專利名稱：脂肪酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供含有來自于茶的原花色素(Proanthocyanidin)類化合物的脂肪酶抑制劑。
背景技術(shù)：
近年來，伴隨日本人生活模式的歐美化，高脂肪飲食的攝取在不斷增加。根據(jù)1999年(平成11年)日本國國民營養(yǎng)調(diào)查，有報(bào)告指出盡管能量攝取量在逐年減少，但脂質(zhì)能量比超過正常比例25％，中性脂肪值、膽固醇值高的人的比例在60歲以上的人中占5～6成(日本國厚生勞動(dòng)省平成11年國民營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果概要臨床營養(yǎng)2001；98(5)577-588)(日語原名；厚生労働省平成11年國民栄養(yǎng)調(diào)查結(jié)果の概要臨床栄養(yǎng)2001；98(5)577-588)。
肥胖是現(xiàn)代社會(huì)中最重大的疾病之一，其主要原因是過剩攝取脂肪。并且已知過剩攝取脂肪不僅引起肥胖，而且還誘發(fā)起因于肥胖的糖尿病、高血脂癥、高血壓、動(dòng)脈硬化等。作為治療這種肥胖的藥物，在日本國內(nèi)唯一批準(zhǔn)了食欲抑制劑馬吲哚(Mazindol)(日本國注冊(cè)商標(biāo)「マジンド一ル」)，但報(bào)告其有口渴、便秘、胃部不適感、惡心、嘔吐等副作用(臨床評(píng)價(jià)1985；13(2)419-459、臨床評(píng)價(jià)1985；13(2)461-515)。此外，在日本國外，塞尼克(Xenical)(日本國注冊(cè)商標(biāo)「ゼニカル」)作為肥胖改善藥已在市場(chǎng)銷售，該藥具有通過脂肪酶抑制活性抑制從腸管吸收脂肪的作用，但仍報(bào)告其有脂肪便、排便次數(shù)增加、軟便、下痢、腹痛等副作用，很難說一定安全(Lancet 1998；35267-172)。
為了預(yù)防肥胖，通過限制飲食從而減少攝取的熱量是有效的手段，但必須接受嚴(yán)格的營養(yǎng)指導(dǎo)，在日常生活中很多情況下難于實(shí)行。因此，安全且健康地抑制餐后脂肪在體內(nèi)吸收，從治療肥胖及其相關(guān)疾病或增進(jìn)健康的目的來看，認(rèn)為其是實(shí)際有用的對(duì)策。
在這種背景下，安全且證明對(duì)人體有效的特定保健用食品的開發(fā)正在受到關(guān)注，到目前為止，作為抑制餐后血清中性脂肪值升高的食品材料，通過抑制胰脂肪酶從而抑制脂肪吸收的珠蛋白分解物(J.Nutr.1988；12856-60、日本臨床·食糧學(xué)會(huì)志1999；52(2)71-77、健康·營養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144)(J.Nutr.1988；12856-60、日語原名；日本臨床·食糧學(xué)會(huì)誌1999；52(2)71-77、日語原名；健康·栄養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144)、具有與三?；视筒煌仗匦缘亩；视?J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-796、Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117)、從魚油中精制的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等已成為日本國特定保健用食品在銷售。
另一方面，最近來自植物的脂肪酶抑制活性物質(zhì)也正在受到關(guān)注，特別是關(guān)于具有脂肪酶抑制活性的多酚類，報(bào)道了來自植物樹皮的單寧(日本國特公昭60-11912)，在豆科植物水皂角中含有的單寧類、類黃酮類化合物及其糖苷(日本國特開平8-259557)，配合有綠茶中的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯及表兒茶素沒食子酸酯的抑制脂質(zhì)吸收的食品(日本國特開平3-228664)，含有青椒、叢生口蘑、南瓜、灰樹花(Grifola frondosa)、羊棲菜、綠茶、烏龍茶等水提取物的脂肪酶抑制劑(日本國特開平3-219872)，黃酮及黃酮醇類化合物(日本國特開平7-61927)，羥基安息香酸類化合物(沒食子酸)(日本國特開平1-102022)，三萜類化合物及其衍生物(日本國特開平9-40689)，以羅望子的原花青素(Procyanidin)為有效成分的抗肥胖劑(日本國特開平9-291039)等。并且知道葡萄種子提取物的脂肪酶抑制作用(Nutrition 2003；19(10)876-879)，來自五層龍屬(salacia)植物的多酚的脂肪酶抑制作用和對(duì)大白鼠的抗肥胖作用(J.Nutr.2002；1321819-1824)，烏龍茶提取物對(duì)小白鼠的抗肥胖作用(Int.J.Obes.1999；2398-105)等。
但是，上述所報(bào)道的來自植物的脂肪酶抑制劑，其效果并不充分。如即使某植物的提取物有效果，但只要其中含有的活性成分的量不確定，且因?yàn)閬碜杂谔烊晃镔|(zhì)，所以難于維持穩(wěn)定的脂肪酶抑制活性。此外，如果是來自不受歡迎的植物的抑制劑，作為飲食品利用時(shí)會(huì)產(chǎn)生影響香味的問題。例如在說明烏龍茶的脂質(zhì)改善效果的報(bào)告中，有下述報(bào)告，即、每日飲用1330ml市售烏龍茶，服用6周后發(fā)現(xiàn)血中中性脂肪值顯著降低(日本營養(yǎng)·食糧學(xué)會(huì)志1991；44(4)251-259)；以102名單純性肥胖癥男女為對(duì)象，使其連續(xù)6周經(jīng)口攝取烏龍茶(2g×4/日)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67％被驗(yàn)者體重減少1kg以上，并且發(fā)現(xiàn)血中中性脂肪值為高值的被驗(yàn)者攝取烏龍茶后有顯著的改善效果(日本臨床營養(yǎng)學(xué)會(huì)雜志1998；20(1)83-90)。雖然證明如此大量飲用烏龍茶會(huì)有效果，但在日常生活中難于持續(xù)，并且即使提供單純濃縮的烏龍茶，因?yàn)橛袕?qiáng)的苦味、澀味，且咖啡因的量也會(huì)增加，所以作為實(shí)際的對(duì)策不合適。
日本國特公昭60-11912[專利文獻(xiàn)2]日本國特開平8-259557[專利文獻(xiàn)3]日本國特開平3-228664[專利文獻(xiàn)4]日本國特開平3-219872[專利文獻(xiàn)5]日本國特開平7-61927[專利文獻(xiàn)6]日本國特開平1-102022[專利文獻(xiàn)7]日本國特開平9-40689[專利文獻(xiàn)8]日本國特開平9-291039[非專利文獻(xiàn)1]日本國厚生勞動(dòng)省“平成11年國民營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果”概要[日語原名；厚生労働省平成11年國民栄養(yǎng)調(diào)查結(jié)果の概要][非專利文獻(xiàn)2]臨床營養(yǎng)2001；98(5)577-588[非專利文獻(xiàn)3]臨床評(píng)價(jià)1985；13(2)419-459、臨床評(píng)價(jià)1985；13(2)461-515 Lancet 1998；35267-172[非專利文獻(xiàn)5]J.Nutr.1988；12856-60，1988[非專利文獻(xiàn)6]日本臨床·食糧學(xué)會(huì)志1999；52(2)71-77[非專利文獻(xiàn)7]健康·營養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144[非專利文獻(xiàn)8]J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-796[非專利文獻(xiàn)9]Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117[非專利文獻(xiàn)10]Nutrition 2003；19(10)876-879[非專利文獻(xiàn)11]J.Nutr.2002；1321819-1824[非專利文獻(xiàn)12]Int.J.Obes.1999；2398-105[非專利文獻(xiàn)13]日本營養(yǎng)·食糧學(xué)會(huì)志1991；44(4)251-259[非專利文獻(xiàn)14]日本臨床營養(yǎng)學(xué)會(huì)雜志1998；20(1)83-90[非專利文獻(xiàn)15]Chem.Pharm.Bull 1983；31(11)3906-3914[非專利文獻(xiàn)16]Chem.Pharm.Bull 1989；37(1)77-85發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明關(guān)注受歡迎的茶中含有的成分，提供含有來自茶的原花色素類化合物中的至少一種的脂肪酶抑制劑。
本發(fā)明還提供添加有上述脂肪酶抑制劑、受歡迎且以降低血中中性脂肪、促進(jìn)健康為目的飲食品。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述脂肪酶抑制劑、抑制餐后脂肪吸收、抑制血中中性脂肪升高的醫(yī)藥組合物。
作為解決上述課題的手段，從茶中發(fā)現(xiàn)抑制脂肪吸收時(shí)所必需的胰脂肪酶的成分，對(duì)其中存在的各種多酚的脂肪酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，證明原花色素類化合物、特別是具有沒食子酸酯基的原花色素類化合物具有強(qiáng)的脂肪酶抑制活性。
更加具體地說，本發(fā)明的脂肪酶抑制劑的特征在于，含有下述化學(xué)式1表示的原花色素類化合物中的至少一種。 或 上式中，R1和R2分別獨(dú)立表示H或OH，R3和R4分別獨(dú)立表示H或沒食子?；?。此外，沒食子?；鵊的結(jié)構(gòu)式是化學(xué)式2。
本發(fā)明的原花色素類化合物可以根據(jù)如Chem.Pharm.Bull.1983；31(11)3906-3914，1983或Chem.Pharm.Bull.1989；37(1)77-85所述的方法，從市售綠茶、紅茶、烏龍茶等天然材料中提取精制。
脂肪酶抑制劑本發(fā)明的原花色素類化合物可以不含其他成分而單獨(dú)作為脂肪酶抑制劑使用，或者也可以與溶劑、固體擔(dān)體同時(shí)作為脂肪酶抑制劑使用。對(duì)于溶劑或擔(dān)體，考慮到要作為下述飲食品及/或醫(yī)藥品使用，所以優(yōu)選食品或醫(yī)藥品能夠安全使用的物質(zhì)。本發(fā)明的脂肪酶抑制劑有多種用途，例如可以為試驗(yàn)研究用、作為預(yù)防中性脂肪蓄積的食品、醫(yī)藥品的有效成分使用。
脂肪酶抑制活性的測(cè)定方法本發(fā)明的脂肪酶抑制劑，對(duì)脂肪酶特別是胰脂肪酶具有強(qiáng)的抑制作用，其抑制活性可根據(jù)實(shí)施例1具體描述的方法進(jìn)行測(cè)定。
含有脂肪酶抑制劑的飲食品將本發(fā)明的含有原花色素類化合物的脂肪酶抑制劑作為脂肪酶抑制活性成分添加到飲食品中，能夠防止伴隨餐后脂肪成分的攝取所產(chǎn)生的不期望的血中中性脂肪的升高及/或使已升高的血中中性脂肪降低。優(yōu)選的飲食品為日常攝取的飲食品，如綠茶、麥茶、烏龍茶、紅茶、咖啡、運(yùn)動(dòng)飲料、飲料水、調(diào)味料、調(diào)味汁(dressing)。并且飲食品可以為通常食用的飲食品，也可以為清涼飲料、雞尾酒、啤酒、威士忌、蒸餾酒、葡萄酒、清酒、調(diào)味料、調(diào)味汁(dressing)、調(diào)味米、加工食品、方便食品、蒸煮袋食品、巧克力、鮮奶油、洋式點(diǎn)心、乳制品、健康食品、營養(yǎng)補(bǔ)充品等。
飲食品中本發(fā)明的脂肪酶抑制劑的添加量，以每餐原花色素類化合物的攝取量為0.1mg～10g進(jìn)行添加。但因本發(fā)明的原花色素類化合物來自食品，其安全性非常高，在飲食品中的添加量實(shí)際上沒有上限。
含有脂肪酶抑制劑的醫(yī)藥品本發(fā)明的含有原花色素類化合物的脂肪酶抑制劑，還能夠作為抑制餐后脂肪吸收、防止不期望的血中中性脂肪升高及/或使升高的不期望的血中中性脂肪降低的藥劑的有效成分使用。優(yōu)選藥劑為口服藥劑，如可以為保健飲料、片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖果型制劑、滴丸劑等。藥劑中含有的本發(fā)明化合物的量，每次服用量為0.1mg～10g。
本發(fā)明的醫(yī)藥品，因?yàn)槠渲久敢种瞥煞值陌踩愿?，即使長期服用也很安全，因此，為了防止或消除成為生活習(xí)慣病的肥胖，能夠日常服用。
本發(fā)明能夠提供添加有脂肪酶抑制劑、不損壞香味、受歡迎且以降低中性脂肪促進(jìn)健康為目的的飲食品，所述脂肪酶抑制劑含有來自茶葉的原花色素類化合物中的至少一種。為了抑制餐后脂肪的吸收，期望進(jìn)餐的同時(shí)進(jìn)行攝取，從茶中得到的有效成分得到強(qiáng)化的飲料意義重大。特別是通過增強(qiáng)這些成分，使能夠降低中性脂肪的茶的開發(fā)成為可能。


圖1表示實(shí)施例2中用于評(píng)價(jià)脂肪酶活性的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
實(shí)施例實(shí)施例1脂肪酶抑制活性的測(cè)定脂肪酶活性的測(cè)定通過下述步驟實(shí)施，即、使用熒光性4-甲基傘形酮油酸酯(4-UMO)作為基質(zhì)，測(cè)定反應(yīng)生成的4-甲基傘形酮的熒光。
測(cè)定時(shí)，緩沖液使用含有150mM NaCl、1.36mM CaCl2的13mM Tris-HCl(pH8.0)，基質(zhì)4-UMO(Sigma公司制)為將制備成的0.1M DMSO溶液用上述緩沖液稀釋1000倍后的溶液，脂肪酶為將豬胰脂肪酶(Sigma公司制)同樣用上述緩沖液制備成400U/ml溶液，以供酶測(cè)定使用。
酶反應(yīng)是在25℃條件下，在96孔微型板上添加并混合50μl的4-UMO緩沖溶液、25μl蒸餾水(或試料水溶液)，然后添加25μl脂肪酶緩沖液溶液使反應(yīng)開始，反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后，添加100μl的0.1M檸檬酸緩沖液(pH4.2)終止反應(yīng)。反應(yīng)生成的4-甲基傘形酮的熒光(激發(fā)波長355nm、熒光發(fā)射波長460nm)用熒光分析儀(Labsystems公司制Fluoroskan Asent CF)測(cè)定。
被檢試料的抑制活性，以相對(duì)于對(duì)照(蒸餾水)的活性產(chǎn)生50％抑制的試料量IC50(μM)求出。
測(cè)定樣品對(duì)照化合物兒茶素(5)、表兒茶素(1)、沒食子兒茶素(7)、表沒食子兒茶素(3)、兒茶素沒食子酸酯(6)、表兒茶素沒食子酸酯(2)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(8)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(4)從和光純藥(株式會(huì)社)購入。
本發(fā)明的原花色素類化合物采用下述論文所述的方法得到，Chem.Pharm.Bull.1983；31(11)3906-3914，Chem.Pharm.Bull.1989；37(1)77-85。概述為用80％丙酮提取烏龍茶葉，然后去除丙酮，用乙酸乙酯進(jìn)行溶劑分離。通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia公司制造)，使用水、甲醇、50％丙酮對(duì)乙酸乙酯層進(jìn)行分離，接著，使各分離物吸附在Diaion HP-20(三菱化學(xué)公司制造)上，用水-甲醇體系進(jìn)行洗脫，再次利用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia公司制造)進(jìn)行精制。
實(shí)施例2兒茶素類化合物及其2聚體(原花色素類化合物)的脂肪酶抑制活性對(duì)于茶的主要多酚的兒茶素類化合物(單體)以及由兒茶素類化合物聚合形成的原花色素類化合物，根據(jù)實(shí)施例1的方法測(cè)定其脂肪酶活性，其結(jié)果如表1所示。此外，圖1表示用于評(píng)價(jià)的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。茶中存在的主要兒茶素類化合物(8種)中具有脂肪酶抑制活性的物質(zhì)是沒食子酸形成酯鍵的黃烷-3-醇。特別是茶中大量含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在主要兒茶素類化合物中顯示的活性最強(qiáng)。
對(duì)于原花色素類化合物，證明結(jié)構(gòu)內(nèi)具有沒食子酸酯基的化合物、特別是含有EGCG單體的2聚體，具有比EGCG更強(qiáng)的脂肪酶抑制活性。
表1來自茶的多酚的脂肪酶抑制作用

由上述結(jié)果可知，茶中除含有主要兒茶素類化合物(8種)外，還存在活性非常強(qiáng)的2聚體。
權(quán)利要求
1.脂肪酶抑制劑，其含有下述化學(xué)式1表示的原花色素類化合物中的至少一種，[化學(xué)式1] 上式中，R1和R2分別獨(dú)立表示H或OH，R3和R4分別獨(dú)立表示H或沒食子?；?。
2.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶抑制劑，其中，原花色素類化合物從含有下述化合物的組中選擇，原花青素B-2、原花青素B-3、原飛燕草素A-2 3’-O-沒食子酸酯、原飛燕草素B-2、原飛燕草素B-2 3’-O-沒食子酸酯、原飛燕草素B-2 3，3-二-O-沒食子酸酯、原飛燕草素B-4、原飛燕草素B-4 3’-O-沒食子酸酯、原飛燕草素B-5 3，3’-二-O-沒食子酸酯、(-)-表兒茶素(4β-8)(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯、(-)-表兒茶素3-O-沒食子酸酯(4β-8)(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯、(-)-表沒食子兒茶素(4β-8)(-)-表兒茶素3-O-沒食子酸酯、(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯(4β-8)(-)-表兒茶素3-O-沒食子酸酯、(+)-兒茶素(4α-8)(-)-表沒食子兒茶素、(+)-兒茶素(4α-8)(-)-表沒食子兒茶素3-O-沒食子酸酯、以及(+)-沒食子兒茶素(4α-8)(-)-表兒茶素。
3.飲食品，其添加有權(quán)利要求1或2所述的脂肪酶抑制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的飲食品，其中，飲食品從含有茶飲料、清涼飲料及健康食品的組中選擇。
5.醫(yī)藥組合物，其含有權(quán)利要求1或2所述的脂肪酶抑制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的醫(yī)藥組合物，其抑制餐后脂肪的吸收。
全文摘要
本發(fā)明提供脂肪酶抑制劑及添加有該抑制劑的飲食品、醫(yī)藥品，所述脂肪酶抑制劑含有具有來自茶的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)單體的2聚體。更加具體地說，本發(fā)明是含有上述化學(xué)式1表示的原花色素(Proanthocyanidin)類化合物中的至少一種的脂肪酶抑制劑、以及添加該脂肪酶抑制劑的飲食品及醫(yī)藥品組合物。上式中，R
文檔編號(hào)A61K36/82GK1980656SQ20058002226
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月5日
發(fā)明者中井正晃, 福井祐子, 淺見純生, 橋本文雄 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社