脂質(zhì)體約45個F5拷貝)混合。在60℃將混合物溫育40分鐘，在冰上冷凍，在具有Sepharose CL-4B(交聯(lián)的4％瓊脂糖珠，Amersham Phannacia)的柱上層析，以去除殘留的膠束偶聯(lián)物、未偶聯(lián)的蛋白和在溫育期間可能釋放的任何微量的脂質(zhì)體外的藥物。具有膜-整合的F5-PEG-DSPE的脂質(zhì)體用5mM HEPES-144mM NaCl緩沖液pH7.4洗脫，收集在柱的孔隙體積中，過濾除菌，并進行分配以用于儲存(4-6℃)。脂質(zhì)體-整合的F5的數(shù)量通常大于加入的偶聯(lián)物的80％。通過SDS-PAGE測定脂質(zhì)體，通過密度測定法對Coomassie-染色的F5帶進行定量。經(jīng)測定，免疫脂質(zhì)體中的藥物和脂類濃度與非-靶向脂質(zhì)體相似。托泊特坎脂質(zhì)體和F5-免疫脂質(zhì)體(實施例18-19)的特性概述于表12中。
表12.托泊特坎脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體的特征 實施例20.裝載緩沖液的pH和藥物/脂類比率對托泊特坎裝載入脂質(zhì)體的影響
使用乙醇注射方法(實施例18)制備含有包載的0.5N TEA-Pn(pH6.2，同滲重摩413mmol/kg)的脂質(zhì)體(DSPC/Chol/PEG-DSPE，3∶2∶0.015摩爾比)，5次擠壓通過孔徑100nm的二疊層聚碳酸酯過濾器和10次擠壓通過孔徑50nm的二疊層聚碳酸酯過濾器。裝載緩沖液是5mM MES，50g/L葡萄糖，將各pH值調(diào)節(jié)到5.0-6.5的范圍內(nèi)。經(jīng)QELS測定脂質(zhì)體大小為73.1±21.3nm。通過下述方法裝載脂質(zhì)體將托泊特坎貯存液(20mg/ml)與脂質(zhì)體在裝載緩沖液中以100mg/mmol的輸入藥物-磷脂比率混合，在60℃溫育混合物45分鐘，冰上淬火15分鐘，并使用Sephadex G-75柱用20mM HEPES，135mM NaCl，pH6.5洗脫，去除未包囊的藥物。通過分光光度法(實施例70和71)對托泊特坎和磷脂進行定量。結(jié)果(表13)表明，在pH5.5-6.5范圍內(nèi)，托泊特坎裝載幾乎是定量的。
表13.裝載緩沖液的pH對托泊特坎包囊入含有包載的TEA-Pn的脂質(zhì)體的百分比的影響
也研究了藥物與脂類的比率(0.15-0.45mg/mmol磷脂)對裝載效率的影響。按照上述方法，制備含有包載的TEA-Pn(0.5M TEA，pH5.8，同滲重摩480mmol/kg)的脂質(zhì)體，除了最終擠壓步驟是10次通過二疊層0.08μm聚碳酸酯過濾器外。裝載在pH6.5進行。經(jīng)QELS測定脂質(zhì)體大小為93.1±15.1nm。結(jié)果(表14)表明對于整個研究的藥物/脂類比率范圍，裝載效率85％。
表14.藥物/脂類比率對托泊特坎包囊入含TEA-Pn的脂質(zhì)體的包囊效率的影響 實施例21.在體外，在血漿存在下托泊特坎脂質(zhì)體的穩(wěn)定性
如實施例18所述，制備脂質(zhì)體(DSPC/Chol/PEG-DSPE，摩爾比3∶2∶0.015)，該脂質(zhì)體含有包載的0.5N TEA-Pn，pH6.2，同滲重摩413mmol/kg。通過10次擠壓通過二疊層100nm孔徑聚碳酸酯過濾器，產(chǎn)生大小為96.4±29.3nm的脂質(zhì)體。為了定量血漿中的脂質(zhì)體脂類，將[3H]-CHE以0.5Ci/mol DSPC包含在脂類溶液中。托泊特坎在pH6.0，于58℃，以150mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載45分鐘。裝載效率為148.48±10.26g托泊特坎/mol磷脂(99.0±6.8％)。
脂質(zhì)體用50％人血漿在多孔微透析裝置(Spectra-Por Micro透析器10-孔，Spectrum，USA)中溫育。人供體血漿用等體積的含有0.02％疊氮鈉的HEPES-緩沖鹽水(20mM HEPES，135mMNaCI)，pH6.5稀釋，并裝載入透析器(32mL)的下部容器(lower reservoir)中。通過孔徑為30nm的聚碳酸酯膜，將孔(0.4mL)與容器分開，使得血漿蛋白和小分子能自由通過，但脂質(zhì)體不能通過。將脂質(zhì)體與計算出來的量的血漿和HEPES-緩沖鹽水混合，獲得的濃度為2.5mM磷脂和血漿的50vol.％。將裝置在37℃溫育，緩慢攪拌容器中的內(nèi)含物。溫育8小時之后，下部容器中的內(nèi)含物更換新鮮的50％血漿。在給定時間點后(參見下文)，從孔中獲取50-μL等分樣品，在含有2.2-2.4mL Sepharose CL-2B，洗脫劑HEPES-緩沖鹽水的柱上層析，以將脂質(zhì)體與血漿蛋白和游離藥物分離開。將脂質(zhì)體收集在孔隙體積部分中。在將血漿樣品溶解在90％含水異丙醇-0.1N HCl中后，利用384nm激發(fā)光和524nm發(fā)射光通過熒光測定法對托泊特坎定量，通過對[3H]-CHE(淬火校正)進行閃爍計數(shù)來定量脂類。將在每一時間點測得的藥物-與-脂類比率與溫育之前的起始比率進行比較，獲得在每一時間點保持包囊的托泊特坎的百分比。溫育8小時之后，保留在脂質(zhì)體中的藥物的數(shù)量是它起始值的大約55％(表15)。
表15.于37℃，在50％人血漿中，托泊特坎由裝載有TEA-Pn梯度的脂質(zhì)體的體外釋放 實施例22.在各種藥物/脂類比率，具有包載的TEA-Pn梯度的托泊特坎脂質(zhì)體 在小鼠中的體內(nèi)藥物保留和循環(huán)壽命
如實施例18所述，使利擠壓通過二疊層100nm孔徑聚碳酸酯過濾器12次，制備含有包囊的形成梯度的鹽溶液(0.5N TEA-Pn，pH6.2，同滲重摩413mmol/kg)的脂質(zhì)體(DSPC/Chol/PEG-DSPE，3∶2∶0.015摩爾比，以0.5mCi/mmol DSPC含有[3H]-CHE)。經(jīng)QELS測量，脂質(zhì)體的大小為107.7±19.1。在5mM HEPES，50g/L葡萄糖，pH6.5中，將脂質(zhì)體與托泊特坎的含水貯存液(20mg/ml)，以130-360g/mol范圍內(nèi)的藥物/磷脂比率混合，然后在58℃溫育混合物45min，放置在冰上15min，通過Sephadex G-75層析去除未包囊的藥物。12周齡的雌性FvB小鼠以每kg體重5mg托泊特坎的劑量(大約0.2mg托泊特坎/動物)，通過尾靜脈注射以脂質(zhì)體，注射三次。在指定時間，典型地在注射后8小時或24小時，將小鼠麻醉，放血，并分析血液樣品中的藥物和脂類，如實施例8所述。結(jié)果在表16中示出。24小時之后，初始藥物載量的大約6-32％保持包囊狀態(tài)。較高的藥物載量(＞200mg/mmol磷脂)導致較長的藥物保留時間。
表16.使用TEA-Pn梯度方法裝載不同藥物/脂類比率的原型托泊特坎脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物保留和循環(huán)壽命 實施例23.使用不同的包載的銨鹽和三乙銨鹽裝載的托泊特坎脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物保留和循環(huán)壽命
如實施例18所述，制備由DSPE、膽固醇和PEG-DSPE(按重量比3∶1∶0.1)組成的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體也含有0.22mCi/mmol DSPE的[3H]-CHE，與實施例18不同的是，擠壓步驟包括10次通過2疊層200-nm孔過濾器，10次通過2疊層100-nm孔過濾器和20次通過2疊層50-nm孔過濾器。脂質(zhì)體包含下述鹽溶液
由購自Sigma的葡萄糖硫酸鈉(分子量5000)制備0.5N葡萄糖硫酸銨(ammonium dextran sulfate)溶液(A-DS)，并通過與實施例4的程序相似的離子交換程序轉(zhuǎn)化為銨鹽。葡萄糖硫酸溶液立即用12.4M含水氨水滴定。A-DS溶液的pH為5.66，同滲重摩為208mmol/kg。
類似于實施例6，制備0.48N蔗糖八硫酸銨(A-SOS)，但是用氫氧化銨滴定。溶液的pH為6.27，同滲重摩為58mmol/kg。
如實施例6所述制備0.47M蔗糖八硫酸三乙銨(TEA-SOS)。溶液pH為6.6，同滲重摩為297mmol/kg。
通過在61-62℃、以346±1mg/mmol的藥物/磷脂比率用藥物溫育脂質(zhì)體40min，然后在冰上溫育10min，在10mM MES-Na，50g/L葡萄糖，pH6.5含水溶液中將托泊特坎裝載入脂質(zhì)體。通過在Sephadex G-25上進行層析，將脂質(zhì)體從未包囊的藥物純化出來，洗脫劑為含水2mM組胺，144mM NaCl，pH6.6(HCl)。
7到9周齡的雌性Swiss Webster小鼠經(jīng)尾靜脈注射這些脂質(zhì)體托泊特坎制劑，劑量為每kg體重為5mg托泊特坎(大約0.2mg托泊特坎/動物)，注射3次。在注射后8小時或24小時，收集血液，并分析托泊特坎和脂類，如實施例22所述。
結(jié)果呈現(xiàn)在下表17中。盡管所有三種脂質(zhì)體制劑表現(xiàn)出非常接近的脂質(zhì)體循環(huán)壽命，在注射后24天，大約23-28％的注射劑量保留在血液中，但是出乎意料地是，無論在數(shù)量(藥物保留提高大約2倍)還是在統(tǒng)計學顯著性上(在95％置信度水平由2-尾非配對Student′s t-試驗獲得的統(tǒng)計學顯著性分別是p＝0.0257和p＝0.00995；由Mann′s U-試驗獲得的結(jié)果差異明顯[α]＝0.01)，TEA-SOS脂質(zhì)體和A-SOS脂質(zhì)體中的藥物保留效果都好于A-DS脂質(zhì)體。含有托泊特坎脂質(zhì)體的TEA-SOS的藥物保留效果優(yōu)于含有托泊特坎脂質(zhì)體的A-SOS的藥物保留效果。
表17.使用TEA-SOS、銨-SOS(A-SOS)和葡萄糖硫酸銨(A-DS)制備的托泊特坎脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物保留和循環(huán)持續(xù)時間 實施例24.大鼠中托泊特坎脂質(zhì)體的藥物和脂類血漿動力學
在大鼠中評價循環(huán)壽命和托泊特坎釋放參數(shù)。如實施例18所述，通過乙醇混合/擠壓方法制備脂質(zhì)體(DSPC/膽固醇/PEG-DSPE，摩爾比3∶2∶0.015)，并使用TEA-Pn梯度或TEA-八硫酸蔗糖(TEA-SOS)梯度以不同的藥物/脂類比率(15-450mg/mmol磷脂)裝載托泊特坎。為了定量脂類基質(zhì)，脂質(zhì)體包含0.5-1.5mCi/mmolDSPC的[3H]-CHE。以4-5mg/kg體重的劑量，具有留置的中心靜脈插管的雌性Sprague Dawley大鼠(6-8周齡，體重200g)通過靜脈注射(通過導管)托泊特坎脂質(zhì)體。導管用鹽水沖洗。在選定的時間(最高達注射后48小時)通過導管將血液樣品(0.2-0.3mL)收集入肝素化的注射器中，與0.4mL含有0.04％EDTA的冷硫酸鹽緩沖鹽水混合，通過離心分離血細胞，通過H-CHE放射性計數(shù)(淬火校正)評價上清液(PBS-稀釋的血漿)中的脂類，通過熒光測定法評價托泊特坎(實施例71)。對于血漿稀釋液校正分析結(jié)果，由獲得的血液樣品的重量計算，并假設(shè)血細胞(hematocryt)為40％。由經(jīng)計算為體重的6.5％的血液體積估計藥物和脂類的總血液劑量。將給定時間點的藥物/脂類比率與注射的脂質(zhì)體的藥物/脂類比率比較，計算保留在脂質(zhì)體中托泊特坎的百分比。下表18概括了脂類、藥物的血液半衰期，藥物釋放半衰期以及脂質(zhì)體的其他特性。藥物動力學(PK)曲線顯示在圖8A(脂類)和8B(藥物/脂類比率)中?？傮w上說，藥物和脂類的血液PK曲線與單指數(shù)模型(R20.984-0.999)充分擬合。盡管它們大小為90-100nm以及非常少量的PEG化的脂類(0.3mol.％)，脂質(zhì)體令人意想不到地顯示出良好的循環(huán)壽命(脂類組分的血漿半衰期在11-16小時范圍內(nèi))。對于使用TEA-SOS裝載的脂質(zhì)體觀察到最小水平的托泊特坎釋放(半衰期22.9小時)。
表18.大鼠中脂類和藥物的循環(huán)半衰期(t1/2)，藥物從原型托泊特坎脂質(zhì)體釋放出來的半衰期 實施例25.在托泊特坎脂質(zhì)體儲存期間藥物對滲漏的穩(wěn)定性
將制備用于上述研究的幾種原型制劑的樣品，在4-6℃儲存不同的時間，以評價包囊的托泊特坎對藥物從脂質(zhì)體滲漏的保存穩(wěn)定性。使脂質(zhì)體樣品通過Sephadex G-75柱，用20mM HEPES，135mMNaCl，pH6.5洗脫，除去脂質(zhì)體外的藥物，并通過分光光度法分析藥物含量，通過[3H]-CHE放射性計數(shù)法分析脂類。結(jié)果(表19)表明在儲存期間脂質(zhì)體中的托泊特坎具有良好的保留性。
表19.儲存期間原型托泊特坎脂質(zhì)體中的藥物保留 實施例26.HER2-過量表達的癌細胞對脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體托泊特坎的體外吸收
該研究揭示了在細胞培養(yǎng)物中根據(jù)本發(fā)明制備的裝載托泊特坎的抗-HER2-免疫脂質(zhì)體將托泊特坎特異性地輸送到HER2-過量表達的細胞的能力。制備(免疫)脂質(zhì)體并使用實施例19的TEA-Pn方法裝載托泊特坎。在T-75瓶中，于37℃，5％CO2中，將HER-2過量表達的人乳腺癌細胞(SKBr-3，ATCC)培養(yǎng)在改良的McCoy 5A培養(yǎng)基(無曲辛)中，培養(yǎng)直至匯合，該培養(yǎng)基補充以10％胎牛血清、50g/mL硫酸鏈霉素和50U/ml青霉素G(完全生長培養(yǎng)基)。通過胰蛋白酶消化收獲細胞，以150,000細胞/孔，于0.5mL完全生長培養(yǎng)基中，將收獲的細胞溫育在24-孔細胞培養(yǎng)板上，并允許馴化過夜。培養(yǎng)基用0.5mL完全生長培養(yǎng)基替換，該完全生長培養(yǎng)基含有在0.01-0.1mM磷脂范圍內(nèi)選定濃度的托泊特坎制劑?？滓皇饺萦糜诿恳粭l件。對照孔在缺少藥物和/或脂質(zhì)體的情況下溫育(以獲得用于藥物分析的背景讀數(shù))。板在37C，5％ CO2中，伴隨緩慢攪拌溫育4-8小時。對培養(yǎng)基吸氣，細胞用1mL份含有Ca和Mg鹽的冷Hanks′平衡鹽溶液沖洗4次。通過加入0.1mL于水中的1％Triton X-100溶解細胞，細胞裂解物中藥物數(shù)量經(jīng)熒光測定法測定(實施例71)。在10-2500ng托泊特坎/孔范圍內(nèi)獲得標準曲線，并在減去細胞自身熒光背景后與二價多項(說明了在較高藥物濃度自淬火)相符。當使用微量板熒光計時，過濾器選擇為激光光400/30nm，發(fā)射光530/25nm。無論比色皿還是微量板熒光計都給出的相同的結(jié)果。
兩個試驗的結(jié)果概述在下表20中。對HER2定向脂質(zhì)體藥物具有顯著的細胞吸收水平(比非-定向脂質(zhì)體托泊特坎高50-300倍)。令人感興趣的是，對游離托泊特坎的吸收也明顯低于HER2-定向免疫脂質(zhì)體托泊特坎。這可以這樣解釋，在存在血清的細胞生長培養(yǎng)基中，托泊特坎分子中的喜樹堿內(nèi)酯環(huán)快速水解，產(chǎn)生具有較低細胞滲透性和較低細胞毒性的羧基形式的藥物?？傊?，定向細胞的、可內(nèi)化的、連接配體的免疫脂質(zhì)體在胞內(nèi)輸送托泊特坎的能力得到確認。
表20.含有TEA-Pn的托泊特坎脂質(zhì)體和抗-HER2免疫脂質(zhì)體的體外細胞吸收(nd，未測定)。脂質(zhì)體特征請參見表12。
實施例27.在體外脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體托泊特坎對HER2-過量表達的癌細胞的細胞毒性
一旦抗-HER2托泊特坎免疫脂質(zhì)體將藥物胞內(nèi)輸送入HER2-過量表達的癌細胞的能力被確立(實施例26)，對于確保內(nèi)化的脂質(zhì)體能夠以其活性形式釋放藥物是重要的。為了這個目的，對游離托泊特坎(即托泊特坎被配制成溶液)、脂質(zhì)體托泊特坎和抗-HER2-免疫脂質(zhì)體托泊特坎的體外細胞毒性進行了研究。制備脂質(zhì)體托泊特坎制劑，培養(yǎng)并收獲SKBr-3細胞，如實施例26所述。以含5,000個細胞的0.1mL完全生長培養(yǎng)基，將細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，一式三份，并馴化。培養(yǎng)板最邊上的排和列空著。將托泊特坎脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體或游離藥物(通過將托泊特坎20mg/mL貯存液，pH3稀釋入未緩沖的鹽水至2mg/mL新鮮制備游離藥物)的無菌制劑用完全藥物培養(yǎng)基稀釋，獲得起始濃度90、30或10g/mL，并以因子3用培養(yǎng)基連續(xù)稀釋。孔中的培養(yǎng)基用0.2mL藥物/脂質(zhì)體稀釋液替換，并在37℃，5％CO2中溫育規(guī)定的時間(4-6小時)。每排一個孔用無藥物的培養(yǎng)基溫育以充當未處理的對照。從孔中吸取含藥物的培養(yǎng)基，用0.2mL無藥物培養(yǎng)基沖洗細胞，將0.2mL新鮮的無藥物培養(yǎng)基加入到所有孔中。將板在37℃，5％CO2中溫育4天。不改變培養(yǎng)基，將在無血清培養(yǎng)基中的0.03mL的2mg/mL四唑染料(噻唑藍，MTT)(Sigma Chemical Co.)溶液加入到每一孔中。在37℃，5％CO2，將板再溫育2-3小時。吸取培養(yǎng)基，使孔充滿0.2mL 70vol.％的含水異丙醇，0.075N HCl，并溫和攪拌直到formazan染料溶解(15-30min)。在540nm處使用微量板光度計測定formazan溶液的光密度。以試驗孔中的光密度與含未處理細胞的孔中的光密度的比率，計算細胞存活，用％未處理對照表示，用背景校正。將數(shù)據(jù)對藥物濃度作圖，通過圖中由存活-濃度曲線與50％存活線的交點估計IC50劑量。
結(jié)果示出在圖9中。導致50％生長抑制(IC50)的藥物劑量對于游離托泊特坎或非定向脂質(zhì)體托泊特坎超過30μg/mL；對于F5-免疫脂質(zhì)體托泊特坎為15μg/mL。這些結(jié)果與定向藥物吸收數(shù)據(jù)一致。
實施例28.小鼠中脂質(zhì)體和F5-免疫脂質(zhì)體托泊特坎的比較穩(wěn)定性和血漿藥物動力學
根據(jù)實施例11和19，使用乙醇脂類溶液混合-擠壓程序下述條件下，制備以1.5mCi/mmol磷脂含有放射性脂類標記[3H]-CHE的托泊特坎脂質(zhì)體形成梯度的鹽溶液0.643N八硫酸蔗糖三乙銨；聚碳酸酯膜擠壓；15次通過2疊層PCTE過濾器，80nm孔徑；托泊特坎裝載藥物/磷脂輸入比率350mg/mmol(對托泊特坎游離基本成分計算)；F5 scFv連接如實施例19所描述地進行。脂質(zhì)體具有下述特征
經(jīng)QELS測定大小為加權(quán)平均值101.2nm；標準偏差，20.1nm。
藥物包囊托泊特坎脂質(zhì)體(Topo-Ls)359.3±27.4mg/mmol磷脂；托泊特坎F5scFv-免疫脂質(zhì)體(Topo-F5-ILs)326.3±15.9mg/mmol磷脂。
該研究總體上按照實施例22進行。由9只雄性Swiss Webster小鼠(8-10周齡，24-27g)組成的組經(jīng)尾靜脈注射Topo-Ls、Topo-F5ILs或新鮮制備的托泊特坎1mg/mL，于無緩沖鹽水中，劑量為每kg體重5mg托泊特坎基本成分(相當于脂類劑量14-16mol磷脂/kg體重)。在注射后1小時、8小時或24小時，在每一時間點對3只動物在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下經(jīng)開口心臟穿刺放血，將血液收集入含有PBS-EDTA的管中，并分析托泊特坎(熒光測定法)和脂質(zhì)體(通過放射性閃爍計數(shù)法)。投入的劑量取100％，計算在給定時間點保留在血液中的藥物和脂類劑量的數(shù)量，假設(shè)每只動物的血量為體重的6.3％，充滿血細胞的部分45％。單獨將血漿樣品的藥物/脂類放射性比率與注射脂質(zhì)體的藥物/脂類放射性比率比較，對每一動物計算每一時間點保持包囊在脂質(zhì)體中的藥物的數(shù)量。在注射后1小時時收集的血漿樣品中游離托泊特坎的數(shù)量低于注射劑量的1％(事實上，它們在我們分析方法的檢測極限之下)；因此，沒有對游離托泊特坎組在進一步的時間點進行研究。因為游離托泊特坎具有快速血液清除和低血液水平，我們認為在所有時間點血液中發(fā)現(xiàn)的基本上所有托泊特坎都是脂質(zhì)體包囊的托泊特坎。
結(jié)果概述在下表21中。引人注目地，根據(jù)本發(fā)明制備的脂質(zhì)體甚至在注射入動物血流24小時后仍然保持原始藥物載量的79-85％。脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體組的脂類或藥物的平均血漿值之間的差異在1.8-13.6％范圍內(nèi)，這接近于分析誤差或在分析誤差的范圍內(nèi)。使用Student′s t-試驗計算的與每一時間點的藥物或脂類值相關(guān)的脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體之間的零假設(shè)(null hypothesis)的概率，在0.543-0.938范圍內(nèi)。我們的結(jié)論是兩種制劑之間的藥物或脂類的殘留血液水平可以忽略不計且在統(tǒng)計學上是不可區(qū)別的。
表21.在注射后各時間點，脂質(zhì)體脂類、托泊特坎和保持包囊在脂質(zhì)體中的托泊特坎在小鼠血漿中的數(shù)量 實施例29.脂質(zhì)體的和抗-HER2-免疫脂質(zhì)體的托泊特坎在BT-474異種移植物模型中的抗腫瘤功效
在該研究中，我們使用了利用三乙銨-聚磷酸鹽梯度包載藥物的第一原型托泊特坎免疫脂質(zhì)體?；旧习凑諏嵤├?1和19的方法制備脂質(zhì)體。在60℃，將脂類基質(zhì)組分——DSPC(Avanti Polar Lipids；3摩爾份)、膽固醇(Calbiochem，98.3％；2摩爾份)和甲氧基-PEG(2000)-DSPE(Avanti Polar Lipids，0.015摩爾份)——與100％乙醇USP混合，得到含有0.5mM磷脂的溶液。在60℃，用含水三乙銨磷酸鹽溶液(0.608M三乙胺，0.65N磷酸鹽，pH6.1，重量克摩爾滲透濃度為531mmol/kg)稀釋乙醇脂溶液，充分混合，并在60℃使用熱穩(wěn)定的氣壓擠壓機(Lipex Biomembranes)10次擠壓通過孔徑為100nm的2疊層聚碳酸酯膜(Nuclepore，Corning)。擠出的脂質(zhì)體在冰上冷卻，通過在Sepharose CL-4B上，使用5％葡萄糖-5mM HEPES-Na緩沖液，pH6.5作為洗脫劑進行凝膠層析，去除未包囊的三乙銨多磷酸鹽。經(jīng)QELS測定，脂質(zhì)體大小為103.8±35.1nm。以每μmol磷脂0.35mg托泊特坎基本成分的比率，將該緩沖液中的脂質(zhì)體與鹽酸托泊特坎在60℃溫育30min。溫育結(jié)束時，將脂質(zhì)體在冰上冷卻，在Sephadex G-75上以20mMHEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5作為洗脫劑進行層析，去除任何未包囊的藥物。如前面所報告地，通過熒光測定法測定藥物含量，通過磷酸鹽分析方法測定脂類含量。如此獲得的脂質(zhì)體托泊特坎每mmol磷脂具有365.4±23.1mg托泊特坎基本成分。為了制備HER2-定向托泊特坎免疫脂質(zhì)體，將該脂質(zhì)體托泊特坎制劑的一部分與如實施例所述的純化的抗-HER2 scFv F5和酰亞胺-PEG-DSPE接頭的偶聯(lián)物溫育。簡而言之，將于含水10％蔗糖-10mM檸檬酸鈉溶液，pH6.5中的F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物與托泊特坎脂質(zhì)體以每mmol脂質(zhì)體磷脂15mg蛋白的比率混合，并60℃溫育30min。在冰上冷卻溫育混合物，并在Sepharose CL-4B上，以20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5作為洗脫劑進行層析，去除任何未包囊的scFv偶聯(lián)物。在該附加的溫育之后，藥物與脂類的比率降低14％。
將含有1-2mg/mL托泊特坎的托泊特坎脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體制劑通過0.2微米無菌注射過濾器，并在無菌條件下分配入聚丙烯瓶中，4-6℃儲存達1個月直至使用。
通過將將鹽酸托泊特坎粉末以2mg/mL溶解于5％葡萄糖中制備新鮮的游離托泊特坎，通過0.2微米注射過濾器除菌。
如實施例10描述，建立HER2-過量表達的BT-474人乳腺癌異種移植物模型。在腫瘤注射之后第13天，選擇具有120-350立方毫米范圍內(nèi)的腫瘤的動物，并隨機分配入3個治療組和1個對照組，每組有12只動物。在腫瘤接種之后第14、18和21天，小鼠經(jīng)靜脈(尾靜脈)注射托泊特坎制劑進行治療，每次注射劑量為5mg/kg體重，或注射相等體積的生理鹽水。每日監(jiān)控動物的總體健康狀況。每周兩次監(jiān)控腫瘤大小和體重，時間最長至腫瘤接種后第53天。對腫瘤達到體重的20％的動物，或進行性重量減少達20％或更多的動物實施安樂死。
圖11和12分別顯示了腫瘤生長和動物體重數(shù)據(jù)。脂質(zhì)體托泊特坎(拓撲替康(topotecan))制劑在腫瘤生長抑制中的活性要高于游離藥物，F(xiàn)5-靶向脂質(zhì)體制劑(F5-定向脂質(zhì)體制劑(F5-targeted liposomal formulation))的活性高于非靶向脂質(zhì)體制劑(非定向脂質(zhì)體制劑(non-targeted one)。在觀察階段結(jié)束時，各治療組中平均腫瘤大小差異明顯(經(jīng)非配對2-尾Student′s t-試驗獲得的p值(p values)對于游離v.免疫脂質(zhì)體藥物為1.2×10-6；游離v.脂質(zhì)體藥為0.000114；脂質(zhì)體v.免疫脂質(zhì)體藥物為0.00718)。因此，脂質(zhì)體包囊的托泊特坎比游離藥物更具活性，抗-HER2免疫脂質(zhì)體托泊特坎比非定向脂質(zhì)體藥物更具活性。在脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體組中，在最初的腫瘤消退之后，在最后一次治療的10天內(nèi)出現(xiàn)腫瘤再生長的現(xiàn)象。在游離藥物組中并無腫瘤消退現(xiàn)象。被注意到，給定劑量的托泊特坎的脂質(zhì)體制劑比游離藥物毒性更大。具有腸胃毒性。接受脂質(zhì)體托泊特坎的動物出現(xiàn)腹瀉，經(jīng)受體重減輕；在體重減輕的最高峰時，體重減輕平均約14％。在非定向脂質(zhì)體組中，動物體重恢復，除了一只動物(12.5％)在研究結(jié)束時體重減輕始終為15％；在F5-定向組中，5只動物(41.6％)發(fā)展為晚期病態(tài)并斷氣，還有兩只(16.7％)體重減輕始終為約15％。在對照組和游離藥物組中，無體重減輕或治療相關(guān)的病態(tài)。
實施例30.在一周3次給予靜脈注射的小鼠中，游離托泊特坎和脂質(zhì)體托泊特坎的最大耐受劑量(Maximum tolerated dose(MTD))
除了三乙銨多磷酸鹽溶液用具有0.65M三乙銨，pH6.2的三乙銨蔗糖八硫酸鹽溶液替換；并使用80-nm聚碳酸酯膜過濾器替換100-nm聚碳酸酯膜過濾器進行擠壓外，該研究使用如實施例29制備的脂質(zhì)體托泊特坎制劑。通過準彈性光散射法以高斯近似(Gaussian approximation)(QELS)測定的體積加權(quán)脂質(zhì)體大小為95.1±19.6nm(平均值±SD)；藥物/脂類比率為369.1±18.3mg/mmol磷脂。在2組中的5只六周齡雌性Swiss-Webster小鼠(18-20g)經(jīng)三次靜脈(尾靜脈)注射游離托泊特坎或脂質(zhì)體托泊特坎，一周一次，以每次注射2mg/kg托泊特坎基本成分的劑量起始，并對每一隨后的組以1.8的因子增加，直至劑量為37.8mg/kg。免疫脂質(zhì)體托泊特坎不包括在該研究中。每日監(jiān)控動物的體重和總體健康。在從治療開始起10天的時間里，組中兩只動物中任何一只在任何時間點進行性體重減輕超過20％或自然死亡時，被認為指示出了毒性劑量。根據(jù)動物死亡率和重量數(shù)據(jù)，經(jīng)測定對于游離托泊特坎，MTD落入11.7-21mg/kg范圍，對于脂質(zhì)體(原型2)托泊特坎落入2.0-3.6mg/kg范圍。在第二個研究中，用游離托泊特坎、脂質(zhì)體托泊特坎或F5-免疫脂質(zhì)體托泊特坎(由該實施例的脂質(zhì)體托泊特坎制備，如實施例29所述)注射小鼠，劑量由2.0mg/kg(脂質(zhì)體/免疫脂質(zhì)體托泊特坎)或12mg/kg(游離托泊特坎)起始，并對每一隨后的組以1.15的因子增加，直至獲得接近建立的MTD間隔的上限范圍的劑量。在所有動物中并不導致死亡或最終發(fā)病的最高劑量被認作MTD，并發(fā)現(xiàn)對于游離托泊特坎為18.4mg/kg，對照脂質(zhì)體托泊特坎為3.0mg/kg，對于免疫脂質(zhì)體托泊特坎為3.0mg/kg。因此，脂質(zhì)體托泊特坎比起游離藥物顯示出更大的毒性。
實施例31.BT-474異種移植物模型中，在0.125-1.0×MTD范圍內(nèi)，脂質(zhì)體托泊特坎的抗腫瘤功效
實施例30中的托泊特坎脂質(zhì)體和F5-免疫脂質(zhì)體被用于該研究。如實施例29所述，在裸鼠中培養(yǎng)BT-474皮下異種移植物。在腫瘤細胞接種18天后，將具有腫瘤(105-345立方毫米，平均約200立方毫米)的動物隨機分入每組6只動物組成的治療組和每組8只動物組成的對照組。在腫瘤接種后第19、23和27天，通過三次靜脈(尾靜脈)注射，動物接受1×MTD、0.5×MTD、0.25×MTD或0.125×MTD的游離或脂質(zhì)體托泊特坎。對照組接受生理鹽水。如實施例29所述，監(jiān)控腫瘤大小和動物體重。為了獲得動物體重測量值，由動物體重總測量值減去腫瘤重量(假設(shè)腫瘤密度為1.0，由腫瘤大小計算腫瘤重量)獲得該值。在MTD時所有藥物顯示出抗腫瘤活性(圖13A-13D)。以它們各自的MTD或以其相等分數(shù)(1/2、1/4或1/8)給予的游離藥物和脂質(zhì)體藥物之間的效率沒有明顯的差異。因此，使用TEA-SOS梯度對藥物進行脂質(zhì)體包囊導致抗腫瘤活性增加大約6倍，而且藥物毒性也有類似的增加。動物體重動態(tài)學表明，除了用游離托泊特坎以MTD進行的治療外，所有的治療都是無毒性的，用游離托泊特坎以MTD進行的治療顯示出短暫的體重減輕(體重減輕約為治療前值的15％)，之后體重減輕癥狀消退(圖14)。
實施例32.使用八硫酸蔗糖三乙銨包載方法制備的托泊特坎脂質(zhì)體的制備和定向的體外細胞毒性
遵照實施例18的程序，使用含有643mM TEA，pH5.7，同滲重摩530mmol/kg的包載的TEA-SOS溶液，以170mg/mmol的藥物/磷脂比率制備脂質(zhì)體托泊特坎。脂質(zhì)體具有55mg藥物/mmol磷脂；190％的裝載效率和105nm的顆粒大小。總體上如實施例19所述，這些脂質(zhì)體與F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物的膠束溶液，以每脂質(zhì)體大約30 scFv(15mg抗體/mmol磷脂)在60℃溫育大約1小時。使用Sepharose CL-4B通過SEC分離連接抗體的脂質(zhì)體，并配制入HBS-6.5 HEPES-緩沖鹽水中。在連接抗-HER2 scfv(F5)期間，藥物/脂類比率沒有可檢測的變化。
如下測定癌細胞對托泊特坎制劑的吸收。將HER2-過量表達的人乳腺癌細胞(SK-Br-3，ATCC HTB-30)以150,000細胞/孔鋪到24孔細胞培養(yǎng)板，并馴化過夜。在37℃，以0.1mM和0.01mM的脂質(zhì)體濃度，將細胞與F5-定向脂質(zhì)體托泊特坎和非定向脂質(zhì)體托泊特坎在完全生長培養(yǎng)基中溫育4小時(一式三份)。用Hanks′平衡鹽溶液沖洗細胞4次，溶解在0.1％Triton X-100-70％酸化的異丙醇混合物110中，通過熒光測定法測定每孔中與細胞連接的托泊特坎的數(shù)量。將結(jié)果(平均值±標準誤差)概述于表22中。定向脂質(zhì)體輸送比非定向脂質(zhì)體多100-300倍的藥物進入定向的細胞。
表22.SK-Br-3乳腺癌細胞對脂質(zhì)體托泊特坎的吸收
如實施例27所述描述地，測定這些托泊特坎制劑對SKBr-3乳腺癌細胞的細胞毒性。將SKBr-3細胞以5,000細胞/孔接種入96-孔板，馴化過夜，用于細胞生長培養(yǎng)基中的增加濃度的(0.004-30g/mL)游離托泊特坎、脂質(zhì)體托泊特坎或F5-免疫脂質(zhì)體托泊特坎37℃溫育4小時。去除含藥物的培養(yǎng)基，將細胞生長在無藥物培養(yǎng)基中72小時。利用噻唑藍(MTT)分析方法測定每孔中存活細胞的數(shù)量，用與對照(未處理)細胞的百分比表示。結(jié)果呈現(xiàn)在圖10中。托泊特坎免疫脂質(zhì)體的毒性(IC50≥0.15-0.5μg/mL)大于非定向托泊特坎脂質(zhì)體(IC50≥3.1μg mL)和游離托泊特坎(IC50≥2.3μg/mL)。
實施例33.不同大小的托泊特坎脂質(zhì)體的體內(nèi)穩(wěn)定性
如實施例22所述，通過12次擠壓通過100nm孔徑聚碳酸酯膜或另外再12次通過50nm孔徑聚碳酸酯膜制備含有TEA-Pn的脂質(zhì)體。以150g/mo1磷脂的比率加入托泊特坎(TPT)。裝載在58℃熱水浴中45min完成，然后在冰上淬火。50-nm-和100-nm-擠出的脂質(zhì)體的裝載效率分別為126.80±19.24μg TPT/μmol PL(84.5±12.8％)和148.48±10.26μg TPT/μmol PL(99.0±6.8％)。三組中的雌性SwissWebster小鼠以5mg TPT/kg的劑量靜脈內(nèi)注射兩種Ls-TPT制劑中的其中一種。6小時后殺死小鼠，并收集血液。如實施例22所述，分析血漿中的TPT和脂質(zhì)體脂類。結(jié)果呈現(xiàn)在表23中。
表23.使用TEA-Pn包載方法裝載的不同大小的Ls-TPT的體內(nèi)穩(wěn)定性 實施例34.6-(3-氨丙基)玫瑰樹堿(6-APE)的合成和脂質(zhì)體包囊
根據(jù)Werbel et al.，J. Med.Chem.1986，v.29，p.1321-1322的程序，在兩步法中由玫瑰樹堿制備6-(3-氨丙基)玫瑰樹堿。室溫中，將501.4mg玫瑰樹堿基本成分(NSC71795)(Aldrich Chemical Co.)與大約100mg氫化鈉(Sigma；用無水石油醚洗滌)在5ml干二甲基甲酰胺(DMF)中攪拌30min。在2mL干DMF中，向該混合物逐滴加入678mg的N-溴丙基酞酰亞胺(bromopropylphtalimide)(Aldrich)溶液。氬中攪拌紫色的反應混合物過夜，用1mL水處理，并傾倒入60ml水中?；旌衔镉?5mL二氯甲烷提取兩次，提取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并通過中性氧化鋁層。氧化鋁層用10mL二氯甲烷沖洗兩次，合并的過濾物和沖洗物在真空中干燥。產(chǎn)物用20ml無水乙醇和2ml無水肼在室溫中攪拌過夜。將獲得的漿在真空下過濾，黃色的過濾物用50mL 0.2N NaOH稀釋，并用兩份(75ml和50ml)氯仿提取。氯仿提取物經(jīng)Na2SO4干燥，并在真空中干燥。粗產(chǎn)物(產(chǎn)量408mg)在硅60柱上層析，用氯仿-甲醇混合物(體積比7∶3)等度洗脫，用干三甲胺飽和。在未反應的玫瑰樹堿之后，洗脫在第二黃色帶中的餾分，顯示出含有大約30％產(chǎn)量的期望的化合物。結(jié)果由1H-NMR.TLC確定Rf0.29-0.31(硅60；CHCl3-MeOH體積比7∶3，用三甲胺飽和)。玫瑰樹堿，Rf 0.81-0.83。通過溶解在無水乙醇中并在干異丙醇中用6 N HCl溶液滴定，將獲得的化合物轉(zhuǎn)化為二鹽酸鹽。過濾出橙色晶體6-APE二鹽酸鹽(NSC 176328)，用醚沖洗，真空中干燥。二鹽酸鹽的產(chǎn)量為86％。
如下制備脂質(zhì)體在0.5M TMA的三甲銨多磷酸鹽(TMA-Pn)溶液，pH5.6中，60℃對DSPC、膽固醇和PEG(分子量2000)-DSPE(3∶2∶0.015摩爾比)組成的純脂膜進行水合，然后經(jīng)六個循環(huán)的快速冷凍(-78℃)和解凍(60℃)，并10次擠壓通過二疊層50-nm孔徑聚碳酸酯過濾器。使用Sepharose CL-4B柱，用HEPES-葡萄糖(5mM HEPES，5％葡萄糖，pH5.5)洗脫，去除未包囊的TMA-Pn。脂質(zhì)體大小為85.7±32.1nm。
以100g APE/mol磷脂的藥物與磷脂比率，將濃的6-APE溶液(10mg/ml)加入到含TMA-Pn的脂質(zhì)體，將混合物在58℃溫育45分鐘，并在冰上快速冷卻15分鐘。通過用HEPES-葡萄糖緩沖液(5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH6.5)洗脫，在Sephadex G-75柱上凝膠層析去除未包囊的藥物。然后如實施例71所述地，通過分光光度法對脂質(zhì)體包載的APE進行定量，使用實施例70的提取分析法測定脂質(zhì)體磷脂。藥物包囊定量實施。
實施例35.HER2-定向免疫脂質(zhì)體6-APE的制備，以及體外6-APE制劑對HER2-過量表達的BT-474乳腺癌細胞的細胞毒性
如上面實施例34所述，制備含有包囊的6-APE的脂質(zhì)體(Ls-APE)。遵照實施例19的方法，由Ls-APE制備含有包囊的6-APE的抗-HER2免疫脂質(zhì)體(F5-ILs-APE)。實施例27的MTT-基細胞存活分析方法被用于測定作為溶液、作為Ls-APE和作為HER2-定向F5-ILs-APE輸送的6-APE對HER2-過量表達的人乳腺癌細胞(BT-474)的細胞毒性。將細胞暴露于含藥物的培養(yǎng)基6小時，之后在無藥物培養(yǎng)基中溫育3小時。結(jié)果顯示在圖15中。游離APE的IC50是0.26μg APE/ml，F(xiàn)5-ILs-APE的IC50是0.756μg APE/ml，而非定向Ls-APE的IC50是51.0μg APE/ml。定向和非定向脂質(zhì)體之間的活性差異有67.5倍，這表明具有相當大的定向輸送效應。
實施例36.6-APE的EGFR-定向免疫脂質(zhì)體制劑和在體外對癌細胞的細胞毒性
如實施例34所述，制備裝載6-APE的脂質(zhì)體。通過與EGFR-特異性Fab′抗體片段連接，制備EGFR-定向免疫脂質(zhì)體，如下描述。EGFR-特異性IgG MAbC225(cetuximab，ERBITUXTM，Imclone Systems)用胃蛋白酶消化產(chǎn)生(Fab′)2片段。通過在37℃用10-20mM 2-巰基乙胺處理15min，還原純化的(Fab′)2片段，通過使用Sephadex G-25進行凝膠過濾來純化Fab′片段。反應性硫醇基團典型地以每蛋白分子約0.9硫醇基團存在(使用Ellmann′s試劑定量)。在pH6.2-6.5的含水溶液中，以蛋白-接頭摩爾比1∶4，將C225Fab′共價連接到兩親性接頭Mal-PEG-DSPE(AvantiPolar Lipids，AL)，在室溫中進行2-4小時，或在4-6℃中過夜，產(chǎn)生C225Fab′-PEG-DSPE偶聯(lián)物，產(chǎn)量為蛋白質(zhì)的30-50％。在3％瓊脂糖-4％聚丙酰胺珠狀凝膠(Ultrogel AcA34，獲自Sigma Chemical Co.)進行尺寸排阻柱層析，用HBS-6.5緩沖液洗脫，將形成膠束的偶聯(lián)物與未反應的蛋白分離開來。在孔隙體積部分中回收偶聯(lián)物。按照如下方法形成免疫脂質(zhì)體6-APE將C225 Fab′-PEG-DSPE與裝載藥物的脂質(zhì)體一起以30mg C225蛋白/mmol脂質(zhì)體的比率在60℃溫育30min，在冰上淬火15min，Sepharose CL-4B柱上層析，用HBS-6.5緩沖液洗滌純化免疫脂質(zhì)體(脂質(zhì)體出現(xiàn)在柱的孔隙體積中或附近)。
將MDA-MB-468 EGFR-過量表達的人乳腺癌細胞和EGFR表達水平低的MCF-7人乳腺癌細胞(ATCC，Rockville，MD)培養(yǎng)在供應方建議的生長培養(yǎng)基中，并根據(jù)實施例27的方法研究游離6-APE、脂質(zhì)體6-APE和抗-EGFR-免疫脂質(zhì)體6-APE對這些細胞的細胞毒性。將這些與含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，然后溫育后置于無藥物培養(yǎng)基中3天。結(jié)果顯示在圖16中。在MDA-MB-468細胞中，對于游離6-APE，IC50為約0.1μg/ml，對于C225-ILs-APE，IC50為約0.9μg/ml。在MCF-7細胞中，對于游離6-APE，IC50為約0.5μg/ml，對于C225-ILs-APE，IC50為約14μg/ml。在兩種細胞系中，Ls-APE的IC50大于＞30μg/ml。因此，裝載EGFR-定向6-APE的免疫脂質(zhì)體在EGFR-過量表達的MDA-MB-468乳腺癌細胞中表現(xiàn)出抗原-特異性細胞毒性活性，但是在不過量表達EGFR的MCF-7乳腺癌細胞中并沒有表現(xiàn)出這種細胞毒性活性。在MCF-7細胞中，定向和非定向6-APE脂質(zhì)體活性相等。
實施例37.脂質(zhì)體6-APE在大鼠中的藥物動力學
如上面實施例11所述，制備含有包載的TEA-Pn溶液(557mM磷酸鹽基團，500mM TEA，pH5.8，同滲重摩480mmol/kg)的脂質(zhì)體以及DSPC、膽固醇和PEG-DSPE(摩爾比3∶2∶0.015)的脂類組合物。將脂類的乙醇溶液在60℃與10體積的含水TEA-Pn溶液混合，并10次擠壓通過二疊層80nm孔徑聚碳酸酯膜。使用Sepharose CL-4B柱，用MES-葡萄糖(5mM MES-Na，5％葡萄糖，pH5.5)洗脫，去除未包囊的TEA-Pn。經(jīng)QELS測定脂質(zhì)體大小為92.3±23.3nm。以0.5mCi/mmol磷脂，將非-可交換的放射性脂類標記[3H]-CHE包括在脂類基質(zhì)中。如實施例34所述，脂質(zhì)體用6-APE裝載。
遵照實施9的方案研究藥物動力學。雌性Sim Albino大鼠(9周齡，200g)經(jīng)靜脈注射10mg 6-APE/kg。在規(guī)定的時間點獲取血液，通過熒光測定法分析血漿中的6-APE。將血漿等分試樣(0.05-0.2ml)與1-2mL 90％含水異丙醇-0.1N HCl混合，利用熒光對6-APE定量，如實施例71。脂類通過[3H]-CHE放射性閃爍計數(shù)法定量。
結(jié)果顯示在圖17中。藥物的血液半衰期(t1/2)為13.7小時，脂質(zhì)體脂類為16.6小時(圖17A)。藥物由脂質(zhì)體釋放的半衰期是77.9，證明具有非凡的包囊穩(wěn)定性(圖17B)。
實施例38.2-(2-(N，N-二乙基氨基)乙基)玫瑰樹堿(2-DAE)的合成和脂質(zhì)體包囊
2-(2-(N，N-二乙基氨基)乙基-玫瑰樹堿鎓氯化物(NSC 359449)是抗腫瘤玫瑰樹堿衍生物，其通過在甲醇中，在三乙胺存在下用2-(N，N-二乙基氨基)乙基氯對玫瑰樹堿進行烷基化作用制備而得(參見Werbel，L.M.，Angelo，M.，F(xiàn)ry，D.M.，和Worth，D.F.J.Med.Chem.1986，291321-1322)。如實施例37所述的方法制備含有包載的TEA-Pn的脂質(zhì)體。在5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH7.4中，以2-DAE-與-磷脂比率為100μg/μmol，將2-DAE.2HCl與TEA-Pn脂質(zhì)體溫育。裝載的藥物的數(shù)量是88.2μgAPE/μmol PL(效率88.2％)。
實施例39.脂質(zhì)體2-DAE在大鼠中的藥物動力學
如實施例37所述研究脂質(zhì)體2-DAE(實施例38)在大鼠中的血液藥物動力學。2-DAE的t1/2是17.8h，脂質(zhì)體脂類基質(zhì)的t1/2是18.2h(A)。在血液中藥物從脂質(zhì)體釋放出來的半衰期是t1/2＝677h(B)。因此，那些脂質(zhì)體在血流中對藥物滲漏特別穩(wěn)定。
實施例40.使用TEA-Pn方法將長春瑞濱裝載入脂質(zhì)體。pH的影響
利用實施例11的乙醇注射方法制備脂質(zhì)體，該方法使用0.608M TEA，0.65M磷酸鹽基團的TEA-Pn溶液，pH6.1，同滲重摩為531mmol/kg；將脂類懸浮液15次擠壓通過二疊層100nm孔徑聚碳酸酯膜。經(jīng)QELS測定，所得的脂質(zhì)體大小為108.3±17.1nm。以藥物-與-磷脂比率為350μg/μmol，將長春瑞濱酒石酸鹽貯存液10mg/mL USP形式的長春瑞濱(VRB)加入到于含水5mM HEPES-Na，5％葡萄糖，pH6.5中的脂質(zhì)體，用1-5N NaOH將pH調(diào)整到理想值，將混合物在58±2℃溫育30min。然后將混合物在冰上冷卻15min，通過Sephadex G-75凝膠過濾層析，用HBS-6.5緩沖液(20mM HEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5)洗脫去除未包囊的藥物。然后將純化的脂質(zhì)體的等分試樣溶解在酸性異丙醇中，使用分光光度法在270nm處分析長春瑞濱。在甲醇-氯仿提取之后，利用Bartlett的磷酸鹽分析方法(1959)定量脂質(zhì)體磷脂。
計算的裝載后藥物-對-脂類比率是如同表24中顯示。長春瑞濱裝載是定量的(即幾乎100％)，并在研究范圍內(nèi)獨立于pH。
表24.在各種pH值的外部緩沖液中，長春瑞濱裝載入含包載的TEA-Pn的脂質(zhì)體中 實施例41.以各種不同的藥物/脂類比率包封率、利用TEA-Pn方法制備的脂質(zhì)體長春瑞濱和小鼠體內(nèi)穩(wěn)定性
根據(jù)實施例40制備帶有截留的TEA-Pn溶液的脂質(zhì)體；除了以1.5mCi/mmol磷脂，將[3H]-CHE引入到脂類基質(zhì)中。經(jīng)QELS測定，脂質(zhì)體大小為98.5±34.3nm。以藥物-與-磷脂比率150-450mg VRB/mmol，將脂質(zhì)體與處于5mMHEPES-Na，5％葡萄糖，pH6.5的含水緩沖液中的酒石酸長春瑞濱USP(美國藥典)混合，在58±2℃下溫育30分鐘(min)。加入藥物之后，不調(diào)節(jié)pH。分離裝載了長春瑞濱的脂質(zhì)體(vinorelbine-loaded liposames(Ls-VRB))，并如實施例40所述分析藥物和磷脂。
以5mg VRB/kg的劑量，給處于三個組中的雌性5-6周齡的Swiss Webster小鼠(Harlan Bioresearch)，靜脈注射Ls-VRB-Pn。脂類劑量根據(jù)裝載程度變化，并可以由上面計算出的藥物-與-脂類比率確定。在注射后8小時或24小時，麻醉動物，放血，并在冰上將血液收集入稱重過的管中，管中含有已知量的含0.04％EDTA的PBS。離心收集血細胞；并如下所述，通過[3H]-CHE放射性閃爍計數(shù)法分析上清液中的脂質(zhì)體脂類，利用HPLC分析長春瑞濱。樣品摻有長春堿(內(nèi)標)，用乙醚提取，蒸發(fā)，將殘留物溶解在移動相中，移動相由含水的50mM三乙錢醋酸鹽(pH5.5)和乙腈(體積比58∶42)組成。在C-18保護柱之前，將樣品加載在C18反相硅柱(Supelco C-18柱，250mm×4mmi.d.(內(nèi)徑)，顆粒大小5μm)上。用上面的移動相，以1.0ml/min的流速，等度洗脫該柱。吸光率檢測儀在280nm處檢測VRB。VRB和長春堿(內(nèi)標)的典型保留時間，分別為9.1min和7.8min。
結(jié)果顯示在表25中。裝載效率隨著藥物/脂類比率的增加而減小，從150mg/mmol下的幾乎100％減小至450mg/mmol下的約66％。注意到，以每mmol磷脂超過250mg長春瑞濱的比率加入酒石酸長春瑞濱，引起脂質(zhì)體懸浮液發(fā)生實質(zhì)上的酸化(pH＜4.0)，從而導致裝載效率降低。因此，確立了在藥物裝載步驟期間，需要控制pH。8小時之后，在血液中檢測到的脂質(zhì)體基質(zhì)的數(shù)量是在被注射劑量(iniected dosed(％id))的30.4±6.6％至38.6±5.2％id的范圍內(nèi)，與被注射脂類的絕對數(shù)量無明顯的關(guān)系。在24小時之后，血液中依然可以檢測到脂類基質(zhì)的6.4％ID至14.8％ID。8小時后，保持被包囊態(tài)的藥物的數(shù)量在37％至63％之間變化。然而，在注射后24小時，藥物水平下降到所應用的分析方法的檢測極限之下。
表25.使用TEA-Pn方法(不調(diào)節(jié)裝載緩沖液pH)、在不同藥物/脂類比率下所制備的脂質(zhì)體長春瑞濱的包封率和體內(nèi)藥物保留。藥物保留數(shù)據(jù)是平均值±SD(N＝3)。
實施例42.以不同藥物/脂類比率，使用TEA-SOS方法，將長春瑞濱裝載入脂質(zhì)體
除了用TEA-SOS溶液(0.65M TEA，pH5.4，同滲重摩521mmol/kg)替換TEA-Pn溶液外，如實施例40所述制備用于藥物裝載的TEA-SOS脂質(zhì)體，并使脂質(zhì)體擠壓通過80nm孔徑的聚碳酸酯膜。經(jīng)QELS測定，脂質(zhì)體大小為86.6±12.9nm。以不同的藥物-與-磷脂比率，將VRB加入到處于含水5mM HEPES-Na、5％葡萄糖、pH6.5中的脂質(zhì)體，隨后將混合物在60℃下溫育30分鐘。然后分離裝載了VRB的脂質(zhì)體，并如實施例40中所述進行分析。
在VRB脂質(zhì)體中，計算的藥物-與-脂類比率示出于表26中。令人注目地，與聚合陰離子輔助的裝載不同，在使用聚陰離子化的糖(蔗糖八硫酸酯(sucroseoctasulfate))的脂質(zhì)體中的長春瑞濱裝載幾乎是定量的，獨立于藥物/脂類比率，最高可達450mg VRB/mmol磷脂的；僅僅在550mg VRB/mmol磷脂時，稍微低些(88％)。
表26.長春瑞濱裝載入脂質(zhì)體對藥物-與-脂類比率的依賴性 實施例43.通過TEA-Pn方法裝載有長春瑞濱的HER2-定向免疫脂質(zhì)體的制備，HER2-定向和非定向長春瑞濱脂質(zhì)體在大鼠中的比較血液藥物動力學
如實施例19制備抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物。將非定向長春瑞濱脂質(zhì)體(實施例41，以350mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載)與F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物(實施例19)，在含水20mM HEPES-Na、135mM NaCl、pH6.5緩沖液中，以15mg/mmol蛋白質(zhì)/磷脂比率、在60℃下溫育30分鐘，制備HER2-定向長春瑞濱免疫脂質(zhì)體。通過在Sepharose 4B柱上、用相同的緩沖液洗脫而進行凝膠層析，去除未摻入的F5偶聯(lián)物。將非定向的脂質(zhì)體(Ls-Pn-VRB)和HER2-靶向脂質(zhì)體(F5-ILs-Pn-VRB)，以5mg VRB/kg劑量，靜脈內(nèi)給予雌性Albino大鼠(8-9周齡；200g)。在不同時間點，如實施例9所述收集血液，并如實施例41中那樣地分析VRB和脂質(zhì)體脂類。通過使用MICROSOFT EXCEL(Microsoft Corp.)電子數(shù)據(jù)表格動向功能(spreadsheetTREND function)，以便找到單指數(shù)動力學的最佳擬合；從而分別由脂類濃度-時間圖或由藥物/脂類比率-時間圖，計算出脂質(zhì)體脂類的血液半衰期和50％藥物釋放時間。結(jié)果(圖18)表明定向的和非定向的長春瑞濱脂質(zhì)體具有相同的藥物和脂類的藥物動力學，其中脂類半衰期為約12.1小時，并且50％藥物釋放時間是約4.3小時。
實施例44.使用銨和取代的銨鹽制備的長春瑞濱脂質(zhì)體的制劑和比較體內(nèi)穩(wěn)定性
葡聚糖硫酸酯銨(ammonium dextran sulfate(DS-A))溶液(pH5.8，0.65MNH4+，同滲重摩390mmol/kg)和葡聚糖硫酸酯三乙基銨溶液(triethylammoniumdextran sulfate(DS-TEA))(pH6.0，0.65M NH4+，同滲重摩465mmol/kg)，是根據(jù)實施例4的方法，由分子量為10,000的葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)(SigmaChemical Co.)，分別采用12.4M含水的銨或純?nèi)野愤M行滴定制備而來。由分析級硫酸銨制備硫酸銨(ammonium sulfate(S-A))含水溶液，325mM，pH5.1，同滲重摩703mmol/kg。所有三種溶液含有的Na+是總陽離子含量的1％以下。使用實施例41的乙醇混合-擠出方法(DSPC/膽固醇/PEG-DSPE 3∶2∶0.015摩爾比)，制備包載有這些溶液的脂質(zhì)體。以1.5mCi/mmol磷脂，將放射性脂類標記[3H]-CHE引入到脂類基質(zhì)中。擠壓步驟由10次通過二疊層的0.1um聚碳酸酯膜組成。以350mg/mmol的藥物-與-磷脂比率，將VRB加入到處于5mM HEPES-Na、5％葡萄糖、pH6.5中的脂質(zhì)體中，用lN NaOH將pH調(diào)節(jié)到6.5；并且將混合物在58-60℃下溫育30分鐘。然后，反應物質(zhì)在冰上被冷卻15min；并使用Sephadex G-75凝膠過濾層析去除未包封的藥物，采用含水的20mM HEPES-Na、135mM NaCl、pH6.5進行洗脫。通過分光光度技術(shù)，分析純化的、裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體中的VRB；并使用Bartlett(1959)的磷酸鹽分析方法分析磷脂(參見實施例70、71)。如實施例43所述，在大鼠中研究脂質(zhì)體的脂類和藥物的血液藥物動力學。
結(jié)果顯示于圖19-20以及表27中。將用葡聚糖硫酸酯三乙基銨裝載的脂質(zhì)體與那些用葡聚糖硫酸酯的銨鹽裝載的脂質(zhì)體進行比較。出乎意料地，相當程度上，那些用三乙基銨鹽裝載的脂質(zhì)體比那些用銨鹽裝載的脂質(zhì)體穩(wěn)定更多。對于三種不同的制劑，脂質(zhì)體載體本身的藥物動力學相似；因此，主要取決于所利用的脂類組成成分。從用葡聚糖硫酸酯三乙基銨裝載的Ls-VRB滲漏長春瑞濱，比起那些用葡聚糖硫酸酯銨裝載的脂質(zhì)體，慢大約三倍。使用硫酸銨裝載的脂質(zhì)體具有最快的藥物滲漏速度。
表27.藥物包封進使用包載有銨和取代的銨鹽的脂質(zhì)體中的比較體內(nèi)穩(wěn)定性 實施例45.不同大小的裝載長春瑞濱的脂質(zhì)體的制備和體內(nèi)穩(wěn)定性
利用實施例11的乙醇混合-擠壓方法，制備帶有包載的蔗糖八硫酸酯三乙基銨(triethylammonium sucrose octasulfate)溶液(0.65M TEA，pH6.4，同滲重摩502mmol/kg)的[3H]-CHE-標記脂質(zhì)體(1.5mCi/mmol磷脂)。擠出步驟包含15次通過孔徑為0.05μm、0.08μm或0.1μum的二疊層聚碳酸酯膜。遵照實施例40的方法，進行長春瑞濱裝載、長春瑞濱脂質(zhì)體分離、以及脂質(zhì)體表征。雌性Albino大鼠(8-9周齡；200g)被用于研究脂質(zhì)體體內(nèi)穩(wěn)定性。如實施例43所述，在大鼠中研究脂質(zhì)體脂類和藥物的藥物動力學。
結(jié)果顯示在圖21、22以及下面的表28中。將擠壓通過0.05、0.08和0.1μm聚碳酸酯過濾器的脂質(zhì)體進行比較，并顯示出具有相似的藥物和脂質(zhì)體載體藥物動力學，以及相似程度的內(nèi)含物滲漏。藥物在血液中從脂質(zhì)體的釋放是用50％釋放時間表征，是在大約40-80小時的范圍內(nèi)；令人滿意地，高于24小時。
表28.長春瑞濱脂質(zhì)體的表征 實施例46.使用TEA-SOS包載方法制備HER2-定向長春瑞濱脂質(zhì)體，以及大鼠中HER2 scFv-定向和非定向免疫脂質(zhì)體長春瑞濱的藥物動力學
如實施例30所述，制備脂質(zhì)體，以350mg/mmol的藥物-磷脂比率裝載長春瑞濱，并進行分析；除了實施例45的TEA-SOS(蔗糖八硫酸酯三乙基錢)溶液被替換為TEA-Pn溶液。擠出步驟包括15次通過0.08μm孔徑的聚碳酸酯過濾器。經(jīng)QELS測定，脂質(zhì)體大小為95.0±26.0nm。由這些長春瑞濱脂質(zhì)體制備F5scFv-連接的抗-HER2長春瑞濱免疫脂質(zhì)體，并且在大鼠中研究HER2-定向和非定向脂質(zhì)體長春瑞濱的脂質(zhì)體脂類和藥物的血液藥物動力學，如實施例43中所述。對于F5-ILs-VRB和Ls-VRB，脂質(zhì)體脂類的循環(huán)半衰期分別是11.4小時和10.3小時；50％藥物釋放時間分別是30.9小時和30.3小時。因此，Ls-VRB和F5-ILs-VRB的脂類和藥物的藥物動力學是非常接近的，這表明scFv-PEG-DSPE偶聯(lián)物的引入在循環(huán)時既不影響對載體本身的清除，也不導致藥物從載體滲漏的增加(圖23、24)。
實施例47.包含聚(乙二醇)的非離子型脂類衍生物的長春瑞濱脂質(zhì)體之制備和藥物動力學特性
合成的C20-神經(jīng)酰胺之甲氧基-PEG(分子量2,000)-衍生物(PEG-神經(jīng)酰胺)，是得自Northern Lipids，Inc.，Canada。甲氧基-PEG(分子量2,000)-二硬脂酰丙三醇(PEG-DSG)(SUNBRIGHT GS20)是獲自NOF Corp.，Japan。
具有摩爾比為3∶2∶0.3的DSPC、膽固醇和PEG-脂類(PEG-神經(jīng)酰胺或PEG-DSG)的脂類組成的并且包載有TEA-SOS溶液(0.65M TEA，pH6.4，同滲重摩502mmol/kg)的脂質(zhì)體，是通過實施例11的乙醇混合/擠壓方法制備的。擠壓步驟包括兩次通過兩個層疊式聚碳酸酯膜過濾器，其中層疊式聚碳酸酯膜過濾器使用孔徑為0.2μm的兩次以及使用孔徑為0.08μm的10次。脂質(zhì)體以350mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載長春瑞濱，用大小、藥物和脂類濃度表征；并且，如實施例46所述，在大鼠中研究它們的藥物動力學。兩種制劑顯示出延長的脂類基質(zhì)循環(huán)時間，以及緩慢的藥物體內(nèi)釋放；其中，在24小時后，體內(nèi)血液中至少50％的藥物保持在包封狀態(tài)，如下面的表29中所示。
表29含有不同PEG-脂類的長春瑞濱脂質(zhì)體的表征
引人注目地，與具有低PEG化(總脂類的約0.3mol.％)之相似的、大小相配的脂質(zhì)體(實施例45，109.6nm，t1/2＝14.3小時；98.5nm，t1/2＝13.0小時)相比，增加這些脂質(zhì)體的PEG化(PEG脂類含量為總脂類的約5.7mol.％)幾乎沒有影響脂質(zhì)體血液循環(huán)壽命。
實施例48.HER2-定向脂質(zhì)體長春瑞濱的制備；以及游離、HER2-定向、和非定向脂質(zhì)體長春瑞濱對體外MDA-MB-453細胞的細胞毒性
如實施例42那樣(無[3H]-CHE)，在pH6.0和350μg長春瑞濱/μmol磷脂下，通過藥物裝載，制備裝載有長春瑞濱的脂質(zhì)體(Ls-VRB)。通過將這些脂質(zhì)體與F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物溫育，形成抗-HER2免疫脂質(zhì)體長春瑞濱(F5-ILs-VRB)，如上面實施例19和42中所述；除了不加入[3H]-CHE之外。通過將酒石酸長春瑞濱的10mg/ml溶液USP(美國藥典)稀釋入細胞培養(yǎng)基，制備“游離型”長春瑞濱。個
MDA-MB-453是適度過量表達HER2受體(約3×104個至1×105個拷貝/細胞)的人乳腺腺癌細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)。作為游離藥物、作為非定向脂質(zhì)體長春瑞濱或作為HER2-定向(F5)-免疫脂質(zhì)體長春瑞濱所遞送的VRB對MDA-MB-453細胞的細胞毒性，是如實施例27所述那樣而確定的。不同之處在于在供應方所推薦的生長條件下(Leibowitz L-15，含有10％的胎牛血清，不補充CO2)，將細胞以10,000個細胞/孔的密度鋪在96孔微量滴定板上；并且以0.03-0.1mg/ml起始，將藥物制劑以1∶3逐步稀釋的系列加入。將細胞存活力數(shù)據(jù)對藥物濃度作圖(圖25)，并將細胞存活力減少到50％(IC50)所需的藥物濃度從圖上估計得到。F5-定向長春瑞濱脂質(zhì)體的IC50(0.06μg/ml)與游離藥物的IC50(0.07μg/ml)接近，大大低于非定向脂質(zhì)體的IC50(2.2μg/ml)。這體現(xiàn)出活性增加37倍，是藥物的癌細胞特異性定向遞送的一個結(jié)果。
實施例49.游離的、HER2-定向的和非定向的脂質(zhì)體長春瑞濱對體外CaLu-3細胞的細胞毒性
前面實施例(實施例48)的脂質(zhì)體和方法，被用于研究游離長春瑞濱、Ls-VRB和F5-ILs-VRB在HER2-過量表達的人非小細胞肺癌細胞CaLu-3(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD)中的細胞毒性。在5％CO2存在下，將細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI-1460培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示在圖26中。游離VRB的IC50為1.2μg/ml，F(xiàn)5-ILs-VRB的IC50為10μg/ml，非定向Ls-VRB的IC50為50μg/ml。這表明作為定向輸送到細胞的效用，在脂質(zhì)體包囊的藥物的活性上，存在5倍的增加。
實施例50.游離長春瑞濱、HER2-定向和非定向脂質(zhì)體長春瑞濱對體外SKBr-3細胞的細胞毒性
實施例48的脂質(zhì)體和方法，被用于研究游離長春瑞濱、Ls-VRB和F5-ILs-VRB在HER2-過量表達的乳腺癌細胞SKBr-3(American Type CultureCollection，Rockville，MD)中的細胞毒性；除了，在5％CO2存在下，將細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的改良型McCoy 5A培養(yǎng)基中，以5,000個細胞/孔的密度鋪板，并且將藥物與細胞溫育6小時。
結(jié)果顯示在圖27中。游離VRB的IC50為0.28μg/ml，F(xiàn)5-ILs-VRB的IC50為0.17μg/ml，且非定向Ls-VRB的IC50為0.8μg/ml。這表明作為定向輸送到細胞的一個作用，藥物活性增加4.7倍。
實施例51.在小鼠的HT29人結(jié)腸癌異種移植物中，脂質(zhì)體長春瑞濱的體內(nèi)抗腫瘤功效
小的單層囊脂質(zhì)體(經(jīng)QELS測定為93.2±26.4nm)是從二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-DSPE(3∶2∶0.045摩爾比)制備的，是通過在蔗糖八硫酸酯三乙基銨的含水溶液(0.6M三乙銨，pH5.7-6.2)中，由濃乙醇溶液水合；然后反復擠壓通過聚碳酸酯膜(100nm孔尺寸)；去除脂質(zhì)體外的聚陰離子鹽；并且在等滲緩沖液中，pH6.5，以325mg VRB/mmol磷脂的藥物/脂類比率，在60℃下，通過與脂質(zhì)體進行溫育，從而裝載長春瑞濱，如實施例42中所述。
在雌性BALB/c純合體裸鼠(6-8周，稱重為17-20g)的脅區(qū)皮下注射1×106個HT-29人結(jié)腸癌細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)。從腫瘤接種后的第16天起，當平均腫瘤直徑達到5-8mm，將小鼠隨機分成三個組，每組6只動物；并且，以5mg/kg的劑量，每三天一次，通過尾靜脈用游離型或脂質(zhì)體型長春瑞濱進行治療，總共注射4次。對于對照組，小鼠用等體積鹽水治療。使用游標卡尺測量每只小鼠的腫瘤大小，并且使用下述公式計算腫瘤體積(腫瘤長度)×(腫瘤寬度)2/2。為了評價與治療相關(guān)的毒性，對動物也每周兩次進行稱重。脂質(zhì)體型長春瑞濱在抑制HT-29腫瘤生長上顯示出比游離型長春瑞濱切實更大的有效性，導致腫瘤消退；而在游離藥物組中，腫瘤不斷持續(xù)生長(圖28)。在治療過程中動物體重鮮有變化，這表明治療是充分耐受的，也表明脂質(zhì)體化(liposomalization)并不增加藥物毒性(圖29)。
實施例52.脂質(zhì)體型長春瑞濱對抗C-26同系鼠結(jié)腸癌腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤功效
如實施例48制備脂質(zhì)體型長春瑞濱和游離型長春瑞濱。雄性BALB/c小鼠(6-8周，稱重17-20g)皮下接種2×105個C-26鼠結(jié)腸癌細胞。接種后第17天，當平均腫瘤直徑達到5-8mm時，將小鼠隨機分成六個處理組，每組5只動物。對荷瘤小鼠，通過尾靜脈，以6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg注射游離長春瑞濱，以及以4mg/kg或6mg/kg的劑量注射脂質(zhì)體型長春瑞濱，每三天一次，總共注射4次。對于對照組，小鼠注射等體積的生理鹽水。腫瘤體積和動物體重遵照實施例51測定。甚至4mg/kg的脂質(zhì)體型長春瑞濱，在減少腫瘤生長上也比12mg/kg的游離藥物效率更加相當有效(圖30)。在治療過程中動物體重幾無變化(＜10％減輕)，這表明與游離藥物的毒性相比，脂質(zhì)體型長春瑞濱的毒性并不增加(圖31)。
實施例53.HER2-定向脂質(zhì)體長春瑞濱對小鼠的BT-474人乳腺癌異種移植物腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤功效裝載反離子的影響
除了不加入[3H]-CHE之外，分別通過實施例41的TEA-Pn方法和實施例42的TEA-SOS方法，制備大小為99.5±10.2nm的裝載有VRB的脂質(zhì)體。以350mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載VRB。通過將這些脂質(zhì)體與F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物(參見實施例19)溫育，形成HER2-定向脂質(zhì)體型長春瑞濱，如實施例43所述。BT-474 HER2-過量表達的人乳腺癌異種移植物，是在純合型裸鼠中培育，如實施例10中那樣進行。腫瘤細胞接種后第25天，當腫瘤大小達到約200mm(范圍144-309mm)時，將小鼠隨機分入四個組，每組8只動物，通過靜脈注射接受如下治療5mg/kg的游離VRB；F5-ILs-VRB，以Pn作為反離子；或F5-ILs-VRB，以SOS作為反離子，劑量為5mg/kg，每周一次，總共三次注射。對照組接受等體積的生理鹽水。如實施例10中那樣，監(jiān)控腫瘤和動物體重。當以5mg VRB/kg的劑量給予時，使用蔗糖八硫酸酯裝載的HER2-定向脂質(zhì)體型長春瑞濱，在減小腫瘤生長上，效率明顯高于使用多(磷酸鹽)裝載的同樣的定向構(gòu)建物；而這兩種免疫脂質(zhì)體制劑的效率比游離長春瑞濱高許多(圖32)。經(jīng)藥物治療的小鼠表現(xiàn)出很小的重量變化，這表明治療是充分耐受的(圖33)。
實施例54.HER2-定向脂質(zhì)體型長春瑞濱對小鼠的BT-474人乳腺癌異種移植物腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤功效PEG化的影響。
在含水蔗糖八硫酸酯三乙基銨中，經(jīng)乙醇溶液方法，通過水合摩爾比為3∶2∶0.015(″0.5％PEG″)或3∶2∶0.3(″10％PEG″)的DSPC、膽固醇和PEG分子量2,000的PEG-二硬脂酰丙三醇(GS-20，NOF Corp.，Japan)組成的脂類基質(zhì)，根據(jù)實施例48制備摩爾比為3∶2的DSPC和膽固醇的脂質(zhì)體，然后根據(jù)實施例48進行膜擠出。以350mg/mmol的藥物/磷脂比率，將VRB裝載入脂質(zhì)體。如實施例43中所述，通過將這些脂質(zhì)體與F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物(實施例19)溫育，形成F5免疫脂質(zhì)體型長春瑞濱。培養(yǎng)具有BT-474異種移植物的裸鼠，如實施例53那樣，經(jīng)靜脈，以5mg/kg，用游離VRB、F5-ILs-VRB-“0.5％PEG”或F5-ILs-VRB-“10％PEG”治療。如圖34所示，采用非離子型PEG脂類衍生物PEG-DSG提供的具有較高PEG化作用的F5-ILs-VRB，在減少腫瘤生長上，比具有較低數(shù)量PEG-DSG的F5-ILs-VRB效率明顯更高；而兩種制劑都比游離藥物更具活性。
實施例55.在小鼠中，EGFR-定向脂質(zhì)體型長春瑞濱對U87人腦癌異種移植物腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤功效
根據(jù)實施例42，制備帶有包封的0.65M TEA-SOS溶液的脂質(zhì)體(經(jīng)QELS大小為86.6±12.9nm)，并裝載上VRB。如實施例36中所述，通過將VRB脂質(zhì)體與抗-EGFR抗體Fab’片段的PEG-DSPE偶聯(lián)物溫育，制備抗-EGFR-免疫脂質(zhì)體型VRB(C225Fab’-ILs-VRB)。
對雄性NCR nu/nu小鼠(5-6周，稱重17-20g)，在脅區(qū)皮下注射懸浮在生長培養(yǎng)基中的1×107個U87人成膠質(zhì)細胞瘤細胞(ATCC)，總體積150μl。當腫瘤平均大小達到250mm時，將小鼠隨機分入具有10-12只動物的四個組中。小鼠，每周三次、以5mg VRB/kg的劑量，被靜脈注射“游離”VRB、非定向Ls-VRB或C225Fab′-ILs-VRB進行治療。對照組接受等體積的鹽水。如實施例10監(jiān)控腫瘤大小和動物體重。在相等劑量下，C225-Fab′-ILs-VRB，在抑制EGFR-過量表達的人腦癌異種移植物腫瘤的生長上，明顯比非定向脂質(zhì)體型長春瑞濱或游離型長春瑞濱更有效(圖35)。
實施例56.使用硫酸三乙銨方法包封在脂質(zhì)體中的阿霉素的制備和藥物動力學
如實施例2所述，形成含有不同的脂類基質(zhì)組成成分(如下面的表所示)的脂質(zhì)體。N-戊二酰-DSPE(Glu-DSPE)獲自Avanti Polar Lipids，AL，USA。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在氯仿中由脂溶液形成純脂膜；真空下(90μm Hg，2小時)去除痕跡揮發(fā)物；脂膜在硫酸三乙銨(TEA-8O4)溶液(0.65N TEA)中水合，經(jīng)歷六個循環(huán)的快速冷凍和融化；并擠壓通過二疊層0.1μm孔徑聚碳酸酯過濾器10次，和擠壓通過二疊層0.05μm孔徑聚碳酸酯過濾器10次。為了在血液樣品中對脂類基質(zhì)定量，將[3H]-CHE以0.5-1.5mCi/mmol磷脂引入到脂類基質(zhì)中。根據(jù)實施例2，使含有包載的TEA-SO4溶液的脂質(zhì)體裝載上阿霉素。在60℃下，將HEPES-緩沖鹽水(20mMHEPES-Na，135mM NaCl，pH6.5)中的脂質(zhì)體與鹽酸阿霉素(藥物/磷脂比率為140-170mg/mmol)溫育45min，然后在冰上中止，通過凝膠層析去除未包封的阿霉素。通過分光光度法(實施例71)分析阿霉素，并且通過Bartlett方法(實施例70)分析磷脂。所得的脂質(zhì)體的特性，概述在下表30中。
表30.不同脂類組成時的脂質(zhì)體型阿霉素的特性
如實施例9中所述，在大鼠中，以5mg阿霉素/kg的單次靜脈劑量，研究這些具有DSPC/Chol/PEG-DSPE 2.7∶2∶0.3的脂類組成的含阿霉素脂質(zhì)體的血液藥物動力學。脂質(zhì)體具有長的循環(huán)時間(半衰期約28小時)(圖36)。穩(wěn)定的阿霉素-與-類脂比率表明該制劑在循環(huán)中對藥物滲漏而言是非常穩(wěn)定的，在48小時的時間期間里損失為25％以下的藥物。
實施例57.通過TEA-硫酸鹽方法而制備的裝載阿霉素的脂質(zhì)體和抗-HER2免疫脂質(zhì)體制備和對抗HER2-過量表達的人乳腺癌異種移植物的體內(nèi)抗腫瘤功效。
具有不同脂類組成和特性(在下表中列出)的裝載阿霉素的脂質(zhì)體，如實施例56所述進行制備。通過與抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物(大約30scFv/脂質(zhì)體)共溫育，由裝載阿霉素的脂質(zhì)體制備裝載阿霉素的抗-HER2免疫脂質(zhì)體，如實施例19中所述。培養(yǎng)攜帶皮下人乳腺癌異種移植物(BT-474)的NCR nu/nu小鼠；一旦腫瘤平均大小達到200mm3，以5mg/kg劑量用脂質(zhì)體型阿霉素或抗-HER2免疫脂質(zhì)體型阿霉素治療(在10-12只動物組成的組別中)，每周一次，總共三周；并且如實施例29中描述地那樣，監(jiān)控腫瘤進展和動物體重。對于非定向阿霉素脂質(zhì)體制劑，研究不含PEG-DSPE、含0.5mol.％PEG-DSPE或含10mol.％PEG-DSPE的脂類組成情況；對于F5-免疫脂質(zhì)體型阿霉素，研究攜帶有0.5mol.％PEG-DSPE和10mol.％PEG-DSPE的制劑(在這里PEG-DSPE的量，用脂質(zhì)體磷脂的mol.％(摩爾百分數(shù))表示)。結(jié)果(圖37，表31)證明所有阿霉素治療對延緩腫瘤生長是有效的。根據(jù)接種后第53天的腫瘤大小，在所有三個非定向脂質(zhì)體組中的腫瘤生長抑制上的差異，并沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學上的顯著性(ANOVA p＝0.081)；但是免疫脂質(zhì)體型阿霉素比非定向脂質(zhì)體型阿霉素明顯更有效(ANOVA p＝5.5×10-10)，“10％PEG-DSPE”制劑比“0.5％PEG-DSPE”制劑更有效(學生t-試驗，p＝0.027)。在“10％PEG-DSPE”F5-ILs組中，在67％的動物中，腫瘤退化到1mm3或更小；而在“0.5％PEG-DSPE”組中，僅9％。在對照組(鹽水治療)中，在第38-43天，腫瘤超過可接受大小的極限體重的15％。
表31.脂質(zhì)體型阿霉素體內(nèi)抗腫瘤功效研究脂質(zhì)體特征和治療結(jié)果。
實施例58.脂質(zhì)體型長春堿的制備和脂質(zhì)體型長春堿在大鼠中的血液藥物動力學
利用2次擠壓通過二疊層0.2μm聚碳酸酯膜和10次擠壓通過二疊層0.08μm聚碳酸酯膜，通過實施例11的方法，制備含有包載有TEA-SOS水溶液(0.65MTEA，pH6.4，同滲重摩502mmol/kg)和大小99.5±10.2nm(平均值±SD，經(jīng)QELS測定)的脂質(zhì)體。以150mg/mmol的藥物-與-磷脂比率，加入硫酸長春堿USP(美國藥典)形式的長春堿(vinblastine(VBL))。使用1N NaOH，將藥物-脂質(zhì)體混合物的pH調(diào)節(jié)到6.5，隨后將混合物在60℃下溫育30分鐘。然后，反應在冰上冷卻15分鐘；使用Sephadex G-75凝膠過濾層析，用5mM HEPES-Na、135mM NaCl、pH6.5洗脫，去除未包封藥物。然后如實施例70和實施例71那樣，通過分光光度法分析純化的脂質(zhì)體中的VBL，通過Bartlett方法分析磷脂。以1.5mCi/mmol磷脂的比率，將[3H]-CHE引入到制劑中。脂質(zhì)體型長春堿具有152.4±12.0mgVBL/mmol磷脂(定量包封)。
如實施例9所述，以5mg VBL/kg劑量，研究脂質(zhì)體型長春堿在雌性Albino大鼠(8-9周齡；200g)中的血液藥物動力學。如實施例41中所述，在血漿樣品中，對長春堿定量(使用長春瑞濱作為內(nèi)標)。長春堿型脂質(zhì)體顯示出良好的循環(huán)壽命(脂類組分的血漿半衰期為12.8±0.04小時)(圖38)以及對抗藥物從脂質(zhì)體滲漏的良好穩(wěn)定性，在24小時后，超過70％的初始長春堿加載量保持在被包囊狀態(tài)中(圖39)。發(fā)現(xiàn)注射后達到包封藥物之50％釋放的時間為40.6±1.2小時。
實施例59.使用TEA-SOS方法制備采用長春新堿進行裝載的脂質(zhì)體，以及pH對裝載效率的影響。
利用15次通過二疊層0.08μm孔徑聚碳酸酯膜的擠出步驟，通過實施例11的方法，制備大小為86.6±12.9nm(經(jīng)QELS)、含有摩爾比3∶2∶0.015的DSPC/Chol/PEG-DSPE脂類組成的、以及含有包載的含水TEA-SOS溶液(0.65MTEA，pH5.4，同滲重摩521mmol/kg)的脂質(zhì)體。向處于5mM HEPES-Na、5％葡萄糖含水緩沖液、pH6.5中的脂質(zhì)體中，以350μg長春新堿/μmol磷脂的藥物-對-磷脂比率，將長春新堿(VCR)以硫酸長春新堿加入；用1N NaOH將pH調(diào)節(jié)到指示比率；混合物在60℃下溫育30分鐘，冰上冷卻15分鐘；并且使用SephadexG-75凝膠過濾層析，用HBS-6.5(20mM HEPES，135mM NaCl，pH6.5)洗脫，將脂質(zhì)體與未包封藥物分離開來。然后，分析純化的脂質(zhì)體，其中在溶解在酸性異丙醇之后，通過分光光度法使用265nm處的吸光率分析長春新堿；并使用Bartlett的磷酸鹽測試(1959)分析磷脂含量。
結(jié)果顯示在表32中。在pH4.5-7.5范圍內(nèi)，藥物裝載超過90％；并且在pH5.0-7.5，幾乎是定量的。在pH3.5下——該pH值是加入藥物后、在脂質(zhì)體混合物中所觀察到的pH，但不進行pH調(diào)整，裝載水平相當?shù)汀?br>
表32.長春新堿裝載入攜帶有包載的TEA-SOS的脂質(zhì)體中的pH-依賴性 實施例60.使用TEA-SOS方法制備裝載有長春新堿的脂質(zhì)體藥物/脂類比率對裝載效率的影響。
根據(jù)實施例59，制備含SOS-TEA的脂質(zhì)體；根據(jù)實施例59的程序，在pH6.5下，以150-550μg長春新堿/μmol磷脂的藥物-與-磷脂比率，裝載硫酸長春新堿。然后，分析從未包封藥物純化而來的脂質(zhì)體，其中通過分光光度法分析VCR；并使用Bartlett的分析方法(1959)分析脂質(zhì)體磷脂。在整個被研究的藥物/脂類比率的范圍內(nèi)，藥物裝載效率是超過90％的；并且在150-450μg長春新堿/μgmol磷脂之間，幾乎是定量的(表33)。
表33.以不同的藥物-與-脂類比率，將長春新堿裝載入含TEA-SOS的脂質(zhì)體 實施例61.制備免疫脂質(zhì)體型長春新堿以及脂質(zhì)體型長春新堿和免疫脂質(zhì)體型長春新堿對體外癌細胞的細胞毒性
采用350mg/mmol的藥物/磷脂比率，如實施例59所述地那樣，制備脂質(zhì)體型長春新堿(liposomal vincristine(Ls-VCR))。如實施例19所述，通過與抗-HER2scFv F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物共溫育，由脂質(zhì)體型長春新堿制備HER2-特異性的F5-免疫脂質(zhì)體型長春新堿(F5-immunolipsomal vincristine(F5-ILs-VCR))。通過將硫酸長春新堿USP(美國藥典)溶解在水中，制備“游離的”長春新堿(VCR)溶液；然后無菌過濾。通過使用實施例27的程序，進行MTT-基的細胞存活力分析，測定VCR、Ls-VCR和F5-ILs-VCR對HER2-過量表達的人乳腺癌細胞SKBr-3(ATCC)的細胞毒性，其中細胞以5,000個細胞/孔被接種到96-孔微量滴定板中，馴化過夜；并與含藥物的培養(yǎng)基溫育4小時；然后，在溫育后，在無藥物培養(yǎng)基中，放置3天。結(jié)果顯示在圖40中。游離VCR的IC50是75ng/ml，F(xiàn)5-ILs-VCR的IC50是11ng/ml，Ls-VCR的IC50是3μg/ml。根據(jù)本發(fā)明制備的定向脂質(zhì)體長春新堿活性比游離藥物高6.8倍，并且比非定向脂質(zhì)體藥物活性高273倍；這表明作為細胞特異性藥物輸送的一個作用，在抗癌活性上存在實質(zhì)性增加。
實施例62.Ls-VCR在大鼠中的血液藥物動力學
使用10次通過孔徑80nm或100nm的二疊層聚碳酸酯膜的擠壓步驟，通過實施例11的方法，制備脂質(zhì)體；該脂質(zhì)體含有包載的SOS-TEA溶液(0.65MTEA，pH5.8，同滲重摩530mmol/kg)，并且脂類組成為DSPC/Chol/PEG-DSPE(摩爾比3∶2∶0.015)，也以1.5mCi/mmol磷脂含有[3H]-CHE。如實施例59所述，脂質(zhì)體在H6.5下、以350mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載VCR。裝載有VCR的脂質(zhì)體，以5mg VCR/kg的劑量，經(jīng)靜脈給予雌性albino大鼠(180-220g)；并且，如實施例9中所述地，研究藥物和脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學。除了移動相中的含水的醋酸三乙銨(pH5.5)和乙腈的體積比為65∶35之外，如實施例41所述通過HPLC對血液樣品中的VCR量進行定量。VCR典型的保留時間為8.8min(分鐘)。結(jié)果顯示在圖41和表34中。兩種制劑都具有延長的循環(huán)壽命(血液半衰期12-17小時)。在兩種制劑中，就藥物滲漏而言，脂質(zhì)體型長春新堿是非常穩(wěn)定的(半釋放期超過120小時)(圖42)。
表34.使用TEA-SOS方法，以350mg/mmol磷脂裝載了長春新堿的脂質(zhì)體的特征 實施例63.不同藥物/脂類比率的Ls-VCR在大鼠中的血液藥物動力學
使用10次通過孔徑50nm或80nm的二疊層聚碳酸酯膜的擠壓步驟，通過實施例11的方法，制備脂質(zhì)體；該脂質(zhì)體含有包載的SOS-TEA溶液(0.65M TEA，pH6.4，同滲重摩485mmol/kg)，脂類組成為DSPC/Chol/PEG-DSPE(摩爾比3∶2∶0.015)，也以1.5mCi/mmol磷脂含有[3H]-CHE。通過以計算出的藥物/脂類比率100mg/mmol、200mg/mmol或350mg/mmol磷脂，加入含水硫酸VCR溶液的20mg/mL儲液，從而如實施例59所述在pH6.5下使脂質(zhì)體裝載上VCR。對于所有制備方法，藥物裝載效率超過96％。以5mg VCR/kg的劑量，經(jīng)靜脈，將裝載了VCR的脂質(zhì)體給予雌性albino大鼠(8-9周齡，180-220g)；并且如實施例62中所述地那樣，研究藥物和脂質(zhì)體脂類的血液藥物動力學。結(jié)果顯示在表35中。脂質(zhì)體型長春新堿具有良好的循環(huán)壽命(藥物的血液半衰期為20-30小時)；并且，在所有被研究的尺寸和藥物-與-脂類比率下，是異常穩(wěn)定的(藥物釋放半衰期超過93小時)。
表35.使用TEA-SOS方法，以不同藥物/脂類比率裝載長春新堿的脂質(zhì)體的特征 實施例64.HER2-定向脂質(zhì)體型長春新堿的制備，以及非定向型和HER2-定向型脂質(zhì)體長春新堿在小鼠中對過量表達HER2的人乳腺癌異種移植物的抗腫瘤功效。
使用50nm孔徑的膜擠壓和以100mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載藥物，根據(jù)實施例63(省去[3H]-CHE組分)，通過TEA-SOS方法制備裝載有長春新堿的脂質(zhì)體(vincristine-loaded liposomes(Ls-VCR-SOS))。如實施例43所述，通過將Ls-VCR-SOS與抗-HER2 scFv F5-PEG-DSPE偶聯(lián)物(實施例19)溫育，形成F5免疫脂質(zhì)體長春新堿(F5-ILs-VCR)。利用TEA-檸檬酸的裝載有長春新堿的脂質(zhì)體(Ls-VCR-Cit)，是按與Ls-VCR-SOS脂質(zhì)體相似的方法制備的；除了用檸檬酸三乙銨溶液(通過用純?nèi)野穼⒑畽幟仕岬味ㄖ羛H5.1，并將濃度調(diào)整到0.65M三乙胺制備而得)替代TEA-SOS溶液之外。治療研究設(shè)計遵照實施例10的方法。在裸鼠上培養(yǎng)BT-474人乳腺癌的皮下異種移植物腫瘤，且當腫瘤大小達到250mm3(144-309mm3范圍)時，將由8到9只小鼠組成的組別中的小鼠，經(jīng)靜脈、以2mgVCR/kg的劑量，用游離VCR、Ls-VCR或F5-ILs-VCR治療，每周一次，總共三周，是在腫瘤接種后第19天開始進行。如實施例10所述，對腫瘤大小和動物體重進行監(jiān)控。對于對照組，小鼠用等體積的鹽水處理。在腫瘤接種后第63天，利用Mann-Whitney試驗，用統(tǒng)計學方法評價處理組之間、在腫瘤大小上的差異。各組中平均腫瘤大小的動態(tài)變化，顯示在圖43中。當與Ls-VCR或游離VCR相比時，F(xiàn)5-ILs-VCR表現(xiàn)出最大的效率，導致在第63天時，8只動物中的6只(75％)的腫瘤完全消退。Ls-VCR-Cit也是具有效力的，導致在63天時，也觀察到9只動物中的2只(22％)的腫瘤完全消退；然而其比F5-ILs-VCR效力低(p＜0.005)。Ls-VCR-SOS和游離VCR具有相同的功效(p＞0.2)，但效力比F5-ILs-VCR或Ls-VCR-Cit低。因此，令人驚訝的是，借助細胞-定向輸送，使用本發(fā)明的多價陰離子所包封的脂質(zhì)體型藥物，被證明比通過非結(jié)合性陰離子所包封的脂質(zhì)體藥物功效更大。動物體重動力學顯示所有脂質(zhì)體型VCR制劑的毒性低于游離型CVR的毒性，導致治療期間體重減輕較少(圖44)。
實施例65.EGFR-定向脂質(zhì)體型長春新堿的制備，非定向和EGFR-定向脂質(zhì)體型長春新堿在小鼠中對EGFR-過量表達的人腦癌異種移植物的抗腫瘤功效。
如實施例64，使用TEA-SOS方法制備裝載長春新堿的脂質(zhì)體(Ls-VCR)。如實施例36所述，通過將脂質(zhì)體與抗-HER2 Fab′C225Fab-PEG-DSPE偶聯(lián)物共溫育，制備EGFR-定向免疫脂質(zhì)體長春新堿。
在雄性NCR nu/nu小鼠(5-6周齡，稱重17-20g)的脅區(qū)，皮下注射0.15ml的細胞生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有1±107個的穩(wěn)定表達表皮生長因子受體(HER1)突變體EGFRvIII的U87人成膠質(zhì)細胞瘤細胞。在第11天，當平均腫瘤大小達到300-400mm3時，將小鼠隨機分成10-12動物/組的四個組。在腫瘤接種后第11、18和25天，以1.5mg/kg的劑量，靜脈內(nèi)給予游離VCR(硫酸長春新堿1mg/mL，于鹽水中)、Ls-VCR或C225Fab-ILs-VCR，進行治療。對照組中的小鼠類似地注射等體積的生理鹽水。如實施例10所述，監(jiān)控腫瘤大小和小鼠體重。結(jié)果顯示在圖45中。與對照動物相比，所有用VCR制劑治療的動物顯示出腫瘤生長的延遲。在用游離VCR和Ls-VCR治療的組之間，沒有顯著性差異。EGFR-定向型C225Fab-ILs-VCR，比游離型或非定向型脂質(zhì)體VCR效率高。
實施例66.含有包載的三乙銨肌醇六磷酸(triethylammonium inositolhexaphosphate(TEA-IHP))溶液的脂質(zhì)體的制備。
聚陰離子化的多元醇、肌醇六磷酸(IHP)十二烷基鈉鹽，獲自Sigma(St.Louis，MO)。根據(jù)實施例4的程序，通過在Dowex 50Wx8-200交聯(lián)磺化聚苯乙烯樹脂上進行離子交換制備水溶液，該溶液含有0.65M三乙銨和0.681M磷酸基團，pH6.5，且同滲重摩為718mmol/kg；然后用純TEA滴定，并用水稀釋。殘留的鈉含量，是在陽離子數(shù)量的1％以下。在60℃下，將干的脂類(150μmol DSPC、100μmolChol、0.75μmol PEG-DSPE)溶解在0.5ml的100％乙醇USP(美國藥典)中，與4.5ml的、預加熱到相同溫度的三乙銨肌醇六磷酸溶液混合。在30-40mm Hg以及40-45℃下，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，部分地除去乙醇，直到混合物顯示出不起泡。然后，在60-65℃下，將脂類懸浮液15次擠壓通過二疊層0.1μm孔徑聚碳酸酯膜。經(jīng)QELS測定，所得的脂質(zhì)體大小為104.3±39.0nm。通過在Sepharose 4B柱上進行凝膠層析，用5mM HEPES-Na、5％葡萄糖，pH6.5緩沖液洗脫，去除未包封的三乙銨IHP。根據(jù)實施例70提取，使用Bartlett方法，由磷脂濃度定量脂質(zhì)體。
實施例67.將藥物裝載入含包載的TEA-IHP溶液的脂質(zhì)體中
用CPT11或長春瑞濱裝載實施例67的脂質(zhì)體。長春瑞濱以175或350g/mol的藥物-與-磷脂比率裝載，CPT11以250或500g/mol的比率裝載。以下面示出的輸入藥物/磷脂比率(參見表36)，將藥物施加給處于HEPES-葡萄糖緩沖液(實施例67)中的脂質(zhì)體。如果需要，使用1N NaOH將pH調(diào)整到6.5-6.8。混合物在60℃下溫育30分鐘，冰上冷卻15分鐘，并且在Sephadex G-25凝膠過濾柱上層析，用5mM HEPES-Na、145mM NaCl，pH6.5洗脫。將純化的脂質(zhì)體之等分試樣增溶在酸化甲醇中，并通過分光光度法分析(實施例71)。通過(實施例70)提取，使用Bartlett方法(1959)，對磷脂定量。如下面的表36所示，兩種藥物定量(即，幾乎100％)裝載入脂質(zhì)體中。
表36.被裝載入含包載的肌醇六磷酸的脂質(zhì)體中的藥物的特性 實施例68.在體外的小鼠血漿存在下，游離型CPT-11或脂質(zhì)體型CPT-11的化學穩(wěn)定性
在體內(nèi)，前藥CPT-11進行化學轉(zhuǎn)化，形成活性藥物代謝物，稱為SN-38。SN-38和CPT-11都從它們的活性內(nèi)酯形式轉(zhuǎn)化為無活性的前藥，稱為SN-38或CPT-11羧酸鹽。在該實施例中，研究了根據(jù)本發(fā)明的CPT-11脂質(zhì)體化作用，對在血漿存在下CPT-11化學轉(zhuǎn)化為這些前藥的影響。利用10次擠壓通過二疊層0.08μm聚碳酸酯過濾器，根據(jù)實施例11制備脂質(zhì)體；該脂質(zhì)體含有包載的蔗糖八硫酸酯三乙基銨(triethylammonium sucroseoctasulfate)(0.65M TEA，pH6.4，同滲重摩485mmol/kg)，和摩爾比為3∶2∶0.015的DSPC、膽固醇和PEG-DSPE的脂類組成。經(jīng)QELS測定，脂質(zhì)體的大小為87.4±19.2nm。通過以約500mg CPT-11基本成分/mmol脂質(zhì)體磷脂的比率；在含水的5mM HEPES-Na、5％葡萄糖，pH6.5中，在60℃下，溫育30分鐘；然后在冰上維持15分鐘終止，從而裝載CPT-11。然后在Sephadex G-75柱上純化裝載了CPT-11的脂質(zhì)體，采用HEPES緩沖鹽水(5mM HEPES，145mM NaCl，pH6.5)洗脫。所得的CPT-11脂質(zhì)體具有536.5±20.1mgCPT-11/mmol磷脂的比率。通過以1mg/ml，將鹽酸伊立替康USP(美國藥典)溶解在144mM的水溶液NaCl中，新鮮制備游離型CPT-11溶液，用稀HCl酸化到pH3。將10μl脂質(zhì)體型CPT-11或游離型CPT-11的等分式樣，與90μl的肝素-穩(wěn)定的小鼠血漿(Harlan Bioproducts，USA)混合，并于37℃、在振蕩水浴中溫育。在給定時間點時，一式三份將脂質(zhì)體樣品在Sepharose CL-4B尺寸排阻柱(2ml床體積)上進行層析，用HBS-6.5洗脫；并且經(jīng)熒光檢測含藥物的級分。收集第一(空體積)和第二(拖尾(trailing))含藥物峰，并認為是脂質(zhì)體包封的和釋放的藥物級分。通過旋渦10秒鐘，然后在14,100×g離心5分鐘，用400μl冰冷的甲醇提取樣品。分析上清液中的CPT-11，并利用對Warner and Burke，J Chromatogr.，Ser.B Biomed.Sci.Appl.1997，vol.691，p.161-71方法予以修改的方法，通過HPLC分析其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。由3％醋酸三乙銨pH5.5(溶液A)和乙腈(溶液B)組成的移動相，以1.0ml/min的速度，在20vol％B至50vol.％B的線性梯度中，輸送14min。以375nm的激發(fā)光和500nm的發(fā)射光，通過熒光檢測洗脫的產(chǎn)物。保留時間為5.3min(CPT-11羧酸酯)、6.8min(SN-38羧酸酯)、9.3min(CPT-11)和11.0min(SN-38)。結(jié)果表明當游離CPT-11和從脂質(zhì)體釋放的CPT-11經(jīng)歷轉(zhuǎn)化時，脂質(zhì)體內(nèi)的CPT-11是相當穩(wěn)定的。
表37.在小鼠血漿中，游離型CPT-11和脂質(zhì)體型CPT-11體外轉(zhuǎn)化為SN-38和羧酸酯形式。
實施例69.游離型CPT-11或脂質(zhì)體型CPT-11在大鼠中的體內(nèi)化學穩(wěn)定性
如實施例68所述，使用三乙基銨蔗糖八硫酸酯制備脂質(zhì)體CPT-11，該三乙基銨蔗糖八硫酸酯具有0.65M TEA，pH6.4，同滲重摩502mmol/kg。脂質(zhì)體大小為98.5±18.4nm，CPT-11封裝為510.1±16.5mg CPT-11/mmol磷脂。脂質(zhì)體型CPT-11和游離型CPT-11，以25mg/kg的劑量，通過靜脈內(nèi)，給予具有留置的中心靜脈插管的雌性Albino大鼠(180-220g)；并且，在48小時的時間里，間隔地抽取血液樣品。將血液樣品與含有0.04％EDTA的冰冷PBS混合，并迅速離心去除血細胞。如上面實施例68所述，通過HPLC分析上清液流體的等分試樣中的CPT-11、SN-38和它們羧酸酯形式。結(jié)果顯示在圖46和47中。盡管游離CPT-11被迅速清除，在30分鐘之后不可檢測到，然而脂質(zhì)體CPT-11仍然保留在循環(huán)中(t1/215.2小時)，在24小時時有37.8％的藥物保留在循環(huán)中，在48小時后有近似10％的藥物依然保留在循環(huán)中。沒有檢測到脂質(zhì)體形式的CPT-11轉(zhuǎn)化為SN-38或羧酸鹽形式的CPT-11。游離CPT-11，即作為溶液給予的CPT-11，相當快地從循環(huán)中去除(半衰期約16min)，且可以測量到轉(zhuǎn)化為羧酸鹽形式的藥物。
實施例70.脂質(zhì)體磷脂的定量
改良型酸消化——藍色磷鉬酸鹽方法I。該方法是從Bartlett(1959)修改而來。將10-20ml脂質(zhì)體等分試樣置于耐熱的玻璃杯，用0.5ml 10N硫酸在110-130℃下加熱2小時進行消化，通過加入50ml的9％過氧化氫進行礦化；再加熱30min，直到用指示紙條不能檢測到過氧化氫。在環(huán)境溫度中，將消化的樣品用1ml 0.2％含水鉬酸銨稀釋；與0.1ml 5％含水抗壞血酸混合；并且，在沸水浴中溫育10min。在800nm下，測量還原的磷鉬酸鹽復合物的吸光率，并與使用無機磷酸鹽標準溶液所同時產(chǎn)生的標準曲線比較。
改良型酸消化——藍色磷鉬酸鹽方法II。該方法是Morrison(1964)的方法的改良型。將5μl含1-10mM磷脂的脂質(zhì)體等分試樣與60μl濃硫酸和10μl 30％過氧化氫，在耐熱玻璃管中混合。將混合物在200-220℃下加熱10min，用0.7μl去離子水稀釋，與10μl 10％含水亞硫酸鈉混合，在沸水浴中溫育5分鐘，并冷卻至環(huán)境溫度。加入200μl 2％含水鉬酸銨和10μl 10％含水抗壞血酸，并將樣品在沸水浴中10min。將樣品迅速冷卻至環(huán)境溫育；針對空樣品，在825nm下，測量還原的磷鉬酸鹽復合物的吸光率。由使用具有2、4、6、8和10nM磷酸二氫鉀的標準溶液在同一操作中獲得的標準曲線，確定磷脂的數(shù)量。
提取方法。用200μl份額的甲醇-氯仿混合物(體積比1∶2)，對脂質(zhì)體的25-100μl等分試樣提取3次。將有機相合并在耐熱玻璃管中，真空中去除溶劑。殘留物用10N硫酸處理，根據(jù)上面的方法I進一步分析磷。
除非另外指出，分析數(shù)據(jù)用平均值±三次操作的標準誤差表示。
實施例71.脂質(zhì)體中藥物的定量
光分光光度法定量。將脂質(zhì)體等分試樣(10-50μl)與1mL 70vol.％含0.075-0.1N HCL的含水異丙醇混合；并且針對空白樣品，在下列波長處測量吸光率阿霉素，485nm；CPT-11和托泊特坎，372nm；玫瑰樹堿，306nm；長春瑞濱，270nm；長春新堿和長春堿，265nm。通過與同時操作的標準曲線比較，測定藥物的數(shù)量。
熒光定量。將含脂質(zhì)體的樣品(例如血漿)的等分試樣稀釋，稀釋用酸化的異丙醇(0.02-0.1等分試樣1mL70％異丙醇-0.075N HCl；＞0.1ml等分試樣90％異丙醇-0.1N HCI至1mL)。如果出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀，將樣品在冰上溫育1-2小時，并通過在12,100×g離心10分鐘澄清。在下列波長下，測量上清液的熒光CPT-11，激發(fā)光370nm，發(fā)射光423-425nm；托泊特坎，激發(fā)光380-385nm，激發(fā)光520-525nm；玫瑰樹堿，激發(fā)光306nm，發(fā)射光520nm。在減去空白熒光之后，由同時操作的標準曲線計算藥物數(shù)量。
實施例72.脂聚合物對長春瑞濱包囊入脂質(zhì)體的包囊效率的影響。
利用80nm孔徑膜的擠壓步驟，根據(jù)實施例11的方法，制備含有包囊的0.65M TEA-SOS溶液、由DSPC 200摩爾份、膽固醇133摩爾份和聚(乙二醇)(分子量2,000)衍生脂類PEG-DSPE(1-20摩爾份或PEG-DSG(20摩爾份)組成的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體以350mg/mmol的藥物/磷脂比率裝載長春瑞濱，并根據(jù)實施例40的方法從未包囊的藥物純化出來。如實施例70所述，分析脂質(zhì)體中的藥物和脂類含量，并使用體積重量高斯近似方法(volume-weighted Gaussian approximation)經(jīng)QELS分析脂質(zhì)體大小。結(jié)果(表38)表明當數(shù)量為脂質(zhì)體磷脂的1摩爾％以上(總脂類的0.3摩爾％)的陰離子PEG衍生物PEG-DSPE對藥物裝載效率具有負影響時，中性衍生物PEG-DSG卻令人驚奇地并不影響包囊效率，甚至在脂質(zhì)體磷脂的9.1摩爾％(總脂類的5.7摩爾％)時也不影響。
表38.以不同的PEG-脂類衍生物數(shù)量通過TEA-SOS方法制備的長春瑞濱脂質(zhì)體的特性 實施例73.脂質(zhì)體內(nèi)藥物包載劑對CPT-11在小鼠中血液壽命的影響
遵照實施例66的一般程序，制備含有0.65N的六磷酸肌醇(IHP，植酸)或八硫酸蔗糖的三乙銨(TEA)或三乙醇銨(TEOA)鹽溶液的脂質(zhì)體，并以500g/mol磷脂裝載CPT-11。以5mg CPT-11/kg體重的劑量，將脂質(zhì)體靜脈內(nèi)給予Swiss-Webster小鼠。24小時之后，麻醉小鼠，經(jīng)開口心臟穿刺放血。收集血液，如實施例68所述通過HPLC分析血液血漿中的CPT-11含量，藥物數(shù)量用保留在血液中的注射劑量的百分比表示(％ID)。TEOA-IHP在改進藥物血液壽命中的有效性比TEA-IHP、TEOA-SOAS和TEA-SOS低(表39)。
表39.在小鼠靜脈內(nèi)給予CPT-11脂質(zhì)體后24小時CPT-11在血液中的保留水平 實施例74.藥物裝載入含有1.05N二乙銨八硫酸蔗糖的脂質(zhì)體
使用純二乙胺(99.5％純度)，利用實施例6的離子-交換/滴定方法，制備1.05N二乙錢八硫酸蔗糖(DEA-SOS)的含水溶液，pH6.0，同滲重摩727mmo1/kg。使用實施例11的方法，將3摩爾份DSPC、2摩爾份膽固醇和0.015摩爾份PEG2000-DSPE的脂類基質(zhì)在DEA-SOS溶液存在下配制入脂質(zhì)體(體積權(quán)重平均大小92.4nm)，并將CPT-11以不同的藥物/脂類輸入比率裝載在脂質(zhì)體中。通過凝膠層析去除未包囊的藥物，測定每單位脂類包囊的藥物的數(shù)量(藥物/脂類輸入比)。以藥物/脂類輸入比與輸入比的百分比計算包囊效率。結(jié)果顯示在表40中。該裝載獲得其最大的水平每摩爾磷脂約1.76摩爾藥物(1.67-1.70mol藥物/g總脂類)，其與基于脂質(zhì)體中的二乙銨含量的量(1.78mol二乙銨/mol磷脂)非常一致，假設(shè)對于藥物分子發(fā)生脂質(zhì)體內(nèi)二乙銨離子的化學計量交換，以及估算的脂質(zhì)體內(nèi)包載的體積約1.71/mol磷脂。
表40.CPT-11裝載在含有1.05N DEA-SOS的DSPC/Chol/PEG-DSPE脂質(zhì)體中。
除非另外指出，分析數(shù)據(jù)以三次運算的平均值±標準誤差表示。大鼠血漿藥物動力學數(shù)據(jù)以兩次運算的平均值±標準誤差表示。
盡管本發(fā)明已參考目前優(yōu)選的實施方案進行描述，應該理解可以在不脫離本發(fā)明精神的情況下進行各種修改。因此，本發(fā)明的范圍由隨附的權(quán)利要求書決定，并包括這些權(quán)利要求有權(quán)獲得的等同的全部范圍。所有引用的文章和參考文獻，包括專利申請和公布的公開內(nèi)容通過參考并入本文，用于所有目的。
權(quán)利要求
1.組合物，包含介質(zhì)中的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體具有通過包含一種或多種脂類的膜與所述介質(zhì)隔開的內(nèi)部空間，其中所述脂質(zhì)體的內(nèi)部空間含有取代的銨，所述取代的銨具有下式
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是銨氮原子，R1、R2、R3、R4每一個獨立地是氫原子或有機基團，所述有機基團每一個獨立地具有不超過8個的碳原子，并且總數(shù)不超過18個碳原子，包括18個碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一個是有機基團；
其中所述有機基團獨立地是烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、鏈烯基、環(huán)烯基或其羥基取代的衍生物，任選地包含S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺鍵；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三個是有機基團；或至少其中一個所述有機基團具有直接連接到所述銨氮原子的仲碳原子或叔碳原子；和
其中所述內(nèi)部空間也包含陰離子。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述有機基團每一個獨立地具有不超過6個的碳原子。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述有機基團的碳原子總數(shù)不超過16個碳原子。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述有機基團的碳原子總數(shù)不超過12個碳原子。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨在水中形成真溶液。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中基本上所有所述取代的銨包含在所述脂質(zhì)體的所述內(nèi)部空間內(nèi)。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨在藥學上是惰性的。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨選自異丙基乙基銨、異丙基甲基銨、二異丙基銨、叔丁基乙基銨、二環(huán)己基銨、嗎啉鎓、吡啶鎓、哌啶鎓、吡咯烷鎓、哌嗪鎓、叔丁基銨、2-氨-2-甲基丙醇-1，2-氨基-2-甲基-丙二醇-1，3，三-(羥乙基)-氨基甲烷、N，N′-二乙基-乙醇銨、N，N′，N″-三-(2-羥乙基)銨、N，N′-雙-(2-羥乙基)乙銨、三甲銨、三乙銨、二乙基甲基銨、二異丙基乙銨、三異丙銨、N-甲基嗎啉鎓、1-(2-羥乙基)哌啶鎓、1-甲基吡咯烷鎓、1，4-二甲基哌嗪鎓、四甲基銨、四乙基銨和四丁基銨。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨在所述脂質(zhì)體內(nèi)部空間中的濃度高于所述取代的銨在所述含脂質(zhì)體的介質(zhì)中的濃度。
10.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨在所述內(nèi)部空間中的濃度是至少約0.05M、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M或0.7M的濃度。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述取代的銨在所述內(nèi)部空間中的濃度是約0.65M。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述陰離子是二價陰離子、三價陰離子、多價陰離子、聚合陰離子、聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖。
13.組合物，包含介質(zhì)中的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體具有通過包含一種或多種脂類的膜與所述介質(zhì)隔開的內(nèi)部空間，其中所述內(nèi)部空間包含選自聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖的陰離子，以及其中所述脂質(zhì)體包含有效地將實體保留在所述脂質(zhì)體內(nèi)的跨膜梯度。
14.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述跨膜梯度是離子梯度、銨離子梯度、pH梯度、電化學勢梯度、溶解性梯度或包含至少一個C-N鍵的取代的銨離子的梯度。
15.權(quán)利要求1至14中任一項所述的組合物，其中所述陰離子包括
(i)選自下述的多元醇部分單糖、二糖、線性多羥基化化合物、環(huán)狀多羥基化化合物、具有一個以上羥基基團的脂肪醇、具有一個以上羥基基團的脂環(huán)醇、或具有一個以上羥基基團的雜環(huán)醇；和
(ii)連接到所述多元醇部分的至少兩個強陰離子官能團。
16.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述強陰離子官能團的至少一個是硫酸酯、磷酸酯、硼酸酯、磺酸基團、膦酸基團、硫代碳酸基團、二硫代碳酸基團、其衍生物或其類似物。
17.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述多元醇部分選自阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、山梨糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、prolylene glycol、丙三醇、treitol、赤蘚醇、季戊四醇、核糖醇、阿糖醇、山梨醇、甘露醇、乳糖醇、麥芽糖醇、果糖醇、葡萄糖醇、木糖醇或肌醇。
18.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述聚陰離子是每分子具有3至8個硫酸鹽基團的多硫酸化蔗糖。
19.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述多硫酸化蔗糖是八硫酸蔗糖。
20.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述聚陰離子是六磷酸肌醇。
21.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述陰離子在所述脂質(zhì)體內(nèi)部中的濃度是至少約0.05、0.1、0.2、0.5、0.6、0.7或1.0克當量/L。
22.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述陰離子在所述脂質(zhì)體內(nèi)部中的濃度是至少約0.65克當量/L或約1.0克當量/L。
23.權(quán)利要求1-22中任一項所述的組合物，除所述取代的銨和所述陰離子之外，還包括實體。
24.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述實體是球形陽離子實體、治療劑實體或可檢測標記。
25.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述實體以超過所述實體在所述介質(zhì)中的濃度存在于所述內(nèi)部空間中。
26.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述介質(zhì)基本上無所述實體。
27.權(quán)利要求23的組合物，其中所述實體與所述脂類總數(shù)的摩爾比是至少約0.05、至少約0.1、至少約0.2、至少約0.3、至少約0.5、至少約0.7或至少約1.0。
28.權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述治療劑實體是抗菌治療劑、抗病毒治療劑或抗腫瘤治療劑。
29.權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述治療劑實體是氨基糖苷抗生素或氟喹諾酮衍生物。
30.權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述治療劑實體選自拓撲異構(gòu)酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、極光蛋白激酶抑制劑、微管解聚劑、微管穩(wěn)定劑、烷化劑、酶、酶抑制劑、組蛋白脫乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑、抗代謝物、受體結(jié)合劑、激素、激素拮抗劑、核苷酸、多核苷酸、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
31.權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述抗腫瘤治療劑選自蒽環(huán)類抗生素化合物、喜樹堿化合物、長春花堿、玫瑰樹堿化合物、紫杉醇化合物、渥曼青霉素化合物、吡唑并嘧啶化合物、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
32.權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述治療劑實體選自阿霉素、道諾霉素、絲裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、癌霉素、N-乙酰阿霉素、佐柔比星、5-亞氨道諾霉素、N-乙酰道諾霉素、daunoryline、米托蒽醌、喜樹堿、9-氨基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、10，11-亞甲二氧基喜樹堿、9-氨基-10，11-亞甲二氧喜樹堿、9-氯-10，11-亞甲二氧喜樹堿、伊立替康、托泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10，11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10，11-亞甲二氧-20(S)-喜樹堿、7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹堿、長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春氟寧、長春西汀、長春酰胺、玫瑰樹堿、6-3-氨丙基-玫瑰樹堿、2-二乙基氨基乙基-玫瑰樹堿鎓及其鹽、達替銨、retelliptine、帕利它西、多烯紫杉醇、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
33.權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述治療劑實體選自抗組胺乙二胺衍生物、bromphenifamine、苯海拉明、抗原生動物藥物、喹諾酮、碘喹啉、脒化合物、戊烷脒、抗蠕蟲劑化合物、噻嘧啶、抗吸血蟲藥物、奧沙尼喹、抗真菌三唑衍生物、fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑、抗菌頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢尼西、頭孢噻肟、頭孢酰亞胺、頭孢呋辛、抗菌β-內(nèi)酰胺衍生物、氨曲南、頭孢美唑、頭孢西丁、紅霉素組抗菌劑、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、竹桃霉素、青霉素化合物、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、羧芐西林、四環(huán)素化合物、新生霉素、壯觀霉素、萬古霉素；抗分枝桿菌藥物、氨基水楊酸、卷曲霉素、乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、氯法齊明、抗病毒金剛烷胺化合物、金剛烷胺、金剛乙胺、奎尼丁化合物、奎寧、奎納克林、氯喹、羥氯喹、伯胺喹、阿莫地喹、甲氟喹寧、抗微生物qionolone、環(huán)丙沙星、依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺藥物類；尿道抗微生物劑、呋喃妥因、trimetoprim；硝基咪唑類衍生物、甲硝唑、膽堿季銨化合物化合物、ambethinium、新斯的明、毒扁豆堿、抗-阿爾茨海默病、氨基吖啶、他克林、抗帕金森藥物、苯扎托品、比哌立登、普環(huán)啶、苯海索、抗毒蕈堿劑、阿托品、莨菪堿、東莨菪堿、丙胺太林、腎上腺素化合物、多巴胺、血清胺、沙丁胺醇、多巴酚丁胺、麻黃堿、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、metaproperenol、氟替卡松、特布他林、血清胺再吸收抑制劑、麥角胺衍生物、箭毒系列肌肉松弛素、中樞作用肌肉松弛素、巴氯酚、環(huán)苯并環(huán)庚三烯、苯芙海因、煙堿、煙堿受體拮抗劑、β-腎上腺素阻斷劑、acebutil、胺碘酮、苯并二氮化合物、地爾硫草、抗心律失常藥、二異丙酰胺、恩卡尼、局部麻醉化合物、普魯卡因、普魯卡因酰胺、利多卡因、flecaimide、奎尼??；ACE抑制劑、卡托普利、enelaprilat、福辛普利、喹那普利、雷米普利；鴉片劑衍生物、可待因、哌替啶、美沙酮、嗎啡、抗脂類藥物、氟伐他汀、吉非貝齊、HMG-coA抑制劑、普伐他汀、降壓藥劑、可樂定、胍那芐、哌唑嗪、胍乙啶、granadril、肼苯噠嗪、非冠狀動脈血管擴張劑、雙嘧達莫、乙酰膽堿酯酶抑制劑、匹魯卡品、生物堿、毒扁豆堿、新斯的明、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
34.權(quán)利要求24所述的組合物，其中，在2-8℃下的6個月之后，至少90％的所述實體保持包囊在所述脂質(zhì)體中。
35.權(quán)利要求24所述的組合物，其中在2-8℃下的2年之后，至少80％的所述實體保持包囊在所述脂質(zhì)體中。
36.權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述實體以第一實體-脂類比率被包囊在所述組合物的脂質(zhì)體內(nèi)，以及其中在將所述組合物施用到哺乳動物的血流中之后24小時，所述實體以第二實體-脂類比率被保持包囊在所述脂質(zhì)體內(nèi)，其中所述第二實體-脂類比率超過所述第一物質(zhì)-脂類比率的50％、至少60％或至少70％。
37.權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述實體是長春花堿、其類似物或其衍生物。
38.權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述實體是長春瑞濱。
39.權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述哺乳動物是大鼠。
40.包含脂質(zhì)體的組合物，所述脂質(zhì)體包含一種或多種脂類和以至少約0.10的實體-脂類摩爾比率包囊在其中的抗腫瘤治療劑實體，
其中所述脂質(zhì)體組合物的體內(nèi)抗-腫瘤活性比游離非脂質(zhì)體形式的實體的抗腫瘤活性高至少四倍，和
其中施用于哺乳動物的所述脂質(zhì)體組合物的毒性等于或低于以游離非脂質(zhì)體形式施用于所述哺乳動物的所述實體的毒性。
41.權(quán)利要求40所述的組合物，其中施用于哺乳動物的所述脂質(zhì)體組合物的毒性比以游離非脂質(zhì)體形式施用于所述哺乳動物的所述實體的毒性低至少兩倍或低至少三倍。
42.權(quán)利要求40所述的組合物，其中施用于哺乳動物的所述脂質(zhì)體組合物的毒性比以游離非脂質(zhì)體形式施用于所述哺乳動物的所述實體的毒性低至少四倍。
43.權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述實體是前藥。
44.權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述實體是喜樹堿拓撲異構(gòu)酶I抑制劑、喜樹堿前藥，其類似物或其衍生物。
45.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述喜樹堿前藥是伊立替康。
46.權(quán)利要求44所述的組合物，其中施用到哺乳動物血流中的所述實體從所述脂質(zhì)體釋放的半釋放期是至少約10小時。
47.權(quán)利要求44所述的組合物，其中施用到哺乳動物血流中的所述實體從所述脂質(zhì)體釋放的半釋放期是至少約24小時。
48.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包含選自聚陰離子化的糖和聚陰離子化的多元醇的聚陰離子。
49.權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述聚陰離子是八硫酸蔗糖或六磷酸肌醇。
50.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包含生物可降解的聚陰離子聚合物。
51.權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述生物可降解的聚陰離子聚合物是聚磷酸鹽。
52.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體含有取代的銨化合物，所述銨化合物具有下式
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是銨氮原子，R1、R2、R3、R4每一個獨立地是氫原子或有機基團，所述有機基團每一個獨立地具有不超過8個的碳原子，并且總數(shù)不超過18個碳原子，包括18個碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一個是有機基團；
其中所述有機基團獨立地是烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、鏈烯基、環(huán)烯基或其羥基取代的衍生物，任選地包含S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺鍵；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三個是有機基團；或所述有機基團的至少一個具有直接連接到所述銨氮原子的仲碳原子或叔碳原子。
53.權(quán)利要求40-52中任一項所述的組合物，其中所述拓撲異構(gòu)酶抑制劑以每摩爾脂類至少約0.30摩爾藥物的濃度被包載。
54.權(quán)利要求40-53中任一項所述的組合物，其中所述拓撲異構(gòu)酶抑制劑以每摩爾脂類約0.40摩爾藥物至每摩爾脂類約1.7摩爾藥物之間的濃度被包載。
55.權(quán)利要求40-54所述的組合物，其中所述哺乳動物是小鼠。
56.權(quán)利要求40-55中任一項所述的組合物，其中所述抗腫瘤活性在HT-29腫瘤模型或BT-474腫瘤模型中在體內(nèi)被測定。
57.權(quán)利要求46-47所述的組合物，其中所述哺乳動物是大鼠。
58.用于施用長春花堿藥物的組合物，包括介質(zhì)中的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體具有內(nèi)部空間和將所述內(nèi)部與所述介質(zhì)隔開的膜，所述膜包含一種或多種脂類，所述脂質(zhì)體包含以第一藥物/脂類比率包載在所述脂質(zhì)體中的長春花堿藥物，其中在將所述組合物投到哺乳動物的血流中之后24小時，所述長春花堿藥物以第二藥物/脂類比率保持包囊在所述脂質(zhì)體內(nèi)，所述第二藥物/脂類比率為所述第一藥物/脂類比率的約50％以上。
59.權(quán)利要求58所述的組合物，其中所述第二藥物/脂類比率為所述第一藥物/脂類比率的至少約60％。
60.權(quán)利要求58所述的組合物，其中所述第二藥物/脂類比率為所述第一藥物/脂類比率的至少約70％。
61.權(quán)利要求58-60所述的組合物，其中所述第一藥物/脂類摩爾比率至少0.05、至少0.1或至少0.2。
62.權(quán)利要求61所述的組合物，其中所述第一藥物/脂類質(zhì)量比至少約0.05mg/mmol、至少約0.1mg/mmol或至少約0.3mg/mmol。
63.權(quán)利要求58-62中任一項所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包括有效地將所述藥物保留在所述脂質(zhì)體內(nèi)的內(nèi)部/外部跨膜離子梯度。
64.權(quán)利要求58-63中任一項所述的組合物，其中所述內(nèi)部空間包括選自聚合聚陰離子、聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖的聚陰離子。
65.權(quán)利要求63或64所述的組合物，其中所述內(nèi)部空間包括銨離子或取代的銨離子。
66.權(quán)利要求65所述的組合物，其中所述取代的銨離子是伯銨、仲銨、叔銨或季銨離子。
67.權(quán)利要求63或64所述的組合物，其中所述內(nèi)部空間包含取代的銨離子，所述取代的銨離子具有下式
R1-(R2-)N+(-R3)-R4
其中N是銨氮原子，R1、R2、R3、R4每一個獨立地是氫原子或有機基團，所述有機基團每一個獨立地具有不超過8個的碳原子，并且總數(shù)不超過18個碳原子，包括18個碳原子，其中R1、R2、R3、R4中至少一個是有機基團；
其中所述有機基團獨立地是烷基、亞烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、鏈烯基、環(huán)烯基或其羥基-取代的衍生物，任選地包含S、O或N原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺鍵；和
其中R1、R2、R3、R4中至少三個是有機基團；或所述有機基團的至少一個具有直接連接到所述銨氮原子的仲碳或叔碳原子；和
其中所述內(nèi)部空間也包含陰離子。
68.權(quán)利要求65所述的組合物，其中所述聚陰離子以至少0.05克當量/L、至少0.2克當量/L、至少0.5克當量/L、至少0.6克當量/L的濃度包含在所述內(nèi)部空間中。
69.權(quán)利要求58-68中任一項所述的組合物，其中所述長春花堿藥物是長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春氟寧、長春酰胺、長春西汀、其類似物或其衍生物。
70.權(quán)利要求69所述的組合物，其中所述小泡形成脂類包括磷脂酰膽堿和膽固醇。
71.權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述磷脂酰膽堿選自天然卵磷脂、氫化天然卵磷脂、合成的卵磷脂、1，2-二硬脂酰-卵磷脂、1，2-二棕櫚酰-卵磷脂、1，2-二豆蔻酰-卵磷脂、1，2-二油酰-卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰-卵磷脂和1-棕櫚酰-2-油酰卵磷脂。
72.權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述磷脂酰膽堿和所述膽固醇以約3∶2的摩爾比被包含。
73.權(quán)利要求58-68中任一項所述的組合物，其中所述脂類包括中性PEG-脂類衍生物或陰離子PEG-脂類衍生物。
74.權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述中性PEG-脂類衍生物為所述脂類總數(shù)的約0.1摩爾％至約10摩爾％。
75.權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述中性PEG-脂類衍生物是PEG-神經(jīng)酰胺或PEG-二?；肌?br>
76.權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述陰離子PEG-脂類衍生物以低于總脂類的1摩爾％被包含。
77.權(quán)利要求76所述的組合物，其中所述陰離子PEG-脂類衍生物是N-(PEG)-二?；?磷脂酰乙醇胺。
78.權(quán)利要求58-77中任一項所述的組合物，其中所述哺乳動物是大鼠。
79.用于施用長春花堿藥物的組合物，包括介質(zhì)中的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體具有內(nèi)部空間和將所述內(nèi)部與所述介質(zhì)隔開的膜，所述膜包括脂類，
其中所述脂類以約3∶2的摩爾比包括卵磷脂和膽固醇；和
其中所述長春花堿藥物以約0.15mg/mmol卵磷脂至約0.55mg/mmol卵磷脂的藥物/脂類比包含在所述脂質(zhì)體中；和
其中所述內(nèi)部空間也含有生物可降解的聚陰離子聚合物、聚陰離子化的多元醇或聚陰離子化的糖；和
其中所述聚合物或糖以約0.5克當量/L至約1.0克當量/L的濃度包含在所述脂質(zhì)體的所述內(nèi)部空間中；和
其中所述長春花堿藥物是長春瑞濱、長春新堿或長春堿。
80.權(quán)利要求79所述的組合物，其中所述聚陰離子化的糖是八硫酸蔗糖。
81.權(quán)利要求80所述的組合物，還包括離子化的中性聚(乙二醇)-脂類衍生物，其量為總脂類的約0.1摩爾％至約10摩爾％。
82.權(quán)利要求81所述的組合物，其中所述聚(乙二醇)-脂類衍生物是聚(乙二醇)-二烷基丙三醇、聚(乙二醇)-二?；蓟蚓?乙二醇)-神經(jīng)酰胺，其中所述聚(乙二醇)-脂類衍生物的聚(乙二醇)部分的分子量為約250至約10,000。
83.權(quán)利要求80所述的組合物，還含有包括陰離子聚(乙二醇)-脂類衍生物，其量為總脂類的約0.1摩爾％至約0.9摩爾％
84.權(quán)利要求83所述的組合物，所述陰離子聚(乙二醇)-脂類衍生物是PEG-磷脂酰乙醇胺，其中所述聚(乙二醇)-脂類衍生物的聚(乙二醇)部分的分子量為約250至約10,000。
85.權(quán)利要求79-84中任一項所述的組合物，其中在哺乳動物血液循環(huán)中所述長春花堿藥物從所述脂質(zhì)體釋放的半釋放期超過24小時。
86.權(quán)利要求85所述的組合物，其中所述哺乳動物是大鼠。
87.組合物，包含具有內(nèi)部空間的脂質(zhì)體和包含紫杉醇化合物，其中所述紫杉醇化合物基本上包含在所述脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中。
88.權(quán)利要求87所述的組合物，其中所述紫杉醇是離子中性分子。
89.權(quán)利要求88所述的組合物，其中所述紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)不含親水性聚合物部分。
90.權(quán)利要求87-89中任一項所述的組合物，其中所述包囊的紫杉醇的數(shù)量為每摩爾所述脂類至少0.05摩爾。
91.權(quán)利要求89所述的組合物，其中所述包囊的紫杉醇的數(shù)量為每摩爾所述脂類至少0.1摩爾。
92.權(quán)利要求87-92中任一項所述的組合物，其中所述內(nèi)部空間基本上無選自膠束形成表面活性劑化合物和環(huán)糊精化合物的加溶助劑。
93.權(quán)利要求87-92中任一項所述的組合物，其中所述紫杉醇是帕利它西或多烯紫杉醇。
94.前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述脂類包括用親水性聚合物衍生化的脂類。
95.權(quán)利要求94所述的組合物，其中所述親水性聚合物-衍生化的脂類構(gòu)成所述脂類總數(shù)的最高達20摩爾％。
96.權(quán)利要求94所述的組合物，其中所述親水性聚合物-衍生化的脂類構(gòu)成所述脂類總數(shù)的1摩爾％以下。
97.權(quán)利要求94所述的組合物，其中，與除了缺少所述親水性聚合物-衍生化的脂類之外相同組成的脂質(zhì)體的循環(huán)壽命相比，所述脂質(zhì)體在哺乳動物中的血液循環(huán)壽命高兩倍以下。
98.權(quán)利要求97所述的組合物，其中所述哺乳動物是大鼠。
99.權(quán)利要求96所述的組合物，其中所述親水性聚合物-衍生化的脂類構(gòu)成所述脂類總數(shù)的約0.1摩爾％至約0.9摩爾％。
100.權(quán)利要求94-99中任一項所述的組合物，其中所述親水性聚合物是聚(乙二醇)或其衍生物。
101.權(quán)利要求94-100中任一項所述的組合物，其中所述親水性聚合物-衍生化的脂類是聚(乙二醇)-衍生化的磷脂、聚(乙二醇)-衍生化的二?；?、聚(乙二醇)-衍生化的二烷基丙三醇、聚(乙二醇)-衍生化的神經(jīng)酰胺、聚(乙二醇)-衍生化的脂肪酸、聚(乙二醇)-衍生化脂肪醇的或聚(乙二醇)-衍生化的固醇。
102.權(quán)利要求94-101中任一項所述的組合物，其中所述親水性聚合物是具有至少三個乙二醇單元的聚(乙二醇)。
103.權(quán)利要求94-101中任一項所述的組合物，其中所述親水性聚合物是分子量約200至約10,000的聚(乙二醇)。
104.權(quán)利要求94-101中任一項所述的組合物，其中所述親水性聚合物是分子量約500至約5,000的聚(乙二醇)。
105.前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包括導向部分。
106.權(quán)利要求105所述的組合物，其中所述導向部分是蛋白質(zhì)、肽、多糖、多核苷酸、天然小分子、合成小分子、其組合或其衍生物。
107.權(quán)利要求105所述的組合物，其中所述導向部分是天然的、合成的或重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，包含抗體的抗原結(jié)合序列。
108.權(quán)利要求105所述的組合物，其中所述導向部分是抗體、其抗原結(jié)合片段、包括抗體的抗原結(jié)合多肽序列的單鏈蛋白、單結(jié)構(gòu)域抗體、任何前述物質(zhì)的類似物或任何前述物質(zhì)的衍生物。
109.權(quán)利要求105所述的組合物，其中所述導向部分連接到所述脂質(zhì)體膜并暴露于所述介質(zhì)。
110.權(quán)利要求109所述的組合物，其中所述連接的導向部分包含將所述脂質(zhì)體膜與所述部分連接起來的親水性聚合物。
111.權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述親水性聚合物是聚(乙二醇)。
112.權(quán)利要求111所述的組合物，其中所述聚(乙二醇)的分子量為約250至約30,000。
113.權(quán)利要求104-112中任一項所述的組合物，其中所述導向部分導致脂質(zhì)體內(nèi)化入細胞中。
114.權(quán)利要求104-112中任一項所述的組合物，其中所述導向部分選擇性地結(jié)合到受體酪氨酸激酶、生長因子受體、血管生成因子受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、細胞粘附分子或維生素受體。
115.權(quán)利要求114所述的組合物，其中所述酪氨酸激酶受體是生長因子受體。
116.權(quán)利要求115所述的組合物，其中所述酪氨酸激酶生長因子受體是EGFR、ErbB-2(HER-2)、ErbB-3(HER3)、或ErbB-4(HER4)。
117.權(quán)利要求114所述的組合物，其中所述血管生成因子受體是bFGF受體或VEGF受體。
118.權(quán)利要求114所述的組合物，其中所述細胞吸附分子是整聯(lián)蛋白。
119.權(quán)利要求113-118中任一項所述的組合物，其中所述細胞是惡性細胞。
120.將實體包囊入脂質(zhì)體中的方法，包括步驟將權(quán)利要求1-22中任一項所述的組合物與所述實體接觸足以使所述物質(zhì)包囊入所述脂質(zhì)體的時間。
121.權(quán)利要求120所述的方法，其中至少一部分的所述實體進入所述脂質(zhì)體內(nèi)部空間。
122.權(quán)利要求120所述的方法，其中至少90％的所述實體進入所述脂質(zhì)體內(nèi)部空間。
123.權(quán)利要求120所述的方法，其中包囊入所述脂質(zhì)體的所述實體的比例是至少80％、至少90％或至少95％。
124.權(quán)利要求120所述的方法，其中所述實體是球形陽離子實體、治療劑實體或可檢測標記。
125.權(quán)利要求120所述的方法，其中所述實體與所述脂類總數(shù)的摩爾比是至少約0.05、約0.1、約0.2或約0.3。
126.權(quán)利要求120所述的方法，其中所述治療劑實體是抗菌治療劑、抗病毒治療劑或抗腫瘤治療劑。
127.權(quán)利要求120所述的方法，其中所述治療劑實體是氨基糖苷抗生素或氟喹諾酮衍生物。
128.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述治療劑實體選自拓撲異構(gòu)酶抑制劑、法蘭基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、周期蛋白依賴性激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、極光蛋白激酶抑制劑、微管解聚劑、微管穩(wěn)定劑、烷化劑、酶、酶抑制劑、組蛋白脫乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑、抗代謝物、受體結(jié)合劑、激素、激素拮抗劑、核苷酸、多核苷酸、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
129.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述治療劑實體選自蒽環(huán)類抗生素化合物、喜樹堿化合物、長春花堿、玫瑰樹堿化合物、紫杉醇化合物、渥曼青霉素化合物、吡唑并嘧啶化合物、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
130.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述治療劑實體選自阿霉素、道諾霉素、絲裂霉素C、表阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、癌霉素、N-乙酰阿霉素、佐柔比星、5-亞氨道諾霉素、N-乙酰道諾霉素、daunoryline、米托蒽醌、喜樹堿、9-氨基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、10，11-亞甲二氧基喜樹堿、9-氨基-10，11-亞甲二氧喜樹堿、9-氯-10，11-亞甲二氧喜樹堿、伊立替康、托泊特坎、勒托替康、silatecan、(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10，11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿、7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10，11-亞甲二氧-20(S)-喜樹堿、7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹堿、長春新堿、長春堿、長春瑞濱、長春氟寧、長春西汀、長春酰胺、玫瑰樹堿、6-3-氨丙基-玫瑰樹堿、2-二乙基氨基乙基-玫瑰樹堿鎓及其鹽、達替銨、retelliptine、帕利它西、多烯紫杉醇、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
131.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述治療劑實體選自抗組胺乙二胺衍生物、bromphenifamine、苯海拉明、抗原生動物藥物、喹諾酮、碘喹啉、脒化合物、戊烷脒、抗蠕蟲劑化合物、噻嘧啶、抗吸血蟲藥物、奧沙尼喹、抗真菌三唑衍生物、fliconazole、埃他康唑、酮康唑、咪康唑、抗菌頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢尼西、頭孢噻肟、頭孢酰亞胺、頭孢呋辛、抗菌β-內(nèi)酰胺衍生物、氨曲南、頭孢美唑、頭孢西丁、紅霉素組抗菌劑、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、竹桃霉素、青霉素化合物、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、羧芐西林、四環(huán)素化合物、新生霉素、壯觀霉素、萬古霉素；抗分枝桿菌藥物、氨基水楊酸、卷曲霉素、乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、氯法齊明、抗病毒金剛烷胺化合物、金剛烷胺、金剛乙胺、奎尼丁化合物、奎寧、奎納克林、氯喹、羥氯喹、伯胺喹、阿莫地喹、甲氟喹寧甲氟喹寧、抗微生物qionolone、環(huán)丙沙星、依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺藥物類；尿道抗微生物劑、呋喃妥因、trimetoprim；硝基咪唑類衍生物、甲硝唑、膽堿季銨化合物化合物、ambethinium、新斯的明、毒扁豆堿、抗-阿爾茨海默病、氨基吖啶、他克林、抗帕金森藥物、苯扎托品、比哌立登、普環(huán)啶、苯海索、抗毒蕈堿劑、阿托品、莨菪堿、東莨菪堿、丙胺太林、腎上腺素化合物、多巴胺、血清胺、沙丁胺醇、多巴酚丁胺、麻黃堿、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、metaproperenol、氟替卡松、特布他林、血清胺再吸收抑制劑、麥角胺衍生物、箭毒系列肌肉松弛素、中樞作用肌肉松弛素、巴氯酚、環(huán)苯并環(huán)庚三烯、苯芙海因、煙堿、煙堿受體拮抗劑、β-腎上腺素阻斷劑、acebutil、胺碘酮、苯并二氮化合物、地爾硫草、抗心律失常藥、二異丙酰胺、恩卡尼、局部麻醉化合物、普魯卡因、普魯卡因酰胺、利多卡因、flecaimide、奎尼??；ACE抑制劑、卡托普利、enelaprilat、福辛普利、喹那普利、雷米普利；鴉片劑衍生物、可待因、哌替啶、美沙酮、嗎啡、抗脂類藥物、氟伐他汀、吉非貝齊、HMG-coA抑制劑、普伐他汀、降壓藥劑、可樂定、胍那芐、哌唑嗪、胍乙啶、granadril、肼苯噠嗪、非冠狀動脈血管擴張劑、雙嘧達莫、乙酰膽堿酯酶抑制劑、匹魯卡品、生物堿、毒扁豆堿、新斯的明、任何前述物質(zhì)的衍生物、任何前述物質(zhì)的前藥和任何前述物質(zhì)的類似物。
132.權(quán)利要求120-131中任一項所述的方法，其中所述接觸是在含水溶液中。
133.權(quán)利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的pH在約4至約7范圍內(nèi)。
134.權(quán)利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的離子強度等于或小于50mM氯化鈉的離子強度。
135.權(quán)利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的離子強度等于或小于20mM氯化鈉的離子強度。
136.權(quán)利要求132所述的方法，其中所述含水溶液的pH在約6.0至約7.0之間，以及所述實體是長春花堿、其類似物或其衍生物。
137.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述含水溶液的pH約6.5，以及所述實體是長春瑞濱。
138.權(quán)利要求135所述的方法，其中所述含水溶液的pH在約5至約7之間，所述物質(zhì)是喜樹堿衍生物。
139.權(quán)利要求139所述的方法，其中所述含水溶液的pH在約5.0至約6.5之間，以及所述物質(zhì)是托泊特坎或伊立替康。
140.權(quán)利要求134或135所述的方法，其中在所述接觸之后，所述含水溶液的離子強度被增加至50mM氯化鈉的離子強度以上。
141.權(quán)利要求140所述的方法，其中所述離子強度值被增加至至少100mM氯化鈉的離子強度。
142.權(quán)利要求141所述的方法，其中所述離子強度值被增加至至少150mM氯化鈉的離子強度。
143.制備含有包囊的實體的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括步驟
(a)提供所述實體的實體前體；
(b)將所述實體前體包囊入具有內(nèi)部空間的脂質(zhì)體；和
(c)在所述脂質(zhì)體內(nèi)提供一條件，以在所述脂質(zhì)體內(nèi)部空間中將所述包囊的實體前體轉(zhuǎn)化為所述實體，獲得脂質(zhì)體包囊形式的所述實體；
其中所述實體是有機化合物或包含鉑系元素金屬的配位復合物的化合物。
144.權(quán)利要求143所述的方法，其中所述包囊步驟包括將所述實體前體與具有跨膜梯度的所述脂質(zhì)體接觸，接觸的時間足以將所述衍生物包囊入所述脂質(zhì)體。
145.權(quán)利要求144所述的方法，其中所述跨膜梯度是離子梯度、pH梯度、電化學勢梯度或溶解性梯度。
146.權(quán)利要求144所述的方法，其中所述離子梯度選自銨離子、包含至少一個C-N鍵的取代形式的銨離子的離子梯度。
147.權(quán)利要求144所述的方法，其中所述實體前體是所述實體的球形陽離子衍生物。
148.權(quán)利要求143所述的方法，其中所述化合物是藥物。
149.權(quán)利要求148所述的方法，其中所述有機化合物是紫杉醇化合物。
150.權(quán)利要求149所述的方法，其中所述紫杉醇化合物是帕利它西或多烯紫杉醇。
151.權(quán)利要求149所述的方法，其中所述實體前體包含紫杉醇分子的位置2′或7′中任一位置中的羥基基團的酯，其中所述酯包括可滴定的胺。
152.權(quán)利要求151所述的方法，其中所述實體前體是2′-(2-(N，N′-二乙基氨基)丙?；?-帕利它西或2′-(2-(N，N′-二乙基氨基)丙?；?-多烯紫杉醇。
153.權(quán)利要求143所述的方法，其中所述條件是pH的變化。
154.權(quán)利要求143所述的方法，其中所述條件是不穩(wěn)定鍵的酶切割。
155.權(quán)利要求143所述的方法，其中所述條件是水解、光分解、輻解、硫解、氨解、還原、取代、氧化或消除方法。
156.試劑盒，用于提供脂質(zhì)體包囊的實體，包括權(quán)利要求1-22中任一項所述的組合物，使用所述組合物包囊實體的說明書，和任選地在獨立的容器中的所述實體。
157.權(quán)利要求156所述的試劑盒，其中所述實體是球形陽離子物質(zhì)、治療劑實體或可檢測標記。
158.權(quán)利要求1-119中任一項所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包括取代的銨化合物，所述銨化合物在含水溶液中于環(huán)境溫度下的pKa值是至少8.0、至少8.5、至少9.0、至少9.5或至少10.0。
159.權(quán)利要求120-142中任一項所述的方法，其中與所述實體接觸的所述組合物包括脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包含取代的銨化合物，所述銨化合物在含水溶液中于環(huán)境溫度下的pKa值為至少8.0、至少8.5、至少9.0、至少9.5或至少10.0。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有取代的銨和/或聚陰離子、和任選地帶有期望的治療實體或成像實體的脂質(zhì)體組合物。本發(fā)明也提供了制備本發(fā)明提供的脂質(zhì)體組合物的方法。
文檔編號A61K9/127GK1980637SQ20058002239
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月3日
發(fā)明者K·洪, D·C·德拉蒙德, D·B·基爾波京 申請人:赫爾姆生物科學公司