專利名稱：聚合物組合物和相關(guān)使用方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是2002年7月19日提交的美國專利申請10/199,960的部分連續(xù)申請，美國專利申請10/199,960要求分別于2001年7月20日和2002年4月19日提交的美國專利申請60/306,750和60/373,919的優(yōu)先權(quán)。本申請還要求2004年2月27日提交的美國專利申請60/548,314和2004年3月2日提交的美國專利申請60/549,259的優(yōu)先權(quán)。各專利均全文納入本文作為參考。
關(guān)于聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)的聲明根據(jù)國家健康研究院給予西北大學(xué)的基金DE13030、DE12599和DE14193以及NASA給予西北大學(xué)的基金NCC-1-02097，美國政府享有該發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
貽貝粘蛋白(mussel adhesive protein、MAP)是非常重要的水中粘附材料，其在貽貝和貽貝駐留的表面之間形成強韌連接。在連接到表面的過程中，MAP作為液體分泌出來，經(jīng)過交聯(lián)或硬化反應(yīng)形成固體斑塊。MAP的獨特特點之一是含有L-3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)—一種罕見的氨基酸，據(jù)信該氨基酸通過還未完全知曉的機制至少部分造成了MAP對基材的粘結(jié)。貽貝粘附到多種表面，包括金屬、金屬氧化物、聚合物、塑料和木材。
對于生物傳感器、醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品、所有需要處理血清和其它人體/動物體液的設(shè)備和試驗、組織工程、體內(nèi)局部藥物遞送、植入的醫(yī)療裝置、手術(shù)切口的愈合、以康復(fù)為目的的組織粘合例如骨和軟骨的粘合以及納米科技(基于納米顆粒的治療和診斷工具)，控制細(xì)胞和蛋白質(zhì)對表面的粘附都至關(guān)重要。在很多工業(yè)應(yīng)用中，控制細(xì)胞和蛋白質(zhì)對表面的粘附也很重要。這些應(yīng)用包括防止貽貝粘附到艇、船、橋墩以及海洋和淡水中所用的其它結(jié)構(gòu)上，防止海藻和細(xì)菌在工業(yè)用水和飲用水的水管線上以及用于檢測水質(zhì)和純度的傳感器上生長。
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已采用一些物質(zhì)的物理或化學(xué)固定作為限制蛋白和細(xì)胞吸附到表面上的策略，這些物質(zhì)如聚(環(huán)氧烷)(PAO)，如聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)和PEO-PPO-PEO嵌段共聚物，如商品名為PLURONICS的共聚物，以及聚合物例如PEG/四乙醇二甲醚、聚(異丁烯酸甲氧基乙酯)(PMEMA)和聚(異丁烯?；字Ｄ憠A)(聚MPC)(E.W.Merrill，Ann.NY Acad.Sci.，516，196(1987)；Ostuni等，Langmuir 2001，17，5605-20，納入本文作為參考)。當(dāng)前采用的用聚合物修飾表面的方法必須根據(jù)每種材料類型定制，因此需要不同的化學(xué)策略。例如，貴金屬例如鉑、銀和金的表面可用含有巰基(-SH)的分子修飾，而金屬氧化物則常常用硅烷偶聯(lián)化學(xué)來修飾。沒有一種表面修飾策略可通用于不同類型的材料。而且，很多現(xiàn)有方法依賴于昂貴的設(shè)備或復(fù)雜的合成方法，或者依賴于兩者。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及例如在基本為水性的環(huán)境中作為粘合劑的組合物。優(yōu)選的組合物一般包含粘性部分和聚合物部分，所述聚合物部分具有所需的表面活性效果(或其它所需特性)。
一方面，本發(fā)明組合物的粘性部分含有二羥基苯基衍生物，包括二(DHPD)，其中第二個DHPD是 即，二羥基苯基的亞甲基衍生物。
在另一方面，聚合物部分含有聚(環(huán)氧烷)。在非常優(yōu)選的實施方式中，粘性部分含有DHPD，例如，DOPA(如本文所述)，且聚合物部分含有PEO-PPO-PEO嵌段聚合物(如上所述)。
在另一個優(yōu)選實施方式中，粘性部分含有DHPD，其包括含有烯基(ethylenic)或乙烯基的(vinylic)不飽和部分，例如丙烯酸烷基酯的側(cè)鏈。
發(fā)明詳述更具體地說，本發(fā)明包括式(I)的二羥基苯基(DHPD)粘性化合物， 式中，R1和R2可相同或不同，各自獨立地選自氫、飽和和不飽和的、直鏈和支鏈的、取代和未取代的C1-4烴基；P單獨和獨立地選自-NH2、-COOH、-OH、-SH、 式中R1和R2如上所定義。
單鍵、鹵素， 式中A1和A2單獨和獨立地選自H、單鍵；保護(hù)基團，大致的聚(環(huán)氧烷)，
式中n是1至約3，A3是 R4是H、C1-6低級烷基，或聚環(huán)氧烷 R3如上所定義，D如式(I)所示。
在一個方面，所述聚(環(huán)氧烷)具有以下結(jié)構(gòu)， 式中，R3和R4單獨和獨立地選自H或CH3，m的值介于1至約250之間，A4是NH2、COOH、-OH，-SH、-H或保護(hù)基團。
非常優(yōu)選的DHPD形式是
R1、R2和P如上所定義。
進(jìn)一步優(yōu)選的DHPD形式具有下列結(jié)構(gòu) 式中，A2是-OH，A1大致是下列結(jié)構(gòu)的聚(環(huán)氧烷)， R3、R4和m如權(quán)利要求2所定義。一般，聚(環(huán)氧烷)是環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物。
本發(fā)明的一個方法包括將基材粘附到另外一個基材上，該方法包括提供具有下列結(jié)構(gòu)的DHPD的步驟
式中R1和R2如上所定義；將上述結(jié)構(gòu)的DHPD施加到要粘附的一個或另一個或兩個基材上；將要粘附的基材與位于它們之間的上述結(jié)構(gòu)的DHPD接觸以將所述基材彼此粘附，任選地通過分開基材和用位于基材之間的上述結(jié)構(gòu)的DHPD使基材再次互相接觸從而使基材相對于彼此易位(reposition)。
在優(yōu)選的方法中，R1和R2是氫。
定義用于本申請的目的，本發(fā)明二羥基苯基衍生物(DHPD)表示以下結(jié)構(gòu)的二羥基苯基衍生物 式中P、R1和R2如下所述，n為1至約5。在一個實施方式中，R1和R2是氫，P自身是二羥基苯基。在本發(fā)明實施方式中優(yōu)選的DHPD是L-3，4，二羥基苯基丙氨酸(DOPA)，(一般地)，
式中A1和A2如上所定義。
本文所用“大致的聚(環(huán)氧烷)(substantially poly(alkyleneoxide))”指組合物中主要或絕大部分是烷基化氧(alkyloxide)或烷基醚。該定義考慮了雜原子和官能團的存在，雜原子例如N、O、S、P等，官能團例如-COOH、-NH2、-SH以及烯基或乙烯基不飽和基團。應(yīng)理解的是，這些非環(huán)氧烷(non-alkyleneoxide)結(jié)構(gòu)存在的量只能是相對豐富，從而不會大大地減少聚合物的適當(dāng)?shù)目偙砻婊钚?、無毒性或免疫應(yīng)答反應(yīng)特性。
附圖簡述

圖1顯示PLURONICF127、其碳酸酯中間體(SC-PAO7)和DME-PAO7在CDCl3中的1H NMR譜。
圖2提供30重量％的DME-PAO7、DOPA-PAO7和未修飾的PLURONICF127水溶液的差示掃描量熱圖。箭頭表示凝膠化吸熱的位置。
圖3表示0.1Hz和0.45％應(yīng)變時22重量％DME-PAO7水溶液的剪切存貯模量(storage modulus)G’作為溫度的函數(shù)作圖。插圖所示是未修飾的PLURONICF127的22重量％水溶液的流變特征圖，流變特征是溫度的函數(shù)。
圖4表示0.1Hz和0.45％應(yīng)變時50重量％DME-PAO8水溶液的剪切存貯模量G’作為溫度的函數(shù)作圖。插圖所示是未修飾的PLURONICF68的50重量％水溶液的流變特征圖，流變特征是溫度的函數(shù)。
圖5表示0.1Hz和0.45％應(yīng)變時，45重量％或50重量％的DME-PAO8水溶液的存貯模量作為溫度的函數(shù)分別作圖。
圖6A個6B表示加熱時不同濃度的(A)DOPA-PAO7和(B)DME-PAO7的差示掃描量熱圖。箭頭表示只在較高聚合物濃度觀察到的膠化吸熱位置。
圖7A-C表示(A)未修飾的Au，(B)m-PEG-OH和(C)m-PEG-DOPA的高分辨C(ls)XPS峰。(C)中286.5eV時的醚峰的顯著增加表明存在PEG。
圖8A-C提供TOF-SIMS陽性光譜，顯示代表金與兒茶酚結(jié)合的峰。用Au峰(m/z～197)標(biāo)準(zhǔn)化該光譜。
圖9提供TOF-SIMS光譜，顯示未修飾的Au基材、接觸過mPEG-OH，mPEG-DOPA粉末或mPEG-DOPA的Au在質(zhì)量m/z～43時的陽性二級離子峰。
圖10表示TOF-SIMS光譜，顯示用mPEG-DOPA進(jìn)行化學(xué)吸附的Au基材的陽性二級離子峰。在m/z～225(AuOC)、254(AuOCCO)和309觀察到金與兒茶酚的結(jié)合。在m/z～434、450、462和478觀察到強度更弱的AuOaCb峰。在m/z為530-1150的范圍內(nèi)觀察到的周期性三重峰對應(yīng)于結(jié)合于DOPA-(CH2CH2O)n的Au，其中各亞峰被14或16amu分開，代表PEG鏈中的CH2、CH2CH2和CH2CH2O。在n＝1-15時觀察到該圖案。
圖11顯示吸附到修飾和未修飾的金表面的蛋白(0.1mg/ml BSA)的SPR譜。與裸露的金和mPEG-OH修飾的表面相比，mPEG-DOPA和mPEG-MAPd修飾的表面顯示出對蛋白的吸附減少。
圖12顯示防污行為的mPEG-DOPA濃度依賴。在所示mPEG-DOPA濃度中修飾金表面24小時，然后分析粘附的細(xì)胞的密度和面積。(*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001；黑棒＝總突出面積(total proj.area)，灰棒＝表面細(xì)胞密度)圖13比較在最佳條件(50mg/ml，24小時)下，裸露的金、mPEG-OH處理的金、用mPEG-DOPA 5K、mPEG-MAPd 2K和mPEG-MAPd 5K處理的金表面上細(xì)胞的粘附和擴散。(黑棒＝總保護(hù)面積，灰棒＝表面細(xì)胞密度，***＝p＜0.001)。
圖14A-C是一系列SEM顯微照片，顯示在(A)未修飾的Au，(B)用mPEG-OH處理的Au，和(C)mPEG-DOPA修飾的Au上NIH 3T3成纖維細(xì)胞的形態(tài)。所有的處理都是在DCM中于50mg/ml處理24小時。
圖15顯示懸浮在所示幾種濃度的NaCl水溶液中的mPEG-DOPA穩(wěn)定的磁性納米顆粒的UV/vis吸收光譜。加入NaCl未引起納米顆粒沉積。
圖16顯示向未處理的Au納米顆粒中加入鹽誘導(dǎo)聚集。所示為懸浮在(所示濃度)NaCl水溶液中的10nm未處理Au納米顆粒的UV/vis掃描圖。隨著NaCl濃度增加，520nm吸收帶的弱化和偏移反映了納米顆粒的聚集。
圖17顯示向mPEG-DOPA穩(wěn)定的Au納米顆粒中加入鹽不誘導(dǎo)聚集。所示為懸浮在(所示濃度)NaCl水溶液中的10nm mPEG-DOPA穩(wěn)定的Au納米顆粒的UV/vis掃描圖。隨著NaCl濃度增加，520nm吸收帶未發(fā)生弱化和偏移，反映了納米顆粒的有效穩(wěn)定化。
圖18顯示懸浮在(所示濃度)NaCl水溶液中的mPEG-DOPA穩(wěn)定的CdS納米顆粒的UV/vis吸收光譜。
圖19顯示未修飾的TiO2和用mPEG-DOPA1-3處理的TiO2的XPS檢測掃描圖(survey scan)。
圖20顯示TiO2和經(jīng)mPEG-DOPA1-3處理的TiO2上對細(xì)胞粘附的長期抗性。無污垢反應(yīng)的持續(xù)時間與DOPA肽錨定基團(anchoring group)的長度成比例。用calcium AM使粘附的細(xì)胞顯像。
圖21顯示經(jīng)mPEG-DOPA1-3修飾的TiO2基材的Cls區(qū)域的高分辨XPS掃描。注意隨著DOPA肽錨定基團的長度增加，醚碳峰(286.0eV)增加。
圖22顯示經(jīng)mPEG-DOPA1-3修飾的TiO2基材的Ols區(qū)域的高分辨XPS掃描。隨著DOPA肽長度的增加，532.9eV處代表聚合氧的峰增加，而Ti-O-H峰(531.7eV)減少。
圖23顯示在316L不銹鋼上的羅巴斯特設(shè)計實驗結(jié)果圖。
圖24顯示在50℃和所示pH值下用mPEG-DOPA1-3修飾24小時的各種表面上的4小時細(xì)胞粘附圖。
圖25顯示凝膠轉(zhuǎn)化率的百分比對UV照射時間(分鐘)作圖。
圖26顯示摻入的DOPA的摩爾分?jǐn)?shù)對前體溶液中1或7的摩爾％作圖。
圖27顯示凝膠轉(zhuǎn)化率的百分比對前體溶液中1或7的摩爾％作圖。
圖28顯示氮化硅表面的X射線光電子光譜XPS分析。
圖29顯示官能化的氮化硅懸臂的自由監(jiān)測(free monitoring)。
圖30是聚乙二醇的熵彈性(entropic elasticity)分析。
圖31是側(cè)鏈修飾的DOPA的力檢測。
圖32DOPA-T1O2結(jié)合機制的可能模型。
圖33是原子力顯微圖排列。
圖34是力量測量的有關(guān)數(shù)據(jù)。
圖35是粘性數(shù)據(jù)。
圖36是合成路徑和數(shù)據(jù)分析。
這些二羥基苯基衍生物(“DHPD”)粘合劑在水性環(huán)境中發(fā)揮作用。為了形成聚合物組合物，通常提供粘性官能的DHPD部分偶聯(lián)于提供所需表面活性效果的聚合物。下面將更詳細(xì)地描述這些組分。
這些粘性、聚合物組合物有很多用途，包括在各種醫(yī)學(xué)、工業(yè)和消費應(yīng)用中防止蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞粘附到表面上。DHPD還可用作傷口縫線的替代物，輔助骨折或軟骨-至-骨損傷的愈合。下面將更詳細(xì)地描述這些以及其它應(yīng)用。
本發(fā)明優(yōu)選的聚合物組合物具有下列結(jié)構(gòu) 其中，對于式(1a)的各化合物，R1和R2單獨和獨立地如上所定義，P1和P2單獨和獨立地如式(I)中的P所定義；n和m獨立為0至約5，條件是n或m中的至少一個至少是1；粘性部分本發(fā)明的粘性部分是具有下列優(yōu)選結(jié)構(gòu)的二羥基苯基衍生物(“DHPD”)
其中R1、R2和P如上所定義，t是1至約10，優(yōu)選約為1-5，最優(yōu)選1至約3。DHPD粘合可在水性環(huán)境中發(fā)揮作用。在本文中，水性環(huán)境是含有水的任何介質(zhì)。其包括但不限于水，包括鹽水和淡水，細(xì)胞和細(xì)菌生長培養(yǎng)基溶液，水緩沖液，其它基于水溶液和體液。DHPD部分可以被衍生化。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，這種衍生化受要保留的所需粘附特性的限制。
聚合物組分知道本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員將會熟知提供表面活性效果和其它所需特性的各種聚合物組分。所需的表面活性效果與減少的顆粒凝聚和抗生物污垢有關(guān)，所述抗生物污垢包括抗細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)粘附。例如，根據(jù)最終的用途，聚合物組分可以是水溶性的，和/或根據(jù)多種其它的最終用途，聚合物組分能夠形成膠團?？捎糜诒景l(fā)明的聚合物包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚環(huán)氧丙烷(PPO)、PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、聚苯醚、PEG/四乙醇二甲醚、PMEMA、聚MPC和全氟化的(perfluorunated)聚醚?？赏ㄟ^幾種途徑合成聚合物組合物。例如，可通過活化聚合物末端基團的一般合成方法來合成聚合物組合物?？捎锰妓狨セ瘜W(xué)來活化各種聚合物或其單體組分。具體地說，琥珀酰亞胺碳酸酯活化的聚合物組分與DHPD部分反應(yīng)可提供穩(wěn)定的氨酯(urethane)偶聯(lián)物(conjugate)。很多可能途徑中的兩種，即下圖方案1a、1b中的途徑(a)和(b)，顯示了在水性和非水性溶劑中與聚(環(huán)氧烷)的偶聯(lián)，同時沒有損壞所需的生物粘附性。例如，通過形成氨酯或酰胺鍵，DHPD殘基可偶聯(lián)到聚合物組分上以提供所需的偶聯(lián)組合物。這些合成途徑示于方案1a和1b，并在下文中更詳細(xì)地描述。
方案1a
方案1b
更具體地，如果通過形成氨酯鍵偶聯(lián)于聚合物組分，可用多種其它官能團來酯化或衍生DHPD組分的羧酸基團?；蛘?，可將DHPD組分偶聯(lián)于聚合物組分(例如，根據(jù)聚合物末端基團，-NH2或-OH，可發(fā)生酰胺化或酯化)，提供可用各種已知的保護(hù)基團衍生的DHPD官能團，所述保護(hù)基團包括但不限于，Boc、Fmoc、硼酸鹽、磷酸酯和三丁基二甲基甲硅烷基。DHPD組分的N-端保護(hù)可使羧酸基團能夠用于多官能化衍生和/或偶聯(lián)更高密度的聚合物組分。
因此，本發(fā)明的一部分還提供一種用氨酯合成方法將DHPD殘基摻入到聚合物系統(tǒng)中的方法。該方法包括(1)提供末端為多個單體的聚合物組分，各單體具有末端官能基團；(2)制備所述聚合物組分的碳酸酯衍生物；和(3)所述碳酸酯衍生物和至少一個DHPD部分反應(yīng)制備氨酯部分。如上所述，該方法所用的聚合物組分可包括具有末端單體官能團的聚合物組分，其中末端單體官能團可與某試劑反應(yīng)提供所需的碳酸酯衍生物，并最終提供將聚合物組分和DHPD組分偶聯(lián)的氨酯部分。也可采用其它多種偶聯(lián)劑和/或羥基末端聚合物組分來提供所需的氨酯部分。
本發(fā)明的一部分還提供用碳酸酯中間體保持摻入DHPD的聚合物組合物和/或系統(tǒng)的兒茶酚官能團的方法，或者增強其粘附性。該方法包括(1)提供末端為多個單體的聚合物組分，各單體具有末端官能基團；(2)所述聚合物組分與某試劑反應(yīng)以提供碳酸酯中間體；和(3)所述碳酸酯中間體和至少一個DHPD部分反應(yīng)。不受任何理論和實施方式的限制，本發(fā)明的方法可認(rèn)為是一種通過合適的碳酸酯中間體增強聚合物組分的末端基團反應(yīng)性的方法。在DHPD部分的氨基氮上發(fā)生的后續(xù)反應(yīng)提供了相應(yīng)的偶聯(lián)物同時保持了兒茶酚官能團。
根據(jù)本發(fā)明，如方案1a所示，可用各種合成途徑將DHPD部分偶聯(lián)到所述碳酸酯活化的中間體上。在亞硫酰氯存在下DOPA與甲醇反應(yīng)得到的DOPA甲酯(DME)可在有機溶劑中使用?？捎肨LC和NMR監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，實際上偶聯(lián)反應(yīng)在1小時內(nèi)完成(代表性偶聯(lián)物是DME-PAO7(來自PAO PLURONICF127)和DME-PAO8(來自PAO PLURONICF68))。用冷甲醇純化后，獲得了高產(chǎn)物收率。
可在堿水溶液中將游離羧基形式的DOPA偶聯(lián)于碳酸酯中間體。眾所周知，操作DOPA的主要困難是其很容易氧化(成為DOPA醌和其它產(chǎn)物)，而氧化在堿水溶液中很容易發(fā)生。為了防止堿性條件下偶聯(lián)過程中DOPA兒茶酚側(cè)鏈的不希望的氧化，可先將DOPA加入硼酸鈉水溶液中形成硼酸鹽保護(hù)的DOPA(方案1b)。產(chǎn)生的絡(luò)合物在中性或堿性溶液中非常穩(wěn)定，而且在酸性條件下很容易去保護(hù)。利用DOPA和硼酸鹽的絡(luò)合，在堿性條件下將DOPA與幾種市售PAO的末端偶聯(lián)，產(chǎn)生DOPA-PAO7和DOPA-PAO8。目測反應(yīng)溶液發(fā)現(xiàn)不存在強吸收性的DOPA-醌，表示在反應(yīng)過程中DOPA未被氧化。反應(yīng)結(jié)束時，用HCl酸化將嵌段共聚物的DOPA末端基團去保護(hù)。
1H NMR譜和比色測定證實了方案1中琥珀酰亞胺活化的反應(yīng)中間體和所有4種DOPA-修飾的PAO的組成。圖1所示是PAO PLURONICF127、琥珀酰亞胺碳酸酯活化的中間體(SC-PAO7)和相應(yīng)的DOPA甲酯修飾的PAO(用PLURONICF127，DME-PAO7)的1H NMR譜。在含有DOPA的PAO的1H NMR譜中，來自琥珀酰亞胺基碳酸酯基團的-CH2-質(zhì)子在～2.8ppm形成的尖峰，和-CH2-O-質(zhì)子(來自活化的PAO中毗鄰碳酸酯基團的唯一的環(huán)氧乙烷基團)在～4.4ppm形成的尖峰完全消失了，而由于DOPA部分摻入到共聚物中，出現(xiàn)了一系列新峰。含有DOPA的PAO的1H NMR譜的一個特征是在6.5-6.9ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)了(對應(yīng)于DOPA苯環(huán)的三個質(zhì)子)一個單峰和兩個雙峰。水溶液中合成的DOPA-PAO偶聯(lián)物的1H NMR譜(未示出)也觀察到類似的特征。
假定在相應(yīng)的碳酸酯中間體SC-PAO7和SC-PAO8中存在兩個琥珀酰亞胺基碳酸酯基團，根據(jù)這種假設(shè)，用比色分析定量測定了DOPA甲酯和DOPA對這兩種POA的偶聯(lián)效率是76％-81％(表1)。報道的偶聯(lián)效率是相同條件下至少3次重復(fù)合成的平均值，并且當(dāng)反應(yīng)中使用更過量的DOPA時，未觀察到偶聯(lián)效率的顯著增加。從水溶液中制備的DOPA-PAO7和DOPA-PAO8也觀察到類似的偶聯(lián)效率，說明在含有Na2B4O7的堿水溶液中，琥珀酰亞胺基碳酸酯活化的PAO的水解緩慢。
與偶聯(lián)效率相反，在水溶液中合成的選擇性的DOPA-修飾的PAO的產(chǎn)物收率(如圖1所示)比有機溶劑中合成的選擇性的DOPA-修飾的PAO的產(chǎn)物收率低。這可能是因為起始的PAO材料的表面活性劑性能，造成用二氯甲烷從水中萃取DOPA-修飾的PAO時效率低。應(yīng)注意，可用標(biāo)準(zhǔn)的肽化學(xué)將DOPA-PAO7和DOPA-PAO8的游離羧酸進(jìn)一步官能化以定制嵌段共聚物的性能。表1中的4種DOPA-修飾的PAO可存貯在-20℃，可能不會發(fā)生變色或性質(zhì)改變。
表1DOPA修飾PLURONIC的偶聯(lián)效率和產(chǎn)物收率

*用Waite和Benedict(Waite，J.H.&Benedict，C.V.無脊椎動物結(jié)構(gòu)蛋白中二羥基苯丙氨酸(多巴)的測定，Methods in Enzymology 107，397-413(1984)，納入本文作為參考)所揭示的比色法測定。
對于生物傳感器的性能、醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品、所有需要處理血清和其它人體/動物體液的設(shè)備和試驗、組織工程、體內(nèi)局部藥物遞送、植入的醫(yī)療裝置、手術(shù)切口的愈合、以康復(fù)為目的的組織粘合例如骨和軟骨的粘合以及納米科技(基于納米顆粒的治療和診斷工具)，控制細(xì)胞和蛋白質(zhì)在表面的粘附都至關(guān)重要。在很多工業(yè)應(yīng)用中，控制細(xì)胞和蛋白質(zhì)在表面的粘附也很重要。這些應(yīng)用包括防止貽貝粘附到艇、船、橋墩以及海洋和淡水中所用的其它結(jié)構(gòu)上，防止海藻和細(xì)菌在工業(yè)用水和飲用水的水管線上以及用于檢測水質(zhì)和純度的傳感器上生長。
本發(fā)明的聚合物組合物可用作涂層以防止蛋白質(zhì)和細(xì)胞粘附到用于醫(yī)學(xué)和研究用途的裝置上，包括但不限于用作醫(yī)療植入物的涂層、外科手術(shù)裝置的涂層、處理血清和其它動物或人體衍生物質(zhì)的裝置的涂層，醫(yī)學(xué)診斷裝置的涂層和生物傳感器的涂層?；蛘?，所述聚合物組合物可以是用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用例如組織密封的組織粘合聚合物水凝膠，用于防止手術(shù)粘合(瘢痕組織形成)的凝膠，骨和軟骨粘合劑，組織工程，特定位點的藥物流出，以及用于研究用途，例如蛋白質(zhì)(包括抗體)和小分子分析物(包括藥物)的固定。此外，這些涂層和水凝膠在工業(yè)和消費產(chǎn)品中也有很多用途，包括但不限于，防止海運中的生物污垢(海藻、細(xì)菌和貽貝粘附到水下表面)，防止流到工廠例如電力和制藥工廠的水流中的細(xì)菌污染，防止飲用水中的細(xì)菌污染，作為牙齒和義齒粘合劑，輸送指示器的水下粘合劑，水純度和檢測傳感器的涂層，用于防止生物污垢的油漆，用于化妝品中將所需的香味劑和著色劑粘附到頭發(fā)、眼瞼、嘴唇和皮膚上，以暫時性給皮膚著色，如文身等，以及用于消費產(chǎn)品如存貯袋的可再密封性粘合劑。本發(fā)明的方法可用于制備多種聚合物修飾的表面，用于醫(yī)學(xué)(診斷學(xué)、裝置、基于納米顆粒的治療)和非醫(yī)學(xué)(油漆和其它顆粒分散液、MEMS、量子點(quantum dot)、無污垢表面)技術(shù)。
也可用本發(fā)明的方法形成粘性水凝膠。將DHPD粘合劑連接于可在體內(nèi)或體外形成水凝膠的聚合物?？捎煤芏喾椒ㄐ纬蛇@些水凝膠，包括采用在較高溫度例如人體正常溫度形成凝膠的自組裝聚合物，采用可用酶反應(yīng)交聯(lián)的聚合物，采用可使之氧化形成交聯(lián)水凝膠的聚合物，以及采用可使之光活化以產(chǎn)生交聯(lián)水凝膠的聚合物。
抗生物污垢涂層本發(fā)明的抗生物污垢涂層可施加于醫(yī)學(xué)裝置，如血管或動脈支架、起搏器、心臟瓣膜、葡萄糖監(jiān)測器和其它生物傳感器、血管外皮、除纖顫器、矯形外科裝置和手術(shù)裝置，包括縫線和導(dǎo)管。本發(fā)明的聚合物組合物可用作涂層以防止蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞粘附到用于醫(yī)學(xué)或研究應(yīng)用的裝置上。這些應(yīng)用包括但不限于，用作醫(yī)學(xué)植入體的涂層、手術(shù)裝置的涂層、處理血清和其它動物或人體衍生物質(zhì)的裝置的涂層、醫(yī)療診斷裝置和生物傳感器。用聚合物修飾生物材料表面以抗細(xì)胞粘附的挑戰(zhàn)包括產(chǎn)生足夠高密度的、能夠排斥蛋白質(zhì)和細(xì)胞的聚合物，以及產(chǎn)生完全覆蓋所述表面的涂層。這在含有多種不同材料制成的組分的裝置中尤其成問題?？山?jīng)任意多種途徑用本發(fā)明的聚合物聚合物修飾表面。例如，可將聚合物組合物吸附到表面，或?qū)⒑芯酆弦l(fā)劑的DHPD部分吸附到表面上，聚合物的生長從該表面開始。后一種情況中，可采用多種聚合技術(shù)，包括但不限于，表面引發(fā)自由基聚合、自由基聚合方法、離子聚合、開環(huán)聚合和光致聚合。
例如，利用PEG獨特的溶解性，可在接近臨界溶液溫度下限(LCST)或混濁點(cloud point)的溫度用PEG溶液處理表面以增加聚合物的密度。雖然不受任何理論限制，但申請人相信，在本發(fā)明中所用高離子強度和升高的溫度條件下，PEG分子的水壓半徑(hydrodynamic radius)降低，原則上比標(biāo)準(zhǔn)條件下允許更高密度的PEG鏈堆積到表面上。該方法可用于在高溫和高離子強度下出現(xiàn)溶解度逆轉(zhuǎn)的聚合物，例如，聚乙二醇、聚(N-異丙基丙烯酰胺)和其它N-取代的聚(丙烯酰胺)等顯示溶解度逆轉(zhuǎn)的聚合物。
通過用本發(fā)明的各種聚合物組合物修飾表面，使對細(xì)胞和蛋白質(zhì)粘附的抗性高達(dá)7天、14天、21天、30天、60天、90天和120天或更長。經(jīng)修飾的材料對細(xì)胞和/或蛋白粘附抗性的絕大部分變化是粘性組分中DHPD部分的數(shù)目和修飾緩沖液的pH值造成的。對于用吸附法進(jìn)行修飾的表面，吸附時間和聚合物組合物的濃度對經(jīng)修飾的材料對細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)粘附抗性的變化的影響很小。粘性組分中DHPD部分單體的數(shù)目越多，對細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)的粘附抗性越大。表面上聚合物組合物的密度與對細(xì)胞和/蛋白質(zhì)粘附抗性的相關(guān)性很大。涂層的厚度可以是約20-100μm，包括30，取決于所用的聚合物組合物和修飾緩沖液的pH。
用于修飾表面的聚合物組合物的濃度可以是約.1mg/ml-75mg/ml。修飾緩沖液的pH可以是約3-9。修飾時間可以是約10分鐘-約72小時。修飾過程所用溫度可以是約25℃-60℃。
如圖19所示，未修飾TiO2的XPS檢測掃描在～458eV(Ti2p)和～530eV(Ols)有強峰，這代表初始氧化物的特征，還在248.7eV(Cls)有一個小峰，是外來的烴類污染。但是在混濁點條件下用mPEG-DOPA1-3處理的TiO2顯示出表面結(jié)合的碳顯著增加(如Cls所示)，說明表面上存在PEG。而且，用mPEG-DOPA1-3處理后觀察到的Cls峰的增加直接與存在的末端DOPA的數(shù)目成比例。另外，用mPEG-DOPA1-3修飾的TiO2表面的光譜中觀察到在400eV(Nls)有一個小峰，代表DOPA中的酰胺氮。
基材表面的高分辨XPS數(shù)據(jù)的定量分析可提供結(jié)合于表面的PEG相對量的有用信息。表2顯示mPEG-DOPA1-3修飾的TiO2中鈦、氧和碳的原子組成計算。氧信號進(jìn)一步被分成金屬氧化物(Ti-O-Ti)、表面氫氧化物(Ti-O-H)和有機氧以及配對的水(coupled water)(C-O，H2O)等亞類。
表2鈦、氧和碳的原子組成計算

a忽略了痕量的氮。
b假定為結(jié)合于表面的水。
所有基材的TiTi-O-Ti比例都與2.0的理論化學(xué)計量值相差很大；這種差別可能是因為取樣深度超過了表面氧化物的深度(3-4mm)。考慮到5000MwPEG(2.8mm)的Flory半徑和通常的5-10mm的XPS取樣深度，該結(jié)果在預(yù)期內(nèi)。在經(jīng)mPEG-DOPA1-3修飾的表面上，隨著DOPA肽長度的增加，Ti∶C原子比例大大減低，相應(yīng)于吸附的PEG數(shù)目的增加。觀察到C有機氧(C-O)的比例超過了純PEG的理論值2.0，說明在修飾的表面上仍有外來烴類污染。這些結(jié)果示于表3。
表3吸附的聚合物組合物的原子比例

DOPA與TiO2產(chǎn)生很強的、可逆轉(zhuǎn)的鍵。該鍵的鍵能為30.56kcal/mol，在單個分子水平需要約800pN的力才能從TiO2上分離，比卵白素和生物素的相互作用強4倍。DOPA-TiO2相互作用力約處于卵白素-生物素相互作用力(生物學(xué)中基于氫鍵的最強作用力之一(0.1-0.2nN))和共價鍵(＞2nN)之間。
為了適當(dāng)?shù)匮芯緿OPA的粘附，采用了以下條件單分子方法，水性環(huán)境，用于固定DOPA的平臺。選擇原子力顯微鏡(AFM)作為研究工具，因為它可以滿足上述3個條件，并且對于檢測軟材料的粘彈性性質(zhì)是足夠靈敏的，所述軟材料如單分子水平的蛋白質(zhì)、DNA和合成的聚合物。將胺部分摻入到懸臂末端(Si3N4)，然后偶聯(lián)甲氧基-聚(乙二醇，mPEG)和Fmoc-封端的PEG(Fmoc-PEG)衍生物的混合物。(Boc-)DOPA偶聯(lián)到由于Fmoc斷裂而產(chǎn)生的氨基(圖33C)。使用了相對于DOPA-PEG過量5-10摩爾的mPEG，從而可分離單個、未固定的DOPA4 PEG。這種分子構(gòu)型在空間上阻礙了DOPA-PEG的分子動力學(xué)，從而為后面的DOPA氧化試驗結(jié)果提供了一種解釋(圖36)。用X射線光電子光譜(XPS)來監(jiān)測化學(xué)反應(yīng)步驟，顯示出在平坦的氮化硅表面(1×1cm2)上的成功的PEG修飾(圖28)。引入到氮化硅末端(tip)表面的化學(xué)基團改變了靜電特性，這也是表面修飾的一個很好的指示(圖29-A)。注意有一點很重要的是，在裸露的和經(jīng)修飾的懸臂之間檢測到來臨信號(approaching signal)的不同，代表了由于分子層造成的阻力(圖29-B)。
DOPA偶聯(lián)的懸臂表現(xiàn)出附有PEG鏈的熵彈性的很大的粘性(圖34)。力分布的柱狀圖呈單式型(uni-modal shape)，說明只發(fā)生了一次粘附事件，與多價蛋白卵白素12不同。收集了力-距離(F-D)測量結(jié)果并進(jìn)行了統(tǒng)計分析(圖34，n＝105)。負(fù)載速率為180nN/s時，在水中的平均力是785pN。最重要的是，伸長的PEG的長度(36nm)與期望的PEG分子的外形(contour)長度一致(37nm，圖30)。這些數(shù)據(jù)都用來說明一個分子事件DOPA的單價結(jié)合、PEG的多分散性和尖端幾何(tip geometry)。單個的DOPA被偶聯(lián)到聚合物鏈的末端，作為TiO2表面上的一個結(jié)合單元(圖33)。該單價連接與金屬-6組氨酸(金屬-(His)6)研究中不同，后者中鏈接的(His)6提供3個金屬螯合位點(3×金屬/(His)2)13-15。此外，因為PEG的多分散性(樹)和球狀尖端(山)(r＝25nm)，PEG5懸臂的“山-樹”樣構(gòu)型可分開兩個不同的DOPA分離信號。
“d”定義為回縮過程中單個DOPA-PEG分子完全伸展時壓電裝置的z-移位距離(圖34C)。在多次重復(fù)的循環(huán)中，雖然‘d’值有輕微變化，但看起來基本是恒定的(圖34A)。這種小的變化可能是因為DOPA以不同的角度結(jié)合到表面。我們的試驗一個很重要的特點是未結(jié)合信號是用‘同樣的’DOPA分子所進(jìn)行的重復(fù)。這與傳統(tǒng)的單分子提拉試驗(single molecule pulling experiment)中尖端(tip)隨機地提起一個分子形成對比。這也證明，DOPA粘合化學(xué)是完全可逆的。這種可逆性使我們得到這樣一個結(jié)論，即基材和尖端(TiO2～Si3N4)的最弱化學(xué)鍵是Ti(表面)-O(DOPA)鍵。
該結(jié)果說明，在～0.8 nN時，，從機械角度來說，DOPA-TiO2的相互作用力處于卵白素-生物素相互作用力(生物中最強的基于氫鍵的相互作用力的一種(0.1～0.2nN))和共價鍵(＞2nN)之間。從通過改變負(fù)載速率(每單位時間施加的力)獲得的力量數(shù)據(jù)中獲知能量信息。負(fù)載速率4個數(shù)量級的改變產(chǎn)生4種不同的力分布，以確定DOPA結(jié)合的能量情況。圖34D中線性的力對負(fù)載速率的對數(shù)作圖提供了結(jié)合能和距離，然后沿施力方向去除結(jié)合。DOPA的能壘是28.1kcal/mol，達(dá)到最大活化能的距離是1.27(圖34E)。
DOPA的結(jié)合取向據(jù)信是與芳環(huán)上的兩個羥基向下指向表面。因此，確定在AFM中引起單分子粘附信號的化學(xué)基團對于排除由不同取向造成的其它結(jié)合化學(xué)非常重要。采用了兩種方法。
第一，叔(ertary)丁基二甲基硅氧烷(TBDMS)對羥基進(jìn)行的共價化學(xué)修飾，導(dǎo)致在兩百個行進(jìn)-回縮循環(huán)(approach-retraction cycle)中未發(fā)生結(jié)合(圖31，第一條線)。然而，TBDMS基團的去保護(hù)重新產(chǎn)生了DOPA的結(jié)合能力(圖31，底部兩條線)。
第二，用硼酸鹽離子絡(luò)合進(jìn)行保護(hù)也完全抑制了DOPA的強烈粘附(圖31，n＝200)。這些數(shù)據(jù)清楚地確定了DOPA的二羥基是強烈、可逆結(jié)合的真正結(jié)構(gòu)來源。
貽貝發(fā)展出一種很有趣的方式產(chǎn)生這樣一種在水中的強烈粘合，這種有趣的方式就是用酪氨酸羥化酶對酪氨酸進(jìn)行翻譯后修飾。用酪氨酸為底物，這種酶催化加一個羥基的反應(yīng)。大量的這種酶發(fā)現(xiàn)于threads and plaques中，而DOPA也存在threads and plaques中。令人吃驚的是，很小的翻譯后修飾(-OH)似乎產(chǎn)生了巨大的粘附能力變化。因此，設(shè)計了試驗以顯示翻譯后修飾和結(jié)合能力之間的關(guān)系。
制備了用酪氨酸而非DOPA鏈接的懸臂，研究了酪氨酸在TiO2上的粘附。除了一些概率很低的非特異性粘附外，未觀察到可檢測的力信號(圖35A)。為了排除這樣一種假說，即該試驗中所用的尖端不含有任何酪氨酸分子，用金代替了TiO2表面。通過π-π電子相互作用，酪氨酸的芳環(huán)以與表面平行的取向結(jié)合于金表面，該機制在表面吸附化學(xué)18，19中是眾所周知的。TiO2中所用的相同懸臂在金表面多次產(chǎn)生強烈的粘合(圖35B)。力分布的統(tǒng)計分析顯示π-π電子結(jié)合力為398(±98)pN，是DOPA-TiO2相互作用力的約50％(圖35C)。來自酪氨酸-金結(jié)合的力信號也顯示出與前面示出的DOPA-TiO2相互作用同樣的特征具有預(yù)期外形長度的PEG彈性伸長和具有類似的‘d’值的重復(fù)信號形狀(圖33C)。該試驗中，清楚地證明酪氨酸羥化酶介導(dǎo)的翻譯后修飾大大提高了DOPA的結(jié)合能力，從幾乎是零提高到800pN。
DOPA的生物作用不只是在氧化之后具有粘性它還可與多肽鏈交聯(lián)，產(chǎn)生比在threads and pads中發(fā)現(xiàn)的更為堅硬的物質(zhì)。交聯(lián)機制有多種途徑，這些途徑起始于化學(xué)不穩(wěn)定性的DOPA醌結(jié)構(gòu)。在貽貝粘蛋白20中已發(fā)現(xiàn)芳基-芳基環(huán)偶聯(lián)(二-DOPA)，在其它物種中發(fā)現(xiàn)了邁克爾加成(醌-烷基胺加合物)產(chǎn)物，但這種加成產(chǎn)物未在貽貝中發(fā)現(xiàn)(圖36A)。因此，這些結(jié)構(gòu)也有可能因貽貝中的氧化而發(fā)生。這從交聯(lián)角度來講是很清楚的，但是對于成熟(即氧化)后的粘性還存在爭議。已證明DOPA醌結(jié)構(gòu)不是形成粘性的主要因素。通過甲氧基-PEG分子(5～10摩爾當(dāng)量)的過量共軛(它是防止DOPA醌進(jìn)一步反應(yīng)的重要分子構(gòu)型)來使DOPA醌-PEG鏈在空間上和化學(xué)上被穩(wěn)定化。
由pH增加(＝9.7)引發(fā)的單分子DOPA醌的時間分辨的(Time-resolved)監(jiān)測力信號揭示了隱藏至今的有趣事實。第一，檢測到的AFM信號根據(jù)力的量級(強力(high force)和弱力(low force))有兩個明顯的分布(圖36B)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析產(chǎn)生了兩個清楚的柱狀圖，弱力為178±62pN，強力為741±110pN(圖36C)。醌的結(jié)合可歸屬于弱力區(qū)域，因為該區(qū)域只在氧化開始之后才出現(xiàn)，并且隨后隨著時間的進(jìn)展更為頻繁(圖36D)。DOPA氧化的緩慢動力學(xué)特征促成了DOPA信號最初的高頻率。這是檢測受外界刺激后小分子結(jié)構(gòu)改變的第一個單分子試驗?；谶@些結(jié)果，可排除DOPA醌結(jié)構(gòu)造成高粘性的可能性。因此，不受任何理論的限制，氧化過程中還原形式即DOPA的二-羥基基團的重新產(chǎn)生據(jù)信是維持或改變界面處含DOPA材料的粘性的一個很重要的必需條件。
此外，DOPA錨定系統(tǒng)可以是研究其它可延展性生物大分子例如聚糖、DNA和蛋白質(zhì)的新平臺。在所進(jìn)行的研究中，已顯示了PEG(Mw 3400)的彈性性質(zhì)，該PEG長度據(jù)信是迄今研究的最短的鏈長度。之所以能實現(xiàn)該研究只是因為在兩端用了兩種確定的錨定方法(1)PEG和懸臂之間的共價鍵，和(2)PEG和基材之間的DOPA錨定。這種方法與常規(guī)的單分子試驗也形成高度對比，在常規(guī)的單分子試驗里，懸臂的每一次運動中尖端“見到”不同的分子。對于研究分子對外部刺激的反應(yīng)，如果給予的刺激并非百分之百有效23，將會是進(jìn)行研究的很大障礙?；贒OPA的錨定系統(tǒng)可以作為替代技術(shù)來克服現(xiàn)有單分子提拉試驗中的這些問題。
當(dāng)前，還沒有清楚的答案說明為什么DOPA的作用方式像一種可逆的膠水類似于“即時貼”。有兩種分子結(jié)合模型，單核二齒螯合物(圖32A，右)和雙核二齒螯合物(圖32A，左)，但這兩種模型都沒有考慮到DOPA的可逆結(jié)合，因為這些研究只專注于吸附過程而非解吸附過程25。因此，假定這種化學(xué)結(jié)合的本質(zhì)主要是共價結(jié)合，與由于吸附之后水分子的去除而產(chǎn)生的因素?zé)o關(guān)。一個利用FTIR進(jìn)行的研究表明，DOPA-TiO2結(jié)合的本質(zhì)可能60％是離子結(jié)合，40％是共價結(jié)合?；谶@種發(fā)現(xiàn)，修訂了一種分子吸附模型以加入可逆性，其中水中形成多個氫鍵(Fig 32B)。
圖33試驗設(shè)計和單分子DOPA粘附一幅圖描述了藍(lán)色貽貝(Mytilus Edulis)如何粘附到金屬氧化物表面上。圓圈包括一個斑塊，其中發(fā)現(xiàn)了罕見的氨基酸DOPA。
(B)貽貝斑塊中發(fā)現(xiàn)的兩種主要蛋白質(zhì)組分，Mefp-3和Mefp-5。這些貽貝粘蛋白中DOPA的含量很高，在Mefp-5中為27 mole％，在Mefp-3中為21％。粗體Y(Y)DOPA，斜體S(S)磷酸絲氨酸，斜體R(R)羥基精氨酸。
(C)AFM尖端修飾。3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的聚合將氨基基團引入到Si3N4尖端表面(未畫出)。長鏈描述末端與單分子(Boc)-DOPA偶聯(lián)的PEG分子。用摩爾比例為5～10∶1的mPEG-NHS(2k)和Fmoc-PEG-NHS(3.4k)的混合物來穩(wěn)定DOPA-PEG分子(見補充部分更詳細(xì)的描述)。
圖34.單分子力測量和DOPA結(jié)合到TiO2表面的能量情況測定4個代表性AFM單分子DOPA從一個懸臂解離的信號。這4個信號不是連續(xù)產(chǎn)生的(刪除了未顯示任何粘合的信號)。雖然檢測到DOPA粘合的幾率很小(5～10％)，但檢測到的信號顯示出類似的‘d’值(參見圖34C)。
(B)柱狀圖描述力的分布。負(fù)載速率為180nN/秒時平均值是781±151pN(n＝105)。
(C)距離‘d’的定義，當(dāng)DOPA-PEG分子完全伸展時壓電裝置的z-向運動距離。
(D)結(jié)合力(直線)對負(fù)載速率(log)作圖。負(fù)載速率是懸臂的彈簧常數(shù)和提拉速度的乘積。選擇了4個不同的負(fù)載速率1500、180.7、28.4和2nN/秒。圖示了各給定的負(fù)載速率下的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均力。力是846.48±157pN(1500nN/s)、781±151pN(180nN/s)、744±206pN(28.4nN/s)和636.2±150(2nN/s)。
(E)圖示DOPA結(jié)合的能量情況。外力使能量分布發(fā)生了傾斜，降低了反應(yīng)配合物的能壘。線性回歸圖的斜率(＝kBT/xb)是32.31，這樣活化障礙(activationbarrier)(xb)的距離為1.27。當(dāng)負(fù)載速率等于零時能壘高度是由外推法確定的(Eb＝28.1kcal/mol)。
圖35.DOPA粘性起源的分子鑒定酪氨酸單分子結(jié)合于TiO2表面。除了最初的靜電相互作用(在有些懸臂中是不可避免的)，沒用檢測到清晰的結(jié)合信號(上限代表信號，700個重復(fù)，n＝639)。沒有非特異性吸附信號(下限代表信號，700個重復(fù)，n＝61)。
(B)確證酪氨酸存在在尖端表面。酪氨酸苯基的π電子與金的π電子特異性相互作用。
(C)結(jié)合于金表面的酪氨酸的力分布。酪氨酸顯示出398±98pN(180nN/秒)的粘合力。
圖36.氧化后的DOPA(DOPA醌)粘性變化圖示的形成和氧化DOPA的化學(xué)途徑。通過酪氨酸羥化酶的作用生成了DOPA，然后通過pH和該酶氧化成DOPA醌。由于易形成自由基，DOPA醌不穩(wěn)定并具有反應(yīng)性。它可與其它DOPA分子交聯(lián)(二-DOPA)，也可與賴氨酸的氨基反應(yīng)。箭頭是在其它物種但未在貽貝粘蛋白中發(fā)現(xiàn)的可能反應(yīng)。
(B)代表性的力信號(n＝16)，具有圖1C中所示的類似的‘d’值(～50nm)。收集它們在堿性條件下(20mM Tris-Cl，pH 9.7)進(jìn)行1小時的AFM試驗(1800次重復(fù))。該圖的頂部到底部表示時間的推移。紅色信號表示DOPA-TiO2，黑色信號表示DOPA醌-TiO2。
(C)對1800個F-D曲線進(jìn)行總體分析之后得到的力的柱狀圖。弱力區(qū)域的柱狀圖顯示178±82pN(n＝143)，強力區(qū)域的柱狀圖顯示741±110pN(n＝51)。
(D)在規(guī)定的時間窗(10分鐘)內(nèi)事件數(shù)目的散布圖。DOPA信號(圓圈，左y-軸)從第一個10分鐘的22個事件減少到最后一個時間窗的僅3個事件。然而，醌的信號(三角，右y-軸)從第一個時間窗的一個事件增加到最后一個時間窗(50-60分鐘)的42個事件。
總而言之，成功地檢測到DOPA的單分子結(jié)合力(～0.8nN)，并示出了其可逆的結(jié)合化學(xué)。這種強烈粘合是由翻譯后修飾產(chǎn)生的，但DOPA氧化成DOPA醌則大大降低了粘合性。
本發(fā)明的抗污垢涂層可以是基本永久型的，即持續(xù)120天或更多，或是生物可降解性的，這取決于粘性組分中DOPA或DOPA衍生部分的數(shù)目。圖20顯示用mPEG-DOPA1-3處理的TiO2上第28天的3T3成纖維細(xì)胞粘附和擴散試驗。在早期的時間點(即少于7天)，蛋白質(zhì)和細(xì)胞粘附抗性與DOPA肽錨定基團長度的相關(guān)性很好，抗性增大的順序是mPEG-DOPA＜mPEG-DOPA2＜mPEG-DOPA3。用mPEG-DOPA2和mPEG-DOPA3處理的TiO2基材在21天里保持細(xì)胞粘附的減少(或稱為細(xì)胞粘附抗性)。
采用羅巴斯特設(shè)計(Robust design)方法來確定DOPA肽錨定基團長度和修飾條件(pH、濃度和時間)對PEG表面密度和金屬、金屬氧化物、半導(dǎo)體和聚合物表面的抗污垢性能的影響。各基材采用的9個試驗示于下表7中。經(jīng)XPS檢測和對3T3成纖維細(xì)胞的粘附和擴散的檢測表明，對于幾乎所有的表面，DOPA肽的長度和修飾緩沖液的pH導(dǎo)致吸附的PEG數(shù)量的變化最大。表7中總結(jié)的試驗使我們可以確定為各種材料提供最佳細(xì)胞粘附抗性的修飾條件，如4小時細(xì)胞粘附試驗所檢測的。對于各基材進(jìn)行這9個試驗以后，數(shù)據(jù)進(jìn)行羅巴斯特設(shè)計分析。當(dāng)繪制羅巴斯特設(shè)計數(shù)據(jù)圖時存在大的誤差值是該技術(shù)的特點，因為在一個因素水平上的單個數(shù)據(jù)點包含了其它因素被所有因素水平平均后的偏差。
本發(fā)明的高分子組合物還可用于涂覆用于處理體液包括血清的裝置和設(shè)備的表面。這些裝置或設(shè)備表面上的涂層阻止蛋白質(zhì)結(jié)合到其表面，從而減少或消除了在各次使用之間進(jìn)行大量洗滌或清潔裝置或設(shè)備的必要。這些裝置需要徹底清潔以防止施加到該裝置表面的體液樣本之間的交叉污染。當(dāng)前，在各次使用之間清潔這些設(shè)備和裝置需要用腐蝕劑例如50％漂白劑和/或升高的溫度來進(jìn)行大量的洗滌。本發(fā)明的涂覆方法是在室溫使1mg/ml的DHPD聚合物水溶液循環(huán)通過裝置幾個小時。
本發(fā)明的涂層可用在多種用途的醫(yī)學(xué)植入體上。例如，這些涂層可用于阻止細(xì)菌粘附在植入裝置上從而阻止細(xì)菌在其上生長，降低植入部位感染的可能性。通過減少蛋白質(zhì)對裝置的結(jié)合和細(xì)胞對裝置的粘附，這些涂層可用于降低這些裝置上發(fā)生急性炎癥的數(shù)量。本發(fā)明的涂層還可用作納米顆粒，防止在血清存在下這些顆粒的凝集。
水凝膠本發(fā)明的聚合物組合物還可作為用于醫(yī)學(xué)和牙齒應(yīng)用的外科手術(shù)粘合劑，和用作將藥物遞送到粘膜表面的載體。所述聚合物組合物可以是用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用例如組織密封的組織粘合聚合物水凝膠，用于防止手術(shù)粘合(瘢痕組織形成)的凝膠，骨和軟骨粘合劑，組織工程，位點特異性藥物流出，以及用于研究用途，例如蛋白質(zhì)(包括抗體)和小分子分析物(包括藥物)的固定。本發(fā)明的聚合物組合物還可用作界面粘合劑，其中干凈的(neat)單體或單體溶液施加于表面，作為組織表面或金屬或金屬氧化物植入體/裝置表面和大量聚合物或聚合物水凝膠之間的底漆(primer)或粘合劑。通過選擇合適的聚合物組分(本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定)，本發(fā)明的聚合物組合物可以流體形式注入或遞送，并在原位硬化形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。可通過光固化、化學(xué)氧化、酶反應(yīng)或通過遞送到體內(nèi)后的自然升溫而發(fā)生原位硬化。
本發(fā)明一部分提供一種本發(fā)明的聚合物組合物非氧化性凝膠化的方法。該方法包括(1)提供本發(fā)明的聚合物組合物；(2)混合水和所述聚合物組合物；和(3)提高混合物的溫度至足以使所述聚合物組合物凝膠化，所述溫度的提高不會使摻入所述組合物中的聚合物或DOPA或DOPA衍生部分殘基的氧化。根據(jù)組合物中聚合物組分的選擇和其性質(zhì)，混合物濃度的提高可降低實現(xiàn)凝膠化所需的溫度。根據(jù)組合物中特定共聚物組分的選擇和其性質(zhì)，更大的親水嵌段共聚物可提高相應(yīng)組合物凝膠化所需的溫度。可改變其它很多結(jié)構(gòu)和/或物理參數(shù)來定制凝膠化，這些變化可擴展到與本發(fā)明更大的方面相一致的其它聚合物組合物和/或系統(tǒng)。
廣泛認(rèn)可市售的PLURONIC嵌段共聚物以濃度和溫度依賴的方式自組裝成膠團，這些膠團由疏水PPO核和水溶脹性冠(由PEO片段組成)組成。高濃度時，某些PEO-PPO-PEO嵌段共聚物，如PLURONICF127和PLURONICF68，在溫度升高時從低粘度溶液轉(zhuǎn)化為澄清的溫度可逆性凝膠。不受任何理論限制，一般認(rèn)為溫度升高時膠團之間的相互作用導(dǎo)致凝膠相的形成，凝膠相由于膠團糾纏在一起而得到穩(wěn)定。膠團化和凝膠化過程取決于嵌段共聚物分子量、相對嵌段大小、溶劑組成、聚合物濃度和溫度等因素。例如，增加親水PEO嵌段相對疏水PPO嵌段的長度導(dǎo)致膠團化和凝膠化溫度(T凝膠)的增加。
對DME-PAO7和DOPA-PAO7的不同濃度水溶液進(jìn)行了差示掃描量熱法(DSC)檢測，以檢測嵌段共聚物凝集成膠團。得到的PLURONICF127、DME-PAO7和DOPA-PAO7的DSC特征在性質(zhì)上是相似的，特征是對應(yīng)于膠團形成的大幅吸熱轉(zhuǎn)換，然后是在T凝膠處的少量吸熱(圖2)。發(fā)現(xiàn)小峰的轉(zhuǎn)換溫度與流變測定法和小瓶倒置(vial inversion)法測定的T凝膠關(guān)聯(lián)性很強(表4)。
表422重量％的DME-PAO7、DOPA-PAO7和PLURONICF127溶液通過小瓶倒置法、流變測定法或差示掃描量熱法獲得凝膠化溫度。

用冷法制備DOPA-PAO7共聚物的濃度為10-30％(w/w)的水溶液和DOPA-PAO8共聚物的濃度為35-54％(w/w)的水溶液，其中DOPA偶聯(lián)物溶解在約4℃的蒸餾水中，間歇攪拌直到獲得澄清的溶液。最初用小瓶倒置法評價濃溶液的熱凝膠化。該方法中，溶液不再流動的溫度作為凝膠化溫度。
發(fā)現(xiàn)凝膠化溫度強烈依賴于共聚物濃度和嵌段共聚物的組成(即，PAO7vs.PAO8)。例如，發(fā)現(xiàn)22重量％的DOPA-PAO7溶液和DME-PAO8溶液在約22.0±1.0℃形成透明凝膠；將聚合物濃度降低至1 8重量％則得到凝膠化溫度約為31.0±1.0℃。然而，濃度小于17重量％的DOPA-PAO7溶液加入到60℃時不形成凝膠。DOPA-PAO7比未修飾的PLURONICF127(17.0±1.0℃)顯示出略為高些的凝膠化溫度。發(fā)現(xiàn)DOPA-PAO8的凝膠化行為在性質(zhì)上是類似的，但需要更高的聚合物濃度來形成凝膠。54重量％的DOPA-PAO8溶液和DME-PAO8溶液在23.0±1.0℃形成凝膠，而50重量％的DOPA-PAO8溶液在33.0±1.0℃形成凝膠。然而，濃度小于35重量％的DOPA-PAO8溶液加熱至60℃時不形成凝膠。DOPA-PAO8比未修飾的PLURONICF68(16.0±1.0℃)顯示出高得多的凝膠化溫度。發(fā)現(xiàn)這些凝膠在很長一段時間內(nèi)不流動。通過這個試驗，我們還發(fā)現(xiàn)同一市售產(chǎn)品PLURONICPAO的DOPA和DOPA甲酯衍生物顯示出幾乎相同的凝膠化溫度，室溫用54重量％的DME-PAO8溶液或DOPA-PAO8的溶液制成的凝膠比用22重量％的DME-PAO7溶液或DOPA-PAO7的溶液制成的凝膠更硬。
用振蕩流變測定法進(jìn)一步研究了DOPA-修飾的PLURONIC溶液的粘彈性行為。圖3顯示了未修飾的PLURONICF127和DME-PAO7的22重量％的水溶液的彈性存貯模量，G’，其是溫度的函數(shù)。在凝膠化溫度以下，存貯模量G’可忽略，但在凝膠化溫度(T時)，G’迅速增加，如G’開始增加vs.溫度的圖所示。DOPA-PAO7(未示出)顯示出類似的流變學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)22重量％的DME-PAO7溶液和DOPA-PAO7溶液的T凝膠是相同的(20.3±0.6℃)，約比同等濃度未修飾的-PLURONICF127(15.4±0.4℃)高5℃。DME-PAO7或DOPA-PAO7的G’值接近13kPa的平臺值，與未修飾的PLURONICF127的平臺值相當(dāng)。
圖4所示是50重量％的未修飾的PLURONICF68溶液和DME-PAO8溶液的流變學(xué)特征，其作為溫度的函數(shù)。50重量％DME-PAO8溶液的T凝膠是34.1±0.6°e，而相同濃度的未修飾的PLURONICF68的T凝膠約低18℃(16.2±0.8℃)。DME-PAO8和未修飾的PLURONICF68的50重量％溶液的平臺存貯模量沒有很大不同，接近最高達(dá)50 kPa的平臺值。圖5顯示了T凝膠的濃度依賴性，兩種濃度的DME-PAO8的流變學(xué)特征作為溫度的函數(shù)。45重量％的DME-PAO8溶液的T凝膠約比50重量％的DME-PAO8的溶液的高12℃。
由于DOPA和DOPA甲酯都可認(rèn)為是親水性的，相對于未修飾的PLURONICPAO，DOPA-修飾的PLURONICPAO T凝膠值的增加可能是因為DOPA偶聯(lián)到末端基團而造成的親水性PEO片段長度的增加。由圖3和4所示的數(shù)據(jù)可清楚地看到，相對于PLURONICF127，DOPA或DOPA甲酯偶聯(lián)到PLURONICPAO末端基團對于PLURONICF68的T凝膠值影響更大。這可通過F68(約8,600)和F127(約12,600)的總分子量來解釋。用方案1所示的化學(xué)方法將DOPA和DOPA甲酯加到兩個末端使分子量分別增加446和474。這說明由于F68的分子量基礎(chǔ)更小，相對于F127，F(xiàn)68分子量增加的百分?jǐn)?shù)更大。
此處所示的數(shù)據(jù)與之前未修飾的PLURONICPAO的量熱研究一致，證明低溫使的寬峰是膠團造成的，而只在濃縮溶液中觀察到的高溫時的小峰對應(yīng)于凝膠化，一個基本上不發(fā)生熱量變化的過程。如圖5所示，未修飾的PLURONICF127的膠團化起始溫度、最高熱容量溫度和T凝膠值都比DOPA-PAO7的低，而由轉(zhuǎn)化下方的面積所確定的具體焓(圖2)基本相同。這些焓包括膠團化和凝膠化所造成的焓。然而，由于凝膠化的焓很小，觀察到焓變可能大部分是由膠團化造成的。
表5差示掃描量熱試驗得到的DME-PAO7、DOPA-PAO7和未修飾的PLURONICF127的30重量％溶液的膠團化起始溫度、最高熱容溫度、焓和凝膠化溫度的比較。

觀察到膠團化峰延伸到凝膠化起始溫度之上，說明當(dāng)溫度高于凝膠化溫度時其它的單體凝集成膠團。DOPA-PAO7和DME-PAO7凝集的溫度依賴性示于圖6。DSC熱解曲線表明隨著濃度的增加，膠團化溫度和T凝膠降低。在不發(fā)生凝膠化的濃度下，在溶液也可觀察到對應(yīng)于膠團化的寬的吸熱峰；隨著共聚物濃度的減低，寬峰的特征溫度直線上升，而觀察到小峰與濃縮共聚物的凝膠化溫度一致，但當(dāng)共聚物濃度減小時消失。
從前述可知，可設(shè)計和制備多種本發(fā)明的聚合物組合物，以提供多種膠團化和/或熱凝膠化性能?；蛘撸虼送?，可分別用例如聚乙二醇和乳酸/乙二醇酸將本發(fā)明的聚合物組合物降解成可排泄的聚合物組分和代謝物。不管如何，本發(fā)明的聚合物組合物通過摻入一個或多個DHPD殘基提供了改進(jìn)的粘附性能，所述摻入是通過將聚合物組分的末端單體偶聯(lián)于所述殘基實現(xiàn)的。
本發(fā)明聚合物組合物的非氧化性凝膠化的另一種方法是光固化。將可光固化的含有DHPD部分的單體與PEG-DA(PEG-二丙烯酸酯)共聚合，以通過光致聚合形成粘性水凝膠。光致聚合可在任意的可見光或UV波長下實現(xiàn)，這取決于所用的單體。這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定?？晒夤袒膯误w由粘性部分組成，粘性部分偶聯(lián)于具有烯基的可聚合單體(如甲基丙烯酸酯基團，中間有或沒有寡聚環(huán)氧乙烷接頭或氟化醚接頭)。
用紫外燈(365nm)照射含有本發(fā)明粘合劑的可光致聚合單體、PEG-DA和1.5μL/mL光引發(fā)劑(如2，2’-二甲氧基-2-苯基-苯乙酮(2，2’-dimethoxy-2-phneyl-acetonephenone)(DMPA)，樟腦醌/4-(二甲基氨基)-苯甲酸(CQ/DMAB)，和抗壞血酸/熒光素鈉鹽(AA/FNa2))的水性混合物5分鐘以上。發(fā)現(xiàn)前體溶液中存在粘合劑會影響自由基引發(fā)的聚合過程。兒茶酚粘合劑降低了凝膠化形成的程度，降低了粘合劑摻入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中的百分比，并延長了凝膠形成時間。
如圖25所示，通過用回聲檢測儀檢測質(zhì)量，測定了UV照射2分鐘后凝膠轉(zhuǎn)化率達(dá)到75重量％，照射大于5分鐘后，凝膠轉(zhuǎn)化率增至大于85重量％。當(dāng)采用可見光引發(fā)劑時，PEG-DA的凝膠化在4分鐘或更短時間內(nèi)發(fā)生(CQ/DMAB為4分鐘，AA/FNa2為3分鐘)。
PEG-DA與化合物1或7(化合物1和7的合成示于方案2和3)的共聚合性質(zhì)上與純PEG-DA的聚合類似，雖然將化合物1或7加到PEG-DA前體溶液造成凝膠轉(zhuǎn)化率減少(所述凝膠轉(zhuǎn)化率依賴于DOPA單體濃度和引發(fā)體系)。例如，存在2.5mol％或更多的1或7時，在DMPA引發(fā)的UV聚合中，凝膠轉(zhuǎn)化率被降低到小于85重量％。然而，這些凝膠的凝膠轉(zhuǎn)化程度在統(tǒng)計學(xué)上沒有差異。對可見光誘導(dǎo)的引發(fā)劑，觀察到類似的DOPA濃度依賴的抑制。對于AA/FNa2和CQ/DMAB引發(fā)的混合物，加入33.3mol％的化合物1使凝膠化時間增至8分鐘以上。然而，含有化合物1和7的溶液甚至在相對高的DOPA mol％時仍可以進(jìn)行光固化。
方案2

方案3
例如，前體溶液中存在53.8mol％的化合物1或7使凝膠從88重量％減低到77重量％，只有85mol％的DOPA摻入到水凝膠中。對光固化的水凝膠進(jìn)行的DOPA比色測定(比色測定由Waite和Benedict開發(fā))表明水凝膠中存在兒茶酚DOPA。光固化后，在0.5N HCl透析含有DOPA的凝膠以提取未反應(yīng)的DOPA單體。為了定量測量DOPA摻入的程度，根據(jù)Waite和Benedict的DOPA比色試驗分析透析液，用該試驗的結(jié)果計算摻入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中的DOPA的量。圖26顯示摻入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中DOPA的摩爾分?jǐn)?shù)，其作為前體溶液中單體1和單體7的摩爾％的函數(shù)。含有單體1和7的樣品中摻入的DOPA分?jǐn)?shù)沒有顯著差別。摻入到PEG水凝膠中的DOPA最高為24.9μmol/g。
將完整的經(jīng)透析的凝膠浸入亞硝酸鹽試劑中，然后浸入NaOH中，獲得了凝膠中存在DOPA的直接證據(jù)。加入亞硝酸鹽之后，最初無色的凝膠變?yōu)榱咙S色，加入過量的堿之后又變?yōu)榧t色。這種顏色轉(zhuǎn)變是兒茶酚的典型變化，表明通過光致聚合將DOPA的未氧化形式摻入到了水凝膠中。紅色的強度還反應(yīng)了摻入光固化水凝膠中的DOPA的濃度。
在半球形光固化凝膠上進(jìn)行接觸機械測試，以獲得凝膠的機械性能信息。通過假定不可壓縮的彈性半球和剛性平面間具體的非粘合性接觸的赫茲力學(xué)(Hertzian mechanics)，計算了彈性模量(E)，其中負(fù)載(Ph)和位移(δh)之間的赫茲關(guān)系是Ph=16R1/2E9δh53/2---(1)]]>其中R是半球形凝膠懸臂的半徑。用方程(1)擬合負(fù)載對位移的數(shù)據(jù)，根據(jù)擬合曲線的比例系數(shù)可計算彈性模量。如圖6所示，對于含有DOPA的凝膠，獲得了約50kPa的平均楊氏模量(E)。
表6含有DOPA的凝膠的平均楊氏模量

+在前體溶液中為33mol％*由DOPA試驗測定**p＜0.001，相對于PEG-DA凝膠這些模數(shù)值比PEG-DA凝膠的模數(shù)值低大約30％，證實了DOPA對自由基引發(fā)的光致聚合有抑制效果。雖然模量相對于PEG-DA凝膠有所降低，含有DOPA的凝膠仍然顯示出適合很多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的模量。合適的模量大于500Pa。粘性水凝膠的另一個應(yīng)用是局部藥物遞送。例如，粘性水凝膠可形成在嘴或口腔的粘膜表面。水凝膠可負(fù)載有藥物例如抗生素，并有助于藥物在一段時間內(nèi)的緩慢釋放。這些水凝膠還可負(fù)載有鎮(zhèn)痛劑，用于在局部位點減少疼痛。這些水凝膠還可負(fù)載有化療藥物，插入到腫瘤組織中遞送癌癥治療。這些水凝膠還可負(fù)載細(xì)胞增殖抑制劑治療藥物，用作涂覆支架或其它血管裝置，用于在血管裝置的植入位置控制細(xì)胞增殖。
可體內(nèi)交聯(lián)的組織粘性水凝膠可代替金屬或塑料縫線用作組織密封劑。粘合劑在手術(shù)或受傷位置結(jié)合于周圍組織，聚合物形成粘性連接以封閉傷口。水凝膠還可用于修復(fù)骨折以及軟骨至骨的損傷。
其它用途這些涂層和水凝膠在工業(yè)產(chǎn)品中也有很多用途，包括防止海運中的生物污垢(海藻、細(xì)菌和貽貝粘附到水下表面)，防止流到工廠例如電力和制藥工廠水流中的細(xì)菌污染，防止飲用水系統(tǒng)中的細(xì)菌污染，作為牙齒和義齒粘合劑，輸送指示器的水中粘合劑，水純度和檢測傳感器的涂層，用于防止生物污垢的油漆。
這些涂層和水凝膠還在消費產(chǎn)品和化妝品中有很多用途，包括但不限于，用于牙齒和義齒粘合劑，用于化妝品中作為頭發(fā)、皮膚和腿的粘合劑，用于化妝品例如眼影、口紅和睫毛膏(mascara)中，用于暫時性文身中，以及作用包和容器的可再密封性粘合劑。
不限于任何具體的合成方案或制備方法，本發(fā)明合適的組合物可包括但不限于各末端單體和DOPA殘基之間的氨酯部分。如下更詳細(xì)描述的，這種氨酯部分是用于交聯(lián)DOPA殘基和聚合物組分的物質(zhì)/試劑的人工合成物。如知曉本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，在本發(fā)明的廣泛方面考慮多種其它的部分，這取決于末端單體官能團和偶聯(lián)劑的選擇。
實施例總體描述下面的非限制性實施例和數(shù)據(jù)闡釋了與本發(fā)明的組合物和/或方法有關(guān)的各個方面和特征，包括摻入一個或多個DHPD組分的聚合物或共-聚合物組合物的制備，通過本發(fā)明描述的合成方法可知。雖然用幾種聚合物或共-聚合物體系闡釋了本發(fā)明的應(yīng)用，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用多種其它的組合物和/或制備方法可獲得類似的結(jié)果，這些都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
PEO100PPO65PEO100(PLURONICF127，重均分子量＝12,600)，PEO78PPO30PEO78(PLURONICF68，重均分子量＝8,400)，PEG(重均分子量＝8000)，五氟苯酚，1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二氨，熒光素鈉鹽(FNa2)，和抗壞血酸(AA)購自Sigma(St.Louis，密蘇里州)。L-DOPA，亞硫酰氯，異丁烯酰氯，叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMS-Cl)，二碳酸二叔丁酯，甲基丙烯酸酐，2，2’-二甲氧基-2-苯基-苯乙酮(DMPA)，丙烯酰氯，1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，氟化四丁基銨(TBAF)，4-(二甲基氨基)-苯甲酸(DMAB)，1-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)，N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，硼酸鈉，二水合鉬酸鈉，亞硝酸鈉，4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)，N-羥基琥珀酰亞胺，N，N-二異丙基乙胺，二甲基酰胺，和二氯甲烷購自Aldrich(Milwaukee，威斯康星州)。樟腦醌(GQ)獲自Polysciences，Inc.(Warrington，賓夕法尼亞州)。丙酮用4的分子篩干燥，使用前用P2O5蒸餾。三乙胺在使用前新蒸餾。其它化學(xué)試劑按常規(guī)方法使用。
根據(jù)Patel和Price，J.Org.Chem.，1965，30，3575(納入本文作為參考)的方法制備L-DOPA甲酯鹽酸鹽。琥珀酰亞胺基丙酸酯活化的PEG(mPEG-SPA，重均分子量＝5000)購自Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，AL)。用HCl氣體在乙酸乙酯(50mL)中鼓泡約10分鐘制備用HCl飽和的乙酸乙酯。根據(jù)Sever和Wilker，Tetrahedron，2001，57，(29)，6139-6146(納入本文作為參考)的方法合成3，4-雙(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)L-苯丙氨酸(DOPA(TBDMS)2)和3，4-雙(叔丁基二甲基甲硅烷氧基-N-叔丁氧基羰基-L-苯丙氨酸(Boc-DOPA(TBDMS)2)。
以下實施例中所用的玻璃蓋玻片(直徑12mm)浸入5％Contrad70溶液(一種陰離子型和非離子型表面活性劑在allealtine aqueous base(Decon Labs，Inc.，Bryn Mawr，賓夕法尼亞州)中超聲浴20分鐘形成的乳液)中清洗，然后用去離子(DI)水洗滌，在DI水中超聲處理20分鐘，在丙酮中清洗，在丙酮中超聲處理20分鐘，在己烷中清洗，在己烷中超聲處理20分鐘，在丙酮中清洗，在丙酮中超聲處理20分鐘，在DI水中清洗，在DI水中超聲處理20分鐘。然后蓋玻片在HEPA過濾的層流通風(fēng)櫥中風(fēng)干。為了生成原始的(pristine)金基材，用2nm Cr噴鍍(Cressington 208HR)干凈的蓋玻片，然后用10nm的Au(純度為99.9％)噴鍍干凈的蓋玻片。
通過以下方法制備二氧化鈦(TiO2)表面將TiO2用電子束物理蒸發(fā)到硅(Si)晶片上，然后測試前在等離子室中清潔。用Edwards FL400電子束蒸發(fā)器在＜10-6托將100nm Ti涂覆到硅晶片(MEMC Electronic Materials，St.Peters，密蘇里州，表面取向(100))上。然后將硅晶片切成8mm×8mm的片，在以下介質(zhì)中用超聲清洗5％Contrad70，超純水(超純水是去離子和蒸餾過的)，丙酮和石油醚。然后基材在＜200毫托和100W在氧等離子室中進(jìn)一步清洗(HarrickScientific，Ossining，紐約州)3分鐘。
如下所述，用X射線光電子譜(XPS)來表征原始的和經(jīng)修飾的金表面。在配置有單色的(monochromated)AlKα(1486.8eV)300-W的X射線源，1.5mm大小的圓形點(circular spot)，計數(shù)電荷效應(yīng)的浸沒電子槍和超高真空(＜10-8Torr)的Omicron ESCALAB(Omicron，Taunusstein，Germany)上收集XPS數(shù)據(jù)。飛離角(Takeoff angle)定義為基材法線與檢測器之間的角度，該角度固定為45°。用雙面膠帶將基材固定在標(biāo)準(zhǔn)樣品柱螺(stud)上。所有的結(jié)合能都用Au(4f7/2)金峰(84.0eV)或C(ls)碳峰(284.6eV)來標(biāo)準(zhǔn)化。分析由寬檢測掃描(survey scan)(50.0eV通過能(pass energy))和對C(ls)270-300eV的10分鐘高分辨率掃描(22.0eV通過能)組成。峰反卷積(deconvolution)和原子百分?jǐn)?shù)計算用EIS分析軟件進(jìn)行。
次級離子光譜在TRIFT IIITM飛行時間次級離子質(zhì)譜儀(TOF-SIMS)(Physical Electronics，Eden Prairie，MN)上質(zhì)量范圍0-2000m/z內(nèi)收集。用Ga+源，光束能為15keV，光柵大小是100μm。收集陽性和陰性光譜，并用PHI softwareCadence以一套低質(zhì)量離子標(biāo)準(zhǔn)化。
為了檢測表面的相對親水/疏水性，如下所述用固著液滴法收集接觸角數(shù)據(jù)。使用裝有增濕樣品室的定制的接觸角度測角器(組件來自Ramé-Hart，Mountain Lakes，NJ)來檢測未修飾的和經(jīng)修飾的基材上超純水(18.2MΩ-cm；Barnstead，Dubuque，IA)的前進(jìn)和后退接觸角(advancing and receding contactangles)。對各表面，在不同的位置作了4個檢測，報道了平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
用裸露的金傳感器筒(sensor cartridges)在BIACORE 2000(BiacoreInternational AB；Uppsala，Sweden)上進(jìn)行表面等離子體共振(SPR)檢測。用0-100mg/ml NaCl溶劑將共振反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。將mPEG-DOPA、mPEG-MAPd和mPEG-OH的稀釋液(H2O中，0.1mM)注射到SPR流動細(xì)胞(flow cell)中10分鐘，然后液流(flow)轉(zhuǎn)回到純DI水中。在一個檢測蛋白對修飾基材的吸附的單獨試驗中，預(yù)形成有PEG膜的傳感器表面接觸溶于10mM HEPES緩沖液(0.15M NaCl，pH＝7.2)的0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)溶液，然后接觸純緩沖液。
在證明抗污垢效果的試驗中，獲自ATCC(Manassas，VA)的NIH 3T3-瑞士白化體成纖維細(xì)胞維持在37℃、10％CO2、和含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM；Cellgro，Herndon，VA)中。
用Waters HPLC系統(tǒng)(Waters，Milford，MA)在Vydac 218TP反相柱上用乙腈/0.1％三氟乙酸(v/v)水溶液的梯度液進(jìn)行RP-HPLC制備。在LCQ LC-MS系統(tǒng)(Finnigan，Thermoquest，CA)上進(jìn)行ESI-MS分析。在Voyager DE-Pro質(zhì)譜檢測儀(Perseptive Biosystem，MA)上進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。α-氰基-4-羥基肉桂酸用作基質(zhì)。NiTi合金(10mm×10mm×1mm)購自Nitinol Devices&Components(Fremont，CA)。Si、SiO2(1500熱氧化物)和GaAs晶片購自University Wafer(South Boston，MA)。
對于下面的細(xì)胞粘附測試和/或擴散試驗，修飾的和未修飾的基材在12孔TCPS板中用1.0ml含有10％FBS的DMEM在37℃、10％CO2中預(yù)處理30分鐘。用0.25％的胰蛋白酶-EDTA收獲12-16代的成纖維細(xì)胞，重懸于含有10％FBS的DMEM中，用血球計計數(shù)。通過將懸浮液稀釋至合適的體積，然后每孔加入1ml稀釋液，從而使細(xì)胞接種的密度是2.9×103個細(xì)胞/cm2?；脑诤?0％FBS的DMEM、37℃、10％CO2中維持4消失，然后吸走未粘附的細(xì)胞。粘附在基材上的細(xì)胞在3.7％多聚甲醛中固定5分鐘，然后用5μM溶于DMSO的1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate，DiI；Molecular Probes，Eugene，OR)37℃處理30分鐘。然后吸走染料，基材用DMSO洗滌10分鐘(3x)，用Cytoseal(Stephens Scientific，Kalamazoo，MI)固定在玻片上以保留熒光。出于統(tǒng)計學(xué)目的，這些試驗做三次重復(fù)。為了用電子顯微鏡觀察，一些樣品在固定后用EtOH脫水，臨界點干燥，用3nm Au噴鍍。
為了定量細(xì)胞粘附，用Olympus BX-40(λEx＝549nm，λEm＝565nm)檢測基材，用Coolsnap CCD相機(Roper Scientific，Trenton，NJ)記錄顏色。對于一式三份的基材中的每一個，拍5張照片。用MetaMorph(Universal Imaging，Downington，PA)中的閾值將得到的照片定量。用單向ANOVA和95％置信區(qū)間的Tukey’spost-hoc測驗(SPSS，Chicago，IL)來確定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)重要性。報道了檢測結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例1琥珀酰亞胺基碳酸酯PAO，SC-PAO7的合成PLURONICF127(0.60毫摩爾)溶于30mL的無水二烷中。加入溶于10mL無水丙酮的N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(6.0毫摩爾)。將DMAP(6.0毫摩爾)溶于10mL無水丙酮中，并在磁力攪拌下緩慢加入。在室溫進(jìn)行6小時活化，然后將SC-PAO7沉淀在乙醚中。用TLC(氯仿-甲醇(5∶1)溶劑體系)跟蹤反應(yīng)中起始物質(zhì)的消失。溶解在丙酮中并用乙醚沉淀4次來純化產(chǎn)物。產(chǎn)物收率為65％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.96-1.68(br，-OCHCH3CH2O-)，2.80(s，-COON(CO)2(CH2)2)，3.15-4.01(br，-OCH2CH2O-；-OCHCH3CH2O-)，4.40(s，-OCH2CH2OCOON(CO)2CH2CH2-)。
實施例2DME-PAO7的合成將DOPA甲酯鹽酸鹽(1.25毫摩爾)和三乙胺(2.5毫摩爾)的漿液與SC-PAO7(0.16毫摩爾)在10mL氯仿中混合。用TLC(氯仿-甲醇-乙酸(5∶3∶1)溶劑體系)跟蹤反應(yīng)中起始物質(zhì)的消失。室溫攪拌1小時后，蒸發(fā)除去溶劑，用冷甲醇沉淀3次來純化DME-PAO7。DME-PAO7獲得了正的Arnow測驗結(jié)果，說明存在兒茶酚羥基。產(chǎn)物收率是75％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.98-1.71(br，-OCHCH3CH2O-)，2.83-3.06(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，3.15-4.02(br，-OCH2CH2O-；-NHCH(CH2C6H3(OH)2COOCH3)，4.05-4.35(d，-OCH2CH2OCONHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，4.55(br，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，5.30(d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，6.45-6.80(1s，2d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)。
實施例3DOPA-PAO7的合成在Ar氣氛下，將L-DOPA(1.56毫摩爾)加入到30mL的0.1M Na2B4O7(pH＝9.32)水溶液中，然后室溫攪拌30分鐘。將在5mL丙酮中的SC-PAO7(0.156毫摩爾)加入到得到的混合物中，室溫攪拌過夜。反應(yīng)過程中用碳酸鈉維持溶液的pH。用TLC(氯仿-甲醇-乙酸(5∶3∶1)溶劑體系)跟蹤反應(yīng)中起始物質(zhì)的消失。用濃鹽酸將該溶液酸化至pH2，然后用二氯甲烷萃取3次。將合并的二氯甲烷萃取物用無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸發(fā)除去二氯甲烷。從冷甲醇沉淀進(jìn)一步純化產(chǎn)物。DOPA-PAO7獲得了正的Arnow測驗結(jié)果，說明存在兒茶酚羥基。產(chǎn)物收率是52％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.92-1.70(br，-OCHCH3CH2O-)，2.91-3.15(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH)，3.20-4.10(br，-OCH2CH2O-；-OCHCH3CH2O-)，4.1-4.35(d，-OCH2CH2OCONHCHCH2C6H3(OH)2COOH)，4.56(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOH)，5.41(d，-NHCHCH2C6H5(OH)2COOH)，6.60-6.82(1s，2d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOH)。
實施例4琥珀酰亞胺基碳酸酯PAO8，SC-PAO8的合成用與上述合成和純化SC-PAO7類似的方法制備SC-PAO8。產(chǎn)物收率是68％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.95-1.58(br，-OCHCH3CH2O-)，2.80(s，-COON(CO)2(CH2)2)，3.10-4.03(br，-OCH2CH2O-；-OCHCH3CH2O-)，4.40(s，-OCH2CH2OCOON(CO)2CH2CH2)。
實施例5DME-PAO8的合成用與上述合成和純化DME-PAO7偶聯(lián)物類似的方法制備DME-PAO8。產(chǎn)物收率是76％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.98-1.50(br，-OCHCH3CH2O-)，2.85-3.10(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，3.15-4.01(br，-OCH2CH2O-；-OCHCH3CH2O-；-NHCH(CH2C6H3(OH)2COOCH3)，4.03-4.26(d，-OCH2CH2OCONHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，4.55(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，5.30(d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)，6.45-6.77(1s，2d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOCH3)。
實施例6DOPA-PAO8的合成用與上述合成DOPA-PAO7偶聯(lián)物類似的方法制備和純化DOPA-PAO8。產(chǎn)物收率是49％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 0.92-1.50(br，-OCHCH3CH2O-)， 2.91-3.10(m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOH)，3.15-3.95(br，-OCH2CH2O-；-OCHCH3CH2O-)，4.06-4.30(d，-OCH2CH2OCONHCHCH2C6H3(OH)2COOH)，4.54 (m，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOH)，5.35(d，-NHCHCH2C6H5(OH)2COOH)，6.50-6.80(1s，2d，-NHCHCH2C6H3(OH)2COOH)。
實施例7比色測定用Waite和Benedict的比色方法測定DOPA甲酯和DOPA與PLURONICsF127和F68的偶聯(lián)效率。簡而言之，用1N HCl稀釋標(biāo)準(zhǔn)或未知溶液的等份樣品至終體積為0.9mL，如此一式三份分析樣品。將0.9mL亞硝酸鹽試劑(1.45M亞硝酸鈉和0.41M二水合鉬酸鈉)加入到DOPA溶液中，然后立即加入1.2mL的1N NaOH。因為吸光度是隨時間變化的，要注意以確保加入NaOH和記錄吸光度之間的時間間隔對于所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都是3分鐘。在500nm記錄所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度。用DOPA作為DOPA甲酯和DOPA偶聯(lián)物的標(biāo)準(zhǔn)品。
實施例8流變測定用Bohlin VOR流變儀(Bohlin Rheologi，Cranbury，新澤西州)進(jìn)行凝膠化過程的流變學(xué)測定。所有的測定都使用30mm直徑的不銹鋼錐板幾何形狀(coneand plate geometry)，錐角為2.5°。用循環(huán)水浴控制溫度。將0.5mL的液體溶液轉(zhuǎn)移到儀器中之前將樣品在冰箱中冷卻。在0.1Hz，應(yīng)力為0.45％的振蕩模式下()測定存貯和損失模量G’和G”。加熱速率是0.5℃/分鐘，但鄰近凝膠化溫度時加熱速率降低到0.1℃/分鐘。檢測了幾個樣品的粘彈性數(shù)據(jù)對應(yīng)力幅度的依賴性。只在線性區(qū)域進(jìn)行了測定，其中模量不依賴于應(yīng)力幅度。在樣品室外表面周圍的一圈用了礦物油以防止測定過程中的脫水。
實施例9差示掃描量熱法(DSC)在TA Instruments DSC-2920(TA Instruments，New Castle，DE)量熱計上進(jìn)行DSC測定。在加熱和冷卻循環(huán)中獲得各濃度的3個樣品的熱量譜。使用了在密封的鋁蒸發(fā)皿中20ul的樣品體積，在加熱和冷卻速率為3℃/分鐘下記錄掃描數(shù)據(jù)，空蒸發(fā)皿作為對照。
實施例10a將氨基-封端的甲氧基-PEG、mPEG-NH2(2.0g，0.40毫摩爾，Mw＝2,000或5,000，Sun-Bio PEGShop)、N-Boc-L-DOPA二環(huán)己基銨鹽(0.80毫摩爾)、HOBt(1.3毫摩爾)和Et3N(1.3毫摩爾)溶解在20mL 50∶50的二氯甲烷(DCM)和DMF的混合物中。然后加入溶于10mL DCM的HBTU(0.80毫摩爾)，在室溫和氬氣環(huán)境下反應(yīng)30分鐘。然后反應(yīng)溶液依次用飽和氯化鈉溶液、5％NaHCO3、稀HCl溶液和蒸餾水洗滌。減壓濃縮粗產(chǎn)物，在SephadexLH-20上用柱層析純化，甲醇作流動相。在冷甲醇中沉淀3次進(jìn)一步純化產(chǎn)物mPEG-DOPA，室溫真空干燥，在-20℃存貯于氮氣下。1H NMR(500MHz，CDCl3/TMS)δ6.81-6.60(m，3H，C6H3(OH)2-)，6.01(br，s，1H，OH-)，5.32(br，s，1H，OH-)，4.22(br，s，1H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，3.73-3.38(m，PEO)，3.07(m，2H，PEO-CH2-NH-C(O)-)，2.73(t，2H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，1.44(s，9H，(CH3)3C-)，1.25(s，3H，CH3CH2O-)。
實施例10b通過類推，用其它含有DOPA的肽和寡肽(天然或合成來源的)可擴展前述實施例的合成和相關(guān)方法。根據(jù)具體的合成序列，可任選地采用N-端保護(hù)基團。如上所述，也可使用多種其它的類似DOPA的粘性組分，這些是知曉本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可使用B-氨基酸和N-取代的甘氨酸DOPA類似物。
根據(jù)上述的合成技術(shù)和方法，不管具體的DHPD粘性組分，可使用多種聚合物組分。聚合物組分的分子量可以變化，其只受相應(yīng)的溶解度要求的限制。如上所述，很多其它的聚合物可用于表面抗污垢和/或穩(wěn)定顆粒，這些聚合物包括但不限于，透明質(zhì)酸、葡聚糖等。根據(jù)對溶解度的要求和所需的表面作用，聚合物組分可以是支化的、高支化的或樹枝狀(dendrimeric)，這些組分是市售的或可通過公知的合成技術(shù)制備。
雖然實施例10a的組合物是上述起始材料的酰胺化產(chǎn)物，應(yīng)理解可將DHPD組分的N末端偶聯(lián)于合適官能化的天然或合成聚合物(包括上述的聚合物)的末端基團、主鏈或側(cè)鏈來制備類似的聚合物-DHPD偶聯(lián)物。例如但不限于，如上所述，可用末端為碳酸酯官能團的合適聚合物組分與所需DHPD組分的N末端反應(yīng)，提供所需的偶聯(lián)物。
實施例11a以固相肽合成法，在Rink樹脂上(0.6mMol/g)用Fmoc保護(hù)的氨基酸、BOP、HOBt和DIEA作為活化劑，并以NMP為溶劑，合成藍(lán)貽貝Mytilus edulis足蛋白1(Mefp 1)的共有(consensus)十肽重復(fù)序列(貽貝粘蛋白十肽，MAPd，NH2-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Lys-CO2H)。使用25％哌啶的NMP溶液對Fmoc進(jìn)行20分鐘的脫保護(hù)。經(jīng)初始的10分鐘預(yù)活化步驟，使用2當(dāng)量的1∶1∶1∶1的Fmoc-氨基酸∶BOP∶HOBt∶DIEA反應(yīng)20分鐘進(jìn)行氨基酸的偶聯(lián)。完成十肽后，使用碳化二亞胺化學(xué)法，將十肽的游離氨基端與活化的甲氧基-PEG-CO2H(mPEG-SPA，Mw＝2k或5k，Shearwater Polymers)偶聯(lián)。在0℃下，使用1M TMSBr的TFA溶液與EDT、苯甲硫醚和間甲苯酚對PEG-十肽偶聯(lián)物(mPEG-MAPd，2k或5k)進(jìn)行裂解2小時。0℃下，在乙醚中沉淀粗mPEG-MAPd產(chǎn)物，并用制備HPLC使用Vydac 218TP反相柱(220×22mm×10μm)進(jìn)行純化。產(chǎn)物的純度通過分析型HPLC測定為＞90％，并用PerSeptive BiosystemMALDI-TOF-MS確定結(jié)構(gòu)。
實施例11b可將實施例11a中的合成和過程擴展到類似于實施例10b或與實施例10b所述的變化一致。此外，可用通過酶轉(zhuǎn)化所含的酪氨酸殘基來制備含DOPA的聚合物的其它偶聯(lián)物。也可將肽合成領(lǐng)域中其它熟知的技術(shù)有效用于提供其它所希望的蛋白質(zhì)序列、肽偶聯(lián)物并獲得粘附/抗污垢效果。
實施例12a金表面的修飾是通過從聚合物濃度為0.1-75mg/ml的DCM或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；pH＝3、7.4和11)溶液中吸附mPEG-DOPA或mPEG-MAPd(2k、5k)而進(jìn)行的。將基材置于小瓶中并浸入mPEG-DOPA或mPEG-MAPd溶液中靜置長達(dá)24小時。從溶液中取出后，用適宜的溶劑(DCM或DI H2O)清洗基材以去除未結(jié)合的聚合物，并真空干燥。作為比較，用PEG-單甲基醚(mPEG-OH，平均Mw＝5000)進(jìn)行同樣的表面修飾?；蛘?，于37℃下，將一滴含有mPEG-DOPA或mPEG-MAPd(10mM的PBS溶液，PEG分子量＝2000)的溶液在用Au涂覆的玻璃蓋玻片(Au厚度～10nm)上孵育30分鐘，然后用PBS清洗(3x)該蓋玻片的表面。通過前進(jìn)/后退接觸角(advancing/receding contact angle)、XPS和TOF-SIMS對經(jīng)修飾表面進(jìn)行的分析揭示形成了mPEG-DOPA或mPEG-MAPd化學(xué)吸附層。
圖7A-C所示為未經(jīng)修飾的、用mPEG-OH修飾的和用mPEG-DOPA修飾的表面的XPS圖譜。正如所預(yù)期的，用mPEG-OH處理后286.5eV處的醚峰僅極小地最大，而吸附mPEG-DOPA后則觀察到顯著的增大，這表明醚碳的大量存在。文獻(xiàn)中報道了具有相同結(jié)合能的純PEG的醚峰。圖7中285.0eV處的較小峰是由PEG和DOPA首基(headgroup)中的脂肪族和芳香族碳以及在制備/抽真空過程中引入的一些烴污染物造成的。
飛行時間SIMS數(shù)據(jù)證實了XPS中的發(fā)現(xiàn)。對未修飾和用mPEG-DOPA-修飾的Au基材以及mPEG-DOPA粉末和暴露于mPEG-OH的金基材進(jìn)行TOF-SIMS分析。對各基材進(jìn)行約4分鐘的數(shù)據(jù)收集。
未經(jīng)修飾的Au的陽離子譜顯示出典型地代表了烴污染物的(CnH2n+1)+和(CnH2n-1)+峰(數(shù)據(jù)未示出)。存在其它較少的污染物，包括NH4+、Na+和相對少量的CaHbOc+類。由于用于淀積Au薄膜的方法的原因，除了在m/z～196.9的Au峰以外，還在m/z～52處觀察到Cr峰。將金表面暴露于mPEG-OH僅使得代表CaHbOc+PEG片段的峰發(fā)生中等增大，該峰可能是由污染物或mPEG-OH的非特異性吸附造成的。這點可由m/z～225(AuOC+)和254(AuOCCO+)峰證實，當(dāng)與用mPEG-DOPA修飾的基材相比時，這些峰并未顯示出顯著的增大。(圖8A-C)。
用mPEG-DOPA修飾的Au表面的陽離子譜中占主導(dǎo)的是代表被吸附分子的CaHbOc+峰的存在。如圖9所示，相對于未經(jīng)修飾和用mPEG-OH修飾的表面，C2H3O+和C2H5O+的相對豐度提高。C3H7+(m/z～43)和C4H5+(m/z～53)的相對豐度也有顯著的增長，這些峰可能是有烴污染物或Boc保護(hù)基中的叔丁基部分造成的。
PEG化的Au基材陽離子譜中最顯著的特征可能是在高質(zhì)量范圍中的圖形化三重峰(triplet)重復(fù)(圖10)。這些三重峰簇各對應(yīng)于一個Au-DOPA-(CH2CH2O)n片段。當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步分辨，三重峰中的各亞簇代表加入了CH2、CH2CH2或CH2CH2O，這些峰各自分開約14-16amu。該重復(fù)圖形在n＝0-15時可辨認(rèn)，而超出該范圍時該信號則低于檢測限。
在原初Au表面的陰離子譜中，除了n＝1-3時的O-、HO-和Aun-強可檢測峰外，只觀察到少許的記錄(數(shù)據(jù)未示出)。在m/z～13(CH-)、24(C2H2-)和37(C3H-)存在少量的烴污染物。PEG化的Au表面的陰離子譜中占主導(dǎo)的是m/z～126.893的C7H11O2+峰。在用mPEG-OH修飾的Au譜中該峰以中等強度存在表明其代表了較大的乙二醇片段。最令人感興趣的峰位于高質(zhì)量范圍(＞200m/z)，代表了偶聯(lián)于Au的兒茶酚氧。該圖譜表明一個Au原子可結(jié)合對應(yīng)于3個DOPA的多達(dá)6個氧原子。
接觸角數(shù)據(jù)顯示了對用mPEG-DOPA修飾金薄膜時所用吸附溶劑的特性的強烈依賴性(數(shù)據(jù)未示出)。在DCM中修飾的表面顯示出顯著低于未經(jīng)修飾表面(p＜0.001)和在所有水性溶液中進(jìn)行修飾的表面(p＜0.05)的θa。通常而言，隨著水性溶液的pH提高，經(jīng)處理表面的親水性降低，這表明PEG化表面的能力減小，可能是由于DOPA在pH提高時傾向于被氧化為其粘性較低的醌形式，由在先研究支持的解釋顯示DOPA的未氧化兒茶酚形式對粘性起到主要作用。
實施例12b以下對蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞粘附/擴散到未經(jīng)處理和經(jīng)處理的蓋玻片上進(jìn)行了評估。表面等離子體激元共振(surface plasmon resonance，SPR)試驗顯示含DOPA的聚合物迅速結(jié)合于金表面，而所得經(jīng)修飾的表面對蛋白質(zhì)吸附具有增強的抗性(圖11)。吸附于用mPEG-MAPd(5k)修飾的金上的蛋白質(zhì)比吸附于未經(jīng)修飾的金表面的少約70％。對培養(yǎng)于經(jīng)修飾的基材上成纖維細(xì)胞的分析表明細(xì)胞粘附強烈依賴于制備PEG修飾基材時所用的mPEG-DOPA濃度(圖12)、吸附溶劑和修飾時間。用＞25mg/ml的mPEG-DOPA或mPEG-MAPd對表面進(jìn)行24小時的修飾在細(xì)胞粘附和擴散中顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低(圖12-14)。用mPEG-MAPd(5k)修飾的金表面顯示其總突出細(xì)胞面積(total projected cellulararea)降低了97％，而粘附于表面的細(xì)胞密度則降低了91％。
實施例12c實施例12a中所示的修飾，可任選地參照實施例10b和11b進(jìn)行改變，并可擴展到其它貴金屬，包括但不限于銀和鉑表面。如本文所述，這些應(yīng)用也可擴展到包括任何具有鈍化或氧化表面的大塊金屬或合金的表面修飾。例如，可如本文所述，對大塊金屬氧化物和相關(guān)的陶瓷表面進(jìn)行修飾。也可將該技術(shù)擴展到半導(dǎo)體表面，例如用于集成電路和MEMS裝置制造中的那些表面，這些在下文關(guān)于納米顆粒穩(wěn)定化的上下文中也有說明。
實施例13用實施例12a所述的方法，通過從10mM水溶液中吸附mPEG-MAPd(2k)，對硅酸鹽玻璃表面(玻璃蓋玻片)進(jìn)行修飾。如上所述地對粘附于經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾玻璃表面上的NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞密度進(jìn)行評估。用mPEG-MAPd修飾24小時的玻璃表面上的細(xì)胞密度與未經(jīng)修飾的玻璃表面相比顯示出43％的降低(細(xì)胞密度(個細(xì)胞/mm2)在未經(jīng)修飾的玻璃上為75.5+/-6.5；在用mPEG-MAPd修飾的玻璃上為42.7+/-9.8)。
實施例14a為了說明金屬氧化物(且具體為金屬氧化物納米顆粒)的穩(wěn)定化，將50mgmPEG-DOPA(5k)溶于水中(18MΩ-cm，Millipore)并加入1 mg磁粉(Fe3O4)。用作為對照的mPEG-NH2(5k)(Fluka)和mPEG-OH(2k)(Sigma)制備類似的制備物。用Branson Ultrasonics 450探頭式超聲波儀對浸沒于25℃浴中的各水性溶液進(jìn)行1小時的超聲。探頭的頻率為20kHz，長度為160mm，端部直徑為4.5mm。然后取出樣品，使其在室溫中靜置過夜以使任何未經(jīng)修飾的磁鐵石從溶液中沉淀出。用對照聚合物(mPEG-NH2和mPEG-OH)制備的懸浮液迅速析出，得到棕色固體和澄清無色的上清液。使用以PEG-DOPA穩(wěn)定化的納米顆粒制備的樣品中，樣品是澄清棕色的。分離澄清棕色上清液，在水中用Spectra/Por膜管件(MWCO15,000)透析3天。透析后，對樣品進(jìn)行冷凍干燥并將其在室溫下儲存于真空中直至使用。
實施例14b通過透射電子顯微(TEM)、熱重分析(TGA)、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法(FTIR)和UV/可見光光譜法對用mPEG-DOPA穩(wěn)定化的納米顆粒進(jìn)行表征。TEM的結(jié)果顯示大部分納米顆粒的直徑為5-20nm(數(shù)據(jù)未示出)。對0.4mg用mPEG-DOPA穩(wěn)定化的磁鐵石的TGA分析表明所述顆粒含有17重量％的mPEG-DOPA(數(shù)據(jù)未示出)。對未經(jīng)處理的磁鐵石進(jìn)行的FTIR顯示在4000-400cm-1的波長范圍內(nèi)有較小的吸收，而用mPEG-DOPA處理的納米顆粒的FTIR則顯示在800-1600cm-1和2600-3200cm-1的吸收波段，這一點就證實了mPEG-DOPA的存在。
實施例14c干燥的用PEG-DOPA穩(wěn)定化的磁鐵石納米顆粒易分散于水性和極性有機溶劑中(例如，二氯甲烷)以獲得可穩(wěn)定數(shù)月而無明顯沉淀形成的澄清棕色懸浮液。通過將1mg用mPEG-DOPA處理的磁鐵石分散于1ml水(用MillexAP 0.22μm濾器進(jìn)行18MΩ-cm過濾(Millipore))、DCM或甲苯中，制備了用mPEG-DOPA穩(wěn)定化的納米顆粒在不同溶劑中的懸浮液。將懸浮液置于浴式超聲波儀中10分鐘以分散納米顆粒。在室溫下，三種溶液均穩(wěn)定了至少6個月，而未經(jīng)處理的磁鐵石和用mPEG-OH或mPEG-NH2穩(wěn)定化的磁鐵石在各溶劑中的對照懸浮液在少于24小時內(nèi)發(fā)生沉淀。
實施例14d在生理濃度鹽的存在下，發(fā)現(xiàn)用mPEG-DOPA穩(wěn)定化的納米顆粒的懸浮液也是穩(wěn)定的。為了測定mPEG-DOPA能否抑制鹽誘導(dǎo)的納米顆粒聚集，將0.3mg用mPEG-DOPA處理的磁鐵石置于石英比色皿中，加入0.7ml水(用0.25μ濾器進(jìn)行18MΩ-cm過濾)。將飽和NaCl溶液(5μl、10μl、20μl、50μl、100μl)等份(aliquot)連續(xù)加入比色皿中，在進(jìn)行UV-VIS譜前靜置10分鐘(圖15)。懸浮在含有漸增NaCl濃度的溶液中的用mPEG-DOPA穩(wěn)定化的納米顆粒的吸收光譜幾乎相同，這就表明mPEG-DOPA有效穩(wěn)定了納米顆粒并防止了聚集。集中于280nm處的峰是DOPA的兒茶酚側(cè)鏈的指示。
實施例14e知曉了本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解實施例14a-14d中說明的步驟和技術(shù)可擴展到不同的其它金屬氧化物或陶瓷納米顆粒。同樣，本發(fā)明的這些應(yīng)用可進(jìn)一步包括用于類似于或一致于實施例10b和11b中所述的那些組合物和變體的廣泛范圍內(nèi)的聚合物-DHPD偶聯(lián)物。如下文說明，在半導(dǎo)體組合物的制備中，在本發(fā)明的聚合物-DHPD偶聯(lián)物的存在下，可在形成中對金屬氧化物或陶瓷納米顆粒進(jìn)行原位穩(wěn)定化。
實施例15a為了證實金屬納米顆粒的穩(wěn)定性，將市售金膠體懸液(Sigma，粒徑為5或10nm)置于透析管內(nèi)(對5nm使用的截留分子量為8000，而對10nm所使用的則為15000)，并在超純水中透析2-3天以去除存在于市售制品中的疊氮化鈉。然后將經(jīng)透析的懸液置于小玻璃瓶中，并加入mPEG-DOPA(10mg/ml)。將樣品在室溫中靜置約2天，然后對樣品再次進(jìn)行透析以去除過量的mPEG-DOPA。未經(jīng)處理的10nm Au納米顆粒在NaCl的存在下不穩(wěn)定并發(fā)生聚集(圖16)，而經(jīng)處理的Au納米顆粒在NaCl水溶液的存在下則保持穩(wěn)定懸浮(圖17)。
實施例15b可通過如前述實施例所述穩(wěn)定各種其它的金屬納米顆粒，這些金屬包括但不限于銀、鉑等。雖然使用本發(fā)明代表性的偶聯(lián)組合物顯示了穩(wěn)定性，但也可通過與實施例10b和11b中所述的替換實施方式相類似或一致的方式來制備各種其它組合物?？赏ㄟ^原位形成穩(wěn)定化的納米顆粒獲得可比結(jié)果，所述穩(wěn)定化的納米顆粒是在適宜的本發(fā)明粘性偶聯(lián)聚合物的存在下由相應(yīng)的金屬前體合成的。
實施例16a本實施例的數(shù)據(jù)顯示了半導(dǎo)體納米顆粒的穩(wěn)定性。采用基于將Cd(NO3)2稀溶液與Na2S稀溶液緩慢混合的標(biāo)準(zhǔn)方法制備CdS納米顆粒(量子點)。用納米級純水制備Cd(NO3)2和Na2S的新鮮儲備液(2mM)。使用氣密注射器，以20μl s-1的速率將Na2S溶液緩慢注入50ml Cd(NO3)2溶液中。隨著Na2S的加入，溶液變黃，在注入2mL Na2S后，由于CdS納米顆粒的聚集出現(xiàn)了黃色沉淀。分離該CdS沉淀并將其干燥備用。使用上述用于磁鐵石的方法，通過超聲將干燥的CdS粉末分散于mPEG-DOPA溶液中以得到澄清的黃色溶液。將上述黃色水性懸浮液于室溫下在暗處儲存數(shù)月，未觀察到沉淀的形成。在不含聚合物而存在mPEG-OH或mPEG-NH2的條件下進(jìn)行對照試驗，得到了黃色沉淀和澄清無色的上清液。在NaCl水溶液的存在下，用mPEG-DOPA穩(wěn)定的CdS納米顆粒保持穩(wěn)定懸浮(圖18)。
實施例16b本實施例的結(jié)果顯示了穩(wěn)定化半導(dǎo)體納米顆粒的原位形成。在mPEG-DOPA的存在下，通過將Cd(NO3)2和Na2S的稀甲醇溶液緩慢混合制備CdS納米顆粒(量子點)。在甲醇中制備Cd(NO3)2和Na2S的新鮮儲備液(2mM)。將25mgmPEG-DOPA(PEG分子量＝2000)溶于5ml 2mM的Cd(NO3)2甲醇溶液中，然后用注射器以20μl s-1的速率緩慢加入5ml 2mM的Na2S溶液。在加入過程中溶液逐漸變黃。未觀察到黃色的沉淀，動態(tài)光散射法顯示顆粒的平均直徑為2.5nm。在不含聚合物或存在mPEG-OH的條件下進(jìn)行對照試驗，得到了黃色沉淀和澄清無色的上清液。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解根據(jù)所選的材料和相應(yīng)的離子取代或交換反應(yīng)，可在本文所述類型的粘性組合物的存在下制備各種其它無機顆?；摹?br> 實施例16c也可將本發(fā)明的聚合偶聯(lián)組合物用于多種其它半導(dǎo)體材料的穩(wěn)定化。例如，可如本文所述對核-殼納米顆粒進(jìn)行表面穩(wěn)定。
實施例17實施例17-20中優(yōu)化的試驗是用mPEG-DOPA-5K進(jìn)行的。測定了數(shù)個參數(shù)以對mPEG-DOPA從溶液中吸附于金上進(jìn)行優(yōu)化，這些參數(shù)包括溶劑的類型和pH、吸附時間和mPEG-DOPA溶液濃度。使用吸附溶劑并未使細(xì)胞粘附和擴散發(fā)生很大的差異。基材上的細(xì)胞數(shù)和它們的總突出面積在DCM和三種不同水溶液間并無顯著的區(qū)別。與未經(jīng)修飾的基材(p＜0.01)相比，在中性、堿性和有機mPEG-DOPA溶液中吸附的基材均具有顯著增強的抗污特性。雖然并未在溶液間的細(xì)胞粘附和擴散中觀察到差異，接觸角數(shù)據(jù)支持在優(yōu)化修飾策略中可將使用有機溶劑作為減少兒茶酚氧化的一種方法。此外，只有在DCM中進(jìn)行的表面修飾顯示出在表面上具有明顯較少的細(xì)胞和較低的總突出細(xì)胞面積。
實施例18細(xì)胞粘附和擴散顯示出對mPEG-DOPA溶液濃度的強烈依賴性(圖12)。與原來的金表面(p＜0.001)和用10mg/ml溶液修飾的表面(p＜0.05)相比，細(xì)胞的粘附和擴散在使用超過25mg/ml mPEG-DOPA修飾的基材上顯著減少。與未經(jīng)修飾的基材相比，采用低于10mg/ml的濃度時細(xì)胞粘附和擴散無差別。在25-75mg/ml的mPEG-DOPA溶液中修飾的表面在細(xì)胞粘附和擴散中未觀察到彼此間的差別。
實施例19延長mPEG-DOPA的吸附時間段也只觀察到較少的成纖維細(xì)胞粘附和擴散。雖然短至5分鐘的基材修飾似乎降低了細(xì)胞粘附和擴散，24小時的吸附時間使得在PEG化基材上的細(xì)胞吸附和擴散明顯少于未經(jīng)修飾的基材(p＜0.001)和經(jīng)短時間處理的基材(p＜0.05)。
實施例20通過電鏡(Hitachi 3500 SEM)觀測培養(yǎng)于未經(jīng)修飾的表面和經(jīng)PEG修飾的表面上的成纖維細(xì)胞形態(tài)。未經(jīng)修飾的Au和經(jīng)mPEG-OH-修飾的Au上的成纖維細(xì)胞通常展開并很好地擴散開，而培養(yǎng)于經(jīng)mPEG-DOPA修飾的Au上的那些細(xì)胞的擴散則要遠(yuǎn)遠(yuǎn)減少(圖14A-C)。應(yīng)注意的是在mPEG-DOPA表面上觀察到的細(xì)胞凸起數(shù)量少于其它表面，該突起結(jié)構(gòu)在通過整合素的細(xì)胞粘附和局部粘附中起作用。圖1 3所示為成纖維細(xì)胞在裸露的Au、經(jīng)mPEG-OH處理的Au和在優(yōu)化條件下(50mg/ml，處理24小時)用mPEG-DOPA 5K、mPEG-MAPd 2K或mPEG-MAPd 5K處理的Au上的粘附和擴散差異。用含DOPA的偶聯(lián)物修飾的表面的細(xì)胞粘附和擴散顯著少于其它兩種表面中的任何一者。雖然mPEG-MAP5K修飾使得總突起細(xì)胞面積減小了97％并使表面上的細(xì)胞密度減小了91％，該減小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于mPEG-DOPA 2K修飾取得的減小。
圖13中用DOPA-和MAPd-偶聯(lián)的PEG修飾的表面間在細(xì)胞粘附和擴散上存在差異，可歸結(jié)于締合的(associated)PEG粘附層的物理性質(zhì)。對SPR結(jié)果的分析表明用MAPd-PEG形成了比用DOPA固定的等分子量PEG具有更高PEG濃度的更厚且更結(jié)實的粘附層。用MAPd-介導(dǎo)的PEG化制得的較厚粘附層更能成功地抑制蛋白質(zhì)的吸附并從而更能成功地抑制細(xì)胞粘附。
實施例21Boc-DOPA(TBDMS)2-Osu的合成將N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(0.110g，0.95mmol)加入到Boc-DOPA(TBDMS)2(0.500g，0.95mmol)的干燥二氯甲烷(DCM)(8.0mL)溶液中。將該溶液置于冰浴上攪拌，并在氮氣氣氛下加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(0.197g，0.95mmol)。在0℃下將反應(yīng)物攪拌20分鐘，然后溫?zé)岬绞覝?，再攪?小時。過濾反應(yīng)混合物以除去脲副產(chǎn)物，隨后將其蒸發(fā)到原體積的1/5。將溶液冷卻到4℃，使其靜置2小時以沉淀殘留的脲副產(chǎn)物，過濾并蒸發(fā)得到白色泡沫狀的Boc-DOPA(TBDMS)2-OSu(0.567g，產(chǎn)率為96％)。
實施例22Boc-DOPA2(TBDMS)4的合成將Boc-DOPA(TBDMS)2-OSu(0.567g，0.91mmol)溶于干燥二甲基甲酰胺(DMF)(2.5mL)中，然后在氮氣氣氛下一次加入DOPA(TBDMS)2(0.405g，0.95mmol)。將該混合物置于冰浴上攪拌，并用注射器逐滴加入二異丙基乙胺(DIEA)(158μL，0,91mmol)。20分鐘后，將反應(yīng)溫?zé)岬绞覝?，在攪?7小時，過濾(如果需要的話)，用乙酸乙酯(EtOAc)(40mL)稀釋，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用5％HCl水溶液沖洗。用EtOAc從水層中萃取。合并有機層并用5％HCl水溶液(3x)、H2O(1x)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發(fā)得到白色泡沫狀的Boc-DOPA2(TBDMS)4(0.83g，產(chǎn)率98％)。
實施例23Boc-DOPA2(TBDMS)4-Osu的合成使用Boc-DOPA2(TBDMS)4重復(fù)實施例21的過程，以獲得Boc-DOPA2(TBDMS)4-Osu。
實施例24Boc-DOPA3(TBDMS)6的合成使用Boc-DOPA2(TBDMS)4-OSu重復(fù)實施例22的過程，以獲得Boc-DOPA3(TBDMS)6。
實施例25DOPA2的合成將Boc-DOPA2(TBDMS)4(0.5g，0.54mmol)溶于飽和HCl/EtOAc(3mL)中，然后在氮氣下攪拌該溶液。5小時后，用另外的HCl氣體在該溶液中輕輕鼓泡25分鐘。將反應(yīng)物靜置過夜，隨后將其濃縮到原體積的。通過離心收集所得沉淀，用冷EtOAc(3x)洗滌，并干燥獲得白色粉末狀的DOPA2(0.15g，產(chǎn)率74％)。用制備型RP-HPLC進(jìn)一步純化產(chǎn)物，并用ESI-MS表征。
實施例26DOPA3的合成將Boc-DOPA3(TBDMS)6(1.06g，0.79mmol)溶于飽和HCl/EtOAc(3mL)中，并在氮氣下攪拌該溶液。12小時后，用另外的HCl氣體在該溶液中輕輕鼓泡30分鐘，然后繼續(xù)反應(yīng)40小時。再次用更多的HCl氣體在溶液中鼓泡30分鐘，停止攪拌。通過離心收集所得的沉淀，用冷EtOAc(3x)洗滌，并干燥得到白色粉末狀的DOPA3(0.424g，產(chǎn)率為96％)。用制備型RP-HPLC進(jìn)一步純化產(chǎn)物，并用ESI-MS表征。
實施例27mPEG-DOPAl-3的合成用氬氣對0.1M的硼酸鹽緩沖液(50mL，pH8.5)進(jìn)行20分鐘的脫氣，并加入L-DOPA(0.197g，1.0mmol)。在將溶液攪拌15分鐘后，分批加入甲氧基封端的PEG-SPA(mPEG-SPA)5K(0.5g，0.1mmol)，并攪拌反應(yīng)物3小時。然后用HCl水溶液將所得的澄清溶液酸化至pH為1-2，用DCM(3x)萃取。用0.1M HCl洗滌合并的有機層，通過MgSO4干燥，并濃縮。將所剩的殘留物溶于DCM中，用乙酸乙酯沉淀3次，得到白色粉末狀的rmPEG-DOPA(0.420g，產(chǎn)率為84％)。用MALDI-MS和1H NMR光譜法表征產(chǎn)物。
實施例28表面修飾對固體金屬基材(Al、316L不銹鋼和NiTi)進(jìn)行研磨和拋光，最后使用的是0.04m膠體二氧化硅(Syton，DuPont)。采用Edwards FL400電子束蒸發(fā)器，以＜10-6托，將20nm TiO2或10nm TiO2/40nm Au蒸發(fā)淀積到Si晶片上，然后將其切割成8mm×8mm的片。在以下各物質(zhì)中對所有基材進(jìn)行20分鐘的超聲清潔5％Contrad70(Fisher Scientific)、超純H2O、丙酮和石油醚。然后，通過在150毫托和100W下暴露于O2等離子體中(Harrick Scientific)5分鐘對表面進(jìn)行進(jìn)一步的清潔。為了防止形成金氧化物(Au2O3)層，未將某些Au基材暴露于O2等離子體中。為了形成與生物聚合體類似的表面，對玻璃蓋玻片(Fisher Scientific)進(jìn)行了如上所述的清潔，并將其浸泡于0.01％的聚左旋賴氨酸(Sigma)溶液中5分鐘，用超純H2O清洗，并在氮氣下干燥。
為了用最少的樣品研究各種修飾條件，使用了9要素的羅巴斯特設(shè)計法(Robust Design approach)。在混濁點條件下，通過在50℃下浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M MOPS緩沖的0.6M K2SO4溶液中對基材進(jìn)行修飾。如表1所示對緩沖液的pH、修飾時間和mPEG-DOPA濃度進(jìn)行改良。然后用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
表1

實施例28aTiO2基材在混濁點條件下，通過如下方法對TiO2基材進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28b在混濁點條件下，用如下方法對316L不銹鋼(Goodfellow，Devon PA)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28c在混濁點條件下，用如下方法對Al2O3(Goodfellow，Devon PA)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28d在混濁點條件下，用如下方法對SiO2(1500的熱氧化物，University Wafer，South Boston，MA)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1MN-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28eNiTi合金(10mm×10mm×1mm)獲自Nitinol Devices&Components(Fremont，CA)，并在混濁點條件下，用如下方法對其進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28f在混濁點條件下，用如下方法對Au(用電子束蒸發(fā)法淀積在獲自UniversityWafer的Si晶片上)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1MN-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28g在混濁點條件下，用如下方法對Au2O3(將實施例28f中所述的Au樣品暴露于氧等離子體中以形成Au2O3)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28h在混濁點條件下，用如下方法對GaAs(University Wafer，South Boston，MA)進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例28i用如下方法制備p-L-Lys表面將玻璃蓋玻片(Fisher Scientific)浸泡于0.01％的聚左旋賴氨酸(p-L-Lys，Sigma)中5分鐘，用超純H2O清洗，并在N2下干燥。然后，在混濁點條件下，用如下方法對它們進(jìn)行修飾于50℃下，將基材浸泡于mPEG-DOPA1-3的用0.1M N-3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩沖的0.6M K2SO4溶液中24小時。用超純H2O清洗經(jīng)修飾的基材，并在氮氣流下干燥。
實施例29細(xì)胞粘附在37℃和5％CO2下培養(yǎng)第12-16代3T3瑞士白化病患者成纖維細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)，培養(yǎng)基為補充有10％胎牛血清(FBS)(Cellgro，Herndon，VA)、100g/mL青霉素和100U/mL鏈霉素(steptomycin)的達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(DMEM)(Cellgro，Herndon，VA)。在進(jìn)行細(xì)胞粘附分析前，用0.25％的胰蛋白酶-EDTA收集成纖維細(xì)胞，重懸于生長培養(yǎng)基中，并用血球計數(shù)板計數(shù)。
4小時分析的總體步驟在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular Devices Corporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29aTiO2基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定恢復(fù)細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29bTiO2基材(長期研究)對于TiO2的長期研究，以與4小時分析相同的密度在基材上進(jìn)行每周兩次的重新接種。在周期性的間隔中，通過吸取各孔中的培養(yǎng)基來去除未粘附的細(xì)胞。
實施例29c316L不銹鋼基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mLDMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29dAl2O3基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29eSiO2基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29fNiTi基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29gAu基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29hAu2O3基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材3 0分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29iGaAs基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例29jp-L-Lys基材(4小時分析)在37℃和5％CO2的條件下，在裝有含F(xiàn)BS的1.0mL DMEM的12孔組織培養(yǎng)聚苯乙烯板中準(zhǔn)備測試基材30分鐘。以2.9×103個細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞種于基材上，并在37℃和5％CO2的條件下，在含有10％FBS的DMEM中保持4小時。為了進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附分析，在3.7％的多聚甲醛中固定粘附細(xì)胞5分鐘，然后用5μM 1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)(MolecularProbes，Eugene，OR)的DMSO溶液在37℃下染色45分鐘。
用配置了SPOT RT數(shù)碼相機(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)的Leica反射熒光顯微鏡在每片基材上的任意位置上獲取9-16個影像(取決于基材大小)來獲得定量的細(xì)胞粘附數(shù)據(jù)。采用MetaMorph中的閾值，定量所得影像的總突出細(xì)胞面積。(Universal Imaging CorporationTM，其為Molecular DevicesCorporation的子公司，Downington，PA)。報告了測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例30基材的24小時修飾和4小時分析以圖24中所示的pH值，于50℃下在1.0mg/mL的mPEG-DOPA3(或作為對照的mPEG-OH)中修飾各表面24小時。如上實施例9中所述進(jìn)行4小時細(xì)胞粘附和擴散分析。結(jié)果示于圖24中。比較了用mPEG-DOPA3處理的所有基材的細(xì)胞粘附抗性。經(jīng)mPEG-OH處理的基材的細(xì)胞粘附和擴散與未經(jīng)修飾的表面沒有區(qū)別(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例31表面和表面準(zhǔn)備通過物理蒸汽淀積法，用反應(yīng)性磁控濺射(PSI，Villigen，Switzerland)將TiO2(20nm)涂覆于硅晶片上(WaferNet GmbH，Germany)。然后將用金屬氧化物涂覆的晶片切割成1cm×1cm的片以用于離位(ex-situ)橢圓光度法(ellipsometry)測定。用于OWLS測定的光學(xué)波導(dǎo)片購自Microvacuum Ltd.(Budapest，Hungary)，并由AF45玻璃基材(8×12×0.5mm)和200nm厚的Si0.25Ti0.75O2波導(dǎo)表面層組成。用與如上所述用于硅晶片的相同的條件，在波導(dǎo)層的頂部淀積8nm的TiO2層。在聚合物修飾之前，在2-丙醇中對用TiO2涂覆的硅晶片和波導(dǎo)片進(jìn)行10分鐘的超聲處理，在超純水中清洗，并在氮氣流下干燥，然后將其暴露于O2等離子體(Harrick Scientific，Ossining，美國)中3分鐘以從表面上去除所有有機成分。在OWLS測定后，如下所述對波導(dǎo)片進(jìn)行再生以重復(fù)利用將波導(dǎo)片置于清洗溶液(300mM HCl、1％洗滌劑；Roche Diagnostics，瑞士)中超聲處理，然后用超純水清洗以去除被吸附物。
表面修飾.
使用混濁點緩沖液(CP緩沖液用0.1M MOPS緩沖到pH＝6.0的0.6M K2SO4)，在25-50℃的溫度范圍內(nèi)，用根據(jù)實施例27制備的mPEG-DOPA1-3對表面進(jìn)行24小時的修飾，所用聚合物濃度為1.0mg/ml。修飾后用水清洗基材，在N2流中干燥，然后立即如下所述進(jìn)行分析。
X射線光電子光譜法(XPS)測定使用在325W(13kV，25 mA)和0°的飛離角(take-off angle)下工作的標(biāo)準(zhǔn)(非單色化)AlKαX射線源，在SAGE 100上(SPECS，Berlin，Germany)采集測量結(jié)果和高分辨率光譜，，所述飛離角定義為光電子檢測器和表面法線間的角度。用于測量和高分辨率光譜的通過能(pass energy)分別為50eV和14eV。在數(shù)據(jù)采集中，將分析室中的壓力保持在低于2×10-8Pa。所有XPS光譜均以287.4eV下的Cls信號中的脂族烴基成分為參考。用CasaXPS軟件，采用Shirley本底扣除以及90％高斯函數(shù)和10％勞倫斯函數(shù)之和進(jìn)行曲線擬合。用原子靈敏度因子來將測定的強度(峰面積)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化的強度，并可由此計算出表面的原子組成。表7-8中報告了三片重復(fù)基材的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差通常小于平均值的l0％，為了清楚起見將其省略。
表7對于經(jīng)mPEG-DOPA修飾的TiO2表面的XPS數(shù)據(jù)的定量分析

表8從經(jīng)mPEG-DOPA修飾的TiO2表面的XPS數(shù)據(jù)計算得到的原子比例

a供量(Contribution)A、B和C定義于表7中。
分光橢圓光度法(Spectroscopic Ellipsometry)對于ELM測定，如上所述對用TiO2濺射的Si基材進(jìn)行離位修飾，修飾溶液的溫度在25-50℃間變化。修飾后，用H2O清洗基材，在室溫下于10mM HEPES緩沖液中(pH＝7.4)孵育48小時，再次用H2O清洗，并用N2干燥。為了檢測蛋白質(zhì)抗性，將經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的基材暴露于純?nèi)搜逯?5分鐘，用水清洗，并在N2流中干燥。在修飾前和剛修飾后、HEPES孵育后和血清暴露后，于65°、70°和75°下，在M-2000D分光橢圓光度儀上(J.A.Woollam Co.，Inc.，Lincoln，USA)進(jìn)行ELM測定，所用波長為193-1000nm。在WVASE32分析軟件中利用通用化柯西聚合物層(Cauchy polymer layer)(An＝1.45，Bn＝0.01，Cn＝0)的光學(xué)性質(zhì)，用多層模式擬合ELM圖譜，以獲得所吸附PEG和血清粘附層的“干”厚度。(“干”或脫水厚度是指在用N2干燥后在環(huán)境條件下測定的厚度)。表9-10中報告了三次重復(fù)測定的平均厚度。
表9吸附溫度對TiO2a上PEG粘附層厚度的影響

aTiO2表面暴露于mPEG-DOPA3(1mg/ml)中2小時，然后在HEPES中清洗各表面48小時。
表10通過分光橢圓光度法測定的TiO2上的有機粘附層表觀厚度()

a將TiO2表面暴露于mPEG-DOPA3(1mg/ml)中0-1080分鐘，用水清洗，在HEPES中孵育48小時，然后暴露于血清中15分鐘。
b暴露于血清后的吸附層厚度的凈增長小于0.5，該數(shù)值接近于ELM技術(shù)的分辨率。
光學(xué)波導(dǎo)光模式光譜法(Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy，OWLS)。
如上所述，用2-丙醇和O2等離子體清潔用TiO2涂覆的波導(dǎo)體。將清潔的波導(dǎo)體固定在OWLS110(Microvacuum Ltd.)的測定頭上，并于室溫下在混濁點緩沖液(CP緩沖液用0.1M MOPS緩沖至pH＝6.0的0.6M K2SO4)中穩(wěn)定化至少48小時。所述穩(wěn)定化階段使得TiO2表面上的離子交換達(dá)到平衡，并獲得穩(wěn)定的基線。為監(jiān)測聚合物的吸附，以停流模式(stop-flow mode)注入在CP緩沖液中的mPEG-DOPA，然后注入CP緩沖液去除未結(jié)合的PEG，在此之后信號得以穩(wěn)定化。記錄未偶聯(lián)角(incoupling angle)——αTM和αTE，通過制造商提供的軟件將其轉(zhuǎn)化為折射指數(shù)(NTM，NTE)。使用de Feijter公式將傳感器的有效折射指數(shù)實時變化轉(zhuǎn)化為吸附質(zhì)量。需要納入的參考的鄉(xiāng)情[de Feijter，1978#14]用純PEG的0.13cm3/g和純多氨基酸的0.18cm3/g間的線性插值對各mPEG-DOPA聚合物的折射指數(shù)增值——dn/dc進(jìn)行計算。對于蛋白質(zhì)吸附試驗，將測定頭的溫度平衡在37℃，直至信號穩(wěn)定，然后注入血清15分鐘，在注入緩沖液。吸附質(zhì)量并未隨血清暴露時間的延長而有明顯的不同。
實施例32N-甲基丙烯酰基3，4-二羥基-L-苯丙氨酸的合成將1.15g(5.69mmo1)Na2B4O7溶于30ml水中。用Ar對溶液進(jìn)行30分鐘的脫氣，然后加入0.592g(3.0mmol)L-DOPA，攪拌15分鐘。然后加入0.317g(3.0mmol)Na2CO3，將溶液冷卻到0℃，攪拌下緩慢加入0.3ml(3.0mmol)甲基丙烯酰氯。在反應(yīng)過程中，用Na2CO3將溶液的pH保持在9。在室溫下攪拌1小時后，用濃HCl將溶液酸化到pH為2。用乙酸乙酯萃取該混合物3次。用0.1NHCl洗滌后，用無水MgSO4干燥，真空去除溶劑，獲得淺棕色粗固體。通過從硅膠柱中用二氯甲烷(DCM)和甲醇(95∶5)洗脫對產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。蒸發(fā)去除溶劑后，以35％的產(chǎn)率得到白色粘稠固體。1H NMR(500MHz，丙酮-d6) 7.1d(1H，-NH-)；6.6-6.8(3H，C6H3(OH)2-)；5.68s(1H，CHH＝)；5.632s(unknownpeak)；5.33s(1H，CHH＝)；4.67m(1H，-CH-)；2.93-3.1m(2H，CH2-)；1.877s(3H，-CH3)。
實施例333，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-L-苯丙氨酸的合成將3.60g(24.0mmol)TBDMS-Cl溶于18ml無水乙腈中。將1.60g(8.0mmol)L-DOPA加入溶液中，攪拌該懸液并冷卻到0℃，然后加入3.6mlDBU(24.0mmol)。然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時。將冷乙腈加入反應(yīng)溶液中，得到無色沉淀。過濾該沉淀并用冷乙腈洗滌數(shù)次，然后對其進(jìn)行真空干燥。以78％的產(chǎn)率得到白色粉末。1H NMR(500MHz，甲醇-d)； 6.7-6.9(eH，C6H3(O-Si-)2-)；3.72(m，1H，-CH-)；2.82-3.2(m，2H，-CH2-)；1.0(d，18H，-C(CH3))；0.2(d，12H，Si-CH3)。
實施例343，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸的合成將1.60g(3.77mmol)3，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-L-苯丙氨酸加入10ml含0.34g(4.05mmol)NaHCO3的水中。加入0.96g(4.30mmol)二碳酸二叔丁酯(di-t-butyl dicarbonatel在10ml四氫呋喃中的溶液，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時。蒸發(fā)去除四氫呋喃后，在殘留物中加入10ml水。用稀HCl將溶液酸化到pH為5，用乙酸乙酯萃取3次。用無水MgSO4干燥后，真空去除溶劑。通過柱層析純化粗產(chǎn)物(硅膠；洗脫液；10％甲醇的DCM溶液)。蒸發(fā)去除洗脫溶劑后以70％的產(chǎn)率獲得白色固體。1H NMR(500MHz，甲醇-d)； 6.68-6.81(3H，C6H3(O-Si-)2-)；4.28(m，1H，-CH-)；2.78-3.08(m，2H，-CH3-)；1.4(s，9H，-O-C(CH3)3)；1.0(d，18H，-Si-C(CH3)3)；0.2(d，12H，Si-(CH3)2)。
實施例353，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸五氟苯基酯的合成將1g(1.90mmol)3，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸和0.351g(1.90mmol)五氟苯酚(pentafluorophernol)溶于由24ml二噁烷和1ml DMF組成的溶劑混合物中，在0℃下加入0.432g(2.10mmol)DCC。在0℃下攪拌溶液1小時，然后在室溫下攪拌1小時，攪拌后對溶液進(jìn)行過濾以去除二環(huán)己基脲，真空蒸發(fā)。通過柱層析對產(chǎn)物4進(jìn)行純化(硅膠；洗脫液；己烷/乙酸乙酯＝11.2)。去除洗脫液后，以55％的產(chǎn)率獲得純白色的粘稠固體。1H NMR(500MHz，CDCl3)； 6.65-6.81(3H，C6H3(O-Si-)2-)；4.85(m，1H，-CH-)；3.05-3.2(m，2H，-CH3-)；1.41(s，9H，-O-C(CH3)3)；1.0(d，18H，-Si-C(CH3)3)；0.2(d，12H，Si-(CH3)2)。
實施例36N-(13’-氨基-4’，7’，10’-三氧雜三癸基)-叔丁氧羰基-3’，4’-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-L-苯丙酰胺的合成在0℃下，將0.869g(1.26mmol)3，4-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸五氟苯基酯的10ml DCM溶液，在30分鐘的時間內(nèi)逐滴加入到由2.07ml(9.44mmol)4，7，10-三氧雜-1，13-三癸烷二胺和1.32ml(9.44mmol)Et3N在1mlDMF中形成的混合物中。在室溫下將溶液再攪拌2小時，然后在真空下去除溶劑。將粗產(chǎn)物載于硅膠上，用DCM、5％甲醇的DCM溶液、10％甲醇的DCM溶液和15％甲醇的DCM溶液洗脫。真空下去除溶劑獲得白色固體狀的化合物5。產(chǎn)率為63％。1H NMR(500MHz，丙酮-d6)； 7.38(m，1H，-CONH-)；6.60-6.80(3H，C6H3(O-Si-)2-)；5.26(m，1H，-CONH-)；4.30(m，1H，-CH-)；3.4-3.8(m，12H，-CH2O-；3.03-3.4(m，4H，-CH2-NH-，-CH2-NH2)；2.78-3.02(m，2H，-CH2-)；2.0(m，2H，-CH2-)；1.7(m，2H，-CH2-)；1.39(s，9H，-O-C(CH3)3)；1.0(d，18H，Si-C(CH3)3)；0.2(d，12H，Si-C(CH3)2)。
實施例37N-(13-(N’-叔丁氧羰基-L-氨基-3’，4’-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-4，7，10-三氧雜三癸基)-異丁烯酰胺的合成將0.57g(0.79mmol)N-(13’-氨基-4’，7’，10’-三氧雜三癸基)-叔丁氧羰基-3’，4’-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-L-苯丙酰胺和0.166ml(1.18mmol)Et3N溶于5ml無水三氯甲烷中，并在其中加入0.176ml(1.18mmol)甲基丙烯酸酐。在室溫下攪拌溶液3小時，然后在真空下去除溶劑。通過柱層析以61％的產(chǎn)率獲得白色粘稠固體狀的純化合物6(硅膠；洗脫液乙酸乙酯)。1H NMR(500MHz，CDCl3)； 6.60-6.80(3H，C6H3(O-Si-)2-)；6.40(m，1H，-CONH-)；5.71s(1H，CHH＝)；5.30s(1H，CHH＝)；5.096(m，1H，-CONH-)；4.21(m，1H，-CH-)；3.2-3.65(m，16H，-CH2O，-CH2-NH--CH2-NH2)；2.80-2.99(m，2H，-CH2-)；1.96s(3H，-CH3)；1.81(m，2H，-CH2-)；1.68(m，2H，-CH2-)；1.40(s，9H，-O-C(CH3)3)；1.0(d，18H，Si-C(CH3)3)；0.2(d，12H，Si-C(CH3)2)。
實施例38N-(13-(N’-t-Boc-L-3’，4’二羥基苯丙氨酰胺基)-4，7，l0-三氧雜三癸基)-異丁烯酰胺的合成向10ml圓底燒瓶中加入0.344g(0.433mmol)N-(13-(N’-叔丁氧羰基-L-氨基-3’，4’-雙(叔丁基二甲基甲硅氧基)-4，7，10-三氧雜三癸基)-異丁烯酰胺、3mL THF和0.137g(0.433mmol)TBAF。在室溫下攪拌該溶液5分鐘，然后加入3ml 0.1NHCl。用DCM萃取溶液3次，然后真空蒸發(fā)溶劑。通過柱層析(硅膠；洗脫液7％甲醇的DCM溶液)以63％的產(chǎn)率獲得白色固體狀化合物7。1H NMR(500MHz，丙酮-d6)； 7.90(m，1H，-CONH-)；7.23-7.40(d 2H，C6HH2(OH)2-)；6.56-6.76(3H，C6HH2(OH)2-；5.930(m，1H，-CONH-)；5.71s(1H，CHH＝)；5.30s(1H，CHH＝)；4.20(m，1H，-CH-)；3.1-3.60(m，16H，-CH2O，-CH2-NH-，-CH2-NH2)；2.70-2.95(m，2H，-CH2-)；1.96s(3H，-CH3)；1.78(m，2H，-CH2-)；1.65(m，2H，-CH2-)；1.39(s，9H，-O-C(CH3)3)。
實施例39PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)的合成通過在苯中共沸蒸發(fā)來干燥40g(5mmol)PEG，然后將其溶于150mL DCM中。將4.18mL(30mmol)Et3N和3.6mL(40mmol)丙烯酰氯加入該聚合物溶液中。在攪拌下回流該混合物5小時，使其在室溫下冷卻過夜。將乙醚加入該混合物中以形成暗黃色的沉淀。然后將粗產(chǎn)物溶于飽和NaCl溶液中，并將其加熱到60℃以形成兩層。在上層中加入DCM，并加入MgSO4以去除水分。過濾去除MgSO4后，真空下減少溶劑體積，樣品沉淀于乙醚中。真空干燥終產(chǎn)物，并將其存儲在-15℃。產(chǎn)率為75％。1H NMR(500MHz，D2O)δ6.47(d，1H，CHH＝C-)；6.23(m，1H，C＝CH-C(＝O)-O-)；6.02(d，1H，CHH＝C-)；4.35(m，2H，-CH2-O-C(＝O)-C＝C)；3.23-3.86(PEG CH2)PEG-DA光聚合準(zhǔn)備PEG-DA、化合物1、化合物7和光引發(fā)劑初始溶液(precusor solution)，于光聚合前立即混合。將PEG-DA(200mg/mL)和化合物1(40mg/mL)的儲備液溶于用N2吹掃過的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)中，而將化合物7(60mg/mL)溶于預(yù)先用N2吹掃的50∶50 PBS/95％乙醇中。為了制備最終的聚合化合物，將化合物1或7與PEG-DA合并以獲得終濃度為150mg/mL的PEG-DA和DHPD衍生物。然后將100μL混合物加入盤狀模中(100μL，直徑＝9mm，深度＝2.3mm，Secure SealSA8R-2.0，Grace Bio Lab，Inc.，OR)，用UV燈(Black RayLamp，365nm，型號UVL-56，UVP，CA)或藍(lán)光燈(VIP，400-500nm，BISCO Inc.，IL)照射長達(dá)20分鐘。對于UV引發(fā)的光固化，將DMPA(600mg/mL的VP溶液)加入聚合溶液中以獲得34mM的終濃度。在使用可見光誘導(dǎo)的固化中可使用含DMAB(30mg/mL的VP溶液，終濃度＝151mM)的CQ(100mg/mL的VP溶液，終濃度＝150mM)、或使用含AA(100mg/mL的PBS溶液，終濃度＝17mM)的FNa2(188mg/mL的PBS溶液，終濃度＝2mM)作為光引發(fā)劑。將VP終濃度調(diào)整到135-300mM。
照射后，用濾紙吸干凝膠以去除液體表面層，并對其進(jìn)行稱重。然后將凝膠重量除以100μL起始溶液的重量得出凝膠轉(zhuǎn)化百分比。
實施例41DOPA結(jié)合的測定采用了由Waite和Benedict開發(fā)的改良比色DOPA分析法測定結(jié)合入光聚合化凝膠中的DOPA的量。將光致交聯(lián)的凝膠在3mL 0.5N HCl中攪拌以萃取出未結(jié)合入凝膠網(wǎng)絡(luò)的DOPA單體。將0.9mL亞硝酸鹽試劑(1.45M亞硝酸鈉和0.41M二水合鉬酸鈉)和1.2mL 1M NaOH加入到0.9mL萃取溶液中，在加入NaOH的2-4分鐘內(nèi)，用Hitachi U-2010 UV-Vis分光光度計測定混合物的吸光度(500nm)。使用已知的化合物1-7的濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實施例42機械測試通過將25μL聚合混合物載于用1H，1H，2H，2H-全氟代辛基三氯硅烷處理過的玻璃片上，形成半球狀水凝膠。照射凝膠10分鐘，在0.15M HCl中透析至少24小時以萃取未結(jié)合的DOPA單體，然后在測試前在PBS中平衡15分鐘以上。為測定凝膠的模量，用超級粘合劑將半球狀凝膠罩與鋼制量筒(直徑＝6mm，長度＝30mm)的一端連接。將該量筒的另一端與壓電步進(jìn)馬達(dá)(IW-701-00，BurleighInstruments，NY)連接，該馬達(dá)串聯(lián)了分辨率約為0.1mN的50g荷載傳感器(loadtransducer)(FTD-G-50，Schaevitz Sensors，VA)。用纖維光學(xué)位移傳感器(RC100-GM2OV，Philtec，Inc.，MD)測定鋼柱在軸向上的移動。將用TiO2涂覆的Si晶片置于水凝膠下，用PBS浸沒Tio2表面以保持凝膠的水合狀態(tài)。壓頭以5μm/s前進(jìn)，直至測定到4mN的最大壓縮負(fù)荷。
通過將具體情況假定為不可壓彈性半球體和硬質(zhì)平面間無粘附接觸的Hertzian機制，計算彈性模量，在這種情況下負(fù)荷(Ph)和位移(δh)間的Hertzian關(guān)系變?yōu)?
Ph=16R1/2E9δh3/2]]>其中R和E分別為半球狀凝膠的曲率半徑和彈性模量。通過從凝膠的照片上測定的高度和寬度確定該凝膠的曲率半徑。
實施例43將PEG-DOPA化學(xué)氧化為水凝膠4-臂-PEG-胺(PEG-(NH2)4，Mw＝10,000)購自SunBio，Inc.(WalnutCreek，CAv)，而直鏈PEG-雙-胺(PEG-(NH2)2，Mw＝3,400)和甲氧基-PEG-胺(mPEG-NH2，Mw＝5,000)則購自Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，AL)。SephadexLH-20獲自Fluka(Milwaukee，WI)。N-Boc-L-DOPA二環(huán)己銨鹽、高碘酸鈉(NaIO4)、蘑菇酪氨酸酶(MT，EC 1.14.18.1)和辣根過氧化酶(HRP，EC1.11.1.17)獲自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。三乙胺(Et3N)、過氧化氫(30wt％，H2O2)、二水合鉬酸鈉和亞硝酸鈉購自Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee，WI)。L-Dopa 購自Lancaster (Windham，NH)。1-羥基苯并三唑(HOBt)獲自Novabiochem Corp.(La Jolla，CA)，而六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(HBTU)獲自 Advanced ChemTech(Louisville，KY)。
用DOPA修飾的PEG的合成使用如下所述的標(biāo)準(zhǔn)碳化二亞胺偶聯(lián)化學(xué)法合成包含多達(dá)4個DOPA端基的用直鏈和支鏈DOPA修飾的PEG。用4個DOPA修飾的PEG的結(jié)構(gòu)示于圖1中。
PEG-(N-Boc-DOPA)4，I的合成將PEG-(NH2)4(6.0g，0.60mmol)與在60mL50∶50的二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF)混合物中的N-Boc-L-DOPA二環(huán)己銨鹽(4.8mmol)、HOBt(8.0mmol)和Et3N(8.0mmol)反應(yīng)。然后加入HBTU(4.8mmol)在30mL DCM中的溶液，在室溫和氬氣下進(jìn)行1小時的偶聯(lián)反應(yīng)。用飽和氯化鈉溶液、5％NaHCO3、稀HCl溶液和蒸餾水依次洗滌該溶液。減壓濃縮粗產(chǎn)物，并通過柱層析在SephadexLH-20柱上以甲醇為流動相進(jìn)行純化。通過在冷甲醇中沉淀3次對該產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化，在室溫下真空干燥，-20℃存儲于氮氣中。1H NMR(500MHz，CDCl3/TMS)δ6.81-6.77(m，2H，C6HH2(OH)2-)，6.6(d，1H，C6H2H(OH)2-)，6.05(br，s，1H)，5.33(br，s，1H)，4.22(br，s，1H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，3.73-3.41(m，PEO)，3.06(m，2H，PEO-CH2-N-C(O)-)，2.73(t，2H，C6H3(OH)2-CH2-CH-)，1.44(s，9H，(CH3)3C-)。GPC-MALLSMw＝11,900，Mw/Mn＝1.01。
PEG-(DOPA)4，II的合成室溫下，將3.0g化合物I(0.25mmol)溶于15mLDCM中。將15mL TFA加入到混合物中在氬氣下反應(yīng)30分鐘。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)溶劑后，用冷甲醇沉淀產(chǎn)物3次，在室溫下真空干燥，并于-20℃存儲于氮氣中。1H NMR(500MHz，D2O)δ6.79(d，1H，C6H2H(OH)2-)，6.66(s，1H，C6H2H(OH)2-)，6.59(d，1H，C6H2H(OH)2-)，4.00(t，1H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，3.70-3.34(M，PEO)，3.24(m，2H，PEG-CH2-N-C(O)-)，3.01-2.88(m，2H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)。GPC-MALLSMw＝11,400，Mw/Mn＝1.02。
PEG-(N-Boc-DOPA)2，III的合成.將PEG-(NH2)2(5.0g，1.5mmol)、N-Boc-L-DOPA二環(huán)己銨鹽(5.9mmol)、HOBt(9.8mmol)和Et3N(9.8mmol)溶于50mL的50∶50的DCM和DMF混合物中。然后加入HBTU(5.9mmol)在25mL DCM中的溶液，在室溫和氬氣下進(jìn)行30分鐘的反應(yīng)。如對化合物I所述地對產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。1H NMR(500MHz，CDCl3/TMS)δ6.81-6.77(m，2H，C6HH2(OH)2-)，6.59(d，1H，C6H2H(OH)2-)，6.05(br，s，1H)，5.33(br，s，1H)，4.22(br，s，1H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，3.73-3.42(M，PEO)，3.06(m，2H，PEO-CH2-N-C(O)-)，2.74(t，2H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，1.44(s，9H，(CH3)3CO-)。GPC-MALLSMw＝4,600，Mw/Mn＝1.02。
甲氧基-PEG-(N-Boc-DOPA)，IV的合成將mPEG-NH2(2.0g，0.40mmol)、N-Boc-L-DOPA二環(huán)己銨鹽(0.80mmol)、HOBt(1.3mmol)和Et3N(1.3mmol)溶于20mL的5050 DCM和DMF的混合物中。然后加入HBTU(0.80mmol)在10mLDCM中的溶液，在室溫和氬氣下進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。如對化合物I所述地對產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。1H NMR(500MHz，CDCl3/TMS)δ6.81-6.60(m，3H，C6H3(OH)2-)，6.01(br，s，1H，OH-)，5.32(br，s，1H，OH-)，4.22(br，s，1H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，3.73-3.38(m，PEO)，3.07(m，2H，PEO-CH2-NH-C(O)-)，2.73(t，2H，C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-)，1.44(s，9H，(CH3)3C-)，1.25(s，3H，CH3CH2O-)。GPC-MALLSMw＝6,100，Mw/Mn＝1.02。
DOPA含量測定通過1H NMR譜中有關(guān)峰的積分和通過比色DOPA分析法，對用DOPA修飾的PEG中的DOPA含量進(jìn)行測定。在NMR方法中，通過將δ＝1.44的Boc甲基質(zhì)子積分值與δ＝3.73-3.38的PEG亞甲基質(zhì)子積分值比較來測定DOPA含量。DOPA分析法是基于前述Waite和Benedict的方法。簡而言之，用亞硝酸鹽試劑(1.45M亞硝酸鈉和0.41M二水合鉬酸鈉)處理PEG-DOPA水溶液，然后加入過量NaOH溶液。在加入NaOH 2-4分鐘內(nèi)，用Hitachi U-2010UV/vis分光光度計記錄混合物的吸光度(500nm)。使用已知的DOPA濃度的溶液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
PEG-DOPA水凝膠的形成為了形成PEG-DOPA水凝膠，將高碘酸鈉(NaIO4)、辣根過氧化酶和過氧化氫(HRP/H2O2)或蘑菇酪氨酸酶和氧氣(MT/O2)加入PEG-DOPA(200mg/mL)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)溶液中。對于由MT誘導(dǎo)的膠凝，在加入MT之前，用空氣沖洗PBS 20分鐘。將膠凝時間定性為通過翻轉(zhuǎn)含有混合物液體的小瓶而測定的混合物停止流動的時間。
振動流變測定振動流變測定用于監(jiān)測膠凝過程和用于測定水凝膠的機械特性。將交聯(lián)劑加入PEG-DOPA水溶液，并將充分混合的溶液裝載于Bohlin VOR流變儀上。分析進(jìn)行的條件為頻率為0.1Hz、應(yīng)變(strain)為1％、直徑為30mm的圓錐體和以2.5°圓錐角固定的板。
DOPA氧化的分光評估將用DOPA修飾的PEG溶于10mM PBS溶液中(對于HRP/H2O2和NaIO4用氬氣鼓泡，對于MT試驗則使用空氣鼓泡)。加入氧化劑后，在200-700nm的波長下，以800nm/分鐘的掃描速率監(jiān)測溶液的時間依賴UV/vis譜。對所有樣品均先以PBS緩沖液作為空白，然后在室溫下以Hitachi U-2010 UV/vis分光光度計記錄。
分子量分析使用如下條件測定分子量用GPC-MALLS，在DAWN EOS(WyattTechnology)上，使用Shodex-OH Pak柱，在水性流動相中(50mM PBS，0.1MNaCl，0.05％NaN3；pH＝6.0)，以及使用Optilab DSP(Wyatt Technology折射指數(shù)檢測器。對于分子量的計算，使用了經(jīng)試驗測定的化合物IV的dn/dc值(0.136)。
實施例44材料和方法尖端修飾(Tip modification)在對氮化硅(Si3N4)尖端進(jìn)行表面修飾前，先使用O2等離子體儀(一種機器的名稱)進(jìn)行3分鐘的清潔步驟，然后將它們轉(zhuǎn)移入piranha溶液中(硫酸∶H2O2＝8∶2)30分鐘。用H2O清洗后，將它們移入20％(v/v)3-氨基丙基三甲氧基甲硅烷的甲苯溶液中30-60分鐘，以被胺官能化。選擇了2種聚乙二醇(PEG)衍生物用于在AFM尖端上進(jìn)行PEG化mPEG-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Mw 2000)和Fmoc-PEG-NHS(Mw 3400)(Nektar Inc.)。在50mM磷酸鈉緩沖液、pH7.8的0.6M K2SO4和三氯甲烷的混合物中制備(Fmoc-PEG-NHS∶mPEG NHS＝1∶5-10，5mM)的PEG的混合物。如下所述連續(xù)進(jìn)行PEG化反應(yīng)首先在40℃的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行，然后在三氯甲烷中進(jìn)行反應(yīng)，各步驟均進(jìn)行3小時。使用PEG混合物的原因是為了防止多個DOPA結(jié)合于TiO2上。Fmoc-PEG-NHS在Fmoc斷裂后為Boc-DOPA結(jié)合提供了胺。用哌啶(20％v/v的NMP溶液)對Fmoc進(jìn)行脫保護(hù)5分鐘，然后將懸臂轉(zhuǎn)移到含10μL DIPEA的BOP/HOBt/DOPA(摩爾比為1∶1∶1，最終8mM的NMP溶液)溶液中。同樣的步驟還用于酪氨酸修飾。
AFM試驗所有數(shù)據(jù)均采集自置于的Nikon倒置顯微鏡頂部的AFM儀器(AsylumResearch，Santa Barbara，CA)。通過將均分定理(equipartition theorem)應(yīng)用于熱噪聲頻譜(S1)，計算各懸臂的彈簧常數(shù)(根據(jù)廠家提供的信息為45、100和300pN/nm左右)。將1滴水施加于經(jīng)預(yù)先清潔的(在有機溶劑中超聲和使用O2等離子體)TiO2表面。選擇包含PEG彈性和輪廓長度的力距曲線(Force-distancecurve)用于進(jìn)一步的統(tǒng)計分析。對于DOPA醌試驗，所有的試驗均在pH9.8的20mM Tris中進(jìn)行。
動力試驗升負(fù)荷速率(loading rate)依賴性力測定揭示了DOPA結(jié)合的能量景觀(energy landscape)(17)。[力比上1n(升負(fù)荷速率)]的線性圖的斜率(＝kBT/xb)確定了能壘xb沿施加力的軸的距離。通過獲自由牽引速率改變而發(fā)生的力轉(zhuǎn)變在零升負(fù)荷速率處的對數(shù)截距力和獲自斜率的xb來計算結(jié)合的能壘。使用了氮化硅AFM懸臂(Bio-Levers，Olympus，Japan)，這是由于它們具有較小的彈簧常數(shù)(～5pN/nm和～28pN/nm)。本研究中2nN/秒的最低升負(fù)荷速率是通過使用400nm/秒的牽引速率和懸臂(～5pN/mm)獲得的。最高升負(fù)荷速率(1500nN/秒)是通過壓電設(shè)備5μm/秒的工作和使用堅硬懸臂(300pN/nm，Veeco)產(chǎn)生的。表面表征用配備有單色Al Kα(1486.8eV)300W X射線源和用于消除電荷積累(build-up)的電子槍的X射線光電子光譜法(XPS)(Omicron，Taunusstein Germany)分析表面。用與AFM尖端修飾中所述的相同的步驟，對在高溫室(Keun Ho定制)中制造的氮化硅表面(0.7×0.7cm2)進(jìn)行清潔和修飾。來自碳1s軌道的光電信號是涉及Si3N4表面上所有富含種類Si、O和N的表面修飾的主要指示。
雖然已結(jié)合了具體實施方式
對本發(fā)明的原則進(jìn)行了描述，應(yīng)清楚理解的是這些描述的加入僅是作為實施例，而不是為了以任何方式限制本發(fā)明的范圍。例如，本發(fā)明可增強廣泛種類聚合組合物的粘附特性，不論它們是否能水凝膠化。同樣，本發(fā)明可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種其它的合成技術(shù)以功能性修飾用于后續(xù)的偶聯(lián)和制備相應(yīng)的DOPA偶聯(lián)物的具體聚合物組分。通過本文所附的權(quán)利要求書及由它們合理等價物所確定的范圍，其它優(yōu)點、特征和益處將變得顯而易見，這一點應(yīng)能為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。
權(quán)利要求
1.一種式(I)的二羥基苯基(DHPD)粘性化合物， 式中，R1和R2可相同或不同，各自獨立地選自氫、飽和及不飽和的、支鏈和直鏈的、取代和未取代的C1-4烴基；P單獨和獨立地選自-NH2、-COOH、-OH、-SH、 式中R1和R2如上所定義、單鍵、鹵素、 式中A1和A2單獨和獨立地選自H，單鍵，保護(hù)基團，大致的聚(環(huán)氧烷)， 式中n是1至約3，A3是 R4是H、C1-6低級烷基，或聚環(huán)氧烷 R3如上所定義，D如式(I)所示。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述聚(環(huán)氧烷)具有以下結(jié)構(gòu) 式中，R3和R4單獨和獨立地選自H或CH3，m的值介于1至約250之間，A4是NH2、COOH、-OH，-SH、-H、DHPD或保護(hù)基團。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述DHPD具有以下結(jié)構(gòu)
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述DHPD具有以下結(jié)構(gòu)
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述DHPD具有以下結(jié)構(gòu) 式中A2是-OH，A1大致是以下結(jié)構(gòu)的聚(環(huán)氧烷) R3、R4和m如權(quán)利要求2所限定。
6.如權(quán)利要求5所述的DHPD，其特征在于，所述聚(環(huán)氧烷)是環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物。
7.一種將基材粘附于另一個基材的方法，該方法包括以下步驟提供以下結(jié)構(gòu)的DHPD， 其中R1和R2如上所定義；將上述結(jié)構(gòu)的DHPD施加于要粘附的一個或另一個基材上或兩個基材上；將要粘附的基材與位于它們之間的上述結(jié)構(gòu)的DHPD接觸以將所述基材彼此粘附；和任選地通過分開基材和用位于基材之間的上述結(jié)構(gòu)的DHPD使基材再次互相接觸從而使基材相對于彼此易位。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，R1和R2是氫。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，DHPD部分的一個或另一個具有以下結(jié)構(gòu)
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，兩個DHPD都具有以下結(jié)構(gòu)
11.一種含有式(II)所示化合物的粘合劑 式中，R1、R2和P如權(quán)利要求1所定義。
12.如權(quán)利要求11所述的粘合劑，其特征在于，所述粘合劑在水性環(huán)境中粘合。
13.如權(quán)利要求11所述的粘合劑，其特征在于，所述式(II)的化合物是DOPA。
14.一種含有式(III)化合物的組合物 其中，對于式(1a)的各化合物，R1和R2單獨且獨立地如權(quán)利要求1所定義；對于式(1a)的各化合物，P1和P2單獨且獨立地如權(quán)利要求1中的P所定義，n和m獨立為0至約5，條件是m或n中的一個是至少1。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，R1和R2都是氫。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，P1或P2中的至少一個含有大致的聚(環(huán)氧烷)。
17.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，P1或P2中的至少一個含有至少一個烯基(ethlynic)不飽和位點。
18.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，P1或P2中的至少一個含有PEG。
19.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，(1a)中的至少一個是三-DOPA，P是PEG。
20.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，P1和P2彼此偶聯(lián)。
21.一種涂覆的醫(yī)學(xué)裝置，其包括裝置，和涂層，所述涂層含有權(quán)利要求14所述的組合物。
22.如權(quán)利要求20所述的涂覆的醫(yī)學(xué)裝置，其特征在于，所述裝置選自支架和起搏器。
23.如權(quán)利要求14所述的涂覆的醫(yī)學(xué)裝置，其特征在于，所述涂層是可生物降解的。
24.一種防止細(xì)胞或蛋白質(zhì)粘附到手術(shù)切口部位的方法，包括用權(quán)利要求14所述的組合物涂覆所述部位的步驟。
25.一種在強度上介于氫鍵和共價鍵之間的作用力，所述作用力是基本上可逆地形成、斷裂和再形成。
全文摘要
本發(fā)明提供可含有二羥基苯基部分及其衍生物的粘性聚合物組合物，及相關(guān)使用方法。
文檔編號A61K38/00GK101065134SQ200580006180
公開日2007年10月31日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者P·B·梅瑟史密斯, J·達(dá)爾辛, L·林, B·P·李, K·黃 申請人:西北大學(xué)