專(zhuān)利名稱(chēng)：改善的脂質(zhì)體以及其應(yīng)用的制作方法
改善的脂質(zhì)體以及其應(yīng)用本發(fā)明涉及分子醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)的領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體以及它們作為治療性化合物的遞送載體的應(yīng)用。還提供了一種用于制備脂質(zhì)體的方法。許多化合物的治療效果受到靶細(xì)胞對(duì)化合物的低攝取的限制。通常，為了使治療 效果最大化，期望將化合物遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)室或細(xì)胞核室，其中發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄、以及 mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。親脂性化合物，包括許多較小的不帶電荷的化合物，可以滲透穿過(guò)細(xì)胞 膜并允許細(xì)胞相對(duì)有效的攝取。然而，對(duì)于各種更大和/或帶電荷的化合物，如蛋白質(zhì)、核 酸、以及高度水溶性帶電荷的有機(jī)化合物，借助于穿過(guò)細(xì)胞膜的滲透的被動(dòng)攝取受到限制。已提出多種方法來(lái)改善這樣的化合物攝取到細(xì)胞中。例如，可以以改進(jìn)的或前藥 形式來(lái)給予藥物，以便轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，然后在細(xì)胞內(nèi)酶轉(zhuǎn)化成活性形式。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì) 于每種治療性化合物來(lái)說(shuō)，適宜的前藥形式的制備并不都是可能的?？商鎿Q地，可以使用吞噬或胞吞的細(xì)胞過(guò)程，其中含藥物的顆粒被靶細(xì)胞吸收。借 助于大多數(shù)目前可獲得的藥物遞送顆粒，然而這種方式限于某些細(xì)胞類(lèi)型，例如，吞噬作用 限于單核細(xì)胞譜系的細(xì)胞以及限于某些其它髓樣細(xì)胞，如中性白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)，而 胞吞作用限于多種其它細(xì)胞，連同其它來(lái)自間充質(zhì)譜系的細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞 以及成纖維細(xì)胞。因此，不同于巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞(其專(zhuān)門(mén)用于清除和處理來(lái)自血液的 顆粒)，存在許多種沒(méi)有或很少準(zhǔn)備好處理含藥物顆粒的細(xì)胞。用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞攝取藥物的又一種方式涉及使用融合顆粒(其用來(lái)融合于靶細(xì)胞 的表面膜)，將顆粒的內(nèi)容物釋放到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)室中。已提出滅活和重組的病毒顆粒用 于該目的，尤其在基因治療中，其中較大的核酸鏈被引入到細(xì)胞中。由包埋在人工脂質(zhì)雙層 中的融合促進(jìn)病毒蛋白質(zhì)組成的病毒樣顆粒代表另一個(gè)實(shí)例。然而，安全問(wèn)題和與生長(zhǎng)、分 離、以及滅活病毒成分有關(guān)的費(fèi)用限制了這些方式的廣泛應(yīng)用。覆蓋所有血管的血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞是就處理含藥物顆粒(例如，載藥脂質(zhì)體)而 言會(huì)受到妨礙的細(xì)胞的實(shí)例。內(nèi)皮細(xì)胞在全身體內(nèi)平衡和重要疾病(包括(慢性)炎癥和 癌癥)的病理(生理)學(xué)方面具有關(guān)鍵作用。它們還是用于藥物遞送的有吸引力的靶細(xì)胞 /靶組織，因?yàn)樗鼈兪怯裳恨D(zhuǎn)運(yùn)的任何化合物完全可進(jìn)入的。此外，就外觀和功能而言， 內(nèi)皮的異質(zhì)性便于組織和疾病特異性藥物遞送方式。內(nèi)皮細(xì)胞是用于癌癥治療的有希望的 靶，因?yàn)檠苌蓪?duì)于向?qū)嶓w腫瘤供給氧和營(yíng)養(yǎng)物是至關(guān)重要的。此外，在炎性疾病中，它 們引導(dǎo)白血細(xì)胞從血液移動(dòng)到組織中，因此對(duì)于疾病的發(fā)展是必不可少的。本發(fā)明的發(fā)明 人觀察到，靶向在TNFa激活的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的E-選擇蛋白或VCAM-I的脂質(zhì)體容易以 可比于巨噬細(xì)胞的胞吞能力的量被吞噬。然而，不同于巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞并不廣泛地處理 或降解脂質(zhì)體，因而在泡囊體內(nèi)累積載藥載體。缺乏脂質(zhì)體降解和/或去穩(wěn)定作用會(huì)導(dǎo)致 封裝藥物保留在脂質(zhì)體中，因而導(dǎo)致較差的藥理功效。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于脂質(zhì)的藥物遞送載體，與已知遞送載體 相比，其便于改善在靶細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)藥物釋放。具體目標(biāo)是提供一種基于脂質(zhì)的藥物遞 送載體，用于在靶細(xì)胞(其并不專(zhuān)門(mén)清除和/或處理基于脂質(zhì)的顆粒)中進(jìn)行有效的細(xì)胞 內(nèi)藥物釋放，如內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、毛細(xì)胞、祖細(xì)胞的子集、和周細(xì)胞以及并不專(zhuān)門(mén)處理遞送載體的所有其它細(xì)胞。利用區(qū)別a)由靶細(xì)胞攝取的脂質(zhì)體和b)在靶細(xì)胞中釋放來(lái)自脂質(zhì)體的藥物的方法，本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在“經(jīng)典”或“傳統(tǒng)”脂質(zhì)體的雙層(即由脂雙層包圍 的含水室)中加入合成的衍生自吡啶鐺的兩親物(或兩親分子，親水脂分子)會(huì)產(chǎn)生基于 脂質(zhì)的遞送載體，其可以確保在并不專(zhuān)門(mén)處理基于脂質(zhì)的顆粒的細(xì)胞中有效的細(xì)胞內(nèi)藥物 遞送。僅包含雙層的脂質(zhì)體，其中雙層包含一種或多種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物，基于 總脂質(zhì)含量，其量為2至25mol%，發(fā)現(xiàn)是足夠穩(wěn)定的。因此，本發(fā)明提供了一種包括至少一 個(gè)封閉含水內(nèi)室(或區(qū)室)的脂雙層的脂質(zhì)體，其中所述脂雙層包含至少一種合成的衍生 自吡啶鐺的兩親物，基于脂質(zhì)體的總脂質(zhì)含量，所述兩親物的量為2至25mol%。在本領(lǐng)域已知，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”是指由磷脂雙層膜封閉(密封，包圍)的含水室。磷 脂分子由細(xì)長(zhǎng)的非極性(疏水)結(jié)構(gòu)和在一端的極性(親水))結(jié)構(gòu)構(gòu)成。當(dāng)分散在水中 時(shí)，它們自發(fā)形成雙層膜，還稱(chēng)作薄片，其由脂質(zhì)分子的兩個(gè)單層片層構(gòu)成，其中它們的非 極性(疏水)表面彼此面對(duì)并且它們的極性(親水)表面面向含水介質(zhì)。兩親物是一種由具有連接于水不溶性烴鏈的極性水溶性基團(tuán)的分子構(gòu)成的化合 物。吡啶鐺是指吡啶的陽(yáng)離子形式。這可以是由于環(huán)中的氮的質(zhì)子化或由于取代基加入到 環(huán)中的氮上，通常借助于烷基化。在吡啶的氮原子上的孤對(duì)電子并沒(méi)有被非定域，因此吡啶 可以容易地被質(zhì)子化。如在本文中所使用的，措辭“衍生自吡啶鐺”是指在其極性基團(tuán)中具 有吡啶鐺部分的任何兩親物。合成的衍生自吡啶鐺的兩親物在本領(lǐng)域是已知的。用于本發(fā)明特別感興趣 的是合成的衍生自吡啶鐺的兩親物的組，其被SynvoIux專(zhuān)利技術(shù)，SAINT (Synthetic， Amphiphilic, INTeractive)涵蓋。參見(jiàn)例如歐洲專(zhuān)利EP0755924-B1。在本發(fā)明的一種實(shí)施 方式中，至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物選自具有通式(I)的SAINT化合物的組 其中隊(duì)是(C1-C5)烷基、芳(烷基)或烷基基團(tuán)，其具有陽(yáng)離子官能團(tuán)，如 或R1是(C「C5亞烷基)R5，其中R5是具有通式I的結(jié)構(gòu)(除了 R1)；X是鹵化物抗衡離子，選自Cl_、r、Br_;R3是氫以及R2和R4是相同或不同的并且選自包括支鏈或直鏈(Cltl-C2tl)烷基、單 或多不飽和(Cltl-C2tl)鏈烯基、0 = C-O-烷基的組、
或芳(烷基)，或RjPR4是氫以及R3是-CH (R5)2，其中R5包括(C10-C20)烷基、單或多不飽和 (C10-C20)鏈烯基、ο = C-O-烷基、 或芳烷基。在另外的實(shí)施方式中，結(jié)合有如上文所定義的SAINT分子，其中放棄的是具有通式I的化合物，其中R1是CH3、R2和R4是氫、R3是(C16H33) 2CH 并且X是所有提及的抗衡離子，并且否認(rèn)的是這樣的化合物，其中R1是CH3、R2和R4是 C16H33-O-C(O)、R3是氫以及X是所有提及的抗衡離子。根據(jù)本發(fā)明的包括SAINT分子的脂質(zhì)體還稱(chēng)作“SAINT-o-somes”。本發(fā)明的具體 實(shí)施方式使用SAINT-18(氯化1-甲基-4-(順(或順式)-9_ 二油基)甲基-吡啶鐺)和 /或SAINT-12(氯化1-甲基_4-( 二十五烷-13-基)-吡啶鐺)。在本領(lǐng)域中還未描述或建議在傳統(tǒng)脂質(zhì)體中結(jié)合合成的衍生自吡啶鐺的兩親物， 如SAINT。相反，SAINT分子迄今已用于非脂質(zhì)體遞送載體(稱(chēng)作“l(fā)ipoplexes (陽(yáng)離子脂 質(zhì)體)”)，用于向哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送大分子如核酸或蛋白質(zhì)。EP-A-0755924例如披露了 大分子與SAINT的絡(luò)合，可選地以與輔助脂質(zhì)的1 1混合物，以形成尺寸高達(dá)數(shù)ym的 lipoplex顆粒。在形成的lipoplex中，在SAINT與大分子之間僅存在非共價(jià)相互作用。在顆 粒表面上的陽(yáng)離子兩親物對(duì)于帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面具有高親和力。而EP-A-0755924的導(dǎo) 言部分簡(jiǎn)單提到“由磷脂的雙層構(gòu)成的脂質(zhì)體”，必須強(qiáng)調(diào)的是，在EP-A-0755924中披露的 發(fā)明顯然并不涉及這樣的脂質(zhì)體。相反，它涉及l(fā)ipoplexes，其結(jié)構(gòu)組織由Oberle等人使 用原子力顯微鏡(2000，Biophysical Journal 79 (3)，1447-1454)詳細(xì)地加以研究。Oberle 等人的圖7說(shuō)明了，包含SAINT的lipoplexes，如例如在EP-A-0755924中所披露的，由纏繞 成若干層的兩親物的DNA構(gòu)成，其隨后合并成較大的復(fù)合物。值得注意的是，一些DNA “伸 出”lipoplex并且未被屏蔽自環(huán)境，如當(dāng)結(jié)合在包含SAINT的脂質(zhì)體的內(nèi)室中時(shí)的情況，如 在本發(fā)明中所披露的。Rejman 等人(Biochimicaet Biophysica Acte 1660(2004)41-52)、 Zuhorn 等人(Biochmica etBiophysica Acta 1560 (2002) 25-36)、Van de Woude 等人 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 1160-1165,1997)以及 W02006/043809 同樣披露了 lipoplexes而不是包含含水內(nèi)室的脂質(zhì)體。相反，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體，其包括由脂雙層包圍的含水內(nèi)部空間，其中結(jié)合有一種 或多種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物。不希望受任何理論的約束，兩親物的陽(yáng)離子吡啶鐺 首基的性能使脂質(zhì)體脂雙層變得較少剛性的并更易于與細(xì)胞內(nèi)、胞內(nèi)體膜脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)混合(例如，融合)，從而促進(jìn)封裝化合物的細(xì)胞內(nèi)釋放。如下文所說(shuō)明的，對(duì)于僅任何陽(yáng)離子兩親物并沒(méi)有觀測(cè)到這種效應(yīng)，因?yàn)榫哂蓄?lèi)似量的DOTAP (N-[1-(2，3- 二油酰氧基)]-N，N， N-三甲基銨丙烷)，一種眾所周知的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，的脂質(zhì)體呈現(xiàn)較差的性能。根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體具有一種或多種衍生自吡啶鐺的兩親物。脂質(zhì)體的確切組成 將取決于它們要使用的特殊環(huán)境。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)，確定適宜的脂質(zhì)組成是一 種常規(guī)事情。關(guān)于脂質(zhì)體的一般信息可以例如在Lasic，D.D. “l(fā)iposomes from physics toapplication”，Elsevier Science B. V. Amsterdam, 1993 (ISBN0444895485)中找到。在本發(fā)明的脂質(zhì)體中的衍生自吡啶鐺的兩親物的相對(duì)量可以變化，但是基于脂質(zhì) 體的其它脂質(zhì)成分的總量通常高達(dá)約5-25mol%。這可以確保，脂質(zhì)體在靶細(xì)胞之外(例 如，在血流中)是穩(wěn)定的，同時(shí)它便于在與靶細(xì)胞膜混合或融合以后其封裝內(nèi)容物的有效 的細(xì)胞內(nèi)釋放。當(dāng)使用相對(duì)于其它脂質(zhì)包含5-20mol %，優(yōu)選10-20mol %，如11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20mol%的衍生自吡啶鐺的兩親物的脂質(zhì)體時(shí)，獲得了很好的結(jié)果。具 體實(shí)施方式包括這樣的脂質(zhì)體，其包含10-20mol%的SAINT分子，如10、11、12、14、15、17、 19 或 20mol% 的 SAINT-18 或 SAINT-12。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的脂質(zhì)體，除至少一種衍生自吡啶鐺的兩親物以外，基 本上由單一類(lèi)型的脂質(zhì)構(gòu)成。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂質(zhì)體包含兩種或更多種脂質(zhì)的 混合物，其優(yōu)先選自由甘油磷脂、鞘脂質(zhì)以及膽固醇組成的組?？梢允褂锰烊淮嬖诤?或合 成的脂質(zhì)。事實(shí)上，可以與至少一種衍生自吡啶鐺的兩親物聯(lián)合使用任何類(lèi)型的形成脂質(zhì) 體的脂質(zhì)或分子，以形成根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體。構(gòu)成本發(fā)明的脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括磷脂酰膽 堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、神經(jīng)節(jié)苷脂、糖脂、磷脂酰甘油、以及膽固醇。磷脂酰膽堿優(yōu)選 包括二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)以及二 硬脂酰磷脂酰膽堿。磷脂酰乙醇胺優(yōu)選包括二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙 醇胺、以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。磷脂酸優(yōu)選包括二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、 二硬脂酰磷脂酸、以及雙十六烷基磷酸。神經(jīng)節(jié)苷脂優(yōu)選包括神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、神經(jīng)節(jié)苷脂 ⑶la、以及神經(jīng)節(jié)苷脂GTlb。糖脂優(yōu)選包括半乳糖苷神經(jīng)酰胺、葡糖神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰 胺、磷脂、以及紅細(xì)胞糖苷脂。磷脂酰甘油優(yōu)選包括二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂 酰甘油、以及二硬脂酰磷脂酰甘油。體內(nèi)研究表明，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞可以快速地從循環(huán)中除去常規(guī)的脂質(zhì)體，即 存在于多個(gè)器官中的組織靜息巨噬細(xì)胞，尤其是脾臟和肝臟。當(dāng)使用立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體時(shí) 可以減小這種相互作用，其中立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體可以通過(guò)在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)插入單唾液 酰神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)或聚(乙二醇)(PEG)衍生的脂質(zhì)加以制備。涂布有惰性聚合物的這 樣的脂質(zhì)體在它們的血液循環(huán)半衰期(在人類(lèi)中為數(shù)天，相對(duì)于常規(guī)脂質(zhì)體的數(shù)分鐘)方 面呈現(xiàn)出顯著的改善。具有細(xì)胞特異性識(shí)別性能的立體穩(wěn)定的免疫脂質(zhì)體經(jīng)常是通過(guò)將抗體結(jié)合于PEG 鏈的遠(yuǎn)端來(lái)制備。利用PEG鏈作為脂質(zhì)體與抗體之間的接頭導(dǎo)致增強(qiáng)的抗體_抗原識(shí)別和 結(jié)合，因?yàn)榭贵w并沒(méi)有受到PEG的立體屏障活性的屏蔽。已開(kāi)發(fā)了若干種共價(jià)偶合方法，用 于在PEG末端連接(衍生)抗體。它們利用功能化的PEG脂質(zhì)，其具有化學(xué)反應(yīng)性端基如 酰胼、N-(3’_(吡啶二硫基)丙酸酯、馬來(lái)酰亞胺、琥珀酰、對(duì)硝基苯基羰基或氰尿酰氯。因 此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，衍生(例如，PEG化)磷脂可以用來(lái)改善脂質(zhì)體配方的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，和/或用來(lái)便于蛋白質(zhì)偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面。在一個(gè)具體方面中，本發(fā)明的脂質(zhì)體包含相對(duì)量為1 1至2 l(mol%)的磷脂酰膽堿和膽固醇的混合物，可選地以與一種 或多種天然或合成脂質(zhì)(例如PEG化的磷脂)的混合物。脂質(zhì)體本身可以通過(guò)任何常規(guī)方法，包括薄膜方法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法、以 及脫水_再水合方法來(lái)制備。因此，本發(fā)明提供了一種用于制備根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體的方 法，包括將常規(guī)脂質(zhì)與合適量的至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物混合，并且按照常 規(guī)程序(步驟)來(lái)制備脂質(zhì)體。還提供了可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的脂質(zhì)體。例如，上述脂質(zhì)的混合物，已從其除去溶劑，可以通過(guò)使用均化器加以乳化，凍干， 然后融化，以獲得多層脂質(zhì)體。可替換地，可以通過(guò)逆相蒸發(fā)法來(lái)制備單層脂質(zhì)體(Szoka and Papahadjopoulos, 1978，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :4194_4198)。還可以通過(guò)聲處 理或擠壓來(lái)制備單層泡囊(小泡)。在受控的溫度(如由脂質(zhì)的熔點(diǎn)確定的)下，通常利用 浴式聲處理器(bath—type sonifier) Bransontip sonifier 來(lái)進(jìn)對(duì)于聲處理。在脂質(zhì)體制備以后，在形成期間還未確定尺寸的脂質(zhì)體可以通過(guò)擠壓來(lái)確定尺 寸，以獲得脂質(zhì)體尺寸的期望的尺寸范圍和相對(duì)狹窄的分布。脂質(zhì)體的顆粒大小可以通過(guò) 超聲波輻射法、擠壓法、French壓制法、均勻化方法或任何其它合適的常規(guī)方法來(lái)控制?？梢酝ㄟ^(guò)生物膜擠出機(jī)來(lái)進(jìn)行擠壓，如Lipex生物膜擠出機(jī)(Lipex Biomembrane Extruder) (Northern Lipids Inc, Vancouver, British Columbia,力口拿大)。在擠壓過(guò)濾 器中規(guī)定的孔徑可以產(chǎn)生特定尺寸的單層脂質(zhì)體囊泡。約200-400nm的尺寸范圍將使得可 以借助于通過(guò)常規(guī)過(guò)濾器(例如，0.22微米過(guò)濾器)的過(guò)濾來(lái)對(duì)脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行殺菌。 可以在高通量的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)濾滅菌法。脂質(zhì)體還可以借助于通過(guò)非對(duì)稱(chēng)陶瓷過(guò)濾器，如 Ceraflow Microfilter (商業(yè)上可獲自 Norton Company,Worcester,Mass.)的擠壓來(lái)形成。對(duì)于治療應(yīng)用，優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體具有高達(dá)約300nm的尺寸(即，直 徑)。在一種實(shí)施方式中，脂質(zhì)體尺寸在約20至250nm，優(yōu)選30-200nm之間的范圍內(nèi)，如 50、60、75、100、120、135、150或18011111。各種各樣的脂質(zhì)體可以用于本發(fā)明(包括少層囊泡 或多層囊泡)，但優(yōu)選地脂質(zhì)體是小單層囊泡(SUV)，其具有約30至約300納米(nm)，最優(yōu) 選50至150nm的外徑。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以包括一種或多種其它有益成分，例如用于將脂質(zhì)體靶向特定 細(xì)胞的物質(zhì)(介質(zhì)，劑，means)。將藥物部位特異性遞送至患病細(xì)胞可以導(dǎo)致增加的治療效 果并且導(dǎo)致顯著減少的毒性。通過(guò)抗體結(jié)合的脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體進(jìn)行的藥物靶向代表這 樣的一種技術(shù)，其已應(yīng)用于靶向藥物作用的特異性部位如腦、肺、癌細(xì)胞、HIV感染的細(xì)胞或 免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。脂質(zhì)體靶向物質(zhì)(靶向介質(zhì)，靶向裝置)或靶向配體在本領(lǐng)域是已知的， 并且包括蛋白質(zhì)、肽，如抗體或其片段，其對(duì)于特定靶細(xì)胞的表面抗原或?qū)τ谔囟ǖ募?xì)胞內(nèi) 室(如線粒體)具有特異性。在它們的表面提供有靶向抗體的脂質(zhì)體在本領(lǐng)域被稱(chēng)作免疫 脂質(zhì)體。經(jīng)常通過(guò)單克隆抗體與它們的特異性抗原的高親和力結(jié)合來(lái)介導(dǎo)部位特異性靶 向。美國(guó)專(zhuān)利第5，258，499號(hào)披露了遞送載體配方(劑型)，其包括封裝在其上連接有蛋白 質(zhì)激素(配體)如白細(xì)胞介素_2的脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的活性劑。配體能夠顯示對(duì)于特定細(xì)胞受 體的親和力，導(dǎo)致封裝的活性劑遞送到靶細(xì)胞中，在治療病癥如免疫系統(tǒng)紊亂時(shí)能夠?qū)⒒?性劑遞送到特定的細(xì)胞群體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，攜帶靶向部分的脂質(zhì)體，例如，配 體，被靶細(xì)胞內(nèi)化。在又一種實(shí)施方式中，靶向部分是配體，其與酪氨酸激酶受體如，例如，EGFR、HER2、HER3、HER4、PD-GFR、VEGFR、bFGFR 或 IGFR 受體特異性地相互作用。在又一種 實(shí)施方式中，靶向部分與生長(zhǎng)因子受體、血管生長(zhǎng)因子受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、清除劑受體、細(xì) 胞粘附分子、或維生素受體特異性地相互作用。示例性的細(xì)胞特異性配體包括RGD肽、NGR 肽、ATWLPI3R 肽、APRPG 肽、SMSIARL 肽、TAASGVRSMH 肽、LTLRWVGLMS 肽、CDSDSDITWDQLWDLMK 肽、GPLPLR肽、HWGF肽、重組VEGF、抗體和單克隆抗體、雙特異性抗體以及單鏈片段，其是相 對(duì)于例如E選擇蛋白、VCAM-I、內(nèi)皮糖蛋白(endogl in)、MHCII、VEGF :VEGFR復(fù)合物、α ν β 3、 moc-31、cd-90、以及其它細(xì)胞靶表位。另外的受體特異性配體如轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白E^L 鐵蛋白、修飾白蛋白等。在一種實(shí)施方式中，脂質(zhì)體包括至少一種靶向配體，其經(jīng)由接頭分子結(jié)合于 加入脂質(zhì)體脂雙層中的SAINT分子。關(guān)于示例性的SAINT-接頭-配體分子，參見(jiàn) W02006/043811。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體包括未修飾的(即，不包括靶向物質(zhì))SAINT 分子以及經(jīng)由接頭其上結(jié)合有至少一種細(xì)胞或細(xì)胞器特異性配體的SAINT分子?？紤]到位阻，修飾與未修飾SAINT分子的相對(duì)量?jī)?yōu)選小于5%，更優(yōu)選小于1 %， 如大約0. 1 %。例如，制備了這樣的脂質(zhì)體，其包含35. 8mol %的P0PC、40mol %的膽固醇、 4mol% 的PEG-DSPE、20mol% 的 SAINT C18 以及0. 2mol% 的 SAINT C18-接頭作為雙層成分。如上所述，本發(fā)明的脂質(zhì)體包括內(nèi)部空間，其可以用來(lái)將一種或多種感興趣的分 子，例如生物活性化合物，遞送到靶細(xì)胞。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“生物活性化合物”旨在涵 蓋所有天然存在或合成的化合物，其能夠誘發(fā)生物反應(yīng)或?qū)ι锵到y(tǒng)，尤其是組織、細(xì)胞以 及細(xì)胞器，具有有益或有害的效應(yīng)，包括細(xì)胞毒性。這些化合物旨在包括所有種類(lèi)的藥物， 其包括抗生素藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗炎藥物、抗增生藥物和抗腫瘤藥 物，以及作為療法發(fā)展的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何抑制劑，如MAPK或SAPK抑制劑；激素，包括 肽類(lèi)激素和類(lèi)固醇激素；基因，重組核酸，寡核苷酸或編碼所有或部分哺乳動(dòng)物基因的其它 核酸，包括定制的小干擾RNA(還稱(chēng)作短干擾RNA或siRNA)以及特別基因改造的短RNA分 子，其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中可以有效地沉默微小RNA的作用，如antagomirs，一種病毒基因或 來(lái)自微生物的基因；抗原；酶；營(yíng)養(yǎng)物；以及最特別是任何生物活性化合物，其借助于穿過(guò) 感興趣的靶細(xì)胞的細(xì)胞膜的被動(dòng)滲透被低效吸收。在一個(gè)方面，脂質(zhì)體在其內(nèi)室中包括生 物活性化合物，其具有中性或陽(yáng)性?xún)綦姾?，例如蛋白質(zhì)物質(zhì)。本發(fā)明的另一方面涉及包括根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體的組合物。通常，本發(fā)明的脂質(zhì) 體組合物在貯藏期間是相當(dāng)穩(wěn)定的，例如，如在本發(fā)明的脂質(zhì)體內(nèi)實(shí)體的初始加載一段時(shí) 間以后通過(guò)在脂質(zhì)體外側(cè)釋放的或仍然保持在脂質(zhì)體內(nèi)的截留實(shí)體的百分比所測(cè)得的。例 如，在4°C下本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在至少6個(gè)月是穩(wěn)定的，例如，在初始加載實(shí)體6個(gè)月以 后小于10%的截留實(shí)體被釋放。在一種實(shí)施方式中，在4°C下本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物在至 少兩年是穩(wěn)定的，例如，在初始加載實(shí)體兩年以后小于20%的截留實(shí)體被釋放。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以提供為藥物組合物， 其包含本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物和載體，例如，藥用載體。藥用載體的實(shí)例是生理鹽水、等滲 葡萄糖、等滲蔗糖、林格氏液、以及Hanks液?？梢蕴砑泳彌_物質(zhì)以提供最適合于貯存穩(wěn)定 性的PH值。例如，約6. 0至約7. 5之間的pH，更優(yōu)選約6. 5的pH是最適合于脂質(zhì)體膜脂的 穩(wěn)定性，并便于截留實(shí)體的極好保留。通常以2-20mM濃度的組氨酸、羥基乙基哌嗪-乙基磺 酸酯(或鹽)(HEPES)、嗎啉基-乙基磺酸酯(或鹽)(MES)、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、以及檸檬酸鹽是典型的緩沖物質(zhì)。其它適宜的載體包括，例如，水、緩沖水溶液、0. 4% NaCUO. 3%甘氨酸等?？梢蕴砑拥鞍踪|(zhì)、碳水化合物、或聚合物穩(wěn)定劑以及張性調(diào)節(jié)劑，例如，明膠、白蛋 白、葡聚糖、或聚乙烯吡咯烷酮。借助于葡萄糖或更加惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇、 或糊精，可以將組合物的張性調(diào)節(jié)至0. 25-0. 35mol/kg的生理水平。可以通過(guò)常規(guī)的眾所 周知的殺菌技術(shù)，例如，通過(guò)過(guò)濾，來(lái)對(duì)這些組合物進(jìn)行殺菌。所得到的水溶液可以包裝以 供使用或在無(wú)菌條件下過(guò)濾并凍干，在給予以前將凍干的制劑結(jié)合于無(wú)菌水介質(zhì)。根據(jù)需要，藥物脂質(zhì)體組合物還可以包含其它藥用輔助物質(zhì)，以接近生理?xiàng)l件， 如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張性調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。 另外，脂質(zhì)體懸浮液可以包括脂質(zhì)保護(hù)劑，其保護(hù)脂質(zhì)以在存儲(chǔ)期間避免自由基和脂質(zhì) 過(guò)氧化損傷。親脂性自由基猝滅劑，如α-生育酚和水溶性鐵特異性螯合劑，如鐵草胺 (ferrioxamine),是適宜的。在液體藥物制劑中本發(fā)明的脂質(zhì)體的濃度可以差別很大，即通常從按重量計(jì)小于 約0. 05%或至少約2-10%至高達(dá)30至50%，并且將主要通過(guò)液體容積、粘度等并按照所選 擇的特定給藥方式來(lái)選擇。例如，可以增加濃度以降低與治療有關(guān)的液體負(fù)荷。在患有動(dòng)脈 粥樣硬化相關(guān)的充血性心力衰竭或重度高血壓的患者中，這可以是特別期望的?？商鎿Q地， 由刺激性脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)體藥物組合物可以被稀釋至低濃度，以減少在給藥部位的炎癥。給予的脂質(zhì)體藥物組合物的量將取決于若干因素，例如截留在脂質(zhì)體內(nèi)的特定的 治療性實(shí)體、待治療的疾病狀態(tài)、所使用的脂質(zhì)體類(lèi)型、和/或臨床醫(yī)生的判斷。通常，給予 的藥物脂質(zhì)體組合物的量將足以遞送治療有效劑量的特定的治療性實(shí)體。為遞送治療有效劑量所必要的藥物脂質(zhì)體組合物的量可以通過(guò)在藥物試驗(yàn) 領(lǐng)域中常見(jiàn)的常規(guī)體外和體內(nèi)方法來(lái)確定。參見(jiàn)，例如，D. B. Budman, A. H. Calvert, Ε. K. Rowinsky ( ), Handbook ofAnticancer Drug Development，Lffff，2003。禾中 治療性實(shí)體的治療有效劑量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的；并且根據(jù)本發(fā)明，與 通過(guò)給予相同量的在常規(guī)脂質(zhì)體配方(并不包含至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物) 中的治療性實(shí)體所獲得的活性相比，經(jīng)由本發(fā)明的藥物脂質(zhì)體組合物遞送的治療性實(shí)體可 以提供至少相同、或2倍、4倍、或10倍更高的活性。通常，用于本發(fā)明的脂質(zhì)體藥物組合 物的劑量在約0. 005至約500mg的治療性實(shí)體/公斤體重的范圍內(nèi)，最經(jīng)常，在約0. 1至約 IOOmg治療性實(shí)體/kg體重或靶向器官重量的范圍內(nèi)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物脂質(zhì)體組合物被制備成局部劑或注射劑，作為 液體溶液或懸浮液。然而，還可以制備固體形式，其在注射以前適合于在液體載體中的溶液 或懸浮液。還可以按照本領(lǐng)域已知的方法，將組合物配制成腸溶片或凝膠膠囊。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以以醫(yī)學(xué)上可以接受的任何方式給予，其可以取決于待 治療的病癥或疾病?？赡艿慕o予途徑包括注射，通過(guò)胃腸道外途徑如肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、硬膜內(nèi)、鞘內(nèi)、或其它途徑，以及口服、鼻、眼、直腸、陰道、局部、或肺， 例如，通過(guò)吸入。為了將根據(jù)本發(fā)明配制的脂質(zhì)體藥物遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，將脂質(zhì) 體直接緩慢、持續(xù)顱內(nèi)輸注到腫瘤中(對(duì)流增強(qiáng)遞送，或CED)是特別有利的。參見(jiàn)Saito 等人，Cancer Research, vol. 64, p. 2572-2579, 2004 ；Mamot, et al. , J. Neuro-Oncology, vol. 68,ρ. 1-9，2004。還可以將組合物直接施加于組織表面。緩釋、ρΗ依賴(lài)性釋放、或其它 特定化學(xué)或環(huán)境條件介導(dǎo)的釋放給予也明確地包括在本發(fā)明中，例如，通過(guò)這樣的方式如長(zhǎng)效制劑注射、或可侵蝕植入物。期望在其靜脈內(nèi)給予的情況下，平均顆粒直徑是400nm或更小。這是因?yàn)轭w粒直 徑超過(guò)400nm的脂質(zhì)體通過(guò)肝臟、脾臟以及類(lèi)似的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和肺而清除。還提供了一種用于促進(jìn)生物活性化合物遞送到靶細(xì)胞(其并不專(zhuān)門(mén)用于清除和 處理來(lái)自血液的顆粒)的方法，包括靜脈內(nèi)給予根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包含所述 生物活性化合物。另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體作為遞送載體，以體外或體內(nèi)將感興 趣的物質(zhì)引入靶細(xì)胞(其并不專(zhuān)門(mén)用于清除和/或處理基于脂質(zhì)的顆粒)的應(yīng)用。優(yōu)選 地，所述靶細(xì)胞選自由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、毛細(xì)胞、 祖細(xì)胞的亞類(lèi)(亞群)、以及周細(xì)胞組成的組。更優(yōu)選地，靶細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明的脂 質(zhì)體和基于脂質(zhì)體的遞送方法例如可以促進(jìn)生物活性化合物(靶向)遞送到內(nèi)皮細(xì)胞，例 如TNFa激活的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，如本文披露的脂質(zhì)體被有利地用作藥物遞送載體。還提供了根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體在用于制備治療癌癥、慢性炎癥、組織再生/修復(fù)、 糖尿病或代謝性疾病相關(guān)的細(xì)胞功能異常的藥物中的應(yīng)用，上述脂質(zhì)體包含至少一種生物 活性化合物，該生物活性化合物是在它的內(nèi)部空間中和/或被插入脂雙層和/或共價(jià)或以 其它方式連接于脂質(zhì)體成分之一。在一種實(shí)施方式中，提供有EPCAM靶向物質(zhì)并封裝抑制細(xì)胞生長(zhǎng)化合物的脂質(zhì) 體用來(lái)制備治療癌癥的藥物。在另一種實(shí)施方式中，提供有E選擇蛋白靶向物質(zhì)并包含 P38MAPK抑制劑的脂質(zhì)體用來(lái)制備治療腎小球腎炎或reuma的藥物。


圖IA 通過(guò)使用雙放射性標(biāo)記的常規(guī)脂質(zhì)體，即沒(méi)有合成的衍生自吡啶鐺的兩親 物并且除不可降解的[3H]膽固醇油基醚以外還包含可代謝降解的酯膽固醇[14C]油酸酯， 研究了在靶向E選擇蛋白(HES)或VCAM-I (VCAM)的HUVEC中抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體的 細(xì)胞內(nèi)處理。在適當(dāng)代謝的情況下，在胞吞以后，膽固醇酯被水解并且釋放的[14C]油酸將 從細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中。[3H]膽固醇油基醚將保持締合的，因此3H/14C比率是脂質(zhì)體降解 的方便的度量[5]。如圖A所示，3H/14C比率在長(zhǎng)期溫育以后并沒(méi)有變化，這表明缺乏膽固 醇-[14C]油酸酯的水解。甚至24h溫育也沒(méi)有導(dǎo)致雙標(biāo)記的抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體的任 何顯著水解。在圖B中，比較了通過(guò)HUVEC的免疫脂質(zhì)體的降解和通過(guò)IC21細(xì)胞(腹膜巨 噬細(xì)胞)的類(lèi)似脂質(zhì)體的降解。結(jié)果表明，相同的脂質(zhì)體可以被特化細(xì)胞有效地降解。在 溶酶體降解的抑制劑(氯喹，NH4Cl)存在的條件下的溫育表明降解是溶酶體的(數(shù)據(jù)未示 出)。圖2 用抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體(沒(méi)有合成的衍生自吡啶鐺的兩親物)，其熒光 標(biāo)記有脂雙層標(biāo)記DiI JiTNFa激活的HUVEC溫育24h。脂質(zhì)體已累積在不同的細(xì)胞內(nèi)囊 泡中，同時(shí)沒(méi)有跡象表明熒光標(biāo)記在細(xì)胞膜上的再分布，即，在被內(nèi)皮細(xì)胞胞吞以后，脂質(zhì) 體未被降解。圖3 如在一般方法中所描述的來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體，其包含指定量的合 成的衍生自吡啶鐺的兩親物(在這種情況下為SAINT-18)或參比陽(yáng)離子兩親物D0TAP。在 指定的時(shí)期，在4°C和氬氣下，存儲(chǔ)脂質(zhì)體。在指定時(shí)間通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射，利用Mcomp型380 亞微米顆粒分析器以容積稱(chēng)重模式來(lái)分析脂質(zhì)體顆粒大小。數(shù)據(jù)表示為單值(對(duì)于一個(gè)脂質(zhì)體制劑)，或2至5個(gè)獨(dú)立的脂質(zhì)體制劑的平均值士sd。圖4 如在一般方法中所描述的，制備脂質(zhì)體。在沒(méi)有(圖A)或存在(圖B)10% (ν/ν)血清的情況下，將脂質(zhì)體保持在37°C的恒溫水浴中或在室溫(20°C )的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。在 指定時(shí)間，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射，使用Mcomp型380亞微米顆粒分析器以容積稱(chēng)重模式來(lái)分析 顆粒大小。數(shù)據(jù)表示為3或4個(gè)獨(dú)立的脂質(zhì)體制劑的平均值士sd。圖5 如描述的，用增加量的衍生自吡啶鐺的兩親物來(lái)制備脂質(zhì)體。當(dāng)用O至 20mol%的SAINT C18來(lái)配制雙層時(shí)，脂質(zhì)體是完全尺寸穩(wěn)定的。在高于約20至25mol %衍 生自吡啶鐺的兩親物的情況下，脂質(zhì)體開(kāi)始降低它們的尺寸穩(wěn)定性。圖6:作為pH值的函數(shù)，鈣黃綠素釋放自脂質(zhì)體。用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體的 熒光，同時(shí)在96孔板中在具有指定pH的緩沖液中進(jìn)行溫育。鈣黃綠素釋放涉及在用 Triton-XlOO處理后測(cè)得的脂質(zhì)體的總熒光。數(shù)據(jù)表示為與沒(méi)有SAINT或DOTAP的脂質(zhì)體 (3至4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士sd)相比的相對(duì)釋放。圖7 鈣黃綠素釋放自在pH 7. 4和pH 5下用20mol %的SAINT或DOTAP配制的脂 質(zhì)體。用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)，在96孔板中，并在具有指定pH的緩沖液中，監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體的熒光。鈣 黃綠素釋放涉及在用Triton-XlOO處理以后測(cè)得的脂質(zhì)體的總熒光。數(shù)據(jù)表示為與沒(méi)有 SAINT或DOTAP的脂質(zhì)體(3至4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 sd)相比的相對(duì)釋放。與pH 7.4 相比，*p < 0. 005 ；與包含20mol% SAINT的脂質(zhì)體相比，#p < 0. 05。圖8 血清(ν/ν)對(duì)來(lái)自脂質(zhì)體的鈣黃綠素釋放的影響。用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)，在96 孔板中監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體的熒光。在確定用Triton-XlOO處理后測(cè)得的脂質(zhì)體的總熒光以后，計(jì) 算鈣黃綠素釋放。數(shù)據(jù)表示為與沒(méi)有SAINT或DOTAP的脂質(zhì)體(3至4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均 值士 sd)相比的相對(duì)釋放。圖9 用具有封裝鈣黃綠素的脂質(zhì)體對(duì)TNF α激活的HUVEC溫育24h。圖A 用 20mol %的SAINT配制的抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體。圖B 沒(méi)有SAINT的抗E選擇蛋白免疫 脂質(zhì)體。圖C:包含20mol%的SAINT的非靶向脂質(zhì)體。在包含SAINT的靶向脂質(zhì)體的情況 下，鈣黃綠素釋放是最突出的。圖10 通過(guò)HUVEC來(lái)攝取DiI (圖A)和鈣黃綠素(圖B)標(biāo)記的脂質(zhì)體。用指定的 脂質(zhì)體溫育非TNF-α刺激和TNF-α刺激的細(xì)胞3h。通過(guò)FACS分析了脂質(zhì)體的攝取。數(shù) 據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖11 用20mol%的SAINT配制的并且包含白細(xì)胞介素_8 (IL-8) siRNA的E選擇 蛋白靶向脂質(zhì)體對(duì)在有條件永生化人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(CiGEnc)中IL-8的表達(dá)的影響。用 E選擇蛋白SAINT免疫脂質(zhì)體，其包含siRNA (對(duì)于IL-8或不規(guī)則的siRNA為特異性的)， 對(duì)TNF-α激活的ciGEnC進(jìn)行溫育48h。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析了 IL-8表達(dá)的抑制。提供的數(shù) 據(jù)來(lái)自一個(gè)實(shí)驗(yàn)。圖12 :VE_鈣粘著蛋白表達(dá)的下調(diào)。圖11 用20mol%的SAINT配制的并且包含 siRNA的E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體對(duì)H5V多瘤中T癌基因轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮瘤細(xì)胞系的影響。在 siRNA 1000pmol/ml的濃度下，用H5V細(xì)胞溫育包含特異性siRNA (對(duì)于VE-鈣粘著蛋白) 和不規(guī)則的siRNA的E-sel Saint-o-some 48h。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析siRNA的影響。將用 脂質(zhì)體處理的細(xì)胞中VE-鈣粘著蛋白的表達(dá)與TNF-α處理的細(xì)胞進(jìn)行了比較(任意設(shè)置 為1)。數(shù)據(jù)表示為士 SD。實(shí)施例使用的縮寫(xiě)TNFa 腫瘤壞死因子aVCAM-I 血管細(xì)胞粘附分子1HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DiI :1，1，-雙十八烷基-3，3，3’，3’ -四甲基吲哚羰花青高氯酸酯SAINT =N-甲基_4_烷基吡啶鐺氯化物；SATA (N-琥珀酰亞胺基_S_乙酰基硫代 乙酸酯)DOTAP力-[1-(2，3-二油酰氧基)]_隊(duì)N，N-三甲基銨丙烷脂質(zhì)體制備如下制備脂質(zhì)體。在氯仿甲醇(9 1，按體積計(jì))中，以55 40 4 1 的摩爾比率混合來(lái)自1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)的儲(chǔ)備溶液 的脂質(zhì)、膽固醇(Chol)、2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二 醇)-2000] (DSPE-PEG)以及1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚 乙二醇)-2000]-馬來(lái)酰亞胺(DSPE-PEG-Mal)，在降低的氮?dú)鈮毫ο赂稍铮芙庠诃h(huán)己烷 中并凍干。在指定的情況下，以指定的摩爾％將1_甲基_4-(順-9-二油基)甲基-吡啶 鐺-氯化物(SAINT-18)加入到脂質(zhì)混合物中，總是以POPC的量為代價(jià)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候， 將微量的[3H]膽固醇油基醚和膽固醇-[14C]-油酸酯加入到制劑中，分別作為不可降解標(biāo) 記和可降解標(biāo)記。對(duì)于熒光顯微鏡檢查法和共聚焦激光掃描顯微鏡檢查法，將0. 5mol%的 DiI加入到脂質(zhì)混合物中(如所指出的)。然后在H印es緩沖液(IOmM N-2-羥基乙基哌 嗪-N’ -2-乙磺酸Ofepes)、135mM NaCl, pH 6. 7)中或在包含IOOmM鈣黃綠素的水溶液中 水合脂質(zhì)。借助于孔徑為50nm的聚碳酸酯過(guò)濾器(CostanCambridge MA，USA)并通過(guò)重 復(fù)擠壓(13次)，使用高壓擠出機(jī)(Lipex，Vancouver，加拿大)來(lái)確定所形成的脂質(zhì)體的尺 寸。借助于N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?，對(duì)單克隆小鼠抗人E選擇蛋白 抗體(H18/7，由dr. Μ. Gimbrone, jr，Boston, MA, USA友好提供)進(jìn)行硫醇化，并通過(guò)硫氫 基-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)技術(shù)[2]在聚乙二醇鏈的遠(yuǎn)端偶聯(lián)于馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，如前面針對(duì)白 蛋白所描述的[3]。如上所述使用不相關(guān)的大鼠IgG(Sigma-AldrichChemie，Zwijndrecht， 荷蘭)來(lái)制備對(duì)照免疫脂質(zhì)體。沒(méi)有抗體的對(duì)照脂質(zhì)體制備自相同的脂質(zhì)混合物，但代替 用抗體溫育，用是DSPE-PEG-Mal兩倍的摩爾量的半胱氨酸對(duì)它們進(jìn)行溫育，以封閉反應(yīng)性 馬來(lái)酰亞胺基基團(tuán)。通過(guò)使用小鼠免疫球蛋白G作為標(biāo)準(zhǔn)4和磷脂磷含量5確定蛋白質(zhì)來(lái) 表征免疫脂質(zhì)體。調(diào)節(jié)總脂質(zhì)體脂質(zhì)濃度，以獲得在脂質(zhì)體制劑中存在的膽固醇和SAINT 的量。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射，使用Nicomp型380ZLS亞微米顆粒分析儀(NICOMP particle sizing systems, Santa Barbara，CA，USA)，以容積稱(chēng)重模式來(lái)分析顆粒大小。細(xì)胞定位用TNF α激活HUVEC指定時(shí)間。將脂質(zhì)體(放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的)加入到細(xì) 胞中指定時(shí)間。為了分析放射性標(biāo)記脂質(zhì)體的細(xì)胞締合，在溫育結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞置于冰上，除去培養(yǎng)基并用PBS洗滌細(xì)胞5次。然后溶解細(xì)胞并通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)來(lái)確定放射性。對(duì) 于熒光顯微鏡檢查法和共聚焦激光掃描顯微鏡檢查法，如上所述進(jìn)行溫育。在完成溫育以 后的1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行顯微鏡檢查。在此期間，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生變化并且在此期間類(lèi)似溫育 的圖像是可再生的。結(jié)果靶向在TNFa激活的內(nèi)皮細(xì)胞上的E選擇蛋白或VCAM-1的免疫脂質(zhì)體容易以與 巨噬細(xì)胞的胞吞能力可比的量被胞吞。然而，不同于巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞并不處理(降解) 脂質(zhì)體(圖1)并將它們累積在泡囊體中(圖2)。脂質(zhì)體降解和/或去穩(wěn)定作用的缺乏導(dǎo) 致加入的藥物保留在脂質(zhì)體中，因此導(dǎo)致較差的藥理功效。當(dāng)存儲(chǔ)在4°C和氬氣下時(shí)，用增加的mol % SAINT配制的脂質(zhì)體在2個(gè)月以上的時(shí) 間是尺寸穩(wěn)定的。包含SAINT的脂質(zhì)體的配方導(dǎo)致顆粒直徑的稍微增加，從沒(méi)有SAINT的 脂質(zhì)體的90nm至用20mol% SAINT配制的脂質(zhì)體的130nm(圖3)。將結(jié)果與包含20mol% DOTAP的脂質(zhì)體，一種經(jīng)常用于基于脂質(zhì)的核苷酸遞送中的非吡啶鐺陽(yáng)離子脂質(zhì)進(jìn)行比較。用SAINT配制的脂質(zhì)體在37°C下還呈現(xiàn)尺寸穩(wěn)定性至少24h (圖4A)。當(dāng)在10% (ν/ν)血清存在的條件下溫育時(shí)，在溫育7h以后，尤其是在室溫下脂質(zhì)體尺寸會(huì)增加(圖 4B)。然而，在37°C的生理相關(guān)溫度下，在溫育24h以后直徑的增加對(duì)于用合成的衍生自吡 啶鐺的兩親物配制的脂質(zhì)體是非常有限的。與時(shí)間零時(shí)相比，對(duì)于用20mol% SAINT配制的 脂質(zhì)體來(lái)說(shuō)，平均直徑被增加至130nm。如從圖5可以看到的，用高達(dá)20mol%的衍生自吡啶鐺的兩親物配制的脂質(zhì)體仍 然是尺寸穩(wěn)定的。增加的量導(dǎo)致降低的穩(wěn)定性，而在30mol %下則導(dǎo)致具有約500nm的直徑 的巨大的、融合顆粒。使用鈣黃綠素作為用于水溶性封裝化合物的模型來(lái)確定脂質(zhì)體內(nèi)容物的釋放。在 被封裝在脂質(zhì)體內(nèi)的濃度(IOOmM)下，對(duì)鈣黃綠素的熒光進(jìn)行淬滅。在稀釋以后，鈣黃綠素 發(fā)射熒光。這使得可以區(qū)分封裝的鈣黃綠素(沒(méi)有熒光)與釋放的鈣黃綠素(熒光)。借此 (免疫)脂質(zhì)體被吸收的胞吞途徑涉及通過(guò)核內(nèi)體的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，其中會(huì)發(fā)生PH的下降。 因此，從用增加量的合成的衍生自吡啶鐺的兩親物配制的脂質(zhì)體的鈣黃綠素的釋放被確定 為PH的函數(shù)(參見(jiàn)圖6)。在中性pH下，在用SAINT配制的脂質(zhì)體中鈣黃綠素的保留是穩(wěn) 定的。在PH 6以下，鈣黃綠素釋放會(huì)增加，其中用20mol%配制的脂質(zhì)體在4. 5-6的pH范 圍內(nèi)顯示最多的釋放。用20mol% DOTAP配制的脂質(zhì)體呈現(xiàn)較少有利的釋放模式(圖6)。 在圖7中，比較了在pH 7.4和pH 5(相對(duì)于核內(nèi)體中的pH的相關(guān)pH)下用20mol% SAINT 配制的脂質(zhì)體的釋放模式。在PH 5時(shí)，衍生自脂質(zhì)體的鈣黃綠素釋放會(huì)顯著增加。另外， 在該P(yáng)H下，從SAINT脂質(zhì)體的釋放顯著好于從用DOTAP配制的脂質(zhì)體的釋放。將10%血清(ν/ν)加入到用SAINT配制的脂質(zhì)體中，對(duì)于包含> IOmol % SAINT 的脂質(zhì)體，會(huì)導(dǎo)致增加的鈣黃綠素釋放(圖8)。接著，研究了從脂質(zhì)體的體外鈣黃綠素 釋放。用TNFa激活內(nèi)皮細(xì)胞，HUVEC，然后 用(a)用20mol % SAINT配制的抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體、(b)沒(méi)有SAINT的對(duì)照抗E選擇 蛋白免疫脂質(zhì)體或(c)用20mol% SAINT配制的脂質(zhì)體(沒(méi)有抗E選擇蛋白)進(jìn)行溫育。 圖9顯然表明，用SAINT配制的免疫脂質(zhì)體溫育的細(xì)胞顯示最多的鈣黃綠素?zé)晒?，這表明從 由細(xì)胞吸收的SAINT脂質(zhì)體優(yōu)先細(xì)胞內(nèi)釋放熒光團(tuán)。抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體的攝取并不 受到SAINT加入的影響(通過(guò)FACS使用DiI作為標(biāo)記加以確定，參見(jiàn)圖10)，因此在圖9A和圖9B中吸收的脂質(zhì)體量是類(lèi)似的。用SAINT配制但沒(méi)有細(xì)胞靶向物質(zhì)的脂質(zhì)體在較低程度上被吸收(圖9C)。用脂質(zhì)體進(jìn)行的短期溫育證實(shí)了圖9的結(jié)果，上述脂質(zhì)體用作為脂質(zhì)標(biāo)記的DiI 和作為封裝標(biāo)記的鈣黃綠素進(jìn)行雙標(biāo)記。用TNF α激活4h的HUVEC被沒(méi)有SAINT或配制 有20mol% SAINT的抗E選擇蛋白免疫脂質(zhì)體溫育5、15、30或60分鐘。在用沒(méi)有SAINT的 脂質(zhì)體溫育的細(xì)胞中，在所有時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)到主要是紅色熒光。相反，在用配制有SAINT的脂 質(zhì)體溫育的細(xì)胞中，在早期時(shí)間點(diǎn)，除了紅色熒光外還觀測(cè)到黃色熒光。黃色熒光表明鈣黃 綠素的釋放，其熒光共處于脂質(zhì)體。在30和60分鐘，還有可見(jiàn)的綠色熒光，這表明與脂質(zhì) 體本身相比，脂質(zhì)體內(nèi)容物的不同的細(xì)胞內(nèi)途徑(數(shù)據(jù)未示出)。利用FACS (半)量化了脂質(zhì)體的攝取以及封裝鈣黃綠素從脂質(zhì)體的釋放。TNF α激 活的HUVEC對(duì)E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體的攝取可比于用20mol% SAINT配制的脂質(zhì)體和沒(méi)有 SAINT的脂質(zhì)體，如通過(guò)測(cè)量脂質(zhì)體DiI的平均熒光強(qiáng)度(任意單位)所確定的(圖10A)。 然而，與沒(méi)有SAINT的脂質(zhì)體相比，從配制有20mol% SAINT的E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體的鈣 黃綠素釋放是8-10倍更高(圖10B)。用20mol % SAINT配制的并且包含特異性siRNA的E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體在下調(diào) 靶基因方面是非常有效的(圖11和圖12)。在TNFa激活的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中，用20mol% SAINT配制的并且包含相對(duì)于白細(xì)胞介素_8 (IL-8)的siRNA的E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體可抑 制IL-8表達(dá)幾乎60%，同時(shí)未配制有SAINT的脂質(zhì)體或包含對(duì)照(不規(guī)則的)siRNA的脂 質(zhì)體則沒(méi)有影響(圖11)。這也適用于VE-鈣粘著蛋白的表達(dá)，在來(lái)自小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞系 中，使用用20mol% SAINT配制的E選擇蛋白靶向脂質(zhì)體，其可以被有效地抑制大于60%。參考文獻(xiàn)(I)Bevilacqua MP, Pober JS, Mendrick DL, Cotran RS, GimbroneMA. 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權(quán)利要求
一種包括至少一個(gè)封閉內(nèi)部含水室的脂雙層的脂質(zhì)體，其中，所述脂雙層包括基于所述脂質(zhì)體的總脂質(zhì)含量以高達(dá)25mol％的量的至少一種合成的衍生自吡啶鎓的兩親物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其中，所述衍生自吡啶鐺的兩親物的總量為2至 25mol %，優(yōu)選 5 至 20mol %。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體，其中，所述衍生自吡啶鐺的兩親物的總量為 10-20mol%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體，具有約30至約300納米(nm)，最優(yōu)選50至 150nm的外徑。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中，所述至少一種合成的衍生自吡啶 鐺的兩親物是Saint分子，優(yōu)選地為選自在歐洲專(zhuān)利EP0755924中所要求的那些Saint分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體，包括Saint-18(氯化1-甲基-4-(順-9- 二油基) 甲基_吡啶鐺)和/或Saint-12 (氯化1-甲基-4- ( 二十五烷_(kāi)13_基)-吡啶鐺)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體被空間上穩(wěn)定化，優(yōu)選通過(guò) 在所述脂雙層內(nèi)插入單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)和/或聚(乙二醇)(PEG)衍生的脂質(zhì)被 空間上穩(wěn)定化。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，包括在它的表面上的至少一種靶向物 質(zhì)，所述靶向物質(zhì)能夠識(shí)別并結(jié)合于特定靶細(xì)胞的表面分子或靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)室。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的脂質(zhì)體，其中，所述靶向物質(zhì)對(duì)于靶細(xì)胞的表面具有特異性， 所述靶細(xì)胞并不專(zhuān)門(mén)用于清除和處理顆粒，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中，所述靶向物質(zhì)是RGD肽基序、抗 E選擇蛋白抗體或抗VCAM-I抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中，所述至少一種靶向物質(zhì)經(jīng)由接 頭分子而結(jié)合于插入到所述脂雙層中的Saint分子。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，包括在它的內(nèi)室中的和/或與它的脂 雙層相關(guān)的至少一種生物活性化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的脂質(zhì)體，其中，所述生物活性化合物選自由抗生素藥物、抗 菌藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗炎藥物、抗增生藥物以及抗腫瘤藥物；激素；核酸，包 括基因、重組核酸、寡核苷酸、SiRNA、病毒基因或來(lái)自微生物的基因；以及抗原組成的組。
14.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體的方法，包括將常規(guī)脂 質(zhì)與適量的至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物混合，并按照常規(guī)程序來(lái)制備脂質(zhì)體。
15.一種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的脂質(zhì)體和藥用載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體作為遞送載體以將感興趣的物質(zhì)體外 或體內(nèi)引入到靶細(xì)胞中的應(yīng)用，其中所述靶細(xì)胞并不專(zhuān)門(mén)用于清除和/或處理基于脂質(zhì)的 顆粒，尤其是其中所述靶細(xì)胞選自由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚 細(xì)胞、毛細(xì)胞、祖細(xì)胞的亞類(lèi)、以及周細(xì)胞組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體作為藥物遞送載體的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的脂質(zhì)體在治療癌癥、慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、組織再 生/修復(fù)、糖尿病或代謝性疾病相關(guān)的細(xì)胞功能異常中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)的領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體以及它們作為用于治療性化合物的遞送載體的應(yīng)用。提供了一種包括至少一個(gè)脂雙層的脂質(zhì)體，該脂雙層封閉內(nèi)室，其中所述脂雙層包括至少一種合成的衍生自吡啶鎓的兩親物，例如Saint分子。
文檔編號(hào)A61K9/127GK101848703SQ200880114802
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日
發(fā)明者喬安娜·埃娃·阿德里安, 格里耶杰·莫爾瑪, 約翰內(nèi)斯·阿德里安烏斯·安東尼厄斯·瑪麗亞·坎普斯, 馬塞爾·赫爾曼·約瑟夫·勒伊特斯 申請(qǐng)人:辛沃魯克斯Ip有限公司