專利名稱：格爾德霉素及其衍生物抑制癌侵入及識(shí)別新靶點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于癌癥藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及格爾德霉素(1)的化學(xué)衍生物，其中部分衍生物是新化合物，其以飛摩爾(femtomolar)的濃度抑制癌細(xì)胞活動(dòng)，以及這些化合物用于抑制HGF-依賴、Met介導(dǎo)的(Met-mediated)腫瘤細(xì)胞的激活、生長(zhǎng)、侵入和轉(zhuǎn)移的用途。作用在新的但未識(shí)別的靶點(diǎn)上的這些化合物是非常有效的抗癌劑。
背景技術(shù)：
格爾德霉素(GA)是一種袢霉素天然產(chǎn)品藥物(Sasaki K等人，1970；DeBoer C等人，1970)。格爾德霉素類(GAs)在這里是指一類GA衍生物，其中部分衍生物表現(xiàn)出在人類乳腺癌、黑素瘤和卵巢癌的鼠異種移植模型中的抗癌活性(Schulte TW等人，1998；Webb CP等人，2000)。而且，GA類的藥物減少幾種酪氨酸激酶和絲氨酸激酶致癌基因產(chǎn)物的表達(dá)，包括Her2、Met、Raf、cdk4和Akt(Blagosklonny，2002；Ochel等人，2001；前述的Schulte等人)；Solit等人，2002；前述的Webb等人。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些藥品在納摩爾(nanomolar)范圍內(nèi)的濃度發(fā)揮作用(因此這里用nM GA抑制劑或″nM-GAi″表示)，其通過(guò)抑制分子伴侶HSP90，由此阻止客體腫瘤蛋白(client oncoprotein)的正確折疊，使其不穩(wěn)定(Bonvini等人，2001；Ochel等人，2001)。前述Webb等人的工作中所列的由National CancerInstitute Anticancer Drug Screen NCI-Ads提供的一些化合物藥物被發(fā)現(xiàn)是不純的(通過(guò)薄層色譜測(cè)試)，所以以前的結(jié)果或解釋或許是不正確的。
最近的工作已經(jīng)表明，Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑是癌癥治療的一種潛在治療靶點(diǎn)。作用于Met(Met-directed)的RNA酶和反義(anti-sense)策略減少了Met和HGF/SF表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移腫瘤的潛在性(Abounader，R等人，1999；Jiang，WG等人，2001；Abounader，R等人，2002；Stabile，LP等人，2004)。NK4是HGF/SF的片段，其N末端具有4個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域，它是結(jié)合Met受體的HGF/SF的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(Date，K等人，1997)，并且已經(jīng)證明了能夠抑制腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成(Matsumoto，K等人，2003)。HGF/SF的單克隆抗體通過(guò)中和其活性，能夠抑制無(wú)胸腺鼠的人類異種移植瘤的生長(zhǎng)(Cao，B等人，2001)。含吲哚的受體酪氨酸激酶抑制劑K252a和PHA-665752能夠抑制Met激酶活性和Met驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)及其轉(zhuǎn)移潛力(Morotti，A等人，2002；Christensen，JG等人，2003)。
Webb等人(2000)篩選了可能抑制腫瘤細(xì)胞侵入的Met受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑。HGF/SF誘導(dǎo)作為細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移介質(zhì)的尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)及其受體(uPAR)的表達(dá)。Webb等人(2000)描述了一種基于細(xì)胞的分析，其采用誘導(dǎo)uPA和uPAR以及由血纖維蛋白溶酶原向纖維蛋白溶酶的隨后轉(zhuǎn)化，可以篩選在MDCK-2細(xì)胞中有抑制活性的化合物。發(fā)現(xiàn)格爾德霉素(1)及其一些衍生物在飛摩爾(fM)濃度表現(xiàn)出高抑制活性。本發(fā)明人(如下所揭示的)已經(jīng)將此有效的抑制活性包括侵入復(fù)合體的其它活性，尤其通過(guò)人類腫瘤細(xì)胞的體外三維Matrigel膠培養(yǎng)侵入試驗(yàn)所(論證)。在低于納摩爾(nM)濃度下觀察到無(wú)損失的Met表達(dá)，這說(shuō)明了觀察到的抑制活性并不依賴于Met受體的下調(diào)。
眾所周知，格爾德霉素及17-烷氨基-17-去甲氧基格爾德霉素衍生物具有與熱休克蛋白90(hsp90)的N末端結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的能力(Stebbins，CE等人，1997；Grenert，JP等人，1997；Schulte，TW等人，1998；Roe，SM等人，1999；Jez，JM等人，2003)。Hsp90屬于GHKL ATPase的結(jié)構(gòu)蛋白族(Dutta，R等人，2000)。這種豐富的蛋白質(zhì)協(xié)助調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)的活性、更新、運(yùn)輸(protein trafficking)。它促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中蛋白質(zhì)的折疊和調(diào)控，例如轉(zhuǎn)錄因子、甾類受體和蛋白質(zhì)激酶(Fink，AL，1999；Richter，I等人，2001；Picard，D，2002；Pratt，WB等人，2003)。袢霉素天然產(chǎn)物例如GA和macbecin I(2)阻斷了hsp90的功能(BlagosklonnyMV等人，1996；Bohen SP等人，1998)，以及根赤殼菌素((Whitesell，L等人，1994；Sharma，SV等人，1998；Schulte，TW等人，1998)(參見(jiàn)對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)的發(fā)明說(shuō)明)。一種在現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中的藥物，17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(4)的抗腫瘤作用歸功于對(duì)hsp90的阻斷功能(Maloney A等人，2002；Neckers，L等人，2003)。
GA的臨床應(yīng)用的缺點(diǎn)是其溶解性和毒性的限制，但衍生物17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(縮寫(xiě)為17-AAG)(4)(也稱為NSC.330507)具有低毒性的腫瘤抑制活性(Kamal A等人，2003 Nature 425407-410)，并且正處于臨床試驗(yàn)的I-II期評(píng)估中(Goetz MP等人，(2003)A7inals 07icoL 141169-1176；Maloney T等人，(2001)Expert Opin.Biol.TXler.23-24)。另一種GA衍生物正處于臨床前的評(píng)估中，它具有更好的水溶性并且可以口服，這種衍生物就是17-(二甲基氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(2(縮寫(xiě)為17-DMAG)，其在i.p.給藥時(shí)基本達(dá)到100％，大約為口服給藥17-AAG(4)的兩倍(Egorin MJ等人，2002)。17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(6)，即17-AAG(4)代謝物，在降低p185erbB2的能力方面，具有同等的生物活性，并且作為在發(fā)展中的潛在治療方法(Egorin MJ等人(1998))。GA和17-AAG可以使乳腺癌細(xì)胞對(duì)于紫杉醇和阿霉素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡變得敏感(Munster PN等人，(2001)Clin.CancerRes.12228-2236)。
美國(guó)專利4,262,989(Sasaki等人)公開(kāi)了各種在C17和C19位置被取代的格爾德霉素衍生物。列出的在此兩個(gè)位置的取代物包括胺，其可以用包括烷基(C2-12)的不同基團(tuán)進(jìn)行雙取代，所述基團(tuán)可進(jìn)一步被羥基、氨基、甲氨基、吡咯烷基、吡啶基、甲氧基、哌啶基、嗎啉基、鹵素、環(huán)烷基和其它基團(tuán)所取代?？梢哉f(shuō)這些化合物抑制了特定體外癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，該癌細(xì)胞實(shí)際上是由致癌病毒轉(zhuǎn)化的鼠成纖維細(xì)胞克隆”。
Rosen等人，WO98/51702(1998，Nov19)公開(kāi)了能與Hsp90-靶部分結(jié)合的GA衍生物，其結(jié)構(gòu)包含了與蛋白質(zhì)、受體或標(biāo)記物特異性結(jié)合的靶部分，以及結(jié)合hsop90的部分，該部分能結(jié)合hsop90袋，該hsop90袋能結(jié)合袢霉素抗生素。此文獻(xiàn)公開(kāi)了用氮丙啶與GA發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生在此公開(kāi)的化合物15，其是合成過(guò)程中的中間體。用此化合物與碘化氰(ICN)反應(yīng)生成17-(N-碘乙基-N-氰基-17-去甲氧基格爾德霉素。后者的類似物與HSP90結(jié)合，很容易在合成中通過(guò)使用放射性ICN示蹤。公開(kāi)了“相應(yīng)的17-N-碘烷基-N-氰基)化合物可以使用氮雜環(huán)丁烷(3個(gè)碳原子)、吡咯烷(4個(gè)碳原子)等取代氮丙啶來(lái)制備?！盙allaschun等人，WO95/01342(11995，Jan12)公開(kāi)多種袢霉素衍生物作為致癌基因產(chǎn)物的抑制劑和作為抗腫瘤/抗癌劑，見(jiàn)15頁(yè)19行到17頁(yè)12行以及實(shí)施例2-99。
美國(guó)專利5,932,566(Schnur等人)公開(kāi)了許多在包括C4、5、11、17、19，和22的環(huán)位置上取代生成的GA衍生物。據(jù)說(shuō)此化合物可以抑制體內(nèi)SKBr3乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，盡管沒(méi)有提供在何種濃度水平下的抗腫瘤作用的結(jié)果。
PCT公開(kāi)WO2004/087045(2004，Oct.14)揭示了GA類似物單獨(dú)或與其它藥物組合用來(lái)防止或減少再狹窄。在第4頁(yè)，提到了下列化合物17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(所示的化合物4)；17-[2-二甲氨基)乙氨基]-去甲氧基-11-O-甲基格爾德霉素和17-N-氮雜環(huán)丁基-17-去甲氧基格爾德霉素(所示的化合物14)。
Met受體酪氨酸激酶及其配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子(HGF/SF)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Met的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，減少了癌癥病人的總體存活率(Birchmeier等人，2003；Maulik等人，2002b)，并且Met和HGF/SF都已被證明與多種人類和動(dòng)物的癌癥和肉瘤相關(guān)。見(jiàn)URL<vai.org/metandcancer/>的包含列表，其以參考文獻(xiàn)方式整體并入本文。Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)了體外實(shí)驗(yàn)中的(細(xì)胞)增生和侵入，以及在動(dòng)物模型中的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。HGF/SF是促血管生成和存活的重要分子(前述的Birchmeier等人)。由HGF/SF導(dǎo)致的Met激活的一個(gè)結(jié)果是，誘導(dǎo)了尿激酶-型纖溶酶原激活劑(uPA)蛋白水解系統(tǒng)，其是腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移的重要因素。細(xì)胞Met的表達(dá)與HGF/SF接觸，誘導(dǎo)了uPA和/或uPA受體(uPAR)的表達(dá)，導(dǎo)致了由纖溶酶原分裂得到的纖溶酶產(chǎn)物(Hattori等人，2004；Jeffers等人，1996；Tacchini等人，2003)。為尋找可能抑制腫瘤細(xì)胞侵入的藥物，Webb等人(2000)開(kāi)發(fā)了在犬腎MDCK上皮細(xì)胞中的細(xì)胞篩選，并且尋找抑制uPA活性的化合物。許多GA衍生物在飛摩爾(fM)濃度抑制uPA活性(fM-GAi)，即大約在減少M(fèi)et表達(dá)所要求的nM濃度以下6個(gè)數(shù)量級(jí)(Webb等人，2000)。這些研究表明，MDCK細(xì)胞擁有對(duì)于fM-GAi藥物的新靶點(diǎn)，其親合力高，而數(shù)量可能低。
在fM水平上的GA及其衍生物阻礙腫瘤細(xì)胞中Met轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的靶點(diǎn)，仍不清楚。上述破壞hsp90功能的這種袢霉素類藥物，其已知作用濃度較高，在微摩爾級(jí)(uM)及以上水平。本發(fā)明人已經(jīng)評(píng)估GA及其衍生物對(duì)于未知靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系，并且已經(jīng)能夠從hsp90中區(qū)別fM靶點(diǎn)。
在本領(lǐng)域中需要GA類的強(qiáng)有效化合物作為在極低濃度下有效的新抗癌療法。本發(fā)明應(yīng)合了這種需要。
本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室的前述工作表明，由NCI抗瘤藥物篩選程序(NCIADS)提供的超過(guò)30個(gè)GA衍生的藥物中只有4個(gè)能夠在飛摩爾濃度下抑制MDCK細(xì)胞中由肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子(HGF/SF)誘導(dǎo)的尿激酶性纖溶酶原激活劑(uPA)-纖溶酶的活性(參考1Webb CP等人，Cancer Res.60342-3491)。這些藥物在此稱為″fM-GAi″藥物，而在納摩爾級(jí)表現(xiàn)出活性的GA族藥物稱為″nM-GAi″藥物。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在飛摩爾(甚至更低)濃度下的特定GA衍生物(″fM-Gai″化合物)在MDCK細(xì)胞中抑制uPA蛋白水解系統(tǒng)的活性是HGF/SF依賴性的。這種敏感性也體現(xiàn)在人類腫瘤細(xì)胞中，其中uPA活性可以顯著地由HGF/SF上調(diào)。
還發(fā)現(xiàn)，fM-GAi化合物，包括各種17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素衍生物，除了能夠抑制HGF/SF介導(dǎo)的uPA誘導(dǎo)，還能抑制HGF/SF誘導(dǎo)下MDCK細(xì)胞的擴(kuò)散和一些人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系——DBTRG、SNB19和U373在體外實(shí)驗(yàn)中的侵入。但是，在此公開(kāi)了HSP90不是fM-GAi的靶點(diǎn)。首先，不是所有的與HSP90結(jié)合的化合物表現(xiàn)出fM-Gai活性。與HSP90具有高親合力的根赤殼菌素(RA)(Roe等人，1999；Schulte等人，1999)無(wú)法在nM以下濃度抑制HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性。GA、一種fM-Gai藥物、包括macbecin I和II(MA)的其它袢霉素、某些GA衍生物和根赤殼菌素都能夠在nM濃度下抑制uPA活性和Met表達(dá)。通過(guò)使用不同的細(xì)胞系和nM濃度的這些藥物，本發(fā)明人表明了所有可用的HSP90結(jié)合位點(diǎn)都被占據(jù)。但是，在GA濃度為皮摩爾(pM)或更低、HSP90未被GA占據(jù)并且Met蛋白水平未受影響的情況下，uPA活性、細(xì)胞擴(kuò)散和腫瘤細(xì)胞侵入仍然受到抑制。因此，fM-GAi藥物是對(duì)HGF/SF的某些重要生物活性例如腫瘤的侵入性的有效抑制劑，但其作用并非通過(guò)HSP90介導(dǎo)。這表明，在HGF/SF-介導(dǎo)的uPA激活的過(guò)程中，有一個(gè)新的靶點(diǎn)。
因此，這些fM-GAi化合物是用于腫瘤細(xì)胞侵入的潛在藥物，并且可以與外科、傳統(tǒng)化學(xué)療法或放射療法組合以防止癌細(xì)胞侵入。
當(dāng)與如放射性核素的可檢測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合時(shí)，它們也具有作為診斷/預(yù)測(cè)指示劑的效用。
特別地，本發(fā)明涉及式I或式II的化合物或者其在藥學(xué)上可接受的鹽類，其具有在10-11M以下的濃度在癌細(xì)胞中抑制由HGF/SF導(dǎo)致的Met激活的性質(zhì)，其中R1是低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈或支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺；任選被取代的3-6元環(huán)雜環(huán)基；(并且R1優(yōu)選是3-6元雜環(huán)，其中N是雜環(huán)原子)。
R2是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈和支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺；任選被取代的3-6元環(huán)雜環(huán)基；R3是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈或支鏈的烷基胺、烯基胺、炔基胺；或其中N是任選被取代的雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基或雜芳環(huán)中的一個(gè)環(huán)原子。
R4是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基，且其中在C2＝C3、C4＝C5和C8＝C9位的環(huán)雙鍵任選被氫化成單鍵。
在10-11M以下或10-12M以下或10-13M以下或10-14M以下或10-15M以下或10-16M以下或10-17M以下或10-18M以下或10-19M以下濃度，此化合物優(yōu)選抑制癌細(xì)胞中由HGF/SF導(dǎo)致的Met的激活。
在優(yōu)選實(shí)施例中、R1是所示的取代基并且R2、R3和R4中的每一個(gè)都是H。
該化合物優(yōu)選選自(a)17-(2-氟乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(b)17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(c)17-N-氮丙啶基-17-去甲氧基格爾德霉素；
(d)17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(e)17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17-去甲氧基格爾德霉素；(f)17-(2-二甲氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(g)17-(2-氯乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；以及(h)二氫格爾德霉素。
同時(shí)提供了包含上述化合物的藥物化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明涉及一種能夠抑制由HGF/SF誘導(dǎo)的、Met受體介導(dǎo)的具有Met(Met-bearing)的腫瘤或癌細(xì)胞的生物活性的方法，其包括給所述細(xì)胞提供有效量的上述9的化合物、該化合物具有用于抑制所述生物活性的少于約10-11M或少于約10-12M或少于約10-13M或少于約10-14M或少于約10-15M或少于約10-16M或少于約10-17M或少于約10-18M的IC50。該生物活性可以是細(xì)胞內(nèi)uPA活性的誘導(dǎo)、在生物體外或生物體內(nèi)的生長(zhǎng)、或細(xì)胞的擴(kuò)散、所述細(xì)胞在生物體外或在活體內(nèi)的侵入。
還包括抑制由HGF/SF誘導(dǎo)的Met腫瘤或癌細(xì)胞在受試者體內(nèi)轉(zhuǎn)移的方法，其包括給所述受試者提供在此公開(kāi)的有效量的化合物，該化合物具有少于約10-11M或更少的IC50，如上所示在生物體外檢測(cè)時(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵入。優(yōu)選地，這種抑制作用能夠帶來(lái)可檢測(cè)到的由上述細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤的消退，或是可檢測(cè)到的上述受試者體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的減弱。
一種用于防止在易感對(duì)象、優(yōu)選是人體中Met陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的方法，包括給所述對(duì)象提供上述有效量的化合物，其是(a)處于發(fā)生所述腫瘤的危險(xiǎn)中，或者(b)已經(jīng)治療的對(duì)象，處于所述腫瘤的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)中的情況。
用放射性鹵素標(biāo)記的上述化合物優(yōu)選與R1基鍵合，所述放射性鹵素優(yōu)選地選自18F、76Br、76Br、123I、124I、125I和131I。


圖1和2，典型GA衍生物化合物的活性。將初始MDCK細(xì)胞在沒(méi)有或者有不同濃度實(shí)驗(yàn)化合物的參與下暴露于HGF/SF，并且在24小時(shí)后暴露于對(duì)纖溶酶敏感的發(fā)色團(tuán)，然后在405nm讀取吸光度。所示值表示在每個(gè)實(shí)驗(yàn)化合物的每個(gè)濃度下的三份實(shí)驗(yàn)的平均值±1S.D.。
圖3-6，GA及相關(guān)化合物對(duì)人類腫瘤細(xì)胞系中的uPA抑制作用。在沒(méi)有或者加入不同濃度的所示GA及相關(guān)化合物的條件下，用60單位/ml HGF/SF培養(yǎng)細(xì)胞。如前所述，主要在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行uPA活性分析(Webb等人，2000)。實(shí)施例，按照如下使用細(xì)胞圖3-MDCK；圖4-DBTRG；圖5-U373；圖6-SNB19。實(shí)驗(yàn)化合物包括RA和MA，并且在所示濃度使用。GA衍生物縮寫(xiě)如下GA＝格爾德霉素；17-AAG＝17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素以及17-ADG＝17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素。
圖7-9，GA及相關(guān)化合物對(duì)于人類腫瘤細(xì)胞系增殖的作用。將由藥物處理的細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為由在沒(méi)有藥物參與下用HGF/SF刺激的細(xì)胞得到的平均值，并且表示為對(duì)照的百分比。所示值表示在每個(gè)實(shí)驗(yàn)化合物的每個(gè)濃度下的三份實(shí)驗(yàn)(在實(shí)施例中描述的MTS實(shí)驗(yàn))的平均值±1s.d.。按照如下使用細(xì)胞圖7-BTRG；圖8-U373；圖9-SNB19。實(shí)驗(yàn)化合物及縮寫(xiě)如上述圖3-6所述。
圖10，GA對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)散的作用。將MDCK細(xì)胞以1500個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，種3組，并且在24小時(shí)后單獨(dú)或在GA參與下加入HGF/SF(100ng/ml)在再過(guò)24小時(shí)后，細(xì)胞被固定并且用Diff-Quik裝置著色。處理后的MDCK細(xì)胞制備的典型顯微圖在如下板中表示MDCK細(xì)胞(a-j)；HGF/SF處理的細(xì)胞(b-j)；在(c)中加上10-7M的GA；在(d)中加入10-9M的GA；在(e)中加入10-13M的GA；在(f)中加入10-15M的GA；在(g)中加入10-7M的17-AAG；在(h)中加入10-9M的17-AAG；在(i)中加入10-13M的17-AAG；在(j)中10-15M的17-AAG。
圖11-13，GA對(duì)于在生物體外細(xì)胞侵入的作用。用如實(shí)施例19所示的Matrigel侵入實(shí)驗(yàn)(Matrigel invasion assay)測(cè)量DBTRG細(xì)胞(圖11)，SNB19細(xì)胞(圖12)和U373細(xì)胞(圖13)。測(cè)量用藥24小時(shí)后穿過(guò)Matrigel層的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)柱狀圖代表細(xì)胞數(shù)量的三組平均值±1s.d.。
圖14，MA和GA暴露于HSP90α和Met表達(dá)的作用。在所示濃度的mecbecine(MA)或GA存在下，用HGF/SF(100ng/ml)處理MDCK和DBTRG細(xì)胞。如實(shí)施例10所述分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。也用所述的GA親合珠粒(beads)處理每個(gè)細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分樣品，并且用SDS-PAGE分析這些珠粒的洗脫液，然后用HSP90α的抗體進(jìn)行免疫印跡。對(duì)照組的培養(yǎng)沒(méi)有用HGF/SF并且沒(méi)有測(cè)驗(yàn)化合物。得到的熒光圖的相關(guān)區(qū)域表示如下條帶1-6和7-10的樣品分別來(lái)自MDCK和DBTRG的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在pull-down實(shí)驗(yàn)中用GA凝膠珠(上面板)或在全部細(xì)胞溶解產(chǎn)物(下面板)用HSP90α抗體的Westernblotting方法以檢測(cè)HSP90α。條帶2-6和8-12的樣品來(lái)自用HGF/SF處理的細(xì)胞。條帶3、4和9、10的樣品來(lái)自用所示MA處理的細(xì)胞。條帶5、6和11、12的樣品來(lái)自用所示GA處理的細(xì)胞。
圖15，MDCK細(xì)胞在MA中的長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)于Met和HSP90α對(duì)nM-GAi和fM-GAi藥物作用敏感性的影響。MDCK細(xì)胞在1、2或3×10-6M濃度的MA中培養(yǎng)2-3個(gè)月，以分別產(chǎn)生MDCKG1、MDCKG2和MDCKG3細(xì)胞。在盤(pán)中接種106原代細(xì)胞或長(zhǎng)期暴露細(xì)胞(G1-G3)，生長(zhǎng)到80％覆蓋率，然后進(jìn)一步加入GA(+GA，10-6M)或MA(+MA，10-5M)培養(yǎng)24小時(shí)。收獲、裂解細(xì)胞、并且通過(guò)Western blots(見(jiàn)實(shí)施例19)分析裂解產(chǎn)物中Met、HSP90α和β-肌動(dòng)蛋白(作為加樣對(duì)照)的相對(duì)濃度。熒光結(jié)果中相關(guān)的部分表示在圖中。
圖16，長(zhǎng)期用MA培養(yǎng)的細(xì)胞中的HGF/SF-Met信號(hào)傳導(dǎo)。將2.5×105原代MDCK細(xì)胞和加入MA培養(yǎng)的MDCKG3細(xì)胞接種在60×15mm盤(pán)中并且24小時(shí)后加入HGF/SF(100ng/ml)。在所示時(shí)間，收獲、裂解細(xì)胞，用合適的抗體通過(guò)Western blots分析產(chǎn)物中全部和磷酸化Met、全部和磷酸化Erk1、Erk2和β-肌動(dòng)蛋白(加樣對(duì)照)的相對(duì)濃度(見(jiàn)實(shí)施例19)。在熒光圖譜中的相關(guān)區(qū)域表示出了Met、p-Met、Erk1、Erk2和p-Erk1、p-Erk2的結(jié)果。
圖17，MA和GA對(duì)于HGF/SF刺激下擴(kuò)散的MDCK和MDCKG3細(xì)胞的影響。在96孔培養(yǎng)板中接種1500個(gè)原代MDCK細(xì)胞(板a-c)或在3×10-6MMA中培養(yǎng)的MDCKG3細(xì)胞(板d-i)。在24小時(shí)后，單獨(dú)加入HGF/SF(HGF/SF，100ng/ml)，以及分別加入MA(3×10-6M)或GA(10-17-10-15M)。24小時(shí)后，用顯微鏡評(píng)估擴(kuò)散結(jié)果。典型的100倍放大圖象如下(a)MDCK細(xì)胞對(duì)照組；(b)MDCK細(xì)胞+HGF/SF；(c)MDCK細(xì)胞+HGF/SF+MA(3×10-6M)；(d)MDCKG3細(xì)胞對(duì)照組；(e)MDCKG3細(xì)胞+HGF/SF；(f)MDCKG3細(xì)胞+HGF/SF+GA(10-7M)；(g)MDCKG3細(xì)胞+HGF/SF+GA(10-9M)；(h)MDCKG3細(xì)胞+HGF/SF+GA(10-13M)；(i)MDCKG3細(xì)胞+HGF/SF+GA(10-15M).
圖18，在MDCK和MDCK3細(xì)胞中MA和GA對(duì)HGF/SF激發(fā)的uPA誘導(dǎo)的影響。將1500細(xì)胞接種并用HGF/SF或用macbecin II(MA)或格爾德霉素(GA)處理。再次培養(yǎng)24小時(shí)后，用DMEM洗滌細(xì)胞兩次，并且將200ul的含有纖溶酶敏感的發(fā)色團(tuán)的反應(yīng)緩沖液加入到每個(gè)培養(yǎng)板中。然后將板在37 ℃，5％CO2中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，同時(shí)用自動(dòng)分光光度閱讀器以405nm的單波長(zhǎng)讀取產(chǎn)生的吸光度。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式已知包括格爾德霉素和衍生物17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素的袢霉素以及根赤殼菌素能夠與熱休克蛋白質(zhì)90緊密結(jié)合，即已知其對(duì)細(xì)胞的作用的假定機(jī)理。事實(shí)上，GA和17-烷氨基-17-去甲氧基格爾德霉素與hsp90蛋白N-末端的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，格爾德霉素(GA)和其部分衍生物在飛摩爾水平上抑制HGF/SF介導(dǎo)的Met酪氨酸激酶受體的活性，其可以通過(guò)依賴受體的uPA的激活來(lái)進(jìn)行測(cè)量。鑒定是對(duì)于這種活性的結(jié)構(gòu)要求，其得到結(jié)論，這種活性的靶點(diǎn)不是HSP90，而是未知蛋白質(zhì)的復(fù)合體。
在下面，將合成(或從National Cancer Institute獲得)、檢驗(yàn)并討論許多化合物。見(jiàn)實(shí)施例1-19?；衔?-3分別是GA，macbecin和根赤殼菌素。
格爾德霉素(1) Macbecin I(2) 根赤殼菌素(3)


式I 式II

合成和研究了在式III和IV所示的具有所示取代基的另外兩種結(jié)構(gòu)(見(jiàn)實(shí)施例)。這些化合物中的一個(gè)，上面的14也是式I或II的取代產(chǎn)物。
應(yīng)注意，本發(fā)明的活性化合物，特別是那些具有fm-GAi活性的，可以具有氧化的(苯醌，式I)或還原的(氫醌，式II)結(jié)構(gòu)。
式III 式IV17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17-去甲氧基格 Geldanoxazinones爾德霉素衍生物、)Cpd R1R2Cpd X
14-C(O)NH2-H16Br18-C(O)NH2-C(O)CH317I19-H -H除非另外說(shuō)明，在此所指的烷基、烷氧基和烯基可以包括直鏈、支鏈和環(huán)狀部分及其組合，術(shù)語(yǔ)″鹵素″包括氟、氯、溴和碘。很清楚地，僅包含1或2個(gè)原子的基團(tuán)不能是支鏈或環(huán)狀。而且，除非另外說(shuō)明，“任選取代的”意思是包括從零到最大數(shù)量的取代基，例如對(duì)于甲基是3、對(duì)于苯基是5等。在此所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”表示直鏈、支鏈或環(huán)狀完全飽和烴殘基。除非說(shuō)明了碳原子數(shù)量，術(shù)語(yǔ)“烷基”指C1-6烷基(也叫″低級(jí)烷基″)。當(dāng)“烷基”在一般意義上使用時(shí)，例如″丙基″、″丁基"、"戊基″和″己基″等，會(huì)認(rèn)為每個(gè)術(shù)語(yǔ)可以包括其所有的同分異構(gòu)形式(直鏈、支鏈或環(huán)狀)。
優(yōu)選的烷基是C1-6烷基，更優(yōu)選的是C1-4烷基或C1-3烷基。直鏈和支鏈烷基的實(shí)例是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、二級(jí)-丁基、三級(jí)-丁基、正戊基、異戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基丙基。
環(huán)烷基的實(shí)例是環(huán)丙基、環(huán)丙甲基、環(huán)丙乙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。
在此定義的烷基可以由一個(gè)或多個(gè)取代基任選取代。合適的取代基可以包括鹵素；鹵代烷基(例如三氟代甲基，三氯甲基)；羥基；巰基；苯基；苯甲基；氨基；烷氨基；二烷氨基；芳基氨基；雜芳基氨基；烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丁氧基、丙氧基苯氧基；芐氧基等)；硫代；烷硫基(例如甲硫基、乙硫基)；?；?，例如，乙?；?；酰氧基，例如乙酸基；羧基(-CO2H)；羧甲基；氨基甲酰(例如-CONH-烷基、-CON(烷基)2等)；羧基芳基和羧基氨基芳基(例如CONH-芳基、-CON(芳基)2)；氰基；或酮基(其中CH2基由C＝O取代)。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“烯基”表示由包含至少一個(gè)C＝C雙鍵的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基形成的基團(tuán)，包括前述的烯式單、二或多不飽和烷基或環(huán)烷基。因此，環(huán)烯基也是可以的。除非指明了碳原子數(shù)量，烯基優(yōu)選為C2-8烯基。更優(yōu)選為低級(jí)烯基(C2-6)，優(yōu)選C2-5，最優(yōu)選C2-4或C2-3。烯基和環(huán)烯基的實(shí)例包括乙烯基、丙烯基、1-甲基乙烯基、丁烯基、異丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、環(huán)戊烯基、1-甲基-環(huán)戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、環(huán)己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、環(huán)辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1，3-丁二烯基、1，4-戊二烯基、1，3-環(huán)戊二烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，3-環(huán)己二烯基、1，4-環(huán)己二烯基、1，3-環(huán)庚二烯基、1，3，5-環(huán)庚三烯基和1，3，5，7-環(huán)辛四烯基。優(yōu)選的烯基是直鏈或支鏈。如同在此所述，烯基可以由適于上述取代烷基的任選取代基所任選取代。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“炔基”表示由包含至少一個(gè)碳碳三鍵的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基形成的基團(tuán)，包括前述的烯式單、二或多不飽和烷基或環(huán)烷基。除非指明了碳原子數(shù)量，該術(shù)語(yǔ)是指C2-6炔基(低級(jí)炔基)，優(yōu)選C2-5，更優(yōu)選C2-4或C2-3炔基。實(shí)施例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基(包括異構(gòu)體)和戊炔基(包括異構(gòu)體)。優(yōu)選的炔基是直鏈或支鏈炔基。如同在此所述，炔基可以由適于上述取代烷基的任選取代基所任選取代。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”分別指與氧連接的烷基。GA(1)具有取代17C位置的甲氧基(-OCH3)(即式I的R1是-CH3)?？梢栽诖宋恢萌〈钠渌鶊F(tuán)包括C2-C6直鏈或支鏈的烷氧基，優(yōu)選乙氧基和丙氧基。C2-C6直鏈或支鏈的烯氧基或C2-C6炔氧基也可以在此位置出現(xiàn)。
術(shù)語(yǔ)“芳基”表示單環(huán)、多環(huán)、共軛或稠合的芳香烴環(huán)體系基團(tuán)。芳基的實(shí)施例是苯基、聯(lián)苯基和萘基。芳基可以由一個(gè)或多個(gè)在此定義的取代基任選取代。因此，在此所使用的“芳基”也指取代的芳基。
本發(fā)明化合物包括對(duì)于在式I/II的R1表示OR時(shí)的R所表示的取代基低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈和支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺(其中的N可以是第三級(jí)或第四級(jí))。
最優(yōu)選的R1基團(tuán)是3-6元環(huán)雜環(huán)基，優(yōu)選具有單個(gè)N雜環(huán)原子的雜芳基。最優(yōu)選的是3元(氮丙啶基)和4元(氮雜環(huán)丁烷基)雜芳基環(huán)。同樣優(yōu)選更大的環(huán)，包括吡啶基、吡咯基、哌啶基等。
更廣泛地，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”表示單環(huán)、多環(huán)、共軛或稠合的芳香雜環(huán)體系，其中環(huán)狀烴基的一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子取代得到雜環(huán)芳香基。在兩個(gè)或多個(gè)碳原子被取代的情況下，取代的原子可以是兩個(gè)或多個(gè)相同的雜原子，或是兩種不同的雜原子。除了N以外，適合的雜原子還包括O、S和Se。雜環(huán)可含有單鍵或雙鍵。本發(fā)明范疇內(nèi)的那些實(shí)施例，就包括了那些含有其它雜原子和稠環(huán)等的結(jié)構(gòu)，包括噻吩基、呋喃基、吲哚基、咪唑基、呃唑基、噠嗪基、吡唑基、吡嗪基、噻唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、嘌呤基、喹唑啉基、吩嗪基、吖啶基、苯并惡唑基、苯并噻唑基及類似物。如此定義，一個(gè)雜芳基還可任選被一個(gè)或多個(gè)前述取代基進(jìn)一步單取代或雙取代，取代位置在環(huán)上可能的位置，所述取代基為例如低級(jí)烷基、烯基、烷氧基、烯基、烯氧基等等。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，式I/II中R1是取代的芳基，該芳基由一個(gè)或多個(gè)烷基、羧基、酰胺基或氨基，如-CH3、-CH2CH3、-(CH2)mCO2R1、-(CH2)mCH2OR2、-(CH2)mCONHR2、-(CH2)mNHR2、-(CH2)mCONR2R3或-(CH2)mCONR2R3，其中m＝0-3，R1是H、烷基或芳基，并且其中R2或R3獨(dú)立地是H、烷基、芳基或?；Ｊ絀中其它優(yōu)選的R1基團(tuán)包括苯基；2-甲基苯基；2，4-二甲基苯基；2，4，6-三甲基苯基；2-甲基，4-氯-苯基；芳氧基烷基(例如苯氧基甲基或苯氧基乙基)；苯甲基；苯乙基；2，3或4-甲氧基苯基；2，3或4-甲基苯基；2，3或4-吡啶基；2，4或5-嘧啶基；2或3-硫代苯基；2，4或5-(1，3)-呃唑基；2，4或5-(1，3)-噻唑基；2或4-咪唑基；3或5-對(duì)稱三唑基。
亞烴基鏈可以加長(zhǎng)，例如，通過(guò)Arndt-Eistert合成，其中將氯化?；ㄟ^(guò)插入CH2轉(zhuǎn)換為羧酸。因此，羧酸基可以轉(zhuǎn)換為氯化酰基衍生物，例如通過(guò)用SO2Cl2處理。氯化?；苌锟梢耘c重氮甲烷反應(yīng)生成重氮甲酮，然后可以將其用Ag2/H2O或苯甲酸銀和三乙基胺處理。可以重復(fù)此方法以進(jìn)一步增加亞烴基鏈的長(zhǎng)度。或者，醛基(或酮基)可以通過(guò)Wittig-型反應(yīng)(用例如Ph3(P)＝CHCO2Me)生成α、β-不飽和酯。此雙鍵的氫化作用產(chǎn)生增加了兩個(gè)碳原子長(zhǎng)度的亞烴基鏈。以類似的方式，可以用其它膦產(chǎn)生較長(zhǎng)的(和任選取代的、支鏈的、或不飽和的)碳鏈。
本發(fā)明包括含有R2取代基的式I/II化合物，與含有R1的描述相同。兩個(gè)袢霉素環(huán)C17和C19位置可以獨(dú)立地被取代，而如果取代C17，優(yōu)選R2為H。
與在式I/II的環(huán)位置22上的N結(jié)合的R3取代基優(yōu)選為H(如同在此示例的GA和化合物)、或低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈和支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺(其中N可以是第三級(jí)或第四級(jí))。N可以是任選取代的雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基或雜芳基環(huán)的一部分。如果N是環(huán)的一部分，其優(yōu)選為3-6元環(huán)，優(yōu)選不含其它雜環(huán)原子。最優(yōu)選的是氮丙啶基、氮雜環(huán)丁烷基、吡啶基、吡咯基、哌啶基等。
在式I/II的環(huán)位置C11結(jié)合的是O原子，其被R4基團(tuán)取代。R4最優(yōu)選為低級(jí)烷基，但也可以是低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基，從而與C11結(jié)合的基團(tuán)優(yōu)選是烷氧基，但也可以是烯氧基和炔氧基。
除以上公開(kāi)的式I/II的各種取代基外，在位置C2＝C3、C4＝C5和C8＝C9之間的環(huán)雙鍵可以被氫化為單鍵。
顯然地，在環(huán)式I/II中某些位置的取代基的化學(xué)處理可能需要其它潛在反應(yīng)基的保護(hù)。對(duì)于在適當(dāng)條件下的應(yīng)用的合適保護(hù)基，及其引入和去除的方法在本領(lǐng)域是公知的，并且在Greene TW等人，Protective Groups in OrganicSynthesis，3rd ed，John Wiley和Son，1999中說(shuō)明，其內(nèi)容在此作為參考全文引入。
本發(fā)明的化合物可以任選地結(jié)合到或在其被取代的環(huán)結(jié)構(gòu)中包括可用于診斷或治療的放射性核素(見(jiàn)下)。該化合物可以結(jié)合到特異性與蛋白質(zhì)結(jié)合的靶點(diǎn)部分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，考慮到WO98/51702(上述)，本發(fā)明的GA衍生物(無(wú)論是游離的或是可檢測(cè)到的標(biāo)記結(jié)合到靶點(diǎn)部分上)是在此所述的化合物，條件是該化合物不是GA(化合物1)、化合物15；或17-(N-碘乙基-N-氰基-17-去甲氧基格爾德霉素(具有或不具有放射性碘)。然而，本發(fā)明方法的實(shí)施例可以包括這種排除在外的化合物，基于這樣的事實(shí)，在此參考文獻(xiàn)中沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，考慮到WO95/01342(上述)，無(wú)論游離的或結(jié)合到靶點(diǎn)部分或用可檢測(cè)到的標(biāo)記物標(biāo)記到本發(fā)明化合物的GA衍生物是在此所述的化合物，條件是該化合物不是WO95/01342所公開(kāi)的，特別地是列在第15頁(yè)第19行到第17頁(yè)第12行或?qū)嵤├?-99的化合物。此參考文獻(xiàn)的實(shí)施例21公開(kāi)了化合物8，但是沒(méi)有說(shuō)明其在fM或亞-fM濃度下具有抗腫瘤細(xì)胞的新性質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，考慮到美國(guó)專利5,932,566(前述Schnur等人)，無(wú)論游離的或可檢測(cè)到的標(biāo)記或結(jié)合到靶點(diǎn)部分的GA衍生物是在此所述的化合物，條件是該化合物不是17-氨基-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-甲基氨基-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-環(huán)丙基氨基-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2′-羥乙氨基)-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2-甲氧基乙基氨基)-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；1 7-(2′-氟代乙氨基)-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-s-(+)-2-羥丙氨基-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氮雜環(huán)丁烷-1-基-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(3-羥基氮雜環(huán)丁烷-1-基)-4，5-二氫-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氮雜環(huán)丁烷-1-基-4，5-二氫-11-α-氟代-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氮雜環(huán)丁烷-1-基-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2′-氰基乙氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2′-氟代乙氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氨基-22-(2′-甲氧基苯甲酰基)-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氨基-22-(3′-甲氧基苯甲?；?-17-去甲氧基格爾德霉素；
17-氨基-22-(4′-氯苯甲?；?-17-去甲氧基格爾德霉素；1 7-氨基-22-(3′，4′-二氯苯甲?；?-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氨基-22-(4′-氨基-3′-碘代苯甲?；?-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氨基-22-(4′-疊氮基-3′-碘代苯甲?；?-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氨基-11-α-氟代-17-去甲氧基格爾德霉素；17-烯丙氨基-11-α-氟代-17-去甲氧基格爾德霉素；17-炔丙基氨基-11-α-氟代-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2′-氟代乙氨基)-11-α-氟代-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氮雜環(huán)丁烷-1-基-11-(4′-疊氮苯基)氨磺酰羰基-17-去甲氧基格爾德霉素；17-(2′-氟代乙氨基)-11-酮基-17-去甲氧基格爾德霉素；17-氮雜環(huán)丁烷-1-基-11-酮基-17-去甲氧基格爾德霉素；以及17-(3′-羥基氮雜環(huán)丁烷-1-基)-11-酮基-17-去甲氧基格爾德霉素。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，考慮到WO2004/087045(前述)，無(wú)論游離的或結(jié)合到靶部分或用可檢測(cè)到的標(biāo)記物標(biāo)記的GA衍生物是在此所述的化合物，條件是該化合物不是17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；17-2-二甲氨基)乙氨基]-去甲氧基-11-O-甲基格爾德霉素；或17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17。但是，本方法的實(shí)施例可以包括這種排除在外的化合物，并基于這樣的事實(shí)，在此參考文獻(xiàn)中沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的應(yīng)用。
用于成像的放射性同位素示蹤的GA衍生物優(yōu)選的化合物是可檢測(cè)的或診斷標(biāo)記的本發(fā)明GA衍生物化合物，其與可檢測(cè)到的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合，該標(biāo)記物優(yōu)選為可體外成像的。優(yōu)選的可檢測(cè)到的標(biāo)記物是放射性核素，特別是可容易地連到GA衍生物的鹵素原子。
通過(guò)使用HX酸取代鹵族X(＝F、Br、Cl、I)以打開(kāi)包含N雜環(huán)基環(huán)，例如GA衍生物的氮丙啶環(huán)，特別是在此為化合物15的17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(″17-ARG″)的化學(xué)，對(duì)于制備此GA衍生物的氟代、氯代、溴代和碘代形式是相對(duì)易懂的。放射性核素原子是共價(jià)結(jié)合的。此鹵化GA衍生物可以用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人體的研究，診斷和預(yù)后的有效的體內(nèi)成像劑。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，17-(2-鹵代乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素依照實(shí)施例19所述，15通過(guò)與放射性HX*酸((其中X*＝18F、76Br、76Br、123I、124I、125I和131I)反應(yīng)而制得。
下面是部分這些核素的特性的總結(jié)(部分取自Vallabhajosula，S，Radiopharmaceuticals in Oncology，Chapter 3，Nuclear OncologyDiagnosis和Therapy(IKhalkhali等人，eds)Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，2001，p.33)用于診斷用途的鹵素放射性核素用于診斷的鹵素放射性核素

EC，電子捕捉

正電子-發(fā)射放射性核素(用于PET成像)


125I和131I是兩種另外的放射性核素；二者具有潛在治療以及診斷用途。125I通過(guò)電子捕捉衰變并且發(fā)射Auger電子以及β射線。131I是β發(fā)射器。125I對(duì)于小型動(dòng)物成像是特別有效的，例如，對(duì)于通過(guò)閃爍掃描法或單光子發(fā)射計(jì)算X線斷層攝影術(shù)(SPECT)的腫瘤成像。對(duì)于SPECT的總體說(shuō)明，參見(jiàn)Heller，S.L.等人，Sem.Nucl.Med.17183-199(1987)；Cerquiera，M.D.等人，Sem.Nucl.Med.17200-213(1987)；Ell，P.J.等人，Sem.Nucl.Med.17214-219(1987))。
對(duì)于體內(nèi)成像所用的放射性核素，123I不發(fā)射粒子，但是在140-200keV范圍內(nèi)產(chǎn)生許多光子，其可以用傳統(tǒng)Υ照相機(jī)容易地檢測(cè)。
這些類型標(biāo)記充許在組織樣品中檢測(cè)或測(cè)定表達(dá)Met的細(xì)胞的含量，并且因此可以用作疾病中診斷和預(yù)報(bào)工具，其Met(或其配體HGF)的表達(dá)或增強(qiáng)表達(dá)可作為病理上的指標(biāo)，或作為診斷標(biāo)志和/或治療靶點(diǎn)，特別是針對(duì)癌癥。
因此，優(yōu)選的診斷方法是PET成像，閃爍掃描分析和SPECT。這些可以以產(chǎn)生連續(xù)的整體身體圖像，并允許通過(guò)定量的“興趣區(qū)域”(ROI)分析確認(rèn)區(qū)域活性的方式進(jìn)行。
影像過(guò)程和分析的實(shí)施例，特別是對(duì)于動(dòng)物模型，在Gross MD等人(1984)Invest Radiol 19530-534；Hay RV等人(1997)Nucl Med Commun 18367-378)中進(jìn)行了說(shuō)明。
藥物成分及其劑型和用途式I/II的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽是有用的高效抗腫瘤/抗癌劑，其作用機(jī)理可能在于抑制HGF/SF和其受體Met之間的細(xì)胞聯(lián)系，或是二者的結(jié)合。它們也可能用于抑制其它可能導(dǎo)致細(xì)胞不受控制地過(guò)度增殖的生長(zhǎng)因子/受體的相互作用，例如EGF受體，NGF受體，PDGF受體和胰島素受體。
本發(fā)明的藥物組合物包括在本領(lǐng)域中已知?jiǎng)┬偷腇M-GAi化合物。在本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物包括含有有效量以達(dá)到特定藥效的fM-GAi的所有組合物。當(dāng)個(gè)體需要變化時(shí)，每種成分有效含量的最佳范圍的確定是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍中。典型的劑量包括0.01pg-100μg/kg體重，更優(yōu)選1pg-100μg/kg體重，最優(yōu)選10pg-10μg/kg體重。
除了藥理活性分子，藥物組合物中還可以包含適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體，包括有助于將活性化合物處理為藥學(xué)上可用的制劑的賦形劑和輔料，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。用于注射或口服給藥的合適液體制劑，可以包含從約0.01％到99％的活性化合物以及賦形劑。
本發(fā)明的藥物制劑是以公知的方式制備的，例如通過(guò)傳統(tǒng)的混合、研磨、溶解或冷凍干燥步驟。合適的賦形劑可包括填料、結(jié)合劑、分解劑、輔料和穩(wěn)定劑，其全部都是在本領(lǐng)域中公知的。用于非腸道給藥的合適的劑型包括蛋白質(zhì)的水溶液，例如以水溶鹽的形式?；衔飪?yōu)選在二甲基亞砜(DMSO)中溶解，與水溶性靜脈注射(i.v.)溶劑混合，通過(guò)靜脈給藥(見(jiàn)Goetz JP等人，2005，J.Clin.Oncol.2005，231078-1087，對(duì)于17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素的給藥的說(shuō)明)。
另一種化合物，17-(2-二甲氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素可以按上述DMSO劑型通過(guò)靜脈注射給藥，或以不同的劑型口服。對(duì)于本發(fā)明的化合物和方法，優(yōu)選的溶劑是進(jìn)一步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射水溶液的DMSO。
另外，還可以通過(guò)活性化合物合適的油性混懸注射液的混懸劑形式給藥。合適的親油溶劑或溶媒包括脂肪油，例如，芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三甘油酯。水性注射懸浮液可以包括增加混懸劑粘度的物質(zhì)。
組合物可以是凍干顆粒物、無(wú)菌的或在無(wú)菌條件下生產(chǎn)的溶液、片劑、針劑等的形式。可含有溶媒，例如水(優(yōu)選生理上可接受pH的緩沖到，例如磷酸鹽緩沖鹽水)或合適的有機(jī)溶劑，其它惰性的固體或液體物質(zhì)，例如生理鹽水或各種緩沖液。特定的溶媒不是關(guān)鍵的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道要使用哪種溶媒以達(dá)到前述的特定目的。
總之，藥物組合物是通過(guò)混合、溶解、結(jié)合或以本發(fā)明的聚合物或軛合物與一種或多種非水溶性或水溶性的水性或非水性的溶媒聯(lián)合的方式制備。溶媒、載體或賦形劑以及形成該組合物的條件不會(huì)對(duì)活性化合物的生物學(xué)或藥理學(xué)活性產(chǎn)生不利的影響，這是必要的。
給藥的受試者、治療方式和途徑本發(fā)明的優(yōu)選動(dòng)物受試者是哺乳動(dòng)物。本發(fā)明在人類受試者的治療中是特別有效的。通過(guò)術(shù)語(yǔ)“治療”意思是以含有fM-GAi化合物的藥物組合物對(duì)受試者給藥。治療包括對(duì)具有Met-陽(yáng)性腫瘤高危風(fēng)險(xiǎn)但尚未有臨床癥狀的受試者的給藥，以及診斷有這種腫瘤或癌癥并且仍未治療或者已經(jīng)通過(guò)例如外科、傳統(tǒng)化療等其它方法治療并且其腫瘤已經(jīng)減小到不可檢測(cè)的水平的受試者。本發(fā)明對(duì)于防止或抑制腫瘤原發(fā)生長(zhǎng)、再發(fā)腫瘤生長(zhǎng)、侵入和/或轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)具有意義。
其中fM-GAi化合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體聯(lián)合的本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任何方式給藥以實(shí)現(xiàn)其預(yù)期目的。給藥的劑量和用法可以由具有特定疾病治療技能的臨床人員容易地決定。優(yōu)選的用量如下所述。
本發(fā)明的活性化合物可以結(jié)合傳統(tǒng)藥學(xué)上應(yīng)用的無(wú)毒的載體、輔料和溶媒，按劑量單位的劑型，通過(guò)口服、局部外用、非腸道途徑、噴霧吸入或直腸等方式給藥。
總之，本方法包括通過(guò)非腸道途徑給藥，包括用任何已知和合適途徑對(duì)于受試者的疾病和情況進(jìn)行注射或輸注。非腸道途徑包括經(jīng)皮下(s.c.)、靜脈(i.v.)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、經(jīng)皮膚、局部、直腸或吸入等方式給藥。也包括直接瘤內(nèi)注射。或者通過(guò)口服途徑給藥，或同時(shí)通過(guò)口服途徑給藥。給藥劑量取決于受試者的年齡、健康狀況和體重，同時(shí)開(kāi)展的治療種類、治療頻率和期望的效果。本發(fā)明的活性化合物可以以包含傳統(tǒng)藥學(xué)上可接受的無(wú)毒的載體、輔料和溶媒，以劑量單位的劑型給藥。
在一個(gè)治療方法中，這些化合物和所述方法可與外科相結(jié)合應(yīng)用。從而，可以將有效量的fM-GAi化合物直接應(yīng)用到腫瘤(無(wú)論原發(fā)還是轉(zhuǎn)移的)的外科手術(shù)切除部位。這可以通過(guò)在開(kāi)放的外科手術(shù)部位注射或“局部”應(yīng)用或縫合后進(jìn)行注射。
在一個(gè)實(shí)施例中，確定量的該化合物，優(yōu)選約1pg-100μg，加入到在室溫下用肝素鹽水溶液1∶1稀釋的約700ml人類血漿中。也可以加入500μg/dl濃度(在700ml總?cè)萘恐?的人類IgG。可將該溶液在室溫下放置一小時(shí)。然后可以將溶液容器直接與靜脈輸液管連接，并且以約20ml/min的優(yōu)選速度對(duì)受試者給藥。
在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物直接通過(guò)靜脈滴注到受試者中。向250ml肝素鹽水溶液中加入適當(dāng)量，優(yōu)選約1pg-100ug，并以約20ml/min的速度靜脈滴注到患者體內(nèi)。
該組合物可以一次性給藥，但通常分6到12次給藥(或更多，由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定)。治療可以在每天進(jìn)行，但通常每?jī)傻饺爝M(jìn)行一次或少到每周一次，由對(duì)受試者的有益的和毒副作用確定。如果通過(guò)口服途徑，優(yōu)選為片劑或膠囊形式的藥物組合物可以每天給藥一次或多次。
用于全身性用藥的本發(fā)明的藥物劑型可以被制成腸道的、非腸道的或局部的，并且全部三種類型的劑型可以同時(shí)使用來(lái)達(dá)到活性成分的全身給藥。
對(duì)于肺部滴注用藥，可使用氣溶膠溶液。在可噴射的氣溶膠中，活性蛋白質(zhì)或小分子制劑可以與固體或液體隋性載體物質(zhì)聯(lián)合。它也可以裝入擠壓瓶或與加壓揮發(fā)性的、普通氣體推進(jìn)劑混合。除本發(fā)明的蛋白質(zhì)之外，氣溶膠制劑還可包括溶劑、緩沖劑、表面活性劑和抗氧化劑。
在器官包膜(鞘)內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤經(jīng)常導(dǎo)致在器官薄膜內(nèi)產(chǎn)生并積聚大量液體。實(shí)施例包括(1)包被肺部的胸膜內(nèi)產(chǎn)生的胸膜積液，(2)腹膜內(nèi)積聚產(chǎn)生的腹水，以及(3)腦膜內(nèi)轉(zhuǎn)移癌導(dǎo)致的腦水腫。這種滲出液和積液通常在疾病晚期階段發(fā)生。本發(fā)明設(shè)想了該藥物組合物的給藥，其直接給藥到腔隙中，例如生長(zhǎng)腫瘤的腹膜腔隙、心包膜和胸膜間腔隙。也就是，將藥劑直接給到有癌細(xì)胞的液體空間中，或腫瘤相鄰的胸膜、腹膜、心包膜和囊膜等膜空間中。這些部位顯示有惡性腹水、胸膜和心包積液或腦膜癌擴(kuò)散。優(yōu)選在部分地或全部地排出液體(例如腹水、胸膜或心包膜積液)之后將此藥物給藥、但是也可以在未排出液體的包含滲出液、腹水和/或腫瘤灶的腔隙中直接給藥。通常，fM-GAi組分的劑量從1fg到10ug，優(yōu)選為1pg-1ug，并且3至10天給藥一次。直到?jīng)]有腹水或滲出為止。認(rèn)為治療反應(yīng)是在最后胸膜內(nèi)給藥之后四周沒(méi)有進(jìn)一步積液。
對(duì)于局部應(yīng)用，活性化合物可以包含在藥膏或軟膏等局部應(yīng)用的賦形劑中，作為將活性成分直接給藥到受感染區(qū)域的手段。也可以使用對(duì)接種疫苗研究者公知的皮上劃痕法(Scarification)?；钚晕镔|(zhì)的載體可以是可噴射或不可噴射型。不可噴射型可以是半固體或固體形式，其包含適用于局部用藥的載體并且具有優(yōu)選大于水的動(dòng)態(tài)粘度。合適的劑型包括，但不限于，溶液、懸浮液、乳劑、霜?jiǎng)④浉?、粉未、搽劑、敷劑等。如果需要，它們可以是無(wú)菌的或與例如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、緩沖劑或調(diào)節(jié)滲透壓的鹽等輔料混合。不可噴射的局部制劑的優(yōu)選賦形劑的實(shí)例包括軟膏基質(zhì)、例如聚乙二醇-1000(PEG-1000)；例如HEB乳膏等常規(guī)乳膏；凝膠；以及凡士林油等。
依照本發(fā)明的其它藥學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體或者緩釋或控釋載體或者本領(lǐng)域公知的藥物傳遞裝置。
化學(xué)療法和生物抗癌劑的聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)療法劑可以通過(guò)傳統(tǒng)方式并以本領(lǐng)域習(xí)慣的劑量與本化合物聯(lián)合使用。在本發(fā)明中有用的抗癌化療藥物包括但不限于抗代謝物、蒽環(huán)類抗生素、長(zhǎng)春花屬生物堿、抗微管蛋白藥物、抗生素和烷化劑?？蓡为?dú)或聯(lián)合應(yīng)用的典型特定藥物包括順鉑(CDDP)、阿霉素、放線菌素D、絲裂霉素、洋紅霉素、道諾霉素、阿霉素、三苯氧胺、紫杉酚、泰素帝(Taxotere)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、異長(zhǎng)春花堿(vinorelbine)、依托泊苷(VP-16)、異搏定、足葉草毒素、5-氟代尿嘧啶(5FU)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、環(huán)磷酰胺、噻替派、甲氨蝶呤、喜樹(shù)堿、放射菌素-D、絲裂霉素C、氨基蝶呤、風(fēng)車子素(combretastatin(s))和衍生物及其前體藥物。
任何一個(gè)或多個(gè)這種藥物，以致癌基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑為靶點(diǎn)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制血管生成的更新的藥物，以及生物產(chǎn)品例如核酸分子、載體、反義構(gòu)造物、siRNA構(gòu)造物和核酸酶，在適當(dāng)情況下，可以與本發(fā)明的化合物和方法聯(lián)合使用。這種藥物和療法的實(shí)例包括放射療法劑，結(jié)合有植物、真菌或細(xì)菌源毒素或凝結(jié)劑的抗腫瘤藥物的抗腫瘤抗體，篦麻毒素A鏈、去糖基化篦麻毒素A鏈、核糖體滅活蛋白、八疊球菌素、植物毒素(gelonin)、曲霉素、局限曲霉素、核糖核酸酶、表足葉草毒素、白喉毒素或假單胞菌外毒素。能夠殺死或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或分化的其它細(xì)胞毒素劑、細(xì)胞抑制劑或抗細(xì)胞劑包括抗血管生成劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、凝血?jiǎng)?、前體藥物或腫瘤靶點(diǎn)型、酪氨酸激酶抑制劑、反義策略、RNA適體，siRNA和抗VEGF或VEGF受體的RNA酶。許多酪氨酸激酶抑制劑當(dāng)與本化合物一起或之后給藥時(shí)是有用的。舉例來(lái)說(shuō)，它們包括4-氨基吡咯[2，3-d]嘧啶(U.S.Pat.No.5,639,757)?？梢酝ㄟ^(guò)VEGF-R2受體調(diào)節(jié)酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)的小有機(jī)分子的進(jìn)一步實(shí)例是喹唑啉化合物和組合物(U.S.Pat.No.5,792,771)?？梢耘c本發(fā)明聯(lián)合使用的其它物質(zhì)是例如血管抑制性4，9(11)-甾類和C21-氧合甾類的甾類(U.S.Pat.No.5,972,922)。
鎮(zhèn)靜劑和相關(guān)的化合物、前體、類似物、代謝物和水解產(chǎn)物(U.S.Pat.Nos.5,712,291和5,593,990)也可聯(lián)合用于抑制血管生成。這些鎮(zhèn)靜劑和相關(guān)的化合物可以口服給藥。導(dǎo)致腫瘤消退的其它抗血管生成劑包括細(xì)菌多糖CM101(現(xiàn)處于臨床實(shí)驗(yàn))和抗體LM609。CM101誘導(dǎo)腫瘤中新生血管炎癥反應(yīng)并且負(fù)調(diào)控VEGF及其受體的表達(dá)。在血小板α顆粒中發(fā)現(xiàn)的凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)和血小板因子4(PF4)是與肝素相關(guān)的血管新生抑制劑。干擾素和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI′s)是另外兩類可以應(yīng)用的天然血管生成抑制劑。金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是一類天然存在的抑制血管生成的MMPI′s家族。其它研究好的抗血管生成劑是血管生成抑制素(angiostatin)、血管內(nèi)皮抑制素(endostatin)、血管抑制素(vasculostatin)、血管發(fā)生抑制素(canstatin)和抗癌蛋白(maspin)。
化療劑是在每個(gè)治療周期內(nèi)以全劑量或減量單一藥物或多藥物聯(lián)合給藥。以本文中的成分聯(lián)合一種低劑量、單一組份的化療藥物是特別優(yōu)選的。在這種組合中，化療藥物的選擇取決于惡性腫瘤的潛在性質(zhì)。對(duì)于肺癌，優(yōu)選順鉑。對(duì)于乳腺癌，優(yōu)選微管抑制劑例如泰素帝(Taxotere)。對(duì)于由胃腸癌引起的惡性腹水，優(yōu)選5-FU?；熕幬锏摹暗蛣┝俊敝副却怂巹┑呐鷾?zhǔn)劑量(由美國(guó)食品及藥物管理局，F(xiàn)DA批準(zhǔn))低10-95％的單劑量。如果此方案包含聯(lián)合化療法，那么每種藥物劑量以相同百分比減少。盡管高于或低于此水平的治療效果是可見(jiàn)的，但是優(yōu)選比FDA批準(zhǔn)劑量的＞50％的減量，其副作用是最小的。在不同部位的多個(gè)腫瘤可以通過(guò)fM-GAi化合物的全身或膜內(nèi)或瘤內(nèi)注射給藥來(lái)治療。
在以下著作中，已經(jīng)提出了對(duì)所有主要人類腫瘤的最優(yōu)化學(xué)療法劑和聯(lián)合療法，Bethesda Handbook of Clinical Oncology，Abraham J等人，LippincottWilliam & Wilkins，Philadelphia，PA(2001)；Manual of Clinical Oncology，F(xiàn)ourthEdition，Casciato，DA等人，Lippincott William & Wilkins，Philadelphia，PA(2000)。二者在此作為參考全文引入。
fM-GAi化合物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)fM-GAi化合物的治療功效可以在相應(yīng)的嚙齒類動(dòng)物模型中檢驗(yàn)，該模型具備人類腫瘤的代表性。該全部方法在Geran，R.I.等人，″Protocols forScreening Chemical Agents and Natural Products Against Animal Tumors andOther Biological Systems(3d Ed)″，Cane.Chemother.Reports，Part3，31-112；和Plowman，J等人，InTeicher，B，ed.，Anticancer Drug Developnaent Guide Preclinical Screening，Clinical Trials and Spproval.Part IIIn Yivo Methods，Chapter 6，″NCI藥物開(kāi)發(fā)之人類腫瘤異體移植模型″，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，1997中詳細(xì)地說(shuō)明。所有這些文獻(xiàn)在此作為參考全文引入。
人類腫瘤異種移植瘤模型由National Cancer Institute(NCI)實(shí)施的抗癌藥物的臨床前期研究和開(kāi)發(fā)是由一系列檢測(cè)程序、數(shù)據(jù)檢查和確定步驟組成的(Grever，MR，Se7ninOncol.，19622-638(1992))。檢測(cè)程序設(shè)計(jì)為提供相對(duì)定量數(shù)據(jù)，依次從給定的化學(xué)或生物類別中選擇最佳備選制劑。下面我們說(shuō)明人類腫瘤異種移植瘤系統(tǒng)，著重說(shuō)明黑素瘤，它是當(dāng)前在臨床前期藥物開(kāi)發(fā)中使用的。
從1975年以來(lái)，NCI探討了在腹腔(i.p.)移植鼠P388白血病模型中包括化合物預(yù)先篩選的藥物發(fā)現(xiàn)(參見(jiàn)上面)，然后在一系列可移植的腫瘤中評(píng)估所選的化合物(Venditti，J.M.等人，InGarrattini S等人，eds.，Adv.Pharmacoland Chemother 21-20(1984))，其包括人類實(shí)體瘤。免疫缺陷無(wú)胸腺(nu/nu)裸鼠及人類腫瘤鼠移植技術(shù)的發(fā)展，使以上研究成為可能(Rygaard，J.等人，ActaPatAlol.Microbiol.Scand.77758-760(1969)；Giovanella，G.C.等人，J.NatlCanc.Test.51615-619(1973))。評(píng)估某些鼠和人類腫瘤細(xì)胞系(B16，A-375，LOX-IMVI黑素瘤和PC-3前列腺癌)的轉(zhuǎn)移潛力及其用于實(shí)驗(yàn)藥物評(píng)估的實(shí)用性的研究，支持了源于腫瘤移植瘤接種于解剖學(xué)上相近的宿主組織的體內(nèi)研究模型的重要性；這種模型很好地適用于詳細(xì)評(píng)估針能抑制特定腫瘤的某種化合物的抗癌活性。從大約1990年開(kāi)始，NCI開(kāi)始使用人類腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行大規(guī)模藥物篩選((Boyd，MR，InDeVita，VT等人，Cancer Principles和Practice of Oncology，Updates，vol 3，Philadelphia，Lippinicott，1989，pp1-12；前述的Plowman)。源自七種癌癥(腦、結(jié)腸、白血病、肺、黑素瘤、卵巢、和腎臟型)的細(xì)胞系來(lái)源廣泛，經(jīng)冷凍，制備為一系列適用于體外和體內(nèi)研究特性的材料。此方法使篩選過(guò)程從“化合物導(dǎo)向的”轉(zhuǎn)變到“疾病導(dǎo)向的”的藥物開(kāi)發(fā)方式(前述Boyd)。通過(guò)該過(guò)程篩選出的化合物，具有疾病特異性和有差別的細(xì)胞毒性，被認(rèn)為是進(jìn)一步臨床前期評(píng)估的“先導(dǎo)藥物”。為了滿足這種需要，建立了一系列人類腫瘤異種移植瘤模型。
通過(guò)在腋窩附近皮下(s.c.)接種的30-40mg傳代腫瘤組織塊，獲得鼠體內(nèi)原發(fā)實(shí)體瘤模型。一般地異種移植瘤不會(huì)立即用于藥物評(píng)估，而是直到體積倍增時(shí)間穩(wěn)定，通常大約在第四或第五代時(shí)才可用。
異種移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)特性決定了其是否適用于抗腫瘤藥物的活性評(píng)估，特別是在異種移植瘤處于早期皮下(s.c.)移植模型。在此使用的早期階段s.c.模型定義為在治療開(kāi)始前腫瘤處于63-200mg的階段。用于腫瘤生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)特征指標(biāo)包括腫成活率、達(dá)到200mg的時(shí)間、倍增時(shí)間和對(duì)于自發(fā)性退化的易感性。
本領(lǐng)域公知的許多轉(zhuǎn)基因鼠模型的任一種可以用于實(shí)驗(yàn)本化合物。本發(fā)明人之一和同事已經(jīng)描述了特別有效的鼠人類HGF/SF轉(zhuǎn)基因模型，其可以用于在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗人類移植瘤的本化合物。參見(jiàn)ZhangYW et al.(2005)Oncogene24101-106；U.S.Pat.App Ser.No.60/587,044，其內(nèi)容在此作為參考全文引入。下面描述了其它早已公知的模型。
晚期階段的皮下異種移植瘤模型這種皮下接種的移植瘤模型用于評(píng)估受試藥劑的抗腫瘤活性，條件是能夠確定臨床中相關(guān)的活性參數(shù)，例如部分和完全消退以及緩解期時(shí)間等(MartinDS等人，Cancer Treat Rep6837-38(1984)；Martin DS等人，Cancer Res.462189-2192(1986)；Stolfi，RL等人，J.Natl Canc Inst8052-55(1988))。監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)并且在腫瘤達(dá)到100-400mg的重量范圍時(shí)開(kāi)始受試藥劑的治療(治療分期日(staging day)，中位重量大約為200mg)，盡管由異種移植瘤確定，腫瘤可以在更大的尺寸時(shí)開(kāi)始治療。大約每周2次測(cè)量腫瘤大小和體重。通過(guò)軟件程序(由Information Technology Branch of DTP of the NCI員工開(kāi)發(fā)的)，儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，計(jì)算各種效果參數(shù)，并且以圖和表形式描述數(shù)據(jù)。毒性和抗腫瘤活性的參數(shù)定義如下1.毒性確定藥物相關(guān)死亡率(DRD)和最大相關(guān)平均凈體重?fù)p失百分比。受試動(dòng)物的死亡是與治療相關(guān)的是指，如果動(dòng)物在最后一次治療的15天(d)中死亡，并且其腫瘤重量少于對(duì)照組中鼠的致死量或者其死亡時(shí)凈體重?fù)p失比對(duì)照鼠組死亡時(shí)的平均凈體重變化平均值大20％。DRD也可由實(shí)驗(yàn)者設(shè)定。將在每個(gè)觀察日中每組鼠的平均凈體重與在分期日(staging day)的平均凈體重進(jìn)行對(duì)比。將發(fā)生的任何體重?fù)p失計(jì)算為分期日(staging day)體重的百分?jǐn)?shù)。對(duì)照鼠組也同樣進(jìn)行這些計(jì)算，因?yàn)橐恍┮浦擦龅纳L(zhǎng)對(duì)體重有負(fù)面的影響。
2.最佳T/C百分比每天計(jì)算治療組(T)和對(duì)照組(C)腫瘤重量(A重量)的變化，用特定觀察日的腫瘤重量中位數(shù)減去首次治療日(治療分期日)的腫瘤重量中位數(shù)來(lái)測(cè)量腫瘤變化。這些值用于T/C計(jì)算百分比如下％T/C＝(ΔT/ΔC)×100其中ΔT＞0或者＝(ΔT/TI)×100其中ΔT＜0(1)TI是在治療開(kāi)始時(shí)的腫瘤重量中位數(shù)。在治療的第一期結(jié)束時(shí)得到的最佳(最小)值用于定量抗腫瘤活性。
3.腫瘤生長(zhǎng)延遲這是由百分?jǐn)?shù)來(lái)表示的，治療組的腫瘤重量在達(dá)到預(yù)期的倍增值時(shí)所需要延遲的時(shí)間；(從其分期日(staging day)時(shí)的重量)用下列公式與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比[(T-C)/C]×100(2)其中T和C是分別是治療組和對(duì)照的腫瘤生長(zhǎng)到特定大小(除了無(wú)腫瘤鼠和DRDs)所需的時(shí)間中位數(shù)(天數(shù))。由于單獨(dú)基于(T-C)的生長(zhǎng)延遲與腫瘤生長(zhǎng)速度差異高度相關(guān)變化，生長(zhǎng)延遲是以對(duì)照組的百分比來(lái)表達(dá)并考慮腫瘤生長(zhǎng)速度。
4.凈細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)(Net log細(xì)胞殺滅)在治療末期殺滅的細(xì)胞單位的log10對(duì)數(shù)，計(jì)算如下{[(T-C)-治療持續(xù)時(shí)間]×0.301/中位倍增時(shí)間}(3)其中“倍增時(shí)間”是對(duì)于腫瘤大小從200增加到400mg所需要的時(shí)間。
0.301是log102的值，并且T和C是受治療和對(duì)照組達(dá)到特定次數(shù)的倍增所需的時(shí)間(天數(shù))中位數(shù)。如果治療持續(xù)時(shí)間是0，那么可以從這些式中看出，對(duì)于凈細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)和生長(zhǎng)延遲百分比，細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)與生長(zhǎng)延遲百分比成比例。細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)是0，表示在治療末期細(xì)胞的數(shù)量與在治療初期是相同的。細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)為+6表示細(xì)胞數(shù)量的99.9999％的減少。
5.腫瘤消退作為臨床相關(guān)的終點(diǎn)，腫瘤消退在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的重要性已經(jīng)被很多研究者提出(前述Martin等人，1984，1986；前述Stolfi等人)。腫瘤部分消退定義為腫瘤重量減少到治療初期腫瘤重量的50％或更少而且沒(méi)有降低到63mg(5×5mm腫瘤)以下。腫瘤完全消退(CRs)和無(wú)腫瘤存活者都由以下情況定義，即腫瘤灶在實(shí)驗(yàn)期間降到可測(cè)極限(＜63mg)以下。這兩個(gè)參數(shù)的區(qū)分是依靠在最后觀察日以前對(duì)腫瘤再生(在腫瘤消退動(dòng)物中)或無(wú)再生(＝無(wú)腫瘤)情況的觀察結(jié)果。雖然人們能夠測(cè)量更小的腫瘤，但測(cè)量小于4×4mm或5×5mm(相應(yīng)重量分別為32和63mg)以下的s.c.腫瘤的精確性問(wèn)題，仍受到質(zhì)疑。同時(shí)，一旦相對(duì)大的腫瘤已經(jīng)消退到63mg，剩余物的成分可以僅是纖維物質(zhì)/疤痕組織。在治療停止后對(duì)腫瘤再生的測(cè)量為腫瘤細(xì)胞是否在治療中存活下來(lái)提供了一個(gè)更可靠的指示。
大多數(shù)s.c.接種的移植瘤可以作為晚期階段的模型加以使用，雖然對(duì)于一些腫瘤，由于腫瘤壞死作用，使得研究時(shí)間受到限制。如前所述，此模型能夠進(jìn)行臨床相關(guān)參數(shù)測(cè)量并且提供測(cè)試藥劑對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)作用的有價(jià)值的數(shù)據(jù)。而且，通過(guò)分期日(staging day)，研究者確信，血管生成已經(jīng)在腫瘤區(qū)域中發(fā)生，并且分期(staging)能夠使“移植失敗者”從實(shí)驗(yàn)中剔除。然而，此模型在消耗時(shí)間和實(shí)驗(yàn)用鼠方面堪稱成本高昂。對(duì)于生長(zhǎng)更慢的腫瘤，在足夠多鼠可以移植腫瘤以前，所需要的傳代時(shí)間可能至少需約4周，并且在腫瘤可以分期之前可能還需要2-3周。為了腫瘤分期，一定要移植比實(shí)際藥物實(shí)驗(yàn)所必需的更多的鼠(多出50-100％)。
早期治療和早期階段皮下異種移植瘤模型這些模型與晚期階段模型相似，但是，由于治療始于腫瘤生長(zhǎng)的更早期階段，有效的腫瘤是那些具有＞90％移植成活率(take-rate)(或＜10％自發(fā)消退率)。此“早期治療模型”定義為治療開(kāi)始于腫瘤可測(cè)量即＜63mg以前的模型?！霸缙陔A段”模型是當(dāng)腫瘤大小在63-200mg時(shí)開(kāi)始治療的模型。使用63mg大小是由于大約30mg的原始移植瘤已經(jīng)表現(xiàn)出一些生長(zhǎng)。毒性參數(shù)與晚期階段模型相同；抗腫瘤活性參數(shù)是相似的。％T/C值是直接由在每個(gè)觀察日的腫瘤重量中位數(shù)計(jì)算的，而不是由腫瘤重量的變化(Δ)來(lái)測(cè)量的，并且生長(zhǎng)延遲是基于對(duì)于腫瘤移植之后達(dá)到例如500或1000mg的特定大小所需要的天數(shù)。記錄無(wú)腫瘤鼠，但是如果用溶媒治療的對(duì)照組包含＞10％的具有類似生長(zhǎng)特征的鼠，可以將其稱為″接種失敗″或自發(fā)消退。″接種失敗″是沒(méi)有變?yōu)榉€(wěn)固并且繼續(xù)生長(zhǎng)的腫瘤。自發(fā)消退(移植失敗)是在生長(zhǎng)期后減小到其最大尺寸的≤50％的腫瘤。腫瘤消退不會(huì)正常記錄，因?yàn)槠洳豢偸窃谠缙陔A段模型中抗腫瘤作用的良好指示。早期治療模型的主要優(yōu)點(diǎn)是使用所有移植鼠的能力，這是要求良好腫瘤移植成活率(take-rate)的原因。實(shí)際上，最適合此模型的腫瘤是更快生長(zhǎng)的腫瘤。
挑戰(zhàn)存活(Challenge Survival)模型在另一種方法中，確定了人類腫瘤生長(zhǎng)對(duì)宿主生命期的影響。在最后觀察日之前所有垂死鼠或由于瀕死狀態(tài)或廣泛腹水致死的鼠用于計(jì)算治療(T)和對(duì)照(C)組的死亡日中位數(shù)。然后將這些值用于計(jì)算生命期(″ILS″)增加百分比，如下％ILS＝[(T-C/C)]×100(4)如果可能，包括滴定組以確定腫瘤倍增時(shí)間，用于計(jì)算log10細(xì)胞殺滅值。在視覺(jué)觀察和/或驗(yàn)尸結(jié)果的基礎(chǔ)上，死亡(或犧牲)可以認(rèn)為是藥物相關(guān)的。否則，如果死亡日先于對(duì)照組(-2SD)死亡平均日或者如果動(dòng)物在最后治療的15天內(nèi)無(wú)腫瘤證據(jù)死亡，受治療動(dòng)物死亡被認(rèn)為是治療相關(guān)的。
異種移植瘤模型對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)藥劑的響應(yīng)在獲得對(duì)于晚期階段s.c.異種移植瘤模型的藥物敏感性特征過(guò)程中，以多種劑量水平下i.p.給藥來(lái)評(píng)估測(cè)試藥劑?；钚栽u(píng)估是基于按照給定治療方案以每種藥物的最大耐受劑量(＜LD20)下得到最佳效果，該方案的選擇基于給定腫瘤的倍增時(shí)間，生長(zhǎng)慢的腫瘤治療間隔要長(zhǎng)。
如同前述Plowman，J.等人所述，通過(guò)至少2種并且多達(dá)10種臨床藥物在黑素瘤組中產(chǎn)生了至少最小抗腫瘤效果(％T/C≤40)。響應(yīng)次數(shù)表現(xiàn)出獨(dú)立于倍增時(shí)間和組織學(xué)類型，并具有在對(duì)于腫瘤(同樣在其它腫瘤類型的每一副表中見(jiàn)到)觀察到的響應(yīng)次數(shù)中的范圍。當(dāng)按照臨床上更相關(guān)的終點(diǎn)即腫瘤部分或完全消退來(lái)考察響應(yīng)時(shí)，這些腫瘤模型(包括所有腫瘤)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)藥物治療是非常難控制的；在所有48個(gè)腫瘤中的30個(gè)(62.5％)中，腫瘤沒(méi)有響應(yīng)任何實(shí)驗(yàn)藥物。
對(duì)于化合物的體內(nèi)初步評(píng)估的方法體外初步篩選提供了選擇用于后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的最合適腫瘤系的基礎(chǔ)，并且每一種化合物僅對(duì)體外實(shí)驗(yàn)中藥劑敏感性最高的細(xì)胞系產(chǎn)生的異種移植瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的早期方法著重于對(duì)晚期腫瘤階段的動(dòng)物的治療。
在對(duì)于在此指導(dǎo)劑量選擇可用的具體信息的基礎(chǔ)上，選擇比典型實(shí)驗(yàn)藥劑所用的低得多的劑量。單只鼠優(yōu)選采用1pg/kg至1mg/kg劑量ip推注，并且觀察其14天?？梢杂斜匾剡M(jìn)行連續(xù)3劑量研究，直到建立非致死劑量范圍。然后優(yōu)選地利用三個(gè)s.c.異種移植瘤模型評(píng)估受試藥劑，這些移植瘤模型是體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)該藥劑最敏感的并且是適用于早期階段模型的。化合物按照基于(有一些例外)腫瘤的質(zhì)量倍增時(shí)間的計(jì)劃通過(guò)ip給藥，如果必要可為懸浮液。例如，對(duì)于1.3-2.5，2.6-5.9和6-10天的倍增時(shí)間，優(yōu)選的計(jì)劃是每天5次治療(qd×5)，每4天3次治療(q4d×3)，每7天3次治療(q7d×3)。對(duì)于大部分腫瘤，每次治療之間的間隔接近于腫瘤的倍增時(shí)間，并且治療期充許0.5-1.0log10單位的對(duì)照腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)于分期在100-200mg的腫瘤，在治療末期的對(duì)照組的腫瘤大小應(yīng)在500-2000mg的范圍內(nèi)，使得治療后在由于腫瘤大小必須損失鼠之前有足夠的時(shí)間來(lái)評(píng)估其效果。
詳細(xì)藥物研究在初步評(píng)估中一旦認(rèn)定化合物表現(xiàn)出體內(nèi)的效果，就要設(shè)計(jì)更詳細(xì)的研究計(jì)劃并在人類腫瘤異種移植瘤模型中實(shí)施，以進(jìn)一步探討化合物的治療潛力。通過(guò)變化腫瘤細(xì)胞和宿主用藥的濃度和作用時(shí)間，有可能發(fā)明和推薦為最優(yōu)化抗腫瘤活性而設(shè)計(jì)的治療方法。
用氨基-20M-喜樹(shù)堿得到的數(shù)據(jù)很好地說(shuō)明了“濃度×?xí)r間”對(duì)于實(shí)驗(yàn)藥劑的抗腫瘤作用的重要性(前述Plowman，J.等人，1997)。這些結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間維持臨界值以上的血漿藥物濃度對(duì)于獲得最佳治療效果是必需的。
異種移植瘤轉(zhuǎn)移模型也使用例如由Crowley，C.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 5021-5025(1993)描述的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型，實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的化合物對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移的抑制效果。晚期轉(zhuǎn)移包括腫瘤細(xì)胞的附著和滲出、局部侵入、接種、增殖和血管生成。將轉(zhuǎn)染了指示基因如優(yōu)選的綠色熒光蛋白(GFP)基因，或編碼氯霉素乙酰基-轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶或LacZ基因的人類黑素瘤細(xì)胞，接種到裸鼠體內(nèi)。這使得可以利用這些標(biāo)記(GFP的熒光檢測(cè)或酶的組織化學(xué)比色檢測(cè))來(lái)示蹤這些細(xì)胞的活動(dòng)。優(yōu)選以iv(靜脈內(nèi))方式注入細(xì)胞，并在約14天后確認(rèn)轉(zhuǎn)移，特別是在肺中以及在局部淋巴結(jié)節(jié)、股骨和腦中。這模擬了人類黑素瘤在自然條件下轉(zhuǎn)移的器官傾向性。例如，將表達(dá)GFP的黑素瘤細(xì)胞(106細(xì)胞每鼠)i.v.注射到裸鼠的尾部靜脈中。用實(shí)驗(yàn)成分以100μg/動(dòng)物/天的劑量并且通過(guò)q.d.IP給藥來(lái)治療動(dòng)物。用熒光顯微鏡檢術(shù)或光學(xué)顯微組織化學(xué)法或通過(guò)研磨組織和可測(cè)標(biāo)記物的定量比色分析法，觀察和定量單個(gè)轉(zhuǎn)移細(xì)胞及其所在病灶。
對(duì)代表性的鼠進(jìn)行的組織病理學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)研究進(jìn)一步證明在全部主要器官中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞集落的數(shù)量和大小(最大直徑)可以通過(guò)數(shù)字圖象分析列出，例如由Fu，Y.S.等人，Anat.Quant.Cytol.Histol.11187-195(1989)描述的。
對(duì)于集落的確定，將肺、肝、脾、主動(dòng)脈旁淋巴節(jié)、腎、腎上腺和s.c.組織的外植體清洗，切成1-2mm3的小塊，并且將這些組織塊在Tekman組織搗具中研磨5分鐘。將研磨物通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，在分離介質(zhì)中(例如，加入10％FCS，200U/ml I型膠原酶和100ug/ml I型DNase的MEM)以37℃輕輕振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后，將得到細(xì)胞懸液清洗并且在常規(guī)介質(zhì)(例如含有選定的抗生素(G-418或潮霉素)以及10％FCS的MEM)中再懸浮。培養(yǎng)(fed)外植體，并且在用乙醇固定以及用適當(dāng)?shù)呐潴w例如腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的單克隆抗體染色之后確定腫瘤細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)的數(shù)量。在80cm2區(qū)域中計(jì)數(shù)集落的數(shù)量。如果需要，可以進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，其中克隆生長(zhǎng)物不要固定和染色，而是以克隆環(huán)新鮮地回收并在一些分裂(divisions)之后聚集，以便用其它測(cè)量方法，如膠原酶的分泌(通過(guò)底物凝膠電泳)和Matrigel膠侵入法。
盡管有可能使用其他人描述的實(shí)驗(yàn)(Hendrix，M.J.C.等人，Cancer Lett.，38137-147(1987)；Albini，A.等人，Cancer Res.，47 3239-3245(1987)；Melchior，A.，CancerRes.522353-2356(1992))，但在此描述了Matrigel膠侵入實(shí)驗(yàn)法。
所有的實(shí)驗(yàn)按組來(lái)實(shí)施，每組優(yōu)選含有10只鼠。用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)分析結(jié)果。
依照腫瘤的情況，在s.c.肋腹注射相等數(shù)量腫瘤細(xì)胞之后1周，i.v.注射0.2-10×105腫瘤細(xì)胞，然后再過(guò)5周時(shí)間產(chǎn)生一定比例的血原性的自發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤和便于評(píng)估的全面肺腫瘤灶。該模型可以從脾、肝、腎、腎上腺、主動(dòng)脈旁淋巴節(jié)和s.c.部位獲得特別多的肺外轉(zhuǎn)移克隆，其中大部分可能是原發(fā)性腫瘤的自發(fā)轉(zhuǎn)移的代表。
治療步驟實(shí)驗(yàn)成分的劑量按照上述使用相關(guān)癌癥的腫瘤動(dòng)物模型來(lái)確定。將含有本發(fā)明的藥物組合物給藥。治療的組成是將.001、1、100和1000ng化合物溶于200ml生理鹽水中在一小時(shí)內(nèi)靜脈注射到受試者體內(nèi)。每周三次，共治療12次。穩(wěn)定或疾病消退的病人給予超過(guò)12次的治療?；谛枰o予門(mén)診病人或住院病人治療。
病人評(píng)估在治療期內(nèi)和其后30天中每周做一次腫瘤對(duì)于治療的響應(yīng)的評(píng)估。根據(jù)治療的響應(yīng)、副作用、病人健康情況，可以中止或延長(zhǎng)基于上述標(biāo)準(zhǔn)程序的治療。腫瘤響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)是由International Union Against Cancer建立的，并且列出如下。

在病人群中治療的效果是用傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估的，舉例來(lái)說(shuō)，包括卡方檢驗(yàn)或Fisher精確性檢驗(yàn)?？梢元?dú)立評(píng)估在測(cè)量中長(zhǎng)期變化和短期變化。
結(jié)果治療155個(gè)病人。結(jié)果總結(jié)如下。在80％以上的病人中觀察到陽(yáng)性腫瘤反應(yīng)(至少部分緩解)的情況如下響應(yīng) ％PR66％＜PR 20％PR+＜PR 86％毒性副作用發(fā)生率是在治療總數(shù)的10％和小于1％之間，其在臨床上是不重要的。
對(duì)于依照本發(fā)明有用的GA衍生物化合物，其應(yīng)該在這里描述的體外生物化學(xué)或分子實(shí)驗(yàn)中的至少一個(gè)中表現(xiàn)出在飛摩爾水平的活性，并且也具有有效的體內(nèi)抗腫瘤活性。
現(xiàn)在已經(jīng)總體上描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下述實(shí)施例會(huì)更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是以例證的形式提供的，并且不是用于限制本發(fā)明，除非有說(shuō)明。
實(shí)施例1-19格爾德霉素及衍生物的合成和/或特性描述一般方法。熔點(diǎn)未經(jīng)修改。在Matton Galaxy Series FTIR 3000分光光度計(jì)上記錄紅外光譜。在Hitachi U-4001分光光度計(jì)上記錄紫外可見(jiàn)光譜。在Varian Inova-600，UnityPlus-500，VRX-500或VRX-300分光計(jì)上記錄1H和13CNMR光譜。在所有歸屬(assignments)中所用的編號(hào)方式是基于GA環(huán)系統(tǒng)(Sasaki，K等人，J.Ain.Clzem.Soc.927591(1970))，除非另外說(shuō)明)。質(zhì)譜是由MSU質(zhì)譜分光儀(Mass Spectrometry Facility)完成的。GA和macbecinII是由National Cancer Institutes提供的。Macbecin I是通過(guò)公開(kāi)的步驟由macbecin II合成的(Muroi，M等人，1980)。根赤殼菌素是在商業(yè)上可獲得的(Sigma-Aldrich)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化無(wú)水溶劑。
實(shí)施例1(+)-格爾德霉素(1)IR(CH2Cl2)(cm-1)3535，3421，3364，3060，2989，2968，1733，1690，1650，1603，1500，1367，1284，1262，1193，1135，1098，1054；1H NMR(CDCl3，500MHz，用COSY進(jìn)行歸屬)δ8.69(s，IH)(22-NH)，7.27(s，1H)(19-H)，6.92(bd，J＝11.5Hz，1H)(3-H)，6.55(ddd，J＝11.5，11.0，1.0Hz，1H)(4-H)，5.86(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)(5-H)，5.80(bd，J＝9.5Hz，1H)(9-H)，5.17(s，1H)(7-H)，4.77(bs，2H)(7-O2CNH2)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)(6-H)，4.10(s，3H)(17-OCH3)，3.51(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)(H-H)，3.37(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)(12-H)，3.34(s，3H)(6-或12-OCH3)，3.27(s，3H)(6-或12-OCH3)，3.03(bd，J＝6.5Hz，IH)(11-OH)，2.76(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)(10-H)，2.50-2.39(m，2H)(15-H和H1)，2.00(bs，3H)(2-CH3)，1.81-1.70(m，2H)(13-H和H1)，1.77(d，J＝1.0Hz，3H)(8-CH3)，1.68-1.60(m，1H)(14-H)，0.97-0.93(m，6H)(10-和14-CH3)；(Sasaki等人，1970，上述；Organic Synthesis，Cumulative Volume 4，433，″Ethyleneimine″)。13C NMR(CDCl3，125MHz，用DEPT進(jìn)行質(zhì)子化碳的歸屬)δ185.0(18-C)，184.1(21-C)，168.2(1-C)，157.0(17-C)，155.9(7-O2CNH2)，138.1(20-C)，136.4(5-C)，134.8(2-C)，133.3(8-C)，133.1(9-C)，127.6(16-C)，127.2(3-C)，126.3(4-C)，111.7(19-C)，81.7(7-C)，81.3(12-C)，81.0(6-C)，72.7(H-C)，61.7(17-OCH3)，57.3(6-or12-OCH3)，56.7(6-or12-OCH3)，34.7(13-C)，32.7(15-C)，32.2(10-C)，27.9(14-C)，22.9(14-CH3)，12.8(8-CH3)，12.5(2-CH3)，12.4(10-CH3).(對(duì)于GA的13C NMR，見(jiàn)Johnson，RD等人，J.Am.Chem.Soc.963316(1974)；Johnson，RD等人，J.Am.Chem.Soc.993541(1977))。.
實(shí)施例217-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(4)(Schnur，RC等人，1995a，1995b)將(+)-格爾德霉素(5.1mg，9.0mol)與烯丙基胺(10.0μl，0.13mmol)在氯仿(1.5ml)中在室溫下攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(18小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用鹽水洗混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(5.3mg，99％)。IR(KBr)(cm-1)3464，3333，2958，2929，2825，1728，1691，1652，1571，1485，1372，1323，1189，1101，1057；UV(95％EtOH)(nm)332(ε＝2.0×104)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.14(s，1H)，7.28(s，1H)，6.93(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.56(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.38(bt，J＝6.0Hz，1H)，5.94-5.81(m，3H)，5.30-5.24(m，2H)，5.17(s，1H)，4.82(bs，2H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.21(bs，1H)，4.18-4.08(m，2H)，3.55(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)，3.43(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.25(s，3H)，2.72(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.63(d，J＝14.0Hz，1H)，2.34(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.00(bs，3H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.78-1.74(m，2H)，1.74-1.67(m，1H)，0.99-0.95(m，6H)；13C NMR(CDCl3，125MHz，用DEPT進(jìn)行質(zhì)子化碳的歸屬)δ183.8(18-C)，180.9(21-C)，168.4(1-C)，156.0(7-O2CNH2)，144.6(17-C)，141.2(20-C)，135.8(5-C)，134.9(2-C)，133.7(9-C)，132.7(8-C)，132.5(3′-C)，126.9(4-C)，126.5(3-C)，118.5(31-C)，108.8(19-C)，108.7(16-C)，81.6(7-C)，81.4(12-C)，81.2(6-C)，72.6(H-C)，57.1(6-或12-OCH3)，56.7(6-或12-OCH3)，47.8(1′-C)，35.0(13-C)，34.3(15-C)，32.3(10-C)，28.4(14-C)，22.9(14-CH3)，12.8(8-CH3)，12.6(2-CH3)，12.3(10-CH3)；HRMS(FAB)found 586.3120[M+H]+，calcd.586.3129(C31H44N3O8)。
(4)的氫醌形式17-烯丙氨基-17-去甲氧基-18，21-二氫格爾德霉素。(DHAAG).
17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(3.2mg，5.5μmol)溶解在乙酸乙酯(3.0ml)中，然后加入連二亞硫酸鈉鹽(～85％，0.50g，2.4mmol)的水性溶液(2.5ml)。在室溫下攪拌此混合物2小時(shí)。在氮保護(hù)下，分離淺黃色有機(jī)層，用鹽水洗，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮，得到深黃色固體(3.0mg，93％)。1H NMR(用D2O-Na2S2O4交換可交換的氫，然后在CDCl3中進(jìn)行，500MHz)δ7.66(bs，1H)，6.87(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.39(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.04-5.96(ddt，J＝16.0，10.0，5.5Hz，1H)，5.77(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.68(bdd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.29(bd，J＝16.0Hz，1H)，5.13(bd，J＝10.0Hz，1H)，5.01(s，1H)，4.30(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.56(bdd，J＝9.0，2.0Hz，1H)，3.47(bd，J＝5.5Hz，2H)，3.37-3.32(m，1H)，3.32(s，3H)，3.23(s，3H)，2.80-2.71(m，1H)，2.61-2.51(m，1H)，1.90(bs，1H)，1.79-1.72(m，7H)，1.66-1.61(m，1H)，0.96(d，J＝6.5Hz，3H)，0.85(d，J＝7.0Hz，3H)。
實(shí)施例317-(2-二甲氨基乙烷基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(5)(Egorin，MJ等人，2002)。將N，N-二甲乙烯基二胺(6.0RI，0.055mmol)加入到在氯仿(1.0ml)中的(+)-格爾德霉素(4.3mg，7.7μmol)溶液。在室溫下攪拌混合物?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(4小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用0.5％水性氫氧化鈉溶液和鹽水洗混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯/甲醇)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(4.5mg，95％)。IR(KBr)(caf)3462，3329，2932，2871，2824，2774，1733，1690，1653，1565，1485，1373，1321，1253，1188，1100，1055；UV(95％EtOH)(nm)332(ε＝1.7×104)；1HNMR(CDCl3，500MHz)89.18(s，1H)，7.24(s，1H)，7.04(bt，J＝5.0Hz，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.57(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.90(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.84(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.17(s，1H)，4.75(bs，2H)，4.42(bs，1H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.70-3.42(m，3H)，3.57(bdd，J＝9.0，6.5Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.25(s，3H)，2.72(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.67(d，J＝14.0Hz，1H)，2.55(t，J＝5.5Hz，2H)，2.38(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.25(s，6H)，2.01(bs，3H)，1.83-1.68(m，3H)，1.78(bs，3H)，0.98(d，J＝7.0Hz，3H)，0.95(d，J＝6.5Hz，3H)；MS(FAB)found 617[M+H]+。
實(shí)施例417-氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(6)(Schnur等人，1995b；Li，LH等人，1977；Sasaki，K等人，1979).將濃縮的氨水(28％，0.70ml，0.010mol)水性溶液在室溫下加入到在乙腈(5.0ml)中的(+)-格爾德霉素(5.0mg，9.0μmol)溶液。黃色溶液緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(5小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，在乙酸乙酯和鹽水之間分離此混合物。用鹽水洗有機(jī)相，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離固體殘基得到暗紅色固體產(chǎn)物(4.6mg，95％)。IR(KBr)(cm-1)3452，3339，2957，2931，2825，1721，1692，1617，1591，1495，1374，1323，1250，1190，1133，1101，1055；UV(95％EtOH)(nm)328(s＝2.0×104)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.08(s，1H)，7.26(s，1H)，6.95(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.56(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.89-5.82(m，2H)，5.37(bs，2H)，5.17(s，1H)，4.73(bs，2H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.98(bs，1H)，3.59(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)，3.42(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.25(s，3H)，2.75(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.65(d，J＝14.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.97-1.75(m，4H)，1.79(d，J＝1.0Hz，3H)，0.99-0.97(m，6H)；13C NMR(CDCDCl3，125MHz)δ183.1，180.4，167.9，156.1，146.0，140.4，135.8，135.0，134.0，133.0，126.9，126.6，110.3，108.6，81.9，81.2，81.1，72.2，57.1，56.8，35.0，34.7，32.2，28.7，23.8，12.8，12.5，12.2；HRMS(FAB)found 546.2818[M+H]+，calcd.546.2816(C28H40N3O8)。
實(shí)施例517-(2-氯乙基)氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(7)(Sasaki等人，前述)。將氫氧化鈉水性溶液(2.80M，0.75ml，2.1mmol)加入到在乙腈(3.0ml)中(+)-格爾德霉素(11.7mg，0.021mmol)和2-氯乙基胺氫氯化物(242mg，2.1mmol)的混合物中。在室溫下攪拌混合物?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(20小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，在乙酸乙酯和鹽水之間分離此混合物。用鹽水洗有機(jī)相，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(12.0mg，95％)。IR(KBr)(cm-1)3334，2938，2874，2822，1733，1696，1653，1577，1489，1375，1325，1274，1190，1136，1101，1060；UV(95％EtOH)(nm)332(ε＝1.9×104)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.09(s，1H)，7.29(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.56(ddd，J＝11.5，11.0，1.0Hz，1H)，6.35(U，J＝5.0Hz，1H)，5.87(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.85(bdd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.18(s，1H)，4.72(bs，2H)，4.30(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.03(bs，1H)，3.94-3.83(m，2H)，3.75-3.67(m，2H)，3.56(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)，3.43(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.26(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.70(d，J＝14.0Hz，1H)，2.24(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.80-1.75(m，2H)，1.75-1.68(m，1H)，1.00-0.96(m，6H)；13C NMR(CDCl3，125MHz)8183.8，181.2，168.3，155.9，144.7，140.8，135.9，135.0，133.6，132.9，127.0，126.5，110.0，109.1，81.6，81.4，81.2，72.7，57.1，56.7，46.9，42.7，35.1，34.4，32.4，28.8，23.0，12.8，12.6，12.5；MS(FAB)found608[M+H]+。
實(shí)施例617-(2-氟代乙基)氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(8)(Schnur等人，1995b)。將氫氧化鈉水性溶液(1.10M，0.53ml，0.58mmol)加入到在乙腈(1.0ml)中的(+)-格爾德霉素(5.5mg，9.8u.mol)和2-氟代乙基胺氫氯化物(65mg，0.59mmol)的混合物中。在室溫下攪拌混合物?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(12小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，在乙酸乙酯和鹽水之間分離此混合物。用鹽水洗有機(jī)相，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(5.7mg，98％)。IR(KBr)(cm-1)3465，3330，2954，2927，2873，1728，1691，1653，1576，1487，1375，1323，1255，1190，1103，1051；UV(95％EtOH)(nm)332(ε＝1.7×104)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.10(s，1H)，7.29(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.57(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.36(bt，J＝5.0Hz，1H)，5.88-5.83(m，2H)，5.18(s，1H)，4.75(bs，2H)，4.69-4.57(m，2H)，4.30(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.94-3.76(m，2H)，3.56(bd，J＝9.0Hz，1H)，3.43(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.26(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.70(d，J＝14.0Hz，1H)，2.30(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.80-1.76(m，2H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.75-1.68(m，1H)，0.99(d，J＝7.0Hz，3H)，0.97(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，125MHz)δ183.8，181.2，168.4，156.0，144.9，140.9，135.9，135.0，133.6，132.8，127.0，126.5，109.7，109.1，81.6，81.5(d，J＝170Hz)，81.4，81.2，72.6，57.2，56.7，46.0(d，J＝20Hz)，35.1，34.3，32.4，28.8，23.0，12.8，12.6，12.5；HRMS(FAB)found 591.2952[M]+，calcd.591.2956(C30H42FN3O8)。
實(shí)施例717-(2-乙?；被一?氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(9)(Schnur等人，1995b).將N-乙酰基乙烯基二胺(90％，10.0μl，0.094mmol)在室溫下加入到在氯仿(1.0ml)中的(+)-格爾德霉素(5.0mg，8.9mol)溶液中?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(10小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用蒸餾水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(4.5mg，80％)。IR(KBr)(cm-1)3449，3338，2932，2881，2824，1718，1685，1654，1569，1487，1374，1323，1269，1189，1102，1057；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.12(s，1H)，7.23(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.63(bt，J＝5.0Hz，1H)，6.56(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.88(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.84(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.80(bt，J＝6.0Hz，1H)，5.17(s，1H)，4.72(bs，2H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.17(bs，1H)，3.77-3.62(m，2H)，3.58-3.46(m，3H)，3.42(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.25(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.64(d，J＝14.0Hz，1H)，2.33(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(s，3H)，2.00(d，J＝1.0Hz，3H)，1.80-1.76(m，2H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.74-1.67(m，1H)，0.98(d，J＝7.0Hz，3H)，0.95(d，J＝6.5Hz，3H)；HRMS(FAB)found 631.3344[M+H]+，calcd.631.3343(C32H47N4O9)。
實(shí)施例817-(6-乙?；被?1-己基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(10)將在氯仿中(+)-格爾德霉素(5.7mg，0.010mmol)和N-(6-氨基己基)乙酰胺(5.5mg，0.035mmol)的溶液在室溫下攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(20小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用蒸餾水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(5.7mg，82％)。IR(KBr)(cm-1)3445，3323，3202，2931，2865，2824，1723，1687，1653，1562，1486，1371，1322，1256，1188，1135，1106；W(95％EtOH)(nm)333(s＝1.2×104)；1HNMR(CDCl3，500MHz，用COSY進(jìn)行歸屬)δ9.17(bs，1H)，7.26(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.57(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.26(bt，J＝5.0Hz，1H)，5.89(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.85(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.42(bs，1H)，5.18(s，1H)，4.73(bs，2H)，4.31(bs，1H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.59-3.39(m，4H)，3.35(s，3H)，3.27-3.19(m，2H)，3.25(s，3H)，2.74(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.66(d，J＝14.0Hz，1H)，2.39(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.96(s，3H)，1.80-1.75(m，2H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.73-1.62(m，3H)，1.55-1.47(m，2H)，1.46-1.33(m，4H)，0.99(d，J＝7.0Hz，3H)，0.95(d，J＝6.5Hz，3H)；13CNMR(CDCl3，125MHz)δ183.9，180.7，170.0，168.4，156.0，144.9，141.5，135.9，135.0，133.8，132.8，127.0，126.6，108.7，108.4，81.7，81.5，81.2，72.7，57.2，56.7，45.8，39.4，35.1，34.4，32.4，29.7，29.6，28.6，26.5，26.4，23.4，22.9，12.8，12.6，12.4；HRMS(FAB)found 687.3967[M+H]+，calcd.687.3969(C36H55NO9)。
實(shí)施例9(+)-生物素17-(6-氨基己基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素氨化物(11)將1，6-二氨基正己烷(10.0mg，0.086mmol)加入到在氯仿(1.0ml)中的(+)-格爾德霉素(5.0mg，8.9μmol)的溶液在室溫下攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(20小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用0.5％水性氫氧化鈉溶液和鹽水洗此混合物，通過(guò)碳酸鉀干燥，并且濃縮。然后將產(chǎn)生的暗紫色固體和(+)-生物素N-氫氧基琥珀酰亞胺酯(3.0mg，8.8μmol)在DMF(1.0ml)中通宵攪拌。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯)上快速柱層析法去除溶劑和分離得到紫色固體產(chǎn)物(6.5mg，85％)。IR(KBr)(cm-1)3327，2931，2864，1709，1651，1562，1485，1371，1325，1255，1099，731；′H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.19(s，1H)，7.24(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.56(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.28(bt，J＝5.0Hz，1H)，5.87(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.84(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.88-5.77(m，2H)，5.17(s，1H)，5.15(bs，1H)，4.87(bs，2H)，4.50(dd，J＝7.5，5.0Hz，1H)，4.32-4.29(m，2H)，4.23(bs，1H)，3.58-3.41(m，4H)，3.34(s，3H)，3.26(s，3H)，3.24-3.20(m，2H)，3.17-3.12(m，1H)，2.91(dd，J＝13.0，5.0Hz，1H)，2.75-2.69(m，2H)，2.66(d，J＝14.0Hz，1H)，2.38(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.21-2.15(m，2H)，2.01(bs，3H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.78-1.32(m，17H)，0.98(d，J＝7.0Hz，3H)，0.95(d，J＝6.5Hz，3H)；[14]HRMS(FAB)found 871.4619[M+H]+，calcd.871.4592(C44H67N6O10S)。
實(shí)施例1017-[2-[2-(2-乙?；被已趸?乙氧基]乙基]氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(12)將2，2′-(乙烯基二氧)二(乙基胺)(56.0μl，0.38mmol)，乙酸酐(46.0μl，0.48mmol)和三乙基胺(73.2μl，0.52mmol)在氯仿(1.0ml)中在室溫下攪拌1小時(shí)，然后濃縮并在高度真空下干燥。其后，將無(wú)色固體殘基與(+)-格爾德霉素(4.0mg，7.1μmol)在氯仿(1.0ml)中攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(20小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用蒸餾水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯/甲醇)上快速柱層析法分離得到所需要的紫色固體產(chǎn)物(1.1mg，21％)。IR(KBr)(cm-1)3446，3336，2960，2929，2877，1727，1689，1655，1566，1487，1375，1325，1261，1190，1103，1057；′H NMR(CDCl3，300MHz)δ9.17(s，1H)，7.25(s，1H)，6.94(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.78(bt，J＝5.0Hz，1H)，6.57(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.36(bs，1H)，5.89(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.85(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.18(s，1H)，4.74(bs，2H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.26(bs，1H)，3.78-3.40(m，14H)，3.35(s，3H)，3.25(s，3H)，2.78-2.64(m，2H)，2.39(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.98(s，3H)，1.78-1.67(m，3H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，0.99-0.94(m，6H)；HRMS(FAB)found 719.3864[M+H]+，calcd.719.3867(C36H55N4O11)。
實(shí)施例1117-羧甲基氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(13)將(+)-格爾德霉素(3.1mg，5.5μmol)和甘氨酸鈉鹽(10.7mg，0.11mmol)在乙醇(1.2ml)和水(0.3ml)的混合物中在室溫下攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(3小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用稀釋的鹽酸酸化紫色混合物并且在氯仿和蒸餾水之間將其分離。通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥此有機(jī)相，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(乙酸乙酯/甲醇))上快速柱層析法分離得到紫色固體產(chǎn)物(3.2mg，96％)。IR(KBr)(cm-1)3446，3305，2929，2875，1734，1693，1655，1618，1574，1485，1394，1319，1267，1139，1072；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ8.91(s，1H)，7.25(s，1H)，6.83(bs，1H)，6.80(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.60(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.86-5.80(m，2H)，5.16(s，1H)，4.95(bs，2H)，4.33-4.21(m，2H)，4.27(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.54(dd，J＝9.0，2.0Hz，1H)，3.42(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.33(s，3H)，3.25(s，3H)，2.70(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.59(d，J＝14.0Hz，1H)，2.27(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.07(bs，3H)，1.80-1.75(m，2H)，1.62-1.54(m，1H)，1.77(bs，3H)，0.98(d，J＝7.0Hz，3H)，0.91(d，J＝6.5Hz，3H)；HRMS(FAB)found604.2867[M+H]+，calcd.604.2870(C30H42N3O10)。
實(shí)施例1217-(1-氮雜環(huán)丁烷基)-17-去甲氧基格爾德霉素(14)(Schnur，RC等人，1994)。將氮雜環(huán)丁烷(4.0，μl，0.059mmol)加入到a溶液of(+)-格爾德霉素(7.5mg，0.013mmol)溶液在二氯甲烷(1.5ml)中攪拌?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(40分鐘)顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用鹽水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到深紫色固體產(chǎn)物(7.7mg，98％)。IR(in CH2Cl2)(cm-1)3422，3075，3049，2986，1733，1686，1651，1605，1540，1486，1420，1375，1283，1260，1103，1047；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.16(s，1H)，7.10(s，1H)，6.92(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.56(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.92(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.82(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.15(s，1H)，4.79(bs，2H)，4.72-4.58(m，4H)，4.28(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.54(bd，J＝9.0Hz，1H)，3.43(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.24(s，3H)，2.71(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.59(d，J＝14.0Hz，1H)，2.42(五重峰，J＝8.0Hz，2H)，2.23(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.00(bs，3H)，1.78(bs，3H)，1.77-1.73(m，2H)，1.69-1.62(m，1H)，0.97(d，J＝7.0Hz，3H)，0.94(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，125MHz，用DEPT和HMQC進(jìn)行質(zhì)子化碳的歸屬)δ185.8(18-C)，178.4(21-C)，168.4(1-C)，156.0(7-O2CNH2)，145.9(17-C)，140.5(20-C)，135.5(5-C)，135.1(2-C)，134.0(9-C)，132.6(8-C)，126.7(4-C)，126.6(3-C)，109.6(19-C)，109.2(16-C)，81.8(7-C)，81.6(12-C)，81.3(6-C)，72.5(11-C)，58.9(11-和31-C)，57.1(6-或12-OCH3)，56.7(6-或12-OCH3)，35.1(13-C)，34.1(15-C)，32.3(10-C)，28.1(14-C)，22.9(14-CH3)，18.4(21-C)，12.7(8-CH3)，12.6(2-CH3)，12.2(10-CH3)；MS(FAB)found 586[M+H]+。
實(shí)施例1317-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(15)將氮丙啶氮丙啶(Allen，CFH等人，1963)(0.30ml，5.80mmol)在二氯甲烷(2.0ml)中加入到(+)-格爾德霉素(5.8mg，0.010mmol)溶液。在室溫下攪拌混合物?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(25分鐘)顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用鹽水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到橙色固體產(chǎn)物(5.6mg，95％)。IR(KBr)(cm-1)3438，3338，3192，2925，2827，1736，1701，1687，1644，1585，1517，1457，1367，1272，1192，1112；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ.8.77(s，1H)(22-NH)，7.27(s，1H)(19-H)，6.91(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.55(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.86-5.80(m，2H)，5.17(s，1H)，4.80(bs，2H)，4.30(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.52(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)，3.42-3.37(m，2H)，3.34(s，3H)，3.27(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.57(d，J＝14.0Hz，1H)，2.50(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.44-2.33(m，4H)，2.00(bs，3H)，1.80-1.76(m，2H)，1.77(bs，3H)，1.75-1.69(m，1H)，0.99-0.96(m，6H)；13NMR20(CDCl3，，125MHz，用DEPT進(jìn)行質(zhì)子化碳的歸屬)δ183.8(18-C)，183.2(21-C)，168.3(1-C)，156.0(7-O2CN2z)，152.7(17-C)，138.8(20-C)，136.1(5-C)，134.9(2-C)，133.3(9-C)，133.1(8-C)，127.0(4-C)，126.4(3-C)，125.4(16-C)，111.6(19-C)，81.6(7-C)，81.1(12-C)，81.1(6-C)，72.7(11-C)，57.2(6-或12-OCH3)，56.7(6-或12-OCH3)，35.1(13-C)，33.6(15-C)，32.3(10-C)，29.2(17-NCH2)，28.9(14-C)，23.3(14-CH3)，12.9(8-CH3)，12.5(2-CH3)，12.4(10-CH3)；HRMS(FAB)found 572.2968[M+H]+，calcd.572.2926(C30H42N3O8)。
實(shí)施例145′-溴代geldanoxazinone(16)3-溴代-4-硝基苯酚和3-溴代-6-硝基苯酚.將在12ml冰醋酸中的3.8ml發(fā)煙硝酸(89mmole)經(jīng)過(guò)35分鐘加入到在冰浴的燒瓶中，該燒瓶中有60ml冰醋酸，其含有15.2克(87.9mmole)3-溴代苯酚溶液。將反應(yīng)物在室溫下攪拌30分鐘，然后將反應(yīng)物倒在冰上。然后將其在真空中濃縮，在硅膠(1∶2乙酸乙酯∶正己烷作為洗脫液)上用中壓層析法使得分離出產(chǎn)物3-溴代-4-硝基苯酚(3.47克，15.9mmole，18％收率)；從醚/己烷中重結(jié)晶得到m.p.130-131℃(報(bào)導(dǎo)值為m.p.130-131℃(Wright，C等人，1987)以及131℃(Hodgson，HH等人，1926)；1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ7.99(d，1H，J＝9Hz)，7.18(d，1H，J＝3Hz)，6.91(dd，1H，J＝9，3Hz，)；以及3-溴代-6-硝基苯酚(1.94克，8.90mmole，10％收率，從醚/己烷中重結(jié)晶；m.p.41.5-42.5℃(報(bào)導(dǎo)值為m.p.42-45℃(Hanzlik，RP等人，1990)和42℃(Hodson等人，)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ10.60(s，1H)，7.95(d，1H，J＝9Hz)，7.35(d，1H，J＝2Hz)，7.11(dd，1H，J＝9，2Hz，)；13C NMR(CDCl3；用HMQC進(jìn)行歸屬)δ122.9(C-2)，123.8(C-4)，126.0(C-5)，132.2(C-3)，132.7(C-6)，155.2(C-1)；IR(KBr)3450(寬)，1612，1578，1527，1475，1311，1235，1186，900cm-1).
2-氨基-5-溴代苯酚。將3-溴代-6-硝基苯酚(0.292克，1.34mmole)在0.5％水性氫氧化鈉溶液(30mL)中攪拌。將亞硫酸氫鈉(2.00克，85％，9.76mmole)加入到反應(yīng)燒瓶中，并且在室溫下攪拌15分鐘。然后用稀釋的鹽酸酸化反應(yīng)燒瓶直到pH達(dá)到5。其后，用40mL二乙基醚萃取三次，將組合有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮，產(chǎn)生粗2-氨基-5-溴代苯酚(0.533克，m.p.99.5-100.5℃)，其從乙醚/正己烷中重結(jié)晶，產(chǎn)生純的產(chǎn)物(0.151克，0.80mmole，60％產(chǎn)量；m.p.125-127℃(分解)(報(bào)導(dǎo)值為m.p.149.5-150.5℃(Boyland，E等人，1954)；1H NMR(CD3CN，500MHz)δ7.08(bs，1H)，6.82(d，1H，J＝2Hz)，6.78(dd，1H，J＝8，2Hz)，6.56(d，1H，J＝8Hz)，4.03(bs，2H)；IR(KBr)3496(寬)，3377，3298，1598，1502，1431，1269，1210，916，877cm-1)。
5′-溴代geldanoxazinone(16)(Webb等人，前述；Rinehart，KL等人，1977)。將在冰醋酸(2.0ml)中的(+)-格爾德霉素(21.8mg，0.039mmol)和2-氨基-5-溴代苯酚(14.6mg，0.078mmol)混合物在78℃氮?dú)庀聰嚢?9小時(shí)，然后冷凍和濃縮的。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上的快速層析法分離橙色殘基，得到具有未反應(yīng)的(+)-格爾德霉素污染的粗產(chǎn)品。其然后在氯仿中溶解并進(jìn)行預(yù)備的HPLC分離(Waters Nova-Pak Silica 6μm7.8×300mm column，2.0ml/minCHCl3/EtOAc2∶3)，產(chǎn)生亮橙色粉未產(chǎn)品(16.4mg，60％收率)；mp274-278 ℃(分解)(lit.mp275-278℃)(Rinehart，前述)。IR(KBr)(cm-1)3442，3342，3209，2954，2926，2878，1734，1700，1615，1583，1507，1384，1314，1192，1111，1061(lit.1605，1585，1505)(Rinheart，前述)；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.13(bs，1H)，8.33(s，1H)，7.73(d，J＝8.5Hz，1H)，7.60(d，J＝2.0Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)，7.03(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.60(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.96(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.86(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.21(s，1H)，4.72(bs，2H)，4.35(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.25(bs，1H)，3.64(bdd，J＝9.0，6.5Hz，1H)，3.46(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.37(s，3H)，3.27(s，3H)，2.82-2.71(m，3H)，2.08(bs，3H)，1.98-1.86(m，2H)，1.85-1.77(m，1H)，1.81(d，J＝1.0Hz，3H)，1.01(d，J＝7.0Hz，3H)，0.99(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，125MHz)δ180.7，168.4，156.0，148.5，145.0，143.5，136.8，135.5，135.3，133.9，133.0，132.9，130.9，129.1，126.7，125.2，119.3，117.5，112.9，81.9，81.3，81.2，72.2，57.1，56.8，35.3，33.1，32.2，29.4，27.6，23.3，12.8，12.7，12.1；HRMS(FAB)found 698.2080[M+H]+，calcd.698.2077(C34H41BrN3O8)。
實(shí)施例15
5′-碘代geldanoxazinone(17)3-碘代-4-硝基苯酚和3-碘代-6-硝基苯酚。將在12ml冰醋酸中的3.0ml發(fā)煙硝酸(75mmole)經(jīng)過(guò)25分鐘加入到冰浴的燒瓶中，燒瓶中有60ml冰醋酸，其含有15.03克(68.3mmole)3-碘代苯酚溶液。將反應(yīng)物在室溫下再攪拌30分鐘，然后將反應(yīng)物倒在冰上。然后將其在真空中濃縮，用150ml水吸收并且用兩份300ml二氯甲烷萃取，將組合二氯甲烷層通過(guò)無(wú)水硫酸鎂干燥，并且蒸發(fā)，得到17克有機(jī)殘基。在硅膠(1∶2乙酸乙酯∶正己烷作為洗脫液)上用中壓層析法使得分離出產(chǎn)物3-碘代-4-硝基苯酚(6.93克，26.1mmole，38％產(chǎn)量)；m.p.121-123℃；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.98(d，1H，J＝9Hz)，7.54(d，1H，J＝3Hz)，6.92(dd，1H，J＝9，3Hz)，5.54(bs，1H)；IR(KBr)3150(寬)，1600，1580，1512，1404，1336，1298，1212，1121，1023，870cm-1；和3-碘代-6-硝基苯酚(從二氯甲烷/正己烷重結(jié)晶得到3.07克，11.6mmole，17％產(chǎn)量；m.p.92-94℃(報(bào)導(dǎo)值為m.p.96℃(Hodgson，HH等人，1927)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ10.53(s，1H)，7.76(d，1H，J＝9.0Hz)，7.59(d，1H，J＝2.0Hz)，7.33(dd，1H，J＝9.0，2.0Hz)；13C NMR(CDCl3；用HMQC進(jìn)行歸屬)105.2(C-3)，125.6(C-5)，129.2(C-2)，129.7(C-4)，133.4(C-6)，154.6(C-1)；IR(KBr)3430(寬)，1604，1571，1518，1463，1317，1225，1172，1055，888cm-1；分析計(jì)算為C6H4INO3C，27.19；H，1.52；N，5.29.found C，27.36；H，1.57；N，5.15。
2-氨基-5-碘代苯酚。將3-碘代-6-硝基苯酚(0.993克，3.75mmole)在水性氫氧化鈉溶液(在100mL水中的0.233克NaOH)中攪拌。將亞硫酸氫鈉(4.62克，85％，22.6mmole)加入到反應(yīng)燒瓶并且在室溫下攪拌40分鐘。將反應(yīng)燒瓶用包圍的冰浴冷卻并且加入醋酸直到pH達(dá)到5-6。然后將反應(yīng)物用200mL二氯甲烷萃取三次，將組合的有機(jī)層通過(guò)無(wú)水硫酸鎂干燥并濃縮，產(chǎn)生粗6-氨基-3-碘代苯酚(0.533克，m.p.99.5-100.5℃)，用乙基醚/正己烷重結(jié)晶，產(chǎn)生純的產(chǎn)物(0.463克，1.97mmole，53％收率；m.p.126-128℃(分解)(報(bào)導(dǎo)值m.p.141℃(Hodgson，HH等人，1928))；1H NMR(CD3CN，500MHz)δ7.04(bs，1H)，6.97(d，1H，J＝2Hz)，6.95(dd，1H，J＝8，2Hz)，6.45(d，1H，J＝8Hz)，4.05(bs，2H)；IR(KBr)3455(寬)，3380，3305，1714，1504，1430，1365，1279，1257，1223，890cm-1；分析計(jì)算為C6H6INOC，30.66；H，2.57；N，5.96.found C，30.65；H，2.42；N，5.92.)。
5′-碘代geldanoxazinone(17)。將(+)-格爾德霉素(4.8mg，8.6μmol)和2-氨基-5-碘代苯酚(4.0mg，0.017mmol)的混合物在冰醋酸(1.0ml)中在78℃氮?dú)庀聰嚢?0小時(shí)，然后冷卻和濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上的快速層析法分離深橙色殘基，得到具有未反應(yīng)的(+)-格爾德霉素污染的粗產(chǎn)品。然后在氯仿中溶解并進(jìn)行預(yù)備的HPLC分離(Waters Nova-Pak Silica 6μm7.8×300mm column，2.0ml/min CHCl3/EtOAc2∶3)，產(chǎn)生亮橙色粉未產(chǎn)品(2.8mg，44％).IR(in CH2Cl2)(cm-1)3139，3076，3048，2995，2967，1733，1684，1599，1580，1496，1447，1423，1260，1098；1H NMR(CDCl3，500MHz，用COSY進(jìn)行歸屬)δ9.12(bs，1H)，8.30(s，1H)，7.79(d，J＝2.0Hz，1H)，7.71(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)，7.55(d，J＝8.5Hz，1H)，7.01(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.59(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.94(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.84(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.20(s，1H)，4.71(bs，2H)，4.33(bd，J＝10.0Hz，1H)，4.24(bs，1H)，3.63(ddd，J＝9.0，6.5，2.0Hz，1H)，3.45(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.36(s，3H)，3.26(s，3H)，2.79-2.70(m，3H)，2.06(bs，3H)，1.97-1.84(m，2H)，1.82-1.74(m，1H)，1.80(d，J＝1.0Hz，3H)，0.99(d，J＝7.0Hz，3H)，0.97(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，125MHz)δ180.8，168.4，156.0，148.7，144.9，143.3，136.9，135.6，135.3，135.0，133.9，133.6，133.0，131.0，126.8，126.6，125.2，117.5，112.9，96.6，81.9，81.4，81.3，72.2，57.1，56.8，35.4，33.0，32.3，27.7，23.3，12.8，12.6，12.2；HRMS(FAB)found 746.1937[M+H]+，calcd.746.1938(C34H41IN3O8).
實(shí)施例1611-O-乙酰基-17-(1-氮雜環(huán)丁烷基)-17-去甲氧基格爾德霉素(18)(Schnur et I.，.1995a)).將17-(1-氮雜環(huán)丁烷基)-17-去甲氧基格爾德霉素(3.2mg，5.5μmol)與乙酸酐(5.2μl 0.055mmol)和DMAP(7.3mg，0.060mmol)攪拌。基于通過(guò)薄層色譜法(40小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，用鹽水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到所需要的紫色固體產(chǎn)物(3.2mg，93％)。IR(in CH2Cl2)(cm-1)3686，3536，3420，3069，3052，2930，1734，1689，1649，1601，1585，1549，1486，1435，1374，1273，1102；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.37(s，1H)，7.13(bs，1H)，6.94(s，1H)，6.50(ddd，J＝11.5，11.0，1.0Hz，1H)，5.81(dd，J＝11.0，7.5Hz，1H)，5.45(bs，1H)，5.28(bd，J＝10.0Hz，1H)，5.04(dd，J＝8.0，3.5Hz，1H)，4.64-4.54(m，4H)，4.48(bd J，＝7.5Hz，1H)，3.63(bs，1H)，3.33(s，3H)，3.31(s，3H)，2.85-2.77(m，1H)，2.71(bd，J＝10.0Hz，1H)，2.38(五重峰，J＝8.0Hz，2H)，2.06-2.00(m，1H)，1.98(bs，3H)，1.97(s，3H)，1.71-1.56(m，2H)，1.68(bs，3H)，1.28-1.18(m，1H)，0.96-0.93(m，6H)；[7]13C NMR(CDCl3，125MHz)δ186.2，178.0，170.6，169.2，155.7，145.6，140.4，135.6，134.8，132.9，128.3，126.2，109.2，108.6，80.0，79.2，78.4，75.1，58.5，57.6，56.1，35.8，33.0，30.1，29.7，21.6，20.9，18.5，15.6，14.1，12.3；HRMS(FAB)found 628.3237[M+H]+，calcd.628.3234(C33H46IN3O9)。
實(shí)施例1717-(1-氮雜環(huán)丁烷基)-7-去氨甲?；?17-脫甲氧基格爾德霉素(19)(Schnur等人，1994，1995a，前述)將叔丁氧鉀(5.3mg，0.045mmol)在氮?dú)庀录尤氲皆谌〈?4.0ml)的17-(1-氮雜環(huán)丁烷基)-17-去甲氧基格爾德霉素(5.0mg，8.5μmol)溶液中。將反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后通過(guò)在乙酸乙酯和鹽水之間分離淬熄。用鹽水洗有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)快柱層析法分離，得到紫色固體產(chǎn)物(4.4mg，95％)。IR(KBr)(cm-1)3461，3330，2955，2927，2871，2826，1685，1652，1539，1489，1404，1381，1287，1255，1191，1136，1106；′H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.16(s，1H)，7.09(s，1H)，6.90(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.54(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.98(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.70(bd，J＝9.5Hz，1H)，4.72-4.59(m，4H)，4.16(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.98(s，1H)，3.52(dd，J＝9.0，2.0Hz，1H)，3.41(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.34(s，3H)，3.23(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.57(d，J＝14.0Hz，1H)，2.42(五重峰，J＝8.0Hz，2H)，2.23(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(d，J＝1.0Hz，3H)，1.77-1.71(m，2H)，1.74(d，J＝1.0Hz，3H)，1.70-1.62(m，1H)，0.97(d，J＝7.0Hz，3H)，0.94(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，125MHz)δ185.8，178.4，168.6，145.8，140.5，137.2，136.1，134.8，132.0，126.9，125.9，109.5，109.2，81.8，80.5，80.3，72.9，58.9，56.7，56.3，34.9，34.2，32.2，28.2，22.9，18.4，12.6，12.4，11.8；MS(FAB)found 543[M+H]+。
實(shí)施例1817，21-二氫格爾德霉素(20)(Schur等人，1995b)將(+)-格爾德霉素(3.5mg，6.2μmol)在乙酸乙酯(2.5ml)中溶解，，然后加入連二亞硫酸鈉鹽(～85％，0.50g，2.4mmol)的水性溶液(2.5ml)。在室溫下攪拌混合物?；谕ㄟ^(guò)薄層色譜法(1小時(shí))顯示的GA的完全轉(zhuǎn)換，分離有機(jī)層，用鹽水洗此混合物，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥，并且濃縮。通過(guò)在硅膠(正己烷/乙酸乙酯)上快速柱層析法分離得到淡黃色固體產(chǎn)物(3.3mg，94％)。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ8.34(s，1H)，8.08(s，1H)，8.02(bs，1H)，6.76(bd，J＝11.5Hz，1H)，6.37(bdd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，5.94(bd，J＝9.5Hz，1H)，5.64(dd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.04(bs，1H)，4.95(s，1H)，4.65(bs，2H)，4.29(bd，J＝10.0Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.61(bd，J＝9.0Hz，1H)，3.43(bd，J＝9.0Hz，1H)，3.33(s，3H)，3.21(s，3H)，2.79-2.74(m，2H)，2.35(bd，J＝14.0Hz，1H)，1.82-1.65(m，3H)，1.76(bs，6H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)，0.86(d，J＝7.0Hz，3H)；HRMS(FAB)found 562.2886[M]+，calcd.562.2890(C29H42N2O9)。
實(shí)施例19由化合物15制備的鹵素-取代的GA衍生物標(biāo)記的17-(2-鹵代-乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素衍生物
17-(2-碘乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素.(17-IEG)將磷酸溶液(3.0M，20.0μl)在二甲基甲酰胺(0.20ml)中加入17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ARG)(1.1mg，1.92mol)和碘化鉀(17.4mg，0.10mmol)溶液。10分鐘后，在乙酸乙酯和鹽水之間分離混合物。用鹽水洗有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮，得到紫色固體產(chǎn)物(1.3mg，97％)。IR(KBr)(cm-1)3466，3336，2927，2824，1718，1690，1652，1576，1486，1374，1322，1252，1188，1099；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ9.09(s，1H)，7.30(s，1H)，6.94(d，J＝11.5Hz，1H)，6.57(dd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.34(bt，J＝5.0Hz，1H)，5.87(bd，J＝9.5Hz，H)，5.85(bdd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.18(s，1H)，4.73(br s，2H)，4.30(d，J＝10.0Hz，1H)，4.03(bs，1H)，3.91-3.87(m，2H)，3.56(bd，J＝9.0Hz，1H)，3.44(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.31-3.28(m，2H)，3.26(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.69(d，J＝14.0Hz，1H)，2.19(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.80-1.76(m，2H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.75-1.69(m，1H)，0.99-0.96(m，6H)；HRMS(FAB)found 700.2099[M+H]+，calcd.700.2095(C30H42IN3O8)。

17-(2-溴代乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素.(17-BEG)將磷酸溶液(3.0M，20.0μl)在二甲基甲酰胺(0.20ml)中加入17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ARG)(1.1mg，1.92mol)和溴化鉀(12.8mg，0.11mmol)溶液。10分鐘后，在乙酸乙酯和鹽水之間分離混合物。用鹽水洗有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮，得到紫色固體產(chǎn)物(1.2mg，96％)。IR(KBr)(cm-1)3460，3335，2926，2850，2824，1723，1691，1652，1575，1487，1374，1322，1254，1189，1099；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ9.08(s，1H)，7.29(s，1H)，6.94(d，J＝11.5Hz，1H)，6.57(dd，J＝11.5，11.0Hz，1H)，6.36(bt，J＝5.0Hz，1H)，5.87(bd，J＝9.5Hz，H)，5.85(bdd，J＝11.0，10.0Hz，1H)，5.18(s，1H)，4.74(br s，2H)，4.30(d，J＝10.0Hz，1H)，4.03(bs，1H)，3.97-3.92(m，2H)，3.58-3.52(m，3H)，3.44(ddd，J＝9.0，3.0，3.0Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.26(s，3H)，2.73(dqd，J＝9.5，7.0，2.0Hz，1H)，2.70(d，J＝14.0Hz，1H)，2.23(dd，J＝14.0，11.0Hz，1H)，2.01(bs，3H)，1.79-1.76(m，2H)，1.78(d，J＝1.0Hz，3H)，1.75-1.68(m，1H)，0.99-0.96(m，6H)；HRMS(FAB)found[M+H]+，calcd.(C30H42BrN3O8)。
17-(2-氯乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素.(17-CEG)將鹽酸溶液(1.0M，20.0μl)在二甲基甲酰胺(0.10ml)中加入17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ARG)(0.1mg，0.17μmol)和溴化鉀(12.8mg，0.11mmol)溶液。2小時(shí)后，在乙酸乙酯和鹽水之間分離混合物。用鹽水洗有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮，得到紫色固體產(chǎn)物。此粗產(chǎn)物的TLC顯示，原始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)換為需要的標(biāo)題中產(chǎn)物(主產(chǎn)物)和17-HEG(少量)。
17-(2-氟代乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-FEG)將氫氟酸溶液(48％，10.0μl)在二甲替甲酰胺(0.10ml)中加入17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ARG)(0.1mg，0.17μmol)溶液。2小時(shí)后，在乙酸乙酯和鹽水之間分離混合物。用鹽水洗有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮，得到紫色固體產(chǎn)物。此粗產(chǎn)物的TLC顯示，原始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)換為需要的標(biāo)題中產(chǎn)物(主產(chǎn)物)和17-HEG(少量)。
17-(2-氫氧基乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-HEG)將磷酸溶液(3.0M，5.0μl)在DMSO(0.20ml)和水(0.05ml)中加入17-(1-氮丙啶基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ARG)(0.1mg，0.17μmol)溶液。2小時(shí)后，在乙酸乙酯和鹽水之間分離混合物。用鹽水洗有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥和濃縮，得到紫色固體產(chǎn)物。此粗產(chǎn)物的TLC顯示，原始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)換為需要的標(biāo)題中產(chǎn)物。
實(shí)施例20
在HGF/SF-Met-uPA-纖溶酶體系細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)中的格爾德霉素衍生物及其抑制活性合成并檢驗(yàn)GA衍生物中屬于geldanoxazinone類的兩種衍生物的抑制劑作用(化學(xué)結(jié)構(gòu)參見(jiàn)上面)。這些衍生物可以用含有2-氨基苯酚的GA通過(guò)酸催化縮合來(lái)制備(見(jiàn)上述實(shí)施例)。從而用5-溴代-2-氨基苯酚和5-碘代-2-氨基苯酚分別以60％和44％產(chǎn)率制備加合物16和17。這些后者化合物中的每一種都發(fā)現(xiàn)對(duì)Met信號(hào)途徑僅在納摩爾濃度＜8IC50就具有抑制作用。見(jiàn)表1。
在研究的GA柄形環(huán)改變對(duì)于活性的影響的嘗試中，使用了活性17-氨基取代的-17-去甲氧基格爾德霉素衍生物17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17-去甲氧基格爾德霉素(L4)來(lái)測(cè)試這種改變。
表1化合物的uPA-纖溶酶抑制指數(shù).


*uPA-纖溶酶抑制指數(shù)或IC50，是指在經(jīng)HGF/SF處理的MDCK細(xì)胞中，達(dá)到抑制50％uPA生成所需的藥物濃度的負(fù)對(duì)數(shù)。IC50指數(shù)大于12的化合物屬于fM-Gai(在fM或以下濃度范圍的抑制劑)，而指數(shù)低于8的化合物屬于公知的nM-Gai(在nM范圍內(nèi)的抑制劑)組。

14R1＝-C(O)NH2；R2＝-H18R1＝-C(O)NH2；R2＝-C(O)CH319R1＝-H；R2＝-H后者化合物的11-羥基可以用乙酸酐和4-二甲氨基吡啶酯化得到11-O-乙?；?17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17-去甲氧基格爾德霉素(18)。
化合物14的7-尿烷基可以按照Schnur等人(前述)的方法稍微修改來(lái)去除，其通過(guò)用在三元丁醇(在溶劑二甲基亞砜中，其產(chǎn)生低產(chǎn)物收率)中的三元丁氧鉀來(lái)處理，產(chǎn)生17-N-氮雜環(huán)丁烷基-7-去氨基甲酰-17-去甲氧基格爾德霉素(19)。對(duì)于柄形環(huán)的改變都產(chǎn)生了表現(xiàn)出只有＜8IC50的Met-uPA-纖溶酶信號(hào)抑制活性(表1)。
如圖2所示，化合物14是高度活性(＞15IC50)的，超過(guò)了GA的活性，而化合物19是完全無(wú)活性的?；衔?8的活性＜8IC50。
最后，研究實(shí)驗(yàn)了GA-相關(guān)的袢霉素macbecin I(3)和苯醌袢霉素的氫醌形式、二氫格爾德霉素(20)和macbecin II(21)，以及根赤殼菌素(3)的抑制活性。結(jié)果見(jiàn)表1。盡管知道根赤殼菌素(Sharma，SV等人，1998)和macbecinsI(Blagosklonny等人，前述)和II(見(jiàn)此文)具有對(duì)于hsp90高度親合力，這些化合物的每一種在本HGF/SF誘導(dǎo)的uPA-纖溶酶細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很低的活性。但是，發(fā)現(xiàn)二氫格爾德霉素具有高度活性(＞12IC50)。
如背景技術(shù)部分所述，對(duì)于GA及其衍生物的治療潛力的研究主要集中在hsp90起關(guān)鍵作用的生物過(guò)程(Sausville等人，2003；Workman，2003；Banerji等人，2003)。對(duì)于癌細(xì)胞存活和增殖具有關(guān)鍵性的多個(gè)蛋白都依賴于這種蛋白分子伴侶(Neckers，L等人，2003；Maloney，A等人，2003)。GA衍生物的阻礙hsp90功能的能力產(chǎn)生了用于癌癥治療的17-N-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(4)的臨床研究(前述)。初步報(bào)告顯示用為抗癌治療的有效性，但也顯示其肝毒性所致的劑量限制。(非劑量限制包括貧血、厭食、惡心、嘔吐和腹瀉)。例如參見(jiàn)前述Neckers等人；和前述Sausville等人。
如同在此所公開(kāi)的，許多GA衍生物作為癌細(xì)胞中的Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制劑，其作用濃度遠(yuǎn)低于阻礙hsp90功能所需的濃度。此外公開(kāi)了抑制活性不總與人類α-hsp90的親合力相關(guān)。盡管在此公開(kāi)的活性GA衍生物的未知靶點(diǎn)仍需進(jìn)行確認(rèn)，但這些結(jié)果說(shuō)明了特定的結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性。
盡管一些17-N-氨基-衍生的-17-去甲氧基格爾德霉素化合物在細(xì)胞篩選中是活性的，但其它的不是，尤其是那些具有更長(zhǎng)的17-N-氨基取代基，例如化合物9，10，11和12以及羧化衍生物13。
對(duì)于柄形環(huán)的修改，當(dāng)從活性GA衍生物14中去除7-尿烷基時(shí)，得到的去氨甲?；幕衔?9是無(wú)活性的。與hsp90的N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合GA衍生物4和5的結(jié)晶分析(Stebbins等人，前述；Jez等人，前述)表明，尿烷官能度經(jīng)歷了與hsp90的許多氨基酸殘基的氫結(jié)合反應(yīng)。另外，Schnur等人(1995a)報(bào)告，7-尿烷對(duì)于抗-erbB-2活性是需要的。GA衍生物的7-尿烷深嵌在hsp90的ATP-結(jié)合位點(diǎn)中。因此，本發(fā)明人提出，在Met功能中GA結(jié)合的未知靶點(diǎn)具有與hsp90的此結(jié)合區(qū)域的類似性。由活性GA衍生物14的11-羥基乙酰化得到的化合物18在對(duì)于Met信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞篩選中是無(wú)活性的。
再者，GA對(duì)于hsp90的直接作用是眾所周知的。報(bào)告的GA細(xì)胞作用是這樣的，在體外實(shí)驗(yàn)中，hsp90通常是向上調(diào)的，而Met表達(dá)的通常是向下調(diào)控的，如在實(shí)施例21中以及下面所述。也可參見(jiàn)Nimmanapalli，R等人，2001和Maulik，G等人，2002a。GA類對(duì)于hsp90和Met表達(dá)水平的這種作用在此公開(kāi)了僅在更高濃度(＜8IC50)。在亞納摩爾濃度(＞12IC50)下，uPA活性被抑制，hsp90或Met表達(dá)沒(méi)有變化(下面實(shí)施例)。活性化合物的靶點(diǎn)不同于hsp90，如下所述。這里用于檢測(cè)uPA活性的細(xì)胞篩選基于使用MDCK細(xì)胞系的HGF/SF誘導(dǎo)的uPA-纖溶酶網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)HGF/SF處理，MDCK細(xì)胞的uPA活性明顯增加(圖1和2；將對(duì)照組(″ctl″)與+HGF/SF對(duì)比)。但是，我們的高活性GA衍生物在飛摩爾濃度水平明顯抑制此活性，而根赤殼菌素僅在納摩爾水平抑制此活性(見(jiàn)圖1，一些高活性GA衍生物的抑制作用)。
高活性GA衍生物不僅在fM水平抑制uPA活性，它們也抑制體外腫瘤細(xì)胞侵入(見(jiàn)下面實(shí)施例)。但是，僅在nM水平抑制增殖，與低活性或″nM-GA″衍生物濃度相同(Webb等人，前述)。這說(shuō)明，GA類通過(guò)一些機(jī)理抑制增殖和侵入。例如，可能通過(guò)抑制hsp90功能來(lái)影響增殖，而通過(guò)GA與一個(gè)或多個(gè)未知靶點(diǎn)相互作用影響侵入。
為支持這個(gè)觀點(diǎn)，有意地將MDCK細(xì)胞在含有macbecin II(21)的條件下培養(yǎng)，它能在nM水平下同時(shí)抑制侵入和增殖。保持MDCK細(xì)胞在macbecin II(21)的最高無(wú)毒濃度(3μM)條件中培養(yǎng)幾個(gè)月。在此條件下，Met和hsp90都恢復(fù)到親代(″對(duì)照″)水平，并且恢復(fù)了Met對(duì)HGF/SF的響應(yīng)度，而且hsp90似乎仍保持與macbecin結(jié)合。令人驚異地，在macbecinII處理過(guò)的細(xì)胞中uPA-纖溶酶對(duì)GA類的敏感度與在親代MDCK細(xì)胞中相同。HGF/SF可能仍然顯著地向上調(diào)控了uPA活性，而它也可以被GA類在fM水平抑制。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明人的觀點(diǎn)，GA通過(guò)非hsp90靶點(diǎn)抑制HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性。
在此觀察的活性不同于以前公開(kāi)的這些化合物與hsp90的相關(guān)親合力。hsp90高親合力化合物根赤殼菌素(3)(Roe等人，前述)在本細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)中是無(wú)活性的，而hsp90結(jié)合化合物GA和17-N-烯丙氨基-17-去甲氧基GA(4)是活性的。盡管在這些細(xì)胞uPA篩選實(shí)驗(yàn)中的靶點(diǎn)結(jié)合點(diǎn)仍然未知，這個(gè)點(diǎn)也可能是ATP-結(jié)合點(diǎn)，盡管有些不同。
前述的Kamal等人提出，在腫瘤細(xì)胞中hsp90的高親合力構(gòu)象解釋了17-N-烯丙氨基-17-去甲氧基GA(4)和根赤殼菌素(3)的腫瘤選擇性。腫瘤細(xì)胞中的hsp90是以多蛋白分子伴侶復(fù)合體的形式存在，，而正常組織hsp90不是這樣復(fù)合的。仍然不清楚，在此作用的靶點(diǎn)是否類似地被復(fù)合并且改變了GA結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象。
在此所述的Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)活性化合物精巧靈敏的敏感性說(shuō)明了此化合物在阻斷該信號(hào)途徑中所起的催化作用。二氫格爾德霉素(20)被發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中是活性的，盡管比GA本身稍少一些。然而，據(jù)報(bào)告化合物20在空氣中可以被氧化為GA(Schnur等人，1995b，前述)，而這一點(diǎn)，作為在此揭示的化合物20具有活性的可能因素，不能被忽視。但是相關(guān)的袢霉素macbecin I(2)及其還原產(chǎn)物macbecin II(21)都被發(fā)現(xiàn)是無(wú)活性的。兩個(gè)后者化合物都與hsp90結(jié)合。發(fā)明人認(rèn)為，活性袢霉素衍生物(″fM-GA類″)參與了催化電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，并且介于二氫格爾德霉素(20)和GA之間的氧化還原電勢(shì)對(duì)于該過(guò)程是關(guān)鍵性的。兩個(gè)macbecin之間的電勢(shì)差別可能不足以導(dǎo)致該過(guò)程的發(fā)生。
由于只需要低濃度的活性GA類物質(zhì)，就可以抑制導(dǎo)致實(shí)體瘤侵入和轉(zhuǎn)移行為的Met信號(hào)途徑，因此這些化合物成為有吸引力的備選藥物。它們?cè)诘蜐舛认戮途哂谢钚裕梢韵涊d的GA衍生物的劑量依賴型毒性。成功找出并分離這些衍生物的靶點(diǎn)，能夠更好地篩選和設(shè)計(jì)出作為Met信號(hào)途徑抑制劑的其它有效化合物。
實(shí)施例21
HGF/SF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵入的格爾德霉素抑制A.原料和方法細(xì)胞系和藥物MDCK(犬腎上皮細(xì)胞)、DBTRG、U373、U118、SW1783(人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞)、SK-LMS-1(人類平滑肌肉瘤細(xì)胞)是從ATCC購(gòu)買的。DU145、PC-3(人類前列腺癌細(xì)胞)是來(lái)自于Dr.Han-Mo Koo實(shí)驗(yàn)室，Van Andel研究所。U87和SNB19人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞是來(lái)自于Dr.Jasti Rao，伊利諾伊大學(xué)。SNB19是在DMEM F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的。所有其它細(xì)胞是在Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的(二者都來(lái)自Gibco_，Invitrogen Corp.)。培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清(FBS；Hyclone)和青霉素以及鏈霉素。
格爾德霉素及化學(xué)衍生物，17-(N-烯丙氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)，和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-ADG)以及Macbecin II(MA)是由國(guó)家癌癥研究所(NCI)提供的或如同在此所述合成的。根赤殼菌素(RA)是購(gòu)自Sigma公司。
在含有1，2和3×10-6M的MA的培養(yǎng)基中MDCK細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)(＞3個(gè)月)得到了MDCKG1\MDCKG2和MDCKG3細(xì)胞。所有組分首先在0.01M的DMSO中稀釋，等分為小份原料(5μl)并在-80℃凍存直到使用。在使用時(shí)，將原料解凍，并且用DMEM/10％FBS連續(xù)稀釋。對(duì)于用MA長(zhǎng)期培養(yǎng)，至少要一周兩次更換用1，2和3×10-6M的此化合物制備的培養(yǎng)基。
HGF/SF-Met-uPA-纖溶酶細(xì)胞篩選(Webb等人，前述)。在96孔板(96-well plates)中以1500細(xì)胞/孔密度接種細(xì)胞(除SK-LMS-1細(xì)胞以外，其以5000細(xì)胞/孔密度接種)，用于比色測(cè)定光強(qiáng)度，可以用MTS(Promega)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，或者通過(guò)Chromozyme PL(Boehringer Mannheim)測(cè)量uPA-纖溶酶活性。如前所述，細(xì)胞在DMEM/10％FBS中過(guò)夜生長(zhǎng)。將藥物溶解在DMSO中，并從原料濃度連續(xù)稀釋至DMEM/10％FBS培養(yǎng)基，并且加到適當(dāng)?shù)目字?。在藥物或試劑添加后，立即將HGF/SF(60ng/ml)加入到所有孔中(除了用作對(duì)照以計(jì)算基礎(chǔ)生長(zhǎng)和uPA-纖溶酶活性水平的孔)。在藥物及HGF/SF添加后二十四小時(shí)，為了測(cè)定uPA-纖溶酶活性將板如下處理將孔用DMEM(無(wú)酚紅；Life Technologies，Inc.)洗滌兩次，并且將200μl反應(yīng)緩沖劑[50％(v/v)的在DMEM(無(wú)酚紅)中的0.05單位/ml纖溶酶原，40％(v/v)50mMTris緩沖液(pH8.2)，和10％(v/v)的100mM甘氨酸溶液中的3mM Chromozyme PL(BoehringerMannheim)]加入每個(gè)孔中。然后將板在37℃的5％CO2中培養(yǎng)4小時(shí)，此時(shí)在自動(dòng)分光光度板閱讀器上以405nm單波長(zhǎng)讀取產(chǎn)生的吸收度。uPA-纖溶酶抑制指數(shù)或IC50是指uPA-纖溶酶活性被抑制50％時(shí)濃度的負(fù)log10對(duì)數(shù)。
增殖實(shí)驗(yàn)。與uPA-纖溶酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)同時(shí)，用MTS檢測(cè)在96孔板(96-well plates)中的細(xì)胞增殖。細(xì)胞制劑與上述uPA-纖溶酶實(shí)驗(yàn)相同，除了在添加藥物和HGF/SF 24小時(shí)后，要將15μl的MTS的PMS(吩嗪硫酸甲酯)溶液(0.92mg/ml PMS，在0.2gKCl，8.0gNaCl，0.2gKH2PO4，1.15gNa2HPO4，100mg MgCl2.6H2O，133mgCaCl2.2H2O中)加入到每個(gè)孔中。然后將板在37℃的5％CO2中培養(yǎng)4小時(shí)，此時(shí)在自動(dòng)分光光度板閱讀器上以490nm單波長(zhǎng)讀取吸收度。
擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。與評(píng)估uPA活性同時(shí)，用MDCK細(xì)胞的96孔板檢測(cè)細(xì)胞的擴(kuò)散。細(xì)胞制劑與上面所述的相同(纖溶酶實(shí)驗(yàn))。在測(cè)量uPA活性的同時(shí)，將正在進(jìn)行擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞混合，染色(Diff-Quik Set，Dade Behring AG)并且攝像。
在生物體外細(xì)胞侵入實(shí)驗(yàn)。在生物體外侵入實(shí)驗(yàn)按照J(rèn)effers等人，1996所述進(jìn)行，使用由GFR-Matrigel_(Becton Dickinson)覆蓋的24孔侵入室。將細(xì)胞在DMEM/0.1％BSA中懸浮并且接種于侵入(上部)室中(5-25×103細(xì)胞/孔)(DBTRG5,000，SNB19和U373 25,000細(xì)胞/孔)。用添加或未添加HGF/SF(100ng/ml)的DMEM/0.1％BSA填充下部室。為了評(píng)估GA抑制，在HGF/SF添加之后立即將GA連續(xù)地稀釋到最終濃度為1μM-1fM的上部和下部室中。在24小時(shí)后，刮去在上部室中的剩余細(xì)胞。用Diff-Quik(Dade Behring Inc.)著色并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)通過(guò)Matrigel_侵入并且附著到插入物下部表面的細(xì)胞。
Met和其它蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印記(Western Blot)和表達(dá)。以105細(xì)胞每皿的密度在60×15mm的皿中接種細(xì)胞。24小時(shí)后將HGF/SF(100ng/ml)加入到每個(gè)皿中。然后立即將連續(xù)稀釋的GA或MA以所述的濃度加入到相應(yīng)皿中，并且在細(xì)胞溶解前按所示時(shí)間長(zhǎng)短培養(yǎng)細(xì)胞。為了檢測(cè)Met和MAPK磷酸化，將105個(gè)細(xì)胞播種在60×15mm皿中并血清饑餓(serum-starved)培養(yǎng)24小時(shí)。在HGF/SF(100ng/ml)刺激后，細(xì)胞溶解10和30分鐘。對(duì)于對(duì)照細(xì)胞不給予HGF/SF。在細(xì)胞溶解后，通過(guò)DC蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)(Bio-Rad)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，等量的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，并在Western Blot中轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen)上。在用5％干奶封閉后，用特定抗體在膜上做標(biāo)記。所用的抗體是Met(對(duì)于MDCK細(xì)胞，Met 25HZ購(gòu)自Cell Signaling；對(duì)于DBTRG，C-28，Santa Cruz Biologicals)，phospho-Met(Tyr1234/1235兔多克隆抗體(Cell Signaling)，phospho p44/42MAPK(Thr202/tyr204兔多克隆抗體(Cell Signaling)，或β-肌動(dòng)蛋白(AC-15ab6276，Abcam)，其用作上樣對(duì)照。在暴露到HRP-結(jié)合的二抗(secondary antibody)后，用ECL(″增強(qiáng)化學(xué)熒光，Amersham Biosciences)培養(yǎng)膜，并且通過(guò)圖像分析來(lái)檢測(cè)化學(xué)熒光信號(hào)強(qiáng)度。
固相結(jié)合實(shí)驗(yàn)。依照Whitesell等人(1994)如下制備GA固定的親合力凝膠珠在室溫下將GA(相對(duì)于親合凝膠珠的1.5當(dāng)量)與1，6-二氨基正己烷(5-10當(dāng)量)在氯仿中攪拌。GA完全轉(zhuǎn)換后(由TLC監(jiān)視)，用稀釋的水性氫氧化鈉和鹽水洗此混合物。通過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮，得到17-(6-氨基己基胺)-17-去甲氧基格爾德霉素的暗紫色固體產(chǎn)物(通過(guò)1H NMR純化)。然后在DMSO中吸附中間產(chǎn)物，并且用Affi-Gel 10珠(Bio-Rad)攪拌兩小時(shí)。用DMSO洗滌得到的紫色GA珠。
對(duì)照珠是由親和凝膠連接上不具有HSP90親合力的小鏈類似物制成的。在室溫下將Affi-Gel 10珠(Bio-Rad)與N-(6-氨基己基)乙酰胺(Lee等人，1995)(1.3當(dāng)量)在DMSO中攪拌2小時(shí)，然后用DMSO徹底洗滌。
上面得到的GA-珠和對(duì)照珠在5倍體積的TNESV(50mM tris-HCl(pH7.5)，20mM Na2MoO4，0.09％NP-40，150mM NaCl和1mM原釩酸鈉)中洗滌3次并且在4℃下的TNESV中旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，以水解任何未反應(yīng)的N-氫氧基琥珀酰亞胺，然后在1％BSA的TNESV中(1∶10)室溫振蕩至少3小時(shí)。再次用TNESV洗滌3次后，這些珠懸浮在50％TNESV中并在-78℃貯存。
為進(jìn)行親合力下拉(pull-down)實(shí)驗(yàn)，在100×20mm皿中接種5×05細(xì)胞。在細(xì)胞生長(zhǎng)至80％覆蓋后，將不同濃度的GA或MA加入到皿中。在24小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并且將細(xì)胞溶解在添加CompleteTM蛋白酶抑制劑(Roche Molecular Biochemicals)的TNESV緩沖劑中。通過(guò)DC蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用等量的蛋白質(zhì)通過(guò)Western Blot檢測(cè)Met和HSP90α蛋白。對(duì)于下拉(pull-down)實(shí)驗(yàn)，將調(diào)整到相等濃度的20μl的對(duì)照或GA珠加入到500Mμl的提取液中，并且在4℃下旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。用低速離心回收珠，并且用TNESV洗滌3次。60μl2X樣品緩沖液加到珠中并且煮沸10分鐘。此樣品進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行Western Blot分析。
實(shí)施例22格爾德霉素是在人類細(xì)胞中的HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性的有效抑制劑本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室此前已經(jīng)提出，某些GA衍生物在極低濃度下抑制在MDCK細(xì)胞中HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性(Webb等人，2000)。稱為″fM-GAi″化合物的最具活性的衍生物是其中GA的17-甲氧基由氨基或烷氨基(在此所述的)取代的那些化合物。
為確定人類腫瘤細(xì)胞是否象MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出fM-GAi敏感性，首先在一些細(xì)胞系中篩選HGF/SF可誘導(dǎo)的uPA活性(表2)。在MDCK細(xì)胞中HGF/SF誘導(dǎo)出高水平的uPA活性。然而，我們也找到了表現(xiàn)出HGF/SF可誘導(dǎo)的uPA活性的四個(gè)人類腫瘤細(xì)胞系，也就是三種多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系(DBTRG，U373和SNB19)以及高侵入性SK-LMS-1平滑肌肉瘤細(xì)胞(Jeffers等人，前述；Webb等人，2000)。這些化合物的詳細(xì)的fM-GAi濃度-抑制測(cè)試列入表1？？利用細(xì)胞系進(jìn)行的？？見(jiàn)表2？？。根赤殼菌素(RA)和macbecin II(MA)用作在nM范圍中抑制uPA活性的藥物的實(shí)施例。如前述Webb等人在前面描述的，MDCK細(xì)胞用作對(duì)于fM-GAi藥物敏感性的對(duì)照，表現(xiàn)出如同前述的相同敏感性(圖1，板A)。重要地，只有加入到HGF/SF后表現(xiàn)出至少1.5倍uPA活性的人類腫瘤細(xì)胞系(表2)表現(xiàn)出與MDCK細(xì)胞類似的fM-GAi敏感性(圖1，板B(DBTRG)，C(U373)，和D(SNB19)，并且未示出數(shù)據(jù))。這些化合物沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖(圖1，板E、F和G)的明顯影響。fM-GAi化合物表現(xiàn)出在每個(gè)細(xì)胞系中跨越很寬濃度范圍的劑量-依賴曲線，在MDCK和U373細(xì)胞中觀察到17-AAG具有在10-17M低濃度時(shí)的抑制作用。
這些結(jié)果證明，對(duì)于fM-GAi化合物的敏感性不是某一特定細(xì)胞系的專有特征。但是，也看出，fM-GAi藥物只有在那些受HGF/SF影響至少50％的uPA活性被誘導(dǎo)出來(lái)的細(xì)胞中是有效的。在敏感的GBM細(xì)胞系中，值得注意的是DBTRG和U373細(xì)胞(圖1，分別是板B和C)，觀察到uPA活性基線由于響應(yīng)fM-GAi化合物而降低。這可能與在一些GBM細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的低水平自分泌HGF/SF-Met信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。
RA和MA只在nM或更高濃度下抑制由HGF/SF-介導(dǎo)的對(duì)uPA活性的誘導(dǎo)，RA表現(xiàn)出比GA高得多的HSP90親合力(Kd＝19nM vs.1.2μM)(Roe等人，1999；Schulte等人，1999)，只在nM濃度下即可抑制HGF/SF-介導(dǎo)的uPA活性。因此，盡管HSP90可能是nM-GAi類化合物的分子靶點(diǎn)，但是它不可能是這些敏感細(xì)胞中引起fM-GAi活性的原因。
表2在所選擇細(xì)胞系中的uPA活性的HGF/SF誘導(dǎo)1

1為了測(cè)量HGF/SF可誘導(dǎo)的uPA活性，細(xì)胞在96孔板(96-well plates)中接種。24小時(shí)后，將HGF/SF一式三份加入到孔中，最終濃度為0，10，20，40，和60ng/ml，再培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)量uPA活性。所示值是每個(gè)細(xì)胞系在加入HGF/SF后uPA誘導(dǎo)的峰值與其本底u(yù)PA活性值之比率的平均值。
星號(hào)(*)表示顯示出fM-GAi敏感性的那些細(xì)胞系(圖1，未示出數(shù)據(jù))。
實(shí)施例23fM-GAi和HGF/SF誘導(dǎo)的擴(kuò)散和侵入下面的研究檢驗(yàn)fM-GAi化合物，除了抑制uPA活性，是否影響體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞擴(kuò)散和腫瘤細(xì)胞侵入的生物活性。GA本身和17-AAG在pM-fM濃度范圍內(nèi)抑制HGF/SF誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞擴(kuò)散(圖10)。而且，圖11-13表示，甚至在pM-fM濃度，GA能夠完全阻止高侵入性的DBTRG、SNB199和U373人類GBM細(xì)胞在HGF/SF誘導(dǎo)的Matrigel_侵入過(guò)程。這種甚至在fM范圍中的對(duì)侵入的顯著抑制與fM-GAi對(duì)于uPA活性的HGF/SF誘導(dǎo)的抑制作用是接近相似的(比較圖3-6)。
實(shí)施例24不同于HSP90的另一個(gè)fM-GAi活性作用分子靶點(diǎn)的進(jìn)一步證據(jù)本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室此前的工作說(shuō)明，GA在nM或更高濃度下抑制在SK-LMS-1和MDCK細(xì)胞中的uPAR表達(dá)和Met表達(dá)(Webb等人，前述)，而在fM范圍內(nèi)，抑制uPA活性。一項(xiàng)研究檢驗(yàn)了對(duì)fM-GAi化合物敏感的細(xì)胞系中Met和HSP90α的表達(dá)對(duì)GA和MA的敏感性(圖14)。其他人提出，在nM水平GA向上調(diào)控HSP90α(Nimmanapalli等人，2001)并且向下調(diào)控Met表達(dá)(Maulik等人，2002a；Webb等人，前述)(圖3，條帶5和11分別表示MDCK和DBTRG細(xì)胞)。但是，在亞nM濃度的fM-GAi化合物例如GA的條件下，沒(méi)有觀察到HSP90α或Met相對(duì)濃度的顯著改變(圖14，條帶6和12)，在此濃度下uPA活性、擴(kuò)散或體外侵入被抑制。
在10-5M MA中觀察到GA對(duì)于HSP90α的上調(diào)和Met的下調(diào)(條帶3和9)，但是在10-6M觀察到較少的響應(yīng)(條帶4和10)。重要地，在10-5M MA和10-6M的GA條件下用GA-親合珠可恢復(fù)已低至可忽略水平的全部HSP90α(條帶3、5、9和11)，并且對(duì)于GA親合珠可用的HSP90α在10-6MMA條件下也被減少了(條帶4和10)。這些結(jié)果表明，在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的兩種藥物都有效地競(jìng)爭(zhēng)阻止HSP90與珠形GA的結(jié)合，表明了可用結(jié)合點(diǎn)被阻斷。從這些結(jié)果得到結(jié)論，在GA的亞nM濃度下，沒(méi)有發(fā)生對(duì)于Met或HSP90α表達(dá)的影響。而且，nM-GAi藥物MA，像GA，有效地與HSP90競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GA-親合珠，即使MA缺乏fM-GAi活性。這些結(jié)果表明，fM-GAi化合物的亞nM抑制作用不可能包括對(duì)于HSP90α的化學(xué)計(jì)量地有效方法中的結(jié)合。
實(shí)施例25MDCK細(xì)胞用Macbecin II長(zhǎng)期慢性處理的分析從表明在MA治療的細(xì)胞中HSP90α不能夠結(jié)合GA-親合珠的前述實(shí)驗(yàn)中預(yù)知，如果MDCK培養(yǎng)長(zhǎng)期維持在最高無(wú)毒水平的MA上，在HSP90α和其它nM-GAi靶點(diǎn)分子上的結(jié)合位點(diǎn)將可能被占據(jù)，允許檢驗(yàn)這些細(xì)胞是否仍對(duì)于fM-GAi化合物敏感。
檢驗(yàn)了一些高濃度MA，但是只顯示那些使用MDCK細(xì)胞可以耐受并繼續(xù)生長(zhǎng)的最高無(wú)毒水平的結(jié)果。在包含1-，2-和3×10-6M濃度的MA的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，以產(chǎn)生分別稱為MDCKG1，MDCKG2，和MDCKG3的細(xì)胞。MDCK細(xì)胞可以在MA濃度增加到但不高于3×10-6M的條件下持續(xù)地增殖。所有細(xì)胞系在MA的存在下生長(zhǎng)良好，盡管比親代細(xì)胞的生長(zhǎng)速率低(未示出)。在圖15中顯示了長(zhǎng)期在MA中處理的細(xì)胞系對(duì)于10-6M GA或10-5M MA的急性刺激的響應(yīng)。維持在1-2×10-6M MA中的細(xì)胞(MDCKG1-G2)表現(xiàn)出了正常水平的Met和HSP90(條帶2和5)，而在MDCKG3細(xì)胞(維持在3×10-6M MA中)中Met的豐度比在親代細(xì)胞中的要低(比較條帶1和8)。
在急性GA刺激24小時(shí)后，所有用MA長(zhǎng)期慢性處理的細(xì)胞系都表現(xiàn)出在Met豐度上的明顯減少，而用10-5M MA的刺激下減少得較少，特別是用MDCKG2和G3細(xì)胞(條帶3，6，和9)。MDCKG1和G2細(xì)胞系對(duì)GA的刺激表現(xiàn)出HSP90α的急劇增加，但在MDCKG3細(xì)胞中不是這樣。由這些結(jié)果可以得出，MDCKG3至少部分地具有了對(duì)10-6M GA的耐受性，而MDCKG1和G2較少如此，并且在較大程度上更像親代細(xì)胞(對(duì)比圖14和15)。
實(shí)施例26在用Macbecin II長(zhǎng)期慢性處理的MDCK細(xì)胞中的Met功能為評(píng)估MA處理的MDCKG3細(xì)胞是否保持其對(duì)于GA的敏感性，進(jìn)行了一項(xiàng)研究，首先檢測(cè)用MA長(zhǎng)期慢性處理的MDCK細(xì)胞中Met是否仍保持功能性。通過(guò)檢測(cè)，Met的功能是HGF/SF誘導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)(圖16)、擴(kuò)散活性(圖17)和uPA活性的誘導(dǎo)(圖18)。親代MDCK細(xì)胞和MDCKG3細(xì)胞在HGF/SF刺激后表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)腅rk1和Erk2磷酸化時(shí)程(圖16)，以及類似的Met磷酸化水平和時(shí)程。因此，盡管在MDCKG3細(xì)胞中Met表達(dá)水平稍低(圖4和5)，HGF/SF誘導(dǎo)的Met與Erk1和Erk2磷酸化類型與MDCK親代細(xì)胞是相似的。
MDCKG3細(xì)胞即使在3×10-6M MA的存在下仍然能響應(yīng)HGF/SF而發(fā)生擴(kuò)散(圖6A，板d和e)，而相同濃度的MA有效地阻斷了MDCK細(xì)胞的擴(kuò)散(圖17，板c)。
下面檢驗(yàn)GA在10-7到10-15M在MDCKG3細(xì)胞中HGF/SF誘導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)散的抑制活性(圖17)。只有在10-15M GA，才再次完整觀察到擴(kuò)散(圖6A，板i)，表明即使是培養(yǎng)于3×10-6MA中的MDCKG3細(xì)胞仍保持著對(duì)fM-GAi的精巧敏感性。
下面的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)在用MA長(zhǎng)期慢性處理的MDCK G3細(xì)胞中Met是否保持功能性，這通過(guò)HGF/SF誘導(dǎo)的下游uPA誘導(dǎo)來(lái)檢測(cè)(圖18)。正如在親代MDCK細(xì)胞中那樣，GA是比MA有效得多的HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性的抑制劑；它在MDCKG3細(xì)胞中的有效濃度可以在10-13M水平。放在一起考慮，這些發(fā)現(xiàn)表明，在MDCKG3細(xì)胞中Met在擴(kuò)散活性和uPA誘導(dǎo)過(guò)程中通過(guò)Erk1和Erk2的信號(hào)傳導(dǎo)中對(duì)于HGF/SF是完全響應(yīng)的。
實(shí)施例22-26的討論HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性被公認(rèn)與許多種實(shí)體瘤的侵入和轉(zhuǎn)移相關(guān)的。當(dāng)HGF/SF激起Met信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，uPA和uPAR表達(dá)都被上調(diào)，并且纖溶酶原分裂成纖溶酶，導(dǎo)致細(xì)胞外的基體降解(Ellis等人，1993)。高水平的uPA和uPAR表達(dá)與臨床上較差的預(yù)后相關(guān)(Duffy，1996；Duffy等人，1996；Harbeck等人，2002)，并且，事實(shí)上，以u(píng)PAR為靶點(diǎn)的抗癌方法正在發(fā)展(Gondi等人，2003；Lakka等人，2003；Schweinitz等人，2004)。本發(fā)明人及同事先前開(kāi)發(fā)了一種細(xì)胞途徑篩選HGF/SF誘導(dǎo)的uPA-纖溶酶體系抑制劑的方法并且使用這種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)fM-GAi化合物可以在MDCK細(xì)胞中以fM濃度抑制HGF/SF誘導(dǎo)的uPA-纖溶酶蛋白酶解作用(Webb等人，前述)。
上述實(shí)施例說(shuō)明，fM-GAi在fM水平不僅抑制uPA-纖溶酶活性，而且抑制HGF/SF誘導(dǎo)的擴(kuò)散(圖2A)。MDCK細(xì)胞看來(lái)是在HGF/SF誘導(dǎo)的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和uPA-纖溶酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)(表2)中這些高效作用的最敏感的指示器。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于鼠乳腺癌細(xì)胞系DA3和人類前列腺癌細(xì)胞系DU145，兩個(gè)細(xì)胞系均在HGF/SF的作用下擴(kuò)散，但是uPA活性沒(méi)有被HGF/SF誘導(dǎo)，并且擴(kuò)散只有在nM濃度時(shí)被抑制。對(duì)此結(jié)果的解釋是，HGF/SF可誘導(dǎo)的擴(kuò)散和uPA-纖溶酶上調(diào)與fM-GAi敏感性有關(guān)，如表2和圖1中結(jié)果所示。MDCK細(xì)胞仍是一種更好的測(cè)試系統(tǒng)，用于檢測(cè)fM-GAi對(duì)擴(kuò)散的影響。
同時(shí)在此第一次公開(kāi)了響應(yīng)HGF/SF的四種人類腫瘤細(xì)胞系中fM-GAi-介導(dǎo)的對(duì)uPA的抑制作用。因此，這些有效的作用也是人類腫瘤細(xì)胞的特性，不是MDCK細(xì)胞特有的東西。在敏感的人類細(xì)胞系中，uPA活性至少被HGF/SF上調(diào)了1.5倍，這看來(lái)是對(duì)于可靠測(cè)量fM-GAi抑制所必需的水平。在fM-GAi敏感的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系中，uPA活性基線發(fā)生了顯著的降低，但在非敏感性細(xì)胞系中，沒(méi)有發(fā)生這種降低，盡管其uPA活性基線可能比敏感性細(xì)胞系中的更高。許多GBM細(xì)胞系以自分泌方式表達(dá)HGF/SF和Met(Koochekpour等人，前述)，而“不敏感”細(xì)胞沒(méi)有一個(gè)是這樣。因此，基線的降低可以由作用方向?yàn)镠GF/SF誘導(dǎo)途徑的fM-GAi藥物的精巧的效能活性來(lái)解釋。另外，fM-GAi化合物抑制3種敏感的GBM細(xì)胞的侵入(體外)，以及平行地抑制uPA，這證明uPA抑制與腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移的因果相關(guān)性。
在nM濃度，GA藥物族的成員通過(guò)干擾HSP90α作為分子伴侶的功能以降低非正確折疊的癌蛋白來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)(Chavany等人，1996；Stebbins等人，1997；Whitesell & Cook，1996)。大部分已識(shí)別的細(xì)胞癌蛋白通過(guò)N末端的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域與HSP90結(jié)合，而該點(diǎn)也是與GA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(Chavany等人，前述；Mimnaugh等人，1996；Schneider等人，1996；Schulte等人，1997)。通常地，在用nM濃度的GA處理的細(xì)胞中，HSP90表達(dá)被上調(diào)，而癌蛋白在24小時(shí)內(nèi)降解。GA處理在6到24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)癌蛋白降解(Liu等人，1996；Maulik等人，前述；Nimmanapalli等人，2001；Tikhomirov & Carpenter，2000；Yang等人，2001)，并伴隨HSP90α表達(dá)的上調(diào)(Nimmanapalli等人，2001)。然而在人類小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系中，GA治療的效果是Met在HSP90表達(dá)幾乎沒(méi)有發(fā)生變化時(shí)就降解了(Maulik等人，前述)。
相反，此處表明，fM-GAi化合物在遠(yuǎn)低于引起HSP90上調(diào)或Met下調(diào)反應(yīng)的濃度下抑制擴(kuò)散、侵入和uPA活性。而且，即使在HGF/SF添加之后4小時(shí)才加入，fM-GAi化合物仍抑制uPA活性，盡管早在HGF/SF添加之后10分鐘關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)元件的磷酸化反應(yīng)就發(fā)生了。因此，這里已經(jīng)說(shuō)明，fM-GAi的抑制作用一定發(fā)生在Met信號(hào)傳導(dǎo)的下游。
具有比GA更高的HSP90結(jié)合親合力的RA只表現(xiàn)出nM-GAi uPA抑制。RA結(jié)合到與GA和fM-GAi相同的HSP90的ATP袋，但具有更高親合力(Roe等人，1999；Schulte等人，1999)。此發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，fM-GAi化合物通過(guò)非HSP90靶點(diǎn)抑制HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性、細(xì)胞擴(kuò)散和癌細(xì)胞侵入。對(duì)三種過(guò)程的同時(shí)抑制表明，fM-GAi藥物以HGF/SF調(diào)控的轉(zhuǎn)移/侵入途徑中一種共同的步驟為靶點(diǎn)。這并非沒(méi)有可能，HSP90分子伴侶的一個(gè)稀有亞類是fM-GAi抑制的原因。例如，Eustace等人(2004)提出，一種HSP90α異構(gòu)體在癌的侵入性中起關(guān)鍵作用，并且此異構(gòu)體是在細(xì)胞外表達(dá)并在細(xì)胞外相互作用以促進(jìn)MMP2激活。
為檢驗(yàn)此形式的HSP90α是否也是此處所述的敏感的uPA作用的原因，在uPA實(shí)驗(yàn)中使用GA珠進(jìn)行研究。用細(xì)胞外的GA親合力珠抑制HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性，僅在10-5M發(fā)生，證明uPA的fM水平抑制與這種HSP90α的胞外異構(gòu)體無(wú)關(guān)。依照本發(fā)明，具有一個(gè)新的fM-GAi藥物作用分子靶點(diǎn)。
成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是高侵入性腫瘤，HGF/SF對(duì)uPA-纖溶酶網(wǎng)絡(luò)的刺激是GBM侵入的關(guān)鍵步驟(Gondi等人，2003；Rao，2003)。這些腫瘤浸潤(rùn)到正常腦組織中并沿血管蔓延，所以完全切除它們是不可能的。80％的GBM腫瘤表達(dá)HGF/SF，而100％過(guò)度表達(dá)Met(Birchmeier等人，前述)。發(fā)現(xiàn)uPA活性在星形細(xì)胞瘤中(特別在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中)比在正常腦組織或低級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中更高(Bhattacharya等人，2001；Gladson等人，1995；Yamamoto等人，1994)，并且升高的uPA表達(dá)是一種預(yù)后不良的指示(Zhang等人，2000)。因此以Met和uPA為靶點(diǎn)的藥物可能對(duì)于新治療方法是重要的(Rao，2003)。一些本發(fā)明人及同事以前的研究測(cè)量了在一些GBM細(xì)胞系中的侵入可能性；DBTRG和U373是最具侵入性的細(xì)胞系(Koochekpour等人，1997)。SNB19細(xì)胞也是高侵入性的GBM細(xì)胞系(Lakka等人，2003)。如在此所示，所有三種侵入性的GBM細(xì)胞系表現(xiàn)出在極低濃度下fM-GAi對(duì)HGF/SF誘導(dǎo)的uPA活性和侵入性的抑制作用。17-AAG當(dāng)前處于對(duì)于幾種不同癌癥的臨床實(shí)驗(yàn)中(Blagosklonny，2002；Goetz等人，2003)，但未用于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。依照本發(fā)明，fM-GAi藥物對(duì)于GBM腦癌的治療是有效的。
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本文已經(jīng)全部地描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在不偏離本發(fā)明的主旨和范圍并且不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下，在等價(jià)的參數(shù)、濃度和條件的廣泛范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)相同的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種式I或式II所示的化合物 式I 式II或者其在藥學(xué)上可接受的鹽類；其在10-11M以下的濃度能抑制癌細(xì)胞中由HGF/SF導(dǎo)致的Met的激活，其中R1是低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈或支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺；任選被取代的3-6元環(huán)雜環(huán)基；R2是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈和支鏈的烷基胺、烯基胺和炔基胺；任選被取代的3-6元環(huán)雜環(huán)基；R3是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基；低級(jí)烷氧基、烯氧基和炔氧基；直鏈或支鏈的烷基胺、烯基胺、炔基胺；或其中N是任選被取代的雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基或雜芳環(huán)中的一個(gè)環(huán)原子。R4是H、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、任選被取代的低級(jí)烷基、烯基或炔基，且其中在C2＝C3、C4＝C5和C8＝C9位的環(huán)雙鍵任選被氫化成單鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其為式I的苯醌化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其為式II的氫醌化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其以低于10-13M的濃度在癌細(xì)胞中抑制由HGF/SF導(dǎo)致的Met的激活。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其以低于10-15M的濃度在癌細(xì)胞中抑制由HGF/SF導(dǎo)致的Met的激活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其以低于10-17M的濃度在癌細(xì)胞中抑制由HGF/SF導(dǎo)致的Met的激活。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物，其中R1是3-6元雜環(huán)，N是該雜環(huán)上的雜原子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的化合物，其中R2、R3和R4都是H。
9.權(quán)利要求1所述的化合物，其選自(a)17-(2-氟乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(b)17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(c)17-N-氮丙啶基-17-去甲氧基格爾德霉素；(d)17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(e)17-N-氮雜環(huán)丁烷基-17-去甲氧基格爾德霉素；(f)17-(2-二甲氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；(g)17-(2-氯乙基)氨基-17-去甲氧基格爾德霉素；以及(h)二氫格爾德霉素。
10.一種藥物組合物，其包括(a)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
11.一種抑制具有Met的腫瘤或癌細(xì)胞的HGF/SF誘導(dǎo)的、Met受體介導(dǎo)的生物活性的方法，其包括給所述細(xì)胞提供有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物抑制所述生物活性的IC50低于約10-13M。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的生物活性是在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)了uPA的活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的生物活性是所述細(xì)胞的生長(zhǎng)或擴(kuò)散。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)胞的生長(zhǎng)是在體外的生長(zhǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)胞的生長(zhǎng)是在體內(nèi)的生長(zhǎng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的生物活性是所述細(xì)胞的侵入。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞的侵入是在體外發(fā)生。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞的侵入是在體內(nèi)發(fā)生。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞的侵入導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。
20.一種抑制受試者體內(nèi)由HGF/SF誘導(dǎo)的具有Met的腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，其包括給所述受試者提供有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物在體外測(cè)得其抑制腫瘤細(xì)胞侵入的IC50低于約10-12M。
21.一種抑制受試者體內(nèi)由HGF/SF誘導(dǎo)的具有Met的腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，其包括給所述受試者提供有效量的權(quán)利要求10所述的藥物組合物，該藥物組合物包含在體外測(cè)得其抑制腫瘤細(xì)胞侵入的IC50低于約10-12M的化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求11-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制導(dǎo)致由所述細(xì)胞引起的腫瘤的可測(cè)得的消退，或所述受試者體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的可測(cè)得的衰減。
23.一種防止易感受試者體內(nèi)Met陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的方法，包括對(duì)下述之一的所述受試者提供有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物或權(quán)利要求10所述的藥物組合物(a)處于發(fā)生所述腫瘤的危險(xiǎn)中，或者(b)已經(jīng)治療的對(duì)象，處于復(fù)發(fā)所述腫瘤的危險(xiǎn)中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該受試者是人類。
25.一種在具有HGF響應(yīng)的Met表達(dá)的腫瘤的哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤或抗癌響應(yīng)的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物或權(quán)利要求10所述的藥物組合物，從而誘導(dǎo)抗腫瘤或抗癌響應(yīng)，其為(a)部分響應(yīng)，特征為(i)在所有可測(cè)量病變的兩條最大直徑的乘積至少減少了50％；(ii)無(wú)新病變的跡象；以及(iii)任何已存在的病變都無(wú)任何發(fā)展；或者(b)完全響應(yīng)，特征為腫瘤或癌的所有癥狀消失至少一個(gè)月。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗腫瘤或抗癌響應(yīng)是部分抗腫瘤或抗癌響應(yīng)。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物，其用鹵素放射性核素進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的化合物，其中所述放射性核素與R1基結(jié)合。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的化合物，其中所述放射性核素選自18F、76Br、76Br、123I、124I、125I和131I。
31.一種對(duì)作為權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述化合物的靶點(diǎn)的受試者中的腫瘤成像的方法，其包括給予有效量的權(quán)利要求28-30中任項(xiàng)所述標(biāo)記了的化合物，并且用成像方法對(duì)可檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行成像。
全文摘要
在飛摩爾濃度下阻礙uPA纖溶酶網(wǎng)絡(luò)和抑制成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和其它腫瘤的生長(zhǎng)和侵入的格爾德霉素衍生物是潛在高活性抗癌藥物。公開(kāi)了GA和不同的17－氨基－17－去甲氧基格爾德霉素衍生物在fM水平阻礙HGF/SF－介導(dǎo)的Met酪氨酸激酶受體依賴的uPA激活。其它袢霉素I和II)、GA衍生物和根赤殼菌素需要更高的對(duì)數(shù)級(jí)濃度(＞＝nM)，以達(dá)到這種抑制作用。受驗(yàn)化合物的抑制活性不同于已知的該類藥物與hsp90結(jié)合的已知能力，這表明在腫瘤發(fā)展中HGF/SF介導(dǎo)事件的新靶點(diǎn)的存在。公開(kāi)了使用這些化合物抑制癌細(xì)胞活性和治療腫瘤的方法。這種使用低劑量的這些高活性化合物的治療提供了治療不同表達(dá)Met蛋白的腫瘤的方法，特別是對(duì)于侵入性腦癌，并且可以單獨(dú)使用或者與傳統(tǒng)外科療法、化學(xué)療法或放射療法組合使用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1997632SQ200580017002
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者謝謙, 大衛(wèi)·文克特, 沈玉釵, 喬治·F.·范德沃德, 里克·海 申請(qǐng)人:范安德?tīng)栄芯繀f(xié)會(huì), 密執(zhí)安州大學(xué)