專利名稱：細菌感染的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗菌活性的多肽及其衍生物或類似物，和編碼該多肽的核酸。本發(fā)明進一步提供所述多肽、衍生物、類似物或核酸作為藥物的應(yīng)用，還提供在治療方法中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步延伸到由多肽包被的物體。
抗微生物肽是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，其一般含有20-40個氨基酸，具有凈正電荷，并且在非哺乳動物種屬中大部分目前已被鑒定出來。后者限制它們在人或哺乳動物中作為治療劑的有效性，原因在于此類大肽商業(yè)生產(chǎn)中的困難，和所述肽由于它們的非人源性導(dǎo)致的副作用風(fēng)險。直到2003年，Trieste國際抗微生物肽數(shù)據(jù)庫(http://www.bbcm.units.it/～tossi/amsdb.html)中列出的大約800條序列中，只有33條序列是人源性的，并且其中只有3條在長度上少于20個氨基酸。也已經(jīng)開發(fā)了一些短的合成的抗微生物肽。然而，這些肽由于它們的非人源性而具有抗原或毒性作用相關(guān)風(fēng)險的缺點。
已經(jīng)將此類肽特征性地分成6組(Bradshaw，J.P.，Biodrugs，200317235-240)，其中下述3類研究得最多(Bowman H.G.，Journal of InternalMedicine，2003254197-215)(i)缺少半胱氨酸并通常在溶液中帶有α-螺旋兩性分子結(jié)構(gòu)的線性肽，例如，人LL-37(SEQ ID No.19)-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRN LVPRTES；(ii)具有3個二硫鍵的肽，其使得肽具有扁平的二聚β-折疊，例如，人α-防衛(wèi)素(α-defensin)-HNP-1(SEQ ID No.20) (iii)對諸如脯氨酸、精氨酸、色氨酸或組氨酸的某些氨基酸具有特別偏愛的肽，例如，豬PR-39(SEQ ID No.21)-RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGF PPRFPPRFP；或牛indolicidin(SEQ ID No.22)-ILPWKWPWWP WRR。
許多抗微生物肽具有溶解細菌的能力。然而，還不清楚細胞溶解是否是造成所述抗微生物作用的機制(Bowman，如前文)。另外，許多抗菌肽具有凈正電荷，并具有帶有可以幫助肽進入細菌膜的鉸合部的兩親性的元件。然而，這些特征對許多肽都是普遍的，其包括，例如，多肽激素(Bowman，如前文)。因此，目前還沒有完全理解抗微生物肽授予它們的抗微生物功能的機制。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些肽還行使抗病毒作用，但是這被認為是這些肽的任何膜分裂作用的次要的副作用(Bowman，如前文)。
已經(jīng)在科學(xué)文獻中描述的許多抗菌肽具有強的陽離子特征，并通常由精氨酸和賴氨酸殘基組成。然而，并不是所有含有精氨酸和賴氨酸的肽都具有抗微生物活性。例如，Azuma等(Peptides，21327-330(2000))報道了由apoE133-162(LRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVY；SEQ ID No.47)組成的30-mer(長度30個氨基酸)單聚體肽具有抗微生物活性，其活性與抗生素慶大霉素的活性相當(dāng)。然而，作者發(fā)現(xiàn)取代在肽的136、142、147和150位點的個別精氨酸減弱了抗菌活性，而且在142和147位點的殘基看起來最重要。另外，當(dāng)Azuma設(shè)計接近該區(qū)域的較短的肽時，抗菌活性下降了。例如，Azuma’s肽apoE134-151(長度18個氨基酸)盡管含有142和147兩個位點的精氨酸，仍然全然不具有活性。同樣地，Azuma證明了肽apoE134-155(長度22個氨基酸)具有非常低的抗菌活性，和肽apoE134-159(長度26個氨基酸)具有極大減少的抗菌活性。因此，Azuma證明了將肽的長度從30個氨基酸分別減少到26個氨基酸、和22個氨基酸，導(dǎo)致肽的抗菌功效的相當(dāng)多的減少。他們還發(fā)現(xiàn)將肽的長度進一步減少到18個氨基酸導(dǎo)致抗菌功效的完全喪失。最終，Azuma等只研究了apoE衍生肽的抗菌活性，并且沒有評估任何其它抗微生物作用。
因此，看起來Azuma等沒有辦法利用它們的apoE133-162肽的潛在抗菌活性，并且證明簡單構(gòu)建陽離子的肽不能必定地保證它將表現(xiàn)出抗菌功效。因此，Azuma’s肽授予它的抗菌本質(zhì)的機制是全然不清楚的。
本發(fā)明的一個發(fā)明人早先已經(jīng)確定某些多肽具有抗病毒活性。他的研究的這些結(jié)果在PCT/GB2004/005438和PCT/GB2004/005360中有描述。這些抗病毒多肽包含肽的串聯(lián)重復(fù)、及其變體apoE141-149(LRKLRKRLL-SEQ ID No.1)和apoB3359-3367(RLTRKRGLK-SEQ ID No.2)，以及與SEQID No.1或SEQ ID No.2序列接近地相關(guān)修飾的重復(fù)。這些肽衍生于或包括這些脫脂載脂蛋白E和B的LDL受體/HSPG受體結(jié)合區(qū)。然而發(fā)明人不希望被任何假說局限，他們認為這些抗病毒多肽通過許多機制行使它們的抗病毒作用是可能的，其中影響病毒附著的機制是特別贊成的機制。發(fā)明人表明從這些脫脂載脂蛋白的LDL受體/HSPG受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的二聚體化(作為串聯(lián)重復(fù)或其變體)對抗病毒作用是重要的。
盡管事實上，抗病毒試劑與抗菌試劑并不相關(guān)，原因在于它們分別對病毒和細菌的不同作用模式，但是基于上文所討論的抗病毒肽，發(fā)明人決定研究多肽是否具有任何抗菌特性。為了這一目的，他們已經(jīng)研究了這些肽表現(xiàn)的溶菌或其它作用是否可能作用于細菌，即使這些作用在研究病毒時看起來并不會發(fā)生。特別地，發(fā)明人想知道從這些脫脂載脂蛋白的LDL受體/HSPG受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)(例如串聯(lián)重復(fù))的構(gòu)建是否可以具有抗菌作用。特別地，他們想知道apoE141-149區(qū)域的重復(fù)是否可以出乎意料地允許apoE133-162的抗菌特性(在Azuma等中公開，如前文)在更短的多肽中重新獲得。使他們感到震驚的是，他們發(fā)現(xiàn)如下文定義的多肽表現(xiàn)出抗菌活性。
按照本發(fā)明的第一方面，提供多肽或者其衍生物或類似物用于制備治療細菌感染或污染的藥物的應(yīng)用，其中所述多肽包括從脫脂載脂蛋白的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)。
通過術(shù)語“其衍生物或類似物”，我們意指一種其中的氨基酸殘基被具有相似的側(cè)鏈或肽骨架特征的殘基(無論是天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸模擬物)取代的多肽。另外，所述肽的一端或兩端可以通過N和C-末端保護基進行保護，例如，具有與乙酰基或酰胺基相似特征的基團。應(yīng)該理解一旦最終多肽形成或在重復(fù)肽(例如9-mer)的發(fā)展過程中，氨基酸序列可以被改變、剪截或修飾。
本發(fā)明的多肽包含至少兩個從脫脂載脂蛋白的HSPG受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)。應(yīng)該理解所述多肽可以包含同一肽的重復(fù)(即同一肽的同源二聚體或多聚體)。備選地，所述多肽可以包含兩個或更多相關(guān)肽的重復(fù)(即包含兩個或更多的肽單體的肽類型的異源二聚體或多聚體)。如果多肽包含不同的肽，應(yīng)該理解所述肽將共享它們作為或衍生于脫脂載脂蛋白的HSPG受體結(jié)合區(qū)的特征。按照本發(fā)明的多肽應(yīng)該包括作為串聯(lián)重復(fù)以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式將N末端結(jié)合到C末端的此類肽的二聚體或多聚體。因此，除非文中另外指示，否則，當(dāng)我們在本文中提及“串聯(lián)重復(fù)”時，我們是指作為或衍生于脫脂載脂蛋白的HSPG受體結(jié)合區(qū)的肽的重復(fù)。所述串聯(lián)重復(fù)如上文所討論的可以是同源二聚體(或單一肽的多聚體)或可以包含異源二聚體(或相關(guān)肽的多聚體)。
本文所用的術(shù)語“衍生于……的肽”是用來描述或包含來自已被修飾的脫脂載脂蛋白的HSPG受體結(jié)合區(qū)的肽。適宜的修飾可以包括氨基酸取代、添加或刪除。按照本發(fā)明的第一方面，將所述衍生肽或修飾肽作為串聯(lián)重復(fù)進行排列。令人吃驚地，已經(jīng)表明按照本發(fā)明的第一方面的多肽、其衍生物或類似物表現(xiàn)出抗菌活性。
當(dāng)在本文中使用術(shù)語“其剪截體”時，我們意指將按照本發(fā)明的多肽或組成肽通過氨基酸移除或刪除而在大小上減小。氨基酸的減少可以通過從多肽的C或N末端移除殘基，或可以通過從組成肽內(nèi)刪除一個或更多個氨基酸而實現(xiàn)。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如上述定義的多肽具有抗病毒活性。使發(fā)明人震驚的是，當(dāng)將按照本發(fā)明第一方面的多肽在細菌上測試時，它們還表現(xiàn)出抗菌功效，如在實施例所示。因此，發(fā)明人相信他們因而展現(xiàn)出對所述多肽的新的醫(yī)藥學(xué)指示。
當(dāng)將多肽用于治療細菌感染時，它可以施用給受試者。當(dāng)所述受試者是人時，優(yōu)選地，多肽是基于從人脫脂載脂蛋白衍生的重復(fù)。
所述藥物可以用于各種細菌感染的治療，其包括微生物角膜炎；結(jié)膜炎；支氣管肺的感染，例如肺炎；尿道感染，例如膀胱炎、腎盂腎炎；耳、鼻、和喉感染，例如，中耳炎、鼻竇炎、喉炎、白喉；皮膚感染，其包括蜂窩織炎、膿皰病、傷口感染、肉毒中毒、淋病；敗血?。晃负褪改c潰瘍；胃炎；彎曲菌(Campylobacter)感染；奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)感染；腦膜炎；骨髓炎；和沙門菌病。
大體上，由于它們完全不同的作用模式，抗病毒試劑，如阿昔洛韋、利巴韋林、或enfuvirtide(T-20)，對抗細菌感染幾乎沒有用。同樣地，抗菌劑，如抗生素，對抗病毒感染幾乎沒有用。因此，發(fā)明人對按照第一方面的多肽顯示出抗病毒和抗菌功效感到非常驚奇，由于這是完全出乎意料的。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本文所描述的一些特異的多肽僅具有抗菌活性。然而，令人吃驚地，按照本發(fā)明的大多數(shù)多肽作為抗菌劑和抗病毒劑都有活性。因此，最優(yōu)選地，按照第一方面的多肽表現(xiàn)出抗菌活性，以及，還有抗病毒活性。顯然所述多肽表現(xiàn)出的雙重活性是最有利的，原因在于它們可以用于抗擊或治療病毒和細菌感染，優(yōu)選地，同時作用。它們因此具有很大的用途，例如，用于醫(yī)院、外科手術(shù)室的應(yīng)用以及在家中的家庭應(yīng)用。
按照本發(fā)明第一方面的多肽可以包含從脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明第一方面的多肽包含肽的串聯(lián)重復(fù)(如上文所定義)，所述肽從脫脂載脂蛋白BLDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇衍生而來，如Law和Scott所定義的那樣(J.Lipid Res.1990，311109-20)，或備選地，從脫脂載脂蛋白E LDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇衍生而來(J.Lipid Res.1995，361905-1918)。脫脂載脂蛋白B LDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇可以位于脫脂載脂蛋白B的HSPG受體結(jié)合區(qū)內(nèi)，以及脫脂載脂蛋白E的脫脂載脂蛋白E LDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇可以位于脫脂載脂蛋白E的HSPG結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
發(fā)明人實施了詳盡的實驗來評估來自脫脂載脂蛋白和其衍生物的肽的抗菌活性。特別集中在來自ApoE和ApoB的肽和衍生物上。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)apoE141-149單體序列(SEQ ID No.1)和apoB3359-3367(SEQ ID No.2)以及修飾的apoB3359-3367(SEQ ID No.96)不具有可檢測到的抗菌活性。另外，使發(fā)明人震驚的是，他們發(fā)現(xiàn)許多其它相關(guān)的肽具有很少或沒有抗菌作用(參見實施例1，表5和6)。然而，讓人吃驚地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這類肽的重復(fù)(即按照本發(fā)明的第一方面的多肽)，的確表現(xiàn)出抗菌活性。實施例1舉例說明按照本發(fā)明的多肽的功效，其與apoE141-149和apoB3359-3367(即非串聯(lián)重復(fù))以及其它衍生于脫脂載脂蛋白的肽比較。
盡管發(fā)明人不希望局限于任何假說，但是發(fā)明人相信在apoE141-149肽(基于SEQ ID No.1)和apoB3359-3367肽(基于SEQ ID No.2)以及修飾的apoB3359-3367肽(基于SEQ ID No.96)中的陽離子氨基酸殘基，當(dāng)它們是串聯(lián)重復(fù)形式時，允許具有與報道的Azuma大肽(apoE133-162—參考上文)相當(dāng)?shù)目咕钚?。發(fā)明人還已確定了這些肽的某些衍生物也具有抗菌活性，其中包括對所述肽序列的修飾和剪截。
發(fā)明人對具有抗菌活性的多肽進行了詳細的分析，并且尤其是那些基于從脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)的多肽。發(fā)明人在apoE141-149(即9-mer的SEQID No.1)的氨基酸與apoB3359-3367(即9-mer的SEQ ID No.2)以及apoB3359-3367的修飾形式(即9-mer的SEQ ID No.96)的氨基酸之間產(chǎn)生序列比對。所述序列比對在表1中顯示。應(yīng)該理解所述的三種9-mers，或其衍生物是在按照本發(fā)明的多肽中重復(fù)的，以形成至少18-mer，其可以被任選地剪截。
表1表現(xiàn)出抗菌特性的有效肽序列的分析 根據(jù)該比對數(shù)據(jù)，發(fā)明人注意到在每種抗菌多肽中具有重復(fù)發(fā)生的(保守的)氨基酸基序，所述抗菌多肽包含從脫脂載脂蛋白B(apoB3359-3367(SEQ ID No.2))、或修飾的脫脂載脂蛋白B(apoB3359-3367(SEQ ID No.96))、或脫脂載脂蛋白E(apoE141-149(SEQ ID No.1))的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的串聯(lián)重復(fù)、或其剪截物。所述基序?qū)?yīng)三肽精氨酸-賴氨酸-精氨酸(RKR)，其在被稱為SEQ ID.No.1、和SEQID No.96、和SEQ ID No.2的4、5、6位的氨基酸殘基中發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人注意到按照本發(fā)明表現(xiàn)出抗菌活性的所有多肽都包含RKR基序。
因此，特別優(yōu)選地，按照本發(fā)明的多肽包含至少2個RKR基序(即所述多肽包括含有RKR基序的肽的串聯(lián)重復(fù))。
應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽包含至少2個或多個RKR基序(即每個重復(fù)1個RKR)。在所述多肽包括三聚體(3x)重復(fù)、或四聚體(4x)重復(fù)、或甚至更多數(shù)目的重復(fù)的情形下，所述多肽優(yōu)選地分別包括至少3個、或至少4個RKR基序。
在本發(fā)明的一個實施方案中，按照第一方面的多肽可以優(yōu)選地具有式I{abcRKRxyz}+{a′b′c′RKRx′y′z′}其中a，b，c，a′，b′，c′，x，y，z，x′，y′，z′為氨基酸殘基，并且其中所述多肽包含肽abcRKRxyz和肽a′b′c′RKRx′y′z′，其是SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、或SEQ ID No.96、以及其衍生物的重復(fù)。所述衍生物包含SEQ ID No.1、SEQID No.2、或SEQ ID No.96，其中所述肽除RKR基序外至少一個氨基酸殘基可以被精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或其衍生物替代。所述肽還可以包括組氨酸(H)取代，和優(yōu)選地，由僅僅1個H取代組成。
合適地，1個或更多個，更合適地，2個或更多個，和甚至更合適地，3個或更多個氨基酸殘基可以被精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或其衍生物替代。優(yōu)選地，4個或更多個，更優(yōu)選地，5個或更多個，和甚至更優(yōu)選地，6個或更多個氨基酸殘基可以被這些氨基酸或其衍生物替代。優(yōu)選地，被替代或取代的殘基是由式I定義的肽的第一個、第二個、第三個、第七個、第八個、第九個、第十個、第十一個、第十二個、第十六個、第十七個或第十八個殘基。最優(yōu)選的氨基酸取代是用苯丙氨酸(F)殘基或色氨酸(W)殘基，或其衍生物進行取代。
按照本發(fā)明的多肽可以包含18個氨基酸(或其衍生物)，并且因此對應(yīng)由式I定義的帶有或不帶有上文所討論的取代的序列。在這種情形下，氨基酸位置1對應(yīng)a，位置2對應(yīng)b；位置3對應(yīng)c；位置4對應(yīng)氨基酸R(RKR基序的)，等等。
然而，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)基于式I剪截的多肽也具有作為抗菌試劑的活性。因此，優(yōu)選的多肽或其衍生物可以具有少于18個的氨基酸。例如，按照本發(fā)明第一方面的一些多肽在長度上可以是17，16，15，14，13，12，11，10個或更少氨基酸。刪除優(yōu)選地在由式I定義的多肽的第1，2，8，9，10，11，17和/或18位置進行。
發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)基于式I但具有附加氨基酸殘基的多肽也具有作為抗菌試劑的功效。因此，優(yōu)選的多肽或其衍生物可以具有多于18個的氨基酸。例如，按照本發(fā)明第一方面的一些多肽在長度上可以是19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29個或更多氨基酸。添加可以在所述多肽的N或C-末端或核心進行。添加可以在如式I定義的殘基‘a(chǎn)’(即在所述多肽的N-末端)前，或在‘a(chǎn)′’(即在所述多肽的核心)前進行。添加可以在如式I定義的殘基‘z’(即在所述多肽的核心)后，或在‘z′’(即在所述多肽的C-末端)后進行。
然而，所述添加優(yōu)選地在由式I定義的肽的第0，1，2，8，9，10，11，17和/或18位置進行。最優(yōu)選地，添加在肽的第0位置前進行，即將氨基酸添加到由式I定義的‘a(chǎn)’殘基處的第一個氨基酸前的N-末端。
按照式I的多肽可以優(yōu)選地包含下述氨基酸a和a′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；b和b′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；或被刪除；c和c′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或蘇氨酸(T)；或被刪除；x和x′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或甘氨酸(G)；或被刪除；y和y′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；z和z′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除。
式I的多肽可以包含至少1個添加的氨基酸，其可以獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)。優(yōu)選地，將添加的氨基酸加到式I的肽中位置‘a(chǎn)’處的氨基酸前，即添加到N-末端。
因此，應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽可以包括18-mer的{abcRKRxyz}和{a′b′c′RKRx′y′z′}，其中abc，a′b′c′，xyz和x′y′z′如上文所定義，或其剪截物。應(yīng)該理解，例如，a可能不同于a′，并且b可以不同于b′，和c可以不同于c′，等等。
按照第一方面的多肽還可以優(yōu)選地具有式II{abcRKRxyz}+{abcRKRxyz}其中a＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；b＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；或被刪除；c＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或蘇氨酸(T)；或被刪除；x＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或甘氨酸(G)；或被刪除；y＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；z＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除。
如式I的多肽，式II的多肽可以包含至少1個添加的氨基酸，其可以獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)。優(yōu)選地，將添加的氨基酸添加到式II的肽中位置‘a(chǎn)’處的氨基酸前，即添加到N-末端。
因此，應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽可以包括18-mer的{abcRKRxyz}和{abcRKRxyz}，其中abc和xyz如上文所定義，或是其剪截物。
由式II定義的多肽優(yōu)選地包含下述氨基酸a＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；或被刪除；b＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；或被刪除；c＝獨立地選自苯丙氨酸(F)；或色氨酸(W)；或被刪除；x＝獨立地選自苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；或被刪除；y＝獨立地選自苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；或被刪除；z＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；或被刪除。
這些優(yōu)選的多肽可以包含至少1個添加的氨基酸，其可以是苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)或亮氨酸(L)。優(yōu)選地，將添加的氨基酸加到式II的肽中位置‘a(chǎn)’處的氨基酸前，即添加到N-末端。
發(fā)明人還已理解可以使用按照本發(fā)明包含肽的多于只1個串聯(lián)二聚體(2x)重復(fù)或其剪截物的多肽，其中所述肽從脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生而來。例如，包含從脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的三聚體(3x)重復(fù)、或四聚體(4x)重復(fù)、或甚至更多的重復(fù)的多肽可以被用作有用的抗菌試劑。
因此，優(yōu)選地，所述多肽可以具有式III{abcRKRxyz}n其中a，b，c，x，y，和z如上文關(guān)于式I或II的定義，并且其中n等于2，3，4或5，或更大的數(shù)。
其它優(yōu)選的多肽可以包括由式I定義的18-mer肽的重復(fù)(或其剪截物)(例如，包含式I的肽的9-mer的異源二聚體的重復(fù))。
按照本發(fā)明的多肽和其衍生物優(yōu)選地具有用于抑制細菌生長的功效，以至于它們的IC50值約為40μM或更少。優(yōu)選地，IC50值約為30μM或更少，更加優(yōu)選地，約為20μM或更少，并且最優(yōu)選地約為10μM或更少。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解怎樣計算IC50值。
最優(yōu)選地，按照第一方面的多肽可以包含apoE141-149(SEQ ID NO.1)的重復(fù)、或其衍生物和剪截物。
因此，在第二方面，提供多肽、其衍生物或類似物用于制造治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述多肽、其衍生物或類似物包含肽apoE141-149(SEQ ID NO.1)的重復(fù)和其剪截物、或肽apoE141-149的變體的重復(fù)，其中apoE141-149的變體中至少1個亮氨酸(L)殘基被色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)替代。
通過“肽apoE141-149的重復(fù)”，我們意指多肽包含肽序列LRKLRKRLL(SEQ ID No.1)，即9-mer的重復(fù)。所述多肽優(yōu)選地包含氨基酸序列LRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.6)，即18-mer，其為SEQ ID No.1的串聯(lián)重復(fù)二聚體。SEQ ID No.6還在本文稱為GIN 1或GIN1p(其中p表示N末端保護(如通過乙?；?，和C末端保護(如通過酰胺基))。GIN1p還在本文中被稱為MU 10。
通過“其剪截物”，我們意指通過移除氨基酸將所述重復(fù)(如SEQ IDNo.6的18-met)在大小上減小。氨基酸的減小可以通過從C-和/或N-末端移除殘基，或可以通過在所述多肽的核心內(nèi)刪除1個或多個氨基酸(如，SEQ ID No.6的氨基酸2-17)而進行。
發(fā)明人已確定色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)、或苯丙氨酸(F)可以被用于取代apoE141-149串聯(lián)重復(fù)中的亮氨酸，并且所述多肽具有令人吃驚的抗菌活性。
最優(yōu)選地，按照本發(fā)明第二方面的多肽包含含有apoE141-149二聚體重復(fù)或其剪截物的的多肽、其衍生物或類似物，其特征在于二聚體(SEQ IDNo.6)的至少1個亮氨酸(L)殘基被色氨酸(W)、或苯丙氨酸(F)殘基替代。
如下文更詳細地討論，SEQ ID No.6可以利用許多不同的取代和刪除來制造具有抗菌活性的多肽。優(yōu)選地，按照本發(fā)明第二方面的多肽具有至少2個取代，其獨立地選自色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)、或苯丙氨酸(F)取代，和更優(yōu)選地3個或多個色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)、或苯丙氨酸(F)取代。
除了1個或多個L被K，R，Y，F(xiàn)，或W取代，優(yōu)選地至少還有1個氨基酸(優(yōu)選地至少另一個亮氨酸殘基)被精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、或色氨酸(W)替代。特別優(yōu)選地，所述另一個取代是F或W。
發(fā)明人還已理解可以應(yīng)用按照本發(fā)明包含apoE141-149的多于只有1個二聚體串聯(lián)重復(fù)或其剪截物或變體的多肽。例如，三聚體或四聚體或更多的重復(fù)可以用作抗菌試劑。
按照第二方面的多肽可以被合成，以便將其它的氨基酸添加到其上。例如，可以將1，2，3個或更多個的氨基酸添加到衍生于SEQ ID No.6的肽的C或N末端。備選地，所述多肽可以包含大于SEQ ID No.1的9個氨基酸的肽的串聯(lián)重復(fù)。所述肽可以具有添加到SEQ ID No.6的N末端、C末端和/或在第九和第十個氨基酸之間的氨基酸。最優(yōu)選地，將氨基酸添加到SEQ ID No.6的C末端以及在第九和第十個氨基酸之間。應(yīng)該理解，然后可以將所述肽按上文所描述進行修飾，成為衍生于SEQ IDNo.6的多肽。
所述取代的多肽可以包含18個氨基酸(或其衍生物)，并且因而對應(yīng)SEQ ID No.6的全長。然而，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)一些基于SEQ ID No.6選擇性剪截的多肽也具有作為抗菌試劑的功效。因此，優(yōu)選的多肽或其衍生物可以具有少于18個的氨基酸。例如，按照本發(fā)明第二方面的一些多肽在長度上可以是17，16，15，14，13，12，11，10個或更少的氨基酸。
應(yīng)該理解可以將W或Y或R或K或F的修飾形式引入apoE141-149的串聯(lián)重復(fù)，其具有許多本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道的氨基酸變體。所述多肽還將具有抗菌活性，條件是所述修飾沒有顯著地改變它的化學(xué)特征。例如，R或K的側(cè)鏈胺上的氫可以用亞甲基替代(-NH2→-NH(Me)或-N(Me)2)。
按照本發(fā)明第二方面的其它優(yōu)選的多肽(其包含衍生于apoE141-149的肽的串聯(lián)重復(fù))可以包含下述氨基酸序列的一種-(a)WRKWRKRWWWRKWRKRWW(SEQ ID No.7).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQ ID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其所有的亮氨酸被色氨酸殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 7或MU 4。
(b)WRKWRKRWRKWRKR(SEQ ID No.8).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其所有的亮氨酸被色氨酸殘基取代，并且通過切除氨基酸9，10，17和18而被剪截，即為14-mer。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 32。
(c)WRKWRKRWWLRKLRKRLL(SEQ ID No.9).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQ ID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其具有亮氨酸被色氨酸殘基取代的亞型，即為18-mer。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 34。
(d)YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No.10).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQ ID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其所有的亮氨酸被酪氨酸殘基取代，即為18-mer。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 41。
(e)LRKRKKRLRKLRKR(SEQ ID No.11).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其通過切除氨基酸9，10，17和18而被剪截，即為14-mer。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 8。
(f)LRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.3).該多肽對應(yīng)apoE141-149(SEQID NO.6)的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)，其通過切除氨基酸1，2和3而被剪截，即為15-mer。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 2。
(g)FRKFRKRFFFRKFRKRFF(SEQ ID No.48).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 7。
(h)WRKWRKRWWRKWRKRWW(SEQ ID NO.63).該多肽對應(yīng)SEQID No.7，其位置9的W殘基被刪除。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 58。
(i)WRKWRKRWRKWRKRW(SEQ ID NO.64).該多肽對應(yīng)SEQ ID No.7，其位置9，10和18的W殘基被刪除。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 59。
(j)WRKWRKRWWFRKWRKRWW(SEQ ID NO.65).該多肽對應(yīng)SEQID No.7，其位置10的W殘基被F取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 60。
(k)WRKWRKRFFWRKWRKRFF(SEQ ID NO.66).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.7，其位置9，10，17和18的W殘基被F殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 61。
(l)WRKRWWRWRKRWWR(SEQ ID NO.67).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 81。
(m)LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR(SEQ ID NO.68).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 82。
(n)WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR(SEQ ID NO.69).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 83。
(o)LRKLRKRLLWRKWRKRWW(SEQ ID NO.70).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.6，其在位置10，13，17和18的L殘基被W殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 111。
(p)LRKLRKRLLLRKLRKRWW(SEQ ID NO.71).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.6，其在位置17和18的L殘基被W殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 112。
(q)LRKLRKRLLWRKWRKRLL(SEQ ID NO.72).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.6，其在位置10和13的L殘基被W殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 113。
(r)WRKWRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.73).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.6，其在位置1和4的L殘基被W殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 114。
(s)WRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.74).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.6，其在位置1的L殘基被W殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 115。
(t)WRKWRKFFFRKWRKRWW(SEQ ID NO.75).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.7，其在位置8，9和10的W殘基被F殘基取代，并且在位置7的R殘基被刪除。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 116。
(u)WRKWRKRWWFRKFRKRFF(SEQ ID NO.76).該多肽對應(yīng)SEQ IDNo.7，其在位置10，13，17和18的W殘基被F殘基取代。當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 117。
一些按照本發(fā)明第一方面的最優(yōu)選的多肽包含從脫脂載脂蛋白B的HSPG受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)、或其變體或剪截物。
因此，在第三方面，提供多肽、或其衍生物或類似物用于制造治療細菌感染或污染的藥物中的應(yīng)用，所述多肽或其衍生物或類似物包含從脫脂載脂蛋白B的HSPG受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)。
優(yōu)選地，所述多肽、其衍生物或類似物包含從脫脂載脂蛋白B LDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇衍生的重復(fù)。優(yōu)選地，所述多肽、其衍生物或類似物包含肽apoB3359-3367(SEQ ID No.2)的重復(fù)或其剪截物或變體。
按照本發(fā)明第三方面的多肽可以是apoB3359-3367(SEQ ID No.2)的串聯(lián)二聚體重復(fù)，其具有氨基酸序列RLTRKRGLKRLTRKRGLK，即18-mer(SEQ ID No.12)。
按照本發(fā)明第三方面的肽還可以如本文所定義的那樣進行剪截。氨基酸的減少可以通過從C-和/或N-末端移除殘基，或可以通過從所述肽的核心內(nèi)(即SEQ ID No.12的氨基酸2-17)刪除一個或多個氨基酸而實現(xiàn)。
優(yōu)選地，如果所述多肽是三聚體、或四聚體、等等，按照第三方面的多肽包含至少2個RKR基序，或多個。
按照第三方面的優(yōu)選的多肽包含肽apoB3359-3367的串聯(lián)二聚體重復(fù)(即SEQ ID No.12的多肽)或其剪截物，其特征在于除RKR基序外至少1個氨基酸殘基已被甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、組氨酸(H)、色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或它們的衍生物替代。
合適地，1個或更多個，更合適地，2個或更多個，和甚至更合適地，3個或更多個氨基酸殘基可以被甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、組氨酸(H)、色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或它們的衍生物替代。優(yōu)選地，4個或更多個，更優(yōu)選地，5個或更多個，和甚至更優(yōu)選地，6個或更多個氨基酸殘基可以被這些氨基酸或其衍生物替代。優(yōu)選地，被替代或取代的殘基是SEQ ID No.12的第一個、第二個、第三個、第七個、第八個、第九個、第十個、第十一個、第十二個、第十六個、第十七個或第十八個殘基。
優(yōu)選地，按照第三方面的多肽包含SEQ ID No.12的多肽或其剪截物，其特征在于至少1個氨基酸殘基已被色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或它們的衍生物替代。
合適地，1個或更多個，更合適地，2個或更多個，和甚至更合適地，3個或更多個氨基酸殘基可以被色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或它們的衍生物替代。優(yōu)選地，4個或更多個，更優(yōu)選地，5個或更多個，和甚至更優(yōu)選地，6個或更多個氨基酸殘基可以被色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或它們的衍生物替代。優(yōu)選地，被替代或取代的殘基是apoB3359-3367的重復(fù)氨基酸序列的第一個、第二個、第三個、第七個、第八個、和/或第九個殘基，或其結(jié)合。
按照本發(fā)明的多肽可以包含18個氨基酸(或其衍生物)，并且因而對應(yīng)具有或不具有上文所討論的取代的SEQ ID No.12的全長。然而，發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)基于SEQ ID No.12剪截的多肽也具有作為抗菌試劑的功效。因此，優(yōu)選的多肽或其衍生物可以具有少于18個的氨基酸。例如，一些按照本發(fā)明第三方面的多肽在長度上可以是17，16，15，14，13，12，11，10個或更少的氨基酸。刪除優(yōu)選地在SEQ ID No.12的位置1，2，8，9，10，11，17和/或18進行。
在一個優(yōu)選實施方案中，按照第三方面的多肽可以優(yōu)選地具有式IV{abcRKRxyz}+{a′b′c′RKRx′y′z′}其中a和a′＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；亮氨酸(L)；色氨酸(W)；或被刪除；b和b′＝獨立地選自亮氨酸(L)；精氨酸(R)；賴氨酸(K)；或被刪除；c和c′＝獨立地選自蘇氨酸(T)；色氨酸(W)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；x和x′＝獨立地選自甘氨酸(G)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；y和y′＝獨立地選自亮氨酸(L)；正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或被刪除；z和z′＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或亮氨酸；或被刪除。
按照第三方面的多肽還可以優(yōu)選地具有式V{abcRKRxyz}+{abcRKRxyz}其中
a＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；亮氨酸(L)；色氨酸(W)；或被刪除。
b＝獨立地選自亮氨酸(L)；精氨酸(R)；賴氨酸(K)；或被刪除；c＝獨立地選自蘇氨酸(T)；色氨酸(W)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；x＝獨立地選自甘氨酸(G)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；y＝獨立地選自亮氨酸(L)；正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或被刪除；z＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或亮氨酸(L)；或被刪除。
式V的多肽可以更加優(yōu)選地包括下述氨基酸a＝獨立地選自色氨酸(W)；精氨酸(R)；亮氨酸(L)；或被刪除。
b＝獨立地選自亮氨酸(L)；精氨酸(R)或賴氨酸(K)；或被刪除；c＝獨立地選自色氨酸(W)；蘇氨酸(T)；賴氨酸(K)；x＝獨立地選自色氨酸(W)；甘氨酸(G)；亮氨酸(L)；精氨酸(R)；y＝獨立地選自亮氨酸(L)；正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或在此處被剪截；z＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或亮氨酸(L)；或在此處被剪截。
發(fā)明人還已理解可以使用按照本發(fā)明包含多于只有1個apoB3359-3367的串聯(lián)二聚體重復(fù)(SEQ ID No.12)或其變體或剪截物的多肽。例如，包含SEQ ID No.2的三聚體、或四聚體、或甚至更多的重復(fù)的多肽可以被用作有用的抗菌試劑。
因此，優(yōu)選地，所述多肽可以優(yōu)選地具有式VI{abcRKRxyz}n其中a，b，c，x，y，和z如上文關(guān)于式IV或V的定義，并且其中n等于2，3，4或5，或更大的數(shù)。應(yīng)該理解單體肽{abcRKRxyz}如上文所定義的那樣可以是相同的或可以變化。
其它優(yōu)選的多肽可以包括由式IV或V定義的18mer的重復(fù)(或其剪截物)(例如，由式IV定義的9mer肽的異源二聚體的重復(fù))。
按照本發(fā)明第三方面的其它優(yōu)選的多肽可以包含下述氨基酸序列的一種-(a)RTRKRGRRTRKRGR(SEQ ID No.13).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 36。
(b)LRKRKRLLRKRKRL(SEQ ID No.14).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 37。
(c)LRKRKRLRKLRKRKRLRK(SEQID No.15).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 38。
(d)WRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.16).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為GIN 33。
(e)LLRKRLKRLLLRKRLKRL(SEQ ID No.80).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 24。
(f)RRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.83).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 28。
(g)KRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID NO.84).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 29。
(h)LRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID NO.85).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 30。
(i)HRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID NO.86).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 31。
(j)RWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID NO.87).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 32。
(k)RRWRKRWRKRRWRKRWRK(SEQ ID NO.88).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 33。
(l)LRWRKRWRKLRWRKRWRK(SEQ ID NO.89).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 35。
(m)HRWRKRWRKHRWRKRWRK(SEQ ID NO.90).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 36。
(n)RWRKRWRKRWRKRWRK(SEQ ID NO.91).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 37。
(o)RWRKRGRKRWRKRGRK(SEQ ID NO.92).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 69。
(p)RWRKRWRKRWRKRWRK(SEQ ID NO.93).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 71。
(q)RKRGWKWRKRGWKW(SEQ ID NO.94).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 73。
(r)RLTRKRGRLTRKRG(SEQ ID NO.95).當(dāng)在本文中提及時，該多肽被稱為MU 74。
在他們的開發(fā)工作期間(一些工作基于先前鑒定的抗病毒多肽)，發(fā)明人進一步處理依照第一、第二和第三方面的多肽，并且產(chǎn)生先前未知的也表現(xiàn)出抗菌活性的多肽，及其類別(classes)。
因此，按照第四方面，提供包括肽apoE141-149(SEQ ID No.1)的重復(fù)或者其變體或剪截物的多肽、其衍生物或類似物，其特征在于SEQ ID No.1的至少1個亮氨酸(L)殘基被酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)替代。
發(fā)明人還研究了為本文所描述的工作合成的許多其它多肽的抗菌功效。發(fā)明人相信所述多肽是新的，并且按照其它方面，提供包含氨基酸序列為SEQ ID No.3(GIN 2)；SEQ ID No.4(GIN 11)；SEQ ID No.67(MU81)；SEQ ID No.68(MU 82)；SEQ ID No.80(MU 24)；SEQ ID No.94(MU73)或SEQ ID No.95(MU 74)的多肽、其衍生物或類似物。
這些多肽在實施例中被更加詳細地描述。通過實例，GIN 2(SEQ IDNo.3)是對應(yīng)通過切除氨基酸1，2和3而剪截的肽apoE141-149的全長串聯(lián)二聚體重復(fù)(SEQ ID No.12)，即其為15-mer，具有氨基酸序列LRKRLLLRKLRKRLL。GIN 11(SEQ ID No.4)是包含apoE128-149的肽，其具有QSTEELRVRLASHLRKLRKRLL的氨基酸序列。
按照本發(fā)明的其它方面，提供包含氨基酸序列SEQ ID No.3(GIN 2)；SEQ ID No.4(GIN 11)；SEQ ID No.67(MU81)；SEQ ID No.68(MU 82)；SEQ ID No.80(MU 24)；SEQ ID No.94(MU 73)或SEQ ID No.95(MU 74)的多肽、其衍生物或類似物，其用作藥物。
另外，按照本發(fā)明的其它方面，提供包含氨基酸序列SEQ ID No.3(GIN 2)；SEQ ID No.4(GIN 11)；SEQ ID No.67(MU 81)；SEQ ID No.68(MU 82)；SEQ ID No.80(MU 24)；SEQ ID No.94(MU 73)或SEQ ID No.95(MU 74)或其剪截物的多肽、其衍生物或類似物用于制造治療細菌感染的藥物的應(yīng)用。
按照進一步的實施方案，按照本發(fā)明的多肽可以包含apoE133-162或其剪截物的串聯(lián)重復(fù)。通過“apoE133-162的串聯(lián)重復(fù)”，我們意指具有氨基酸序列LRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVY(SEQ ID No.5)的肽的二聚體(即60-mer多肽LRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYLRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVY(SEQID No.97)。在Azuma等中公開的apoE133-162肽(30-mer)顯示出具有一些抗菌活性。然而，令人震驚地，本發(fā)明的發(fā)明人已表明Azuma’s肽的串聯(lián)重復(fù)具有提高的抗菌功效，并且這是完全出乎意料的。
在另一方面，提供按照任一前述方面的多肽，其用作藥物。
在另一方面，提供按照任一前述方面的多肽用于制造治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用。
由于它們增強的生物活性，按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物用作抗菌試劑。
按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物可以治療抵抗任何細菌、或細菌感染。所述細菌可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌。
例如，按照本發(fā)明的肽有效抵抗的細菌可以包括厚壁菌門(Firmicutes)，其可以是芽孢桿菌屬(Bacilli)或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌可以包括球菌(Bacillales)，優(yōu)選地，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。按照本發(fā)明的肽有效作用的其它球菌包括鏈球菌屬(Streptococci)，例如，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。
按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌的其它實例可以包括假單胞菌目(Pseudomonadales)，優(yōu)選地，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌的其它實例可以包括γ-proteobacteria，其可以獨立地選自由腸桿菌屬(Enterobacteriales)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷氏菌屬(Serratai)、巴氏桿菌屬(Pasteurellales)、和Vibrionales組成的組。優(yōu)選的腸桿菌屬包括埃希氏菌(Escherichia)。優(yōu)選的變形桿菌屬包括奇異變形菌(Proteus mirabilis)。優(yōu)選的沙雷氏菌屬包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。優(yōu)選的巴氏桿菌屬包括流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。優(yōu)選的Vibrionales包括霍亂弧菌(Vibriocholerae)。
按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌的其它實例可以包括β-Proteobacteria，其包括奈瑟氏球菌屬(Neisseriales)，例如淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)。按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌的其它實例可以包括δ/ε細分的Proteobacteria，其包括彎曲桿菌屬(Campylobacterales)，例如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)。按照本發(fā)明的多肽有效抵抗的細菌的其它實例可以包括放線細菌屬(Actinobacteria)，例如結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)。
發(fā)明人實施實驗以測定本文公開的哪一種多肽表現(xiàn)出抵抗測試菌金黃色葡萄球菌、和銅綠假單胞菌、和肺炎鏈球菌的抗菌活性。按照本發(fā)明的多肽的活性可以從表5，6，7和8中看出。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出的抗菌活性抗至少1種、優(yōu)選地至少2種、和更優(yōu)選地，所有的金黃色葡萄球菌(S.aureus)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出抗金黃色葡萄球菌、和銅綠假單胞菌的抗菌活性。然而，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)GIN 7，MU 58，MU114，MU 61，MU 60，和GIN 41(SEQ ID No.10)對抗葡萄球菌屬并且特別是金黃色葡萄球菌特別有效。另外，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)GIN1p，MU 61，MU 82，MU 113，MU 114，MU 115，GIN 34，GIN8(SEQ ID No.11)，GIN 2(SEQ IDNo.3)，和GIN 11(SEQ ID No.4)對抗假單胞菌目并且特別是銅綠假單胞菌特別有效。并且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GIN 7(MU 4-SEQ ID No.7)，GIN 34(SEQID No.9)，GIN 2(SEQ ID No.3)，和MU 37(SEQ ID No.91)對抗鏈球菌屬(Streptococcus)特別是肺炎鏈球菌特別有效(IC50值小于30μM)。
按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物可以作為單一療法(即僅使用所述多肽或核酸)或與抗菌治療中應(yīng)用的其它化合物或治療結(jié)合用于治療細菌感染。例如，常規(guī)抗生素包括阿米卡星、阿莫西林、氨曲南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、利奈唑胺、萘夫西林、哌拉西林、quinopristin-達福普汀、替卡西林、妥布霉素、和萬古霉素。
雖然發(fā)明人不希望局限于任何假說，但是他們已表明由按照本發(fā)明的多肽作用的抗菌機制可能包括對細菌的直接破壞作用，其通過細菌膜或通過靶向細菌內(nèi)的位點調(diào)節(jié)?？赡苁怯捎谶@個原因，令人吃驚地，只有少數(shù)肽序列被發(fā)現(xiàn)對抗菌有效。
應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物的治療作用可以被增強所述多肽、衍生物或類似物的活性的試劑“間接地(indirectly)”調(diào)節(jié)。
因此，按照本發(fā)明的其它方面，提供能夠增強按照本發(fā)明第一、第二或第三方面的多肽、衍生物或類似物的生物活性的試劑，以用作藥物或用于制造治療細菌感染的藥物。
能夠增強按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物的生物活性的試劑可以通過許多方式實現(xiàn)它們的作用。例如，所述試劑可以增加所述多肽、衍生物或類似物的表達。備選地(或另外)，所述試劑可以增加按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物在生物系統(tǒng)中的半衰期，例如，通過減少多肽、衍生物或類似物的轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)。
按照本發(fā)明的多肽的衍生物可以被用于治療細菌感染。所述衍生物可以在體內(nèi)增加或減少多肽的半衰期。能夠增加按照本發(fā)明的多肽的半衰期的衍生物的實例包括多肽的擬肽衍生物、多肽的D-氨基酸衍生物、和肽-擬肽雜化物。
按照本發(fā)明的多肽可以通過多種方式進行降解(例如在生物系統(tǒng)中的蛋白酶活性)。所述降解可以限制多肽的生物利用度，并因此限制多肽獲得其生物功能的能力。有廣泛的很好地建立的技術(shù)，通過這些技術(shù)，可以設(shè)計和生產(chǎn)在生物體內(nèi)具有增強的穩(wěn)定性的衍生物。由于對蛋白酶調(diào)節(jié)的降解的抗性增強，所述多肽衍生物可以具有提高的生物利用度。優(yōu)選地，按照本發(fā)明適合應(yīng)用的衍生物或類似物比其衍生的肽具有更強的蛋白酶抗性。
優(yōu)選地，多肽可以通過保護N和/或C末端制備更強的蛋白酶抗性。例如，N末端可以被乙酰基、或烷基或芳基、或烷基-CO-或芳基-CO-基保護，其每一個可以被任選地取代。C末端可以被酰胺基或取代的酰胺基保護。
多肽衍生物和衍生其的多肽的蛋白酶抗性可以通過公知的蛋白降解測定法進行評估。然后將多肽衍生物和多肽的蛋白酶抗性的相對值進行比較。
根據(jù)按照本發(fā)明的第一、第二或第三方面的多肽的結(jié)構(gòu)知識，可以容易地設(shè)計本發(fā)明的多肽的擬肽衍生物?？缮藤彽能浖梢杂糜诎凑蘸芎玫亟⒌姆桨搁_發(fā)擬肽衍生物。
后擬肽(retropeptoids)，(其中所有的氨基酸由擬肽殘基按倒序取代)也能夠模擬衍生于脫脂載脂蛋白的抗菌多肽。與包含1個擬肽殘基的肽或擬肽-肽雜化物比較，期望后擬肽在配體-結(jié)合槽(ligand-binding groove)以相反的方向結(jié)合。結(jié)果，擬肽殘基的側(cè)鏈能夠與原始肽的側(cè)鏈指向相同的方向。
按照本發(fā)明的多肽的修飾形式的另一個實施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制備肽極大地減少該試劑通過常規(guī)代謝過程的任何不必要的降解，減少了需要施用的試劑的量，以及其施用頻率。
本發(fā)明的多肽、類似物、或衍生物代表可以有利地由生物細胞表達的產(chǎn)物。
在另一方面，本發(fā)明還提供編碼按照本發(fā)明的多肽、衍生物或類似物的核酸序列。
按照本發(fā)明的另一方面的優(yōu)選核酸可以包含SEQ ID No.23(cttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt)，SEQ ID No.24(cgtcttactcgtaaacgtggtcttaaa)，SEQ ID No.25(cttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt)，SEQID No.26(caatctactgaagaacttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt)，SEQ IDNo.27(cttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcgtgatgctgatgatcttcaaaaacgtcttgctgtttatcttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcgtgatgctgatgatcttcaaaaacgtcttgctgtttat)，SEQ ID No.28(cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt)，SEQID No.29(tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggtggcgtaaatggcgtaaacgttggtgg)，SEQ ID No.30(tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggcgtaaatggcgtaaacgttgg)，SEQ ID No.31(tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt)，SEQ ID No.32(tatcgtaaatatcgtaaacgttattattatcgtaaatatcgtaaacgttattat)，SEQ ID No.33(cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcgtaaacttcgtaaacgt)，SEQ ID No.34(cgtcttactcgtaaacgtggtcttaaacgtcttactcgtaaacgtggtcttaaa)，SEQ ID No.35(cgtactcgtaaacgtggtcgtcgtactcgtaaacgtggtcgt)，SEQ ID No.36(cttcgtaaacgtaaacgtcttcttcgtaaacgtaaacgtctt)，SEQ ID No.37(cttcgtaaacgtaaacgtcttcgtaaacttcgtaaacgtaaacgtcttcgtaaa)，和SEQID No.38(tggcgttggcgtaaacgttggcgtaaatggcgttggcgtaaacgttggcgtaaa)。
優(yōu)選的核酸進一步包含那些編碼按照本發(fā)明的任意優(yōu)選的多肽的對應(yīng)的DNA分子。
應(yīng)該理解，由于遺傳密碼的豐余，按照本發(fā)明的核酸序列可以不同于天然發(fā)生的序列(例如在ApoB或ApoE基因中)，其提供的密碼子編碼按照本發(fā)明第一、第二或第三方面的多肽、其衍生物或類似物。
還設(shè)想了在多肽序列中其它的修飾，并且其在要求的發(fā)明的范圍內(nèi)，即發(fā)生在翻譯期間或翻譯后的那些修飾，例如，通過乙酰化作用、酰胺化作用、羧基化、磷酸化、蛋白水解的裂解或鍵合到配體上。
應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽、衍生物和類似物代表通過包括對編碼所述分子的核酸序列的細胞表達技術(shù)進行施用的有利試劑。所述細胞表達的方法特別適合醫(yī)藥應(yīng)用，在其中多肽、衍生物和類似物的治療效果需要經(jīng)過一個延長的時期。
因此，按照本發(fā)明的另一方面，提供按照本發(fā)明的先前方面的核酸序列，其用作藥物。
按照另一方面，提供核酸用于制備治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用。
所述核酸可以優(yōu)選地是分離的或純化的核酸序列。所述核酸序列可以優(yōu)選地是DNA序列。
所述核酸序列可以進一步包括能夠控制和/或提高其表達的元件。核酸分子可以被包含在適宜的載體中，以形成重組載體。例如，所述載體可以是質(zhì)粒、黏端質(zhì)粒或噬菌體。所述重組的載體作為使用核酸分子轉(zhuǎn)化細胞的運送系統(tǒng)非常有用。
重組載體還可以包括其它功能元件。例如，可以設(shè)計重組載體以便載體在細胞內(nèi)自主復(fù)制。在這種情形下，重組載體中需要誘導(dǎo)核酸復(fù)制的元件。備選地，重組載體可以被設(shè)計成便于所述載體和重組核酸分子整合到細胞的基因組中。在這種情形下，需要支持靶向整合(例如，通過同源重組)的核酸序列。重組載體還可以包含編碼可被用作克隆過程中的選擇標記的基因的DNA。
重組載體還可以進一步包含啟動子或調(diào)節(jié)子，以控制基因按需要表達。
核酸分子可以(但是不必要)是一個，其整合在被治療的受試者的細胞DNA中。未分化細胞可以被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，其導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳修飾的子細胞(在這種情形下，可能需要受試者中的表達的調(diào)控，例如，使用特殊的轉(zhuǎn)錄因子或基因激活因子)。備選地，運送系統(tǒng)可以被設(shè)計成支持受治療的受試者中分化細胞的不穩(wěn)定的或瞬時轉(zhuǎn)化。當(dāng)是這種情形時，由于當(dāng)轉(zhuǎn)化的細胞死亡或停止表達蛋白時DNA分子的表達將終止(理想地當(dāng)需要的治療作用已獲得時)，表達的調(diào)控可以較不重要。
運送系統(tǒng)可以給受試者提供核酸分子，而其不結(jié)合到載體中。例如，核酸分子可以被結(jié)合到脂質(zhì)體或病毒顆粒內(nèi)。備選地，可以將“裸(naked)”核酸分子通過合適的方法，例如，直接內(nèi)吞吸收，插入到受試者的細胞中。
核酸分子可以通過轉(zhuǎn)染、感染、顯微注射、細胞融合、原生質(zhì)體融合或彈果轟擊(ballistic bombardment)被轉(zhuǎn)移到待治療的受試者的細胞。例如，轉(zhuǎn)移可以通過使用包被的金顆粒、含有核酸分子的脂質(zhì)體、病毒載體(例如腺病毒)進行彈果轉(zhuǎn)染和通過直接應(yīng)用核酸分子提供直接的核酸吸收(例如內(nèi)吞作用)的方式而實現(xiàn)。
應(yīng)該理解按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以用于單一療法(即，單獨使用按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物，以防止和/或治療細菌感染)。備選地，按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以用作輔助物，或與已知療法聯(lián)合使用。
按照本發(fā)明的另一方面，提供預(yù)防和/或治療細菌感染的方法，其包括給需要所述治療的受試者施用治療有效量的按照本發(fā)明的多肽、衍生物、或類似物或核酸。
按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以混合在具有許多不同形式的組合物或化合物中，特別地，其取決于組合物被應(yīng)用的方式。因此，例如，組合物可以是粉劑、片劑、膠囊、液體、軟膏、膏劑、凝膠、水凝膠、氣溶膠、噴霧劑、膠束、經(jīng)皮補片(transdermal patch)、脂質(zhì)體的形式或任意其它可以給人或動物施用的合適的形式。應(yīng)該理解本發(fā)明的組合物的賦形劑(vehicle)應(yīng)該是一種能夠被服用其的受試者良好地耐受的賦形劑，而且優(yōu)選地，其能夠?qū)⒍嚯?、試劑、核酸或衍生物運送到腦。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物應(yīng)該以允許它們通過血腦屏障的方式配制。
包含按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物的組合物可以多種方式應(yīng)用。例如，所述化合物可以包含在例如可以通過片劑、膠囊或液體的形式被口服攝取的組合物中，在這種情形下，需要口服施用。備選地，所述組合物可以通過注射施用到血流中而進行全身施用。注射可以是靜脈注射(大丸劑(bolus)或灌輸)或皮下注射(大丸劑或灌輸)。所述組合物可以通過吸入(如在鼻內(nèi))的方式施用。
包含按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物的組合物可以口服施用或全身施用。而且，組合物可以通過氣溶膠的形式施用，例如，使用可以在鼻內(nèi)施用的噴霧器，或使用通過肺的吸入器。備選地，所述組合物可以局部應(yīng)用，例如，以膏劑或凝膠的形式。當(dāng)要被治療的受試者具有細菌皮膚感染時，可用局部施用。所述組合物可以在陰道內(nèi)(例如，如果需要保護受試者不受通過性傳遞的疾病感染)、或在直腸內(nèi)應(yīng)用。
多肽、試劑、核酸或衍生物還可以結(jié)合到一種緩慢或延遲釋放的裝置中。例如，此類裝置可以被附著在或嵌入皮膚，并且所述化合物可以數(shù)周或數(shù)月地釋放。當(dāng)需要使用按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物進行長期治療時，其通常需要頻繁的施用(比如至少每日注射)，此類裝置就顯得尤其有利。
應(yīng)該理解需要的多肽、試劑、核酸或衍生物的量，取決于其生物活性和生物利用度，所述生物活性和生物利用度又依賴于施用的模式，所應(yīng)用的多肽、試劑、核酸或衍生物的物理化學(xué)特性，和所述多肽、試劑、核酸或衍生物是否用于單一治療或是聯(lián)合治療。施用的頻率也將受到上述因素和尤其是多肽、試劑、核酸或衍生物在受治療的受試者體內(nèi)的半衰期的影響。
施用的最佳劑量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所決定，而且將因應(yīng)用的具體的多肽、試劑、核酸或衍生物，制劑的濃度(the strength of thepreparation)，施用模式，和疾病狀況的進展而不同。依賴于具體的被治療的受試者的其它因素將導(dǎo)致需要調(diào)節(jié)劑量，所述其它因素包括受試者的年齡、體重、性別、飲食、和施藥時間。
已知程序，如制藥工業(yè)應(yīng)用的常規(guī)程序(如體內(nèi)實驗，臨床實驗，等)，可以用來制定按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物的具體制劑，和精確的治療方案(如多肽、試劑、核酸或衍生物的日常劑量和施用頻率)。
一般地，在0.01μg/kg體重和0.5g/kg體重之間的按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物的日劑量，可以用于病毒感染的預(yù)防和/或治療，其取決于應(yīng)用的是哪一種具體的多肽、試劑、核酸或衍生物。更加優(yōu)選地，日劑量在0.01mg/kg體重和200mg/kg體重之間，并且最優(yōu)選地，約在1mg/kg體重和100mg/kg體重之間。
日劑量可以以單獨施用的形式給出(例如單一的每日注射)。備選地，所使用的多肽、試劑、核酸或衍生物可以需要一天內(nèi)施用兩次或更多次。作為一個實例，按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以以2份(或更多，取決于病癥的嚴重性)日劑量施用，其用量為25mg和7000mg之間(即假設(shè)體重為70kg)。接受治療的患者可以在起床(waking)后服用第一劑，然后在傍晚服用第二劑(如果是兩劑方案)，或其后間隔3或4小時服用。備選地，緩慢釋放裝置可以用于提供給患者最佳劑量，而不需要重復(fù)施用劑量。
本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含治療有效量的按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物和任選的藥用賦形劑。在一個實施方案中，多肽、試劑、核酸或衍生物的量為從約0.01mg到約800mg。在另一個實施方案中，多肽、試劑、核酸或衍生物的量為從約0.01mg到約500mg。在另一個實施方案中，多肽、試劑、核酸或衍生物的量為從約0.01mg到約250mg。在另一個實施方案中，多肽、試劑、核酸或衍生物的量為從約0.1mg到約60mg。在另一個實施方案中，多肽、試劑、核酸或衍生物的量為從約0.1mg到約20mg。
本發(fā)明提供一種制備藥用組合物的方法，其包括聯(lián)合使用治療有效量的按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物和藥用賦形劑?！爸委熡行Я俊笔钱?dāng)按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物施用給受試者時其提供病毒感染的預(yù)防和/或治療的任意數(shù)量?！笆茉囌摺笔侵讣棺祫游铩⒉溉閯游?、家畜或人。
“藥用賦形劑”此處是指任何生理學(xué)賦形劑，其為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知，用于配制藥用組合物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述藥用賦形劑為一種液體，而且所述藥用組合物為溶液的形式。在另一個實施方案中，所述藥用賦形劑是固體，而且所述組合物是粉劑或片劑形式。在另一個的實施方案中，藥用賦形劑是凝膠而且所述組合物是膏劑等形式。
一種固體賦形劑可包含一種或多種的物質(zhì)，其還可以作為調(diào)味劑、滑潤劑、增溶劑、懸浮劑、填料、glidants、壓縮助劑、粘合劑或片劑崩解劑；它還可以是膠囊化物質(zhì)。粉劑中，所述賦形劑是細碎的固體，其與細碎的活性多肽、試劑、核酸或衍生物混合在一起。片劑中，所述活性多肽、試劑、核酸或衍生物與具有必要的壓縮特性的賦形劑以適宜比例混合，并壓縮成需要的形狀和大小。所述粉劑和片劑優(yōu)選地包含高達99％的活性多肽、試劑、核酸或衍生物。適宜的固體賦形劑包含，例如，磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)、低熔點臘和離子交換樹脂。
液體賦形劑用于制備溶液、混懸液、乳劑、糖漿、酏劑和加壓組合物。所述活性多肽、試劑、核酸或衍生物可以溶解或懸浮在藥用液體賦形劑中，例如水、有機溶劑、兩者的混合物或藥用油或藥用脂肪。所述液體賦形劑可包含其它適宜的藥用添加劑，如增溶劑、乳化劑、緩沖劑、防腐劑、甜味劑、增香劑、混懸劑、增稠劑、著色劑、粘性調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑。用于口服和腸胃外用藥的液體賦形劑的合適實例包括水(部分含有上述添加劑，如，纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，如二元醇)及其衍生物、和油(如分餾的椰子油和花生油)。對于腸胃外用藥，所述賦形劑還可以是油酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌液體賦形劑用于無菌液體形式的組合物以用作腸胃外施用。用于加壓組合物的液體賦形劑可以是鹵代氫或其它藥用推進劑。
無菌溶液或混懸液形式的液體藥用組合物，可以通過，例如肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹膜內(nèi)、靜脈和尤其是皮下、大腦內(nèi)或腦內(nèi)室(intracerebroventricular)注射而應(yīng)用?？梢詫⑺龆嚯?、試劑、核酸或衍生物制備成無菌固體組合物，其可以在施用時用無菌水、鹽水、或其它適合的無菌注射介質(zhì)溶解或懸浮。賦形劑意欲包括必要且惰性的粘合劑、混懸劑、滑潤劑、食用香料、甜味劑、防腐劑、染料、和涂料。
按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以以無菌溶液或混懸液的形式口服施用，其包含其它溶質(zhì)或混懸劑(例如，足夠的鹽水或葡萄糖以使溶液等滲)、膽汁鹽、阿拉伯膠、明膠、脫水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨酯80(山梨糖醇的油酸酯和其與環(huán)氧乙烷的共聚合酸酐)等。
按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物還可以以液體或固體組合物形式口服施用。適于口服施用的組合物包括固體形式，如丸劑、膠囊、粒劑、片劑、和粉劑，和液體形式，如溶液、糖漿、酏劑、和混懸液。用于腸胃外施用的形式包括無菌溶液、乳劑、和混懸液。
所述多肽、試劑、核酸或衍生物可以用于治療任何哺乳動物，例如，人、家畜、寵物，并且可以用于其它的獸醫(yī)應(yīng)用。
發(fā)明人已經(jīng)明白按照本發(fā)明的多肽可以用作藥物，但是還可以投入許多其它的抗微生物應(yīng)用(不管是臨床環(huán)境還是其它)。例如，除了給患者施用按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物外，它們可以用于包被表面和物體，以預(yù)防或治療細菌污染。
因此，在另一方面中，提供一種預(yù)防和/或治療細菌污染的方法，其包括使用一定量的按照本發(fā)明第一、第二、或第三方面的多肽包被需要其的物體或表面，所述多肽能有效殺死或預(yù)防細菌的生長。
應(yīng)該理解所述多肽特別可以用于包被需要無菌的表面或物體。如上文所討論，許多多肽具有它們既能抗病毒又能抗菌的優(yōu)點。因此，所述多肽應(yīng)該具有廣泛的抗微生物作用。而且，如下文中更詳細地討論，所述多肽能夠附著到表面上，并且因此可以更長時間地有效。
所述多肽可以用于包被任何用于生物學(xué)或醫(yī)學(xué)條件的物體或設(shè)備，例如醫(yī)學(xué)設(shè)備，并且，對于這些醫(yī)學(xué)設(shè)備，重要的是預(yù)防可以導(dǎo)致患者的任何感染的細菌污染?？梢园凑毡景l(fā)明進行包被的醫(yī)學(xué)設(shè)備的實例包括鏡片、接觸透鏡(contact lens)、導(dǎo)管、斯滕特固定模(stents)、傷口愈合敷料、避孕用具、外科手術(shù)植入物和復(fù)位結(jié)合(replacement joints)。
所述多肽特別可用于包被生物材料和由其制成的物體和設(shè)備。由于細菌可以應(yīng)用所述材料作為生長的底物，所以生物材料的細菌污染/感染是特別成問題的。生物材料(例如膠原蛋白和其它生物聚合體)可以用于形成人造關(guān)節(jié)的表面。備選地，某些植入物可以基本上包括所述生物材料。
所述多肽可以用于包被環(huán)境中需要無菌的表面。例如，所述多肽可以用于醫(yī)學(xué)環(huán)境中。所述多肽可以用于保持醫(yī)院病室清潔。它們可以用于清潔手術(shù)室中裝備的表面(如手術(shù)臺)以及手術(shù)室的墻壁和地板。發(fā)明人相信所述多肽可用于大體上改善無菌性，并且特別針對MRSA的傳播(發(fā)明人相信MRSA可以被本發(fā)明的多肽殺死)。
所述多肽可以配制成溶液用于清潔物體和表面。例如，它們可以是生理溶液的常規(guī)組分(例如作為生理鹽水的組分)。
實施例3舉例說明按照本發(fā)明的多肽怎樣很好地附著到接觸透鏡上。而且，實施例2舉例說明即使進行高壓滅菌，肽仍能夠令人驚奇地保持它們的抗菌活性。。當(dāng)肽用于包被在應(yīng)用中經(jīng)受高溫和壓力的物體時，這是最有利的。而且，應(yīng)該理解許多醫(yī)學(xué)設(shè)備，例如外科手術(shù)器械，在應(yīng)用期間需要無菌，其通常通過高壓滅菌。因此，按照本發(fā)明的肽是非常有用的，原因在于它們(i)附著到表面上；并且(ii)經(jīng)受滅菌后保持它們的抗菌活性。
應(yīng)該理解上文所列出的按照本發(fā)明的多肽可以應(yīng)用的物體和表面不是沒有遺漏的。因此，所述多肽可以應(yīng)用到易于被細菌污染的任何表面，例如，廚房和盥洗室表面和產(chǎn)品，例如馬桶座圈、或馬桶本身。
在優(yōu)選的實施方案中，所述多肽可以包含在用于存儲接觸透鏡的鹽溶液中。
按照本發(fā)明的優(yōu)選多肽是高度正電荷性的。這使得它們特別適合包被表面和物體，以預(yù)防廣泛種類的細菌的生長。實施例3和圖8和9清楚地舉例說明按照本發(fā)明的多肽怎樣很好地附著到一系列不同的表面上，即玻璃(條狀蓋板)、先前用生物材料聚(丙交酯-共-乙膠酯)(PLGA)包被的玻璃、和接觸透鏡。
優(yōu)選地，物體或表面的包被可以通過在對按照本發(fā)明所述的多肽合適的pH和溫度下制備一種水性溶液而進行。將物體或表面暴露于所述溶液足夠的時間，以允許其表面固定或吸收適宜量的多肽，或以允許足夠的時間以便殺死細菌。
在一個優(yōu)選實施方案中，制備按照本發(fā)明的多肽的充分濃縮的溶液，并且將其與要包被的物體接觸一段合適的時間。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解怎樣制備需要濃度的多肽溶液，原因在于這將取決于被應(yīng)用的具體多肽和要治療的細菌、和被包被的表面。例如，可以將物體插入溶液(例如，包含約40μM的多肽)中并且在約20℃留在其中約15分鐘。隨暴露于多肽之后，可以將物體洗滌，例如，在合適的緩沖液中，如PBS?？梢孕枰獙⑽矬w留在洗滌緩沖液中過夜。隨洗滌之后，所述多肽已在那時附著到物體上，并且，用保護性的多肽包被的物體可以使用了。
另外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)與按照本發(fā)明的多肽一起預(yù)培養(yǎng)時，接觸透鏡能夠抗細菌感染，如圖2，3和4中舉例說明。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種至少部分用按照本發(fā)明第一、第二或第三方面的多肽包被的接觸透鏡。
應(yīng)用到接觸透鏡表面的所述多肽預(yù)防可以導(dǎo)致在使用者的眼睛中發(fā)生感染的細菌污染的發(fā)生。
在一個實施方案中，所述透鏡可以是一天一次性應(yīng)用的透鏡(即，佩戴一天然后棄之)，在這種情形下，在透鏡使用之前，并且在當(dāng)去除其包裝時，避免了細菌污染。因此，透鏡可以用所述多肽預(yù)處理和/或在含有所述多肽的溶液中包裝。用多肽包被的透鏡減少使用者中可能在佩戴接觸透鏡時發(fā)生的細菌感染的可能性。
備選地，透鏡可以以天為基礎(chǔ)重復(fù)佩戴而使用幾個月或年，但要取出和洗滌并在溶液中儲存過夜。當(dāng)是這種情形時，包被在透鏡上的多肽(在第一次使用前)和/或在透鏡洗滌溶液中優(yōu)選使用所述多肽，將顯著地減少使用者在佩戴透鏡時發(fā)生的細菌感染的可能性，或透鏡在儲存和洗滌過夜時被污染的可能性。
在另一個實施方案中，所述透鏡可以是長期佩戴的透鏡，其可以持續(xù)地佩戴在眼睛里一段長期的時間，例如，多于1天、幾天、1周或甚至1個月或更久。這種接觸透鏡的使用者具有發(fā)展成細菌感染的高風(fēng)險性。因此，在這種情形下，所述多肽可以用于在透鏡首次使用前將其包被。所述包被的透鏡的使用將極大地減少當(dāng)透鏡被佩戴如此長期的時間時發(fā)生的細菌感染的可能性。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用按照本發(fā)明的多肽將接觸透鏡包被，并且，適當(dāng)?shù)那闆r下，將其在包含所述多肽的溶液中儲存和/或洗滌。
發(fā)明人已經(jīng)進一步確定按照本發(fā)明的一些多肽、試劑、核酸或衍生物可以混合并用于預(yù)防或治療廣泛范圍的細菌感染/污染(以及病毒感染/污染)。例如，優(yōu)選地使用按照第一、第二、或第三方面的任一方面的多肽的組合治療細菌感染/污染，例如獨立地選自由GIN 1p、GIN 7、GIN 32、GIN 33和GIN 34組成的組的多肽。然而，應(yīng)該理解多肽的不同組合可以用于治療不同的細菌感染。
而且，按照本發(fā)明的多肽、試劑、核酸或衍生物可以通過用作防腐劑或與防腐劑結(jié)合使用而用于最小化、預(yù)防或治療細菌污染或細菌生長。因此，多肽、試劑、核酸或衍生物可以用作食品中的防腐劑。另外，多肽、試劑、核酸或衍生物可以用于最小化或預(yù)防培養(yǎng)物中細菌生長，例如，在組織培養(yǎng)工作中，其補充或取代抗生素。另外，所述多肽可以用作作為診斷劑的選擇試劑，例如，用于培養(yǎng)基中的細菌生長。例如，可以將對第一種細菌具有特別活性的第一種多肽添加到培養(yǎng)基中，并且可以將對第二種細菌具有特別活性的第二種多肽添加到培養(yǎng)基中。
本文所描述的所有特征(包括任何附加的權(quán)利要求、摘要和附圖)，和/或所公開的任何方法或程序的所有步驟，可以與上述任一方面以任何結(jié)合方式結(jié)合，除了其中至少一些所述特征和/或步驟是互斥的結(jié)合。
現(xiàn)在將進一步描述本發(fā)明的實施方案，其只通過實例的方式，參考下述實施例和附圖，在其中

圖1舉例說明將細菌接種物暴露于不同濃度的按照本發(fā)明的肽GIN 1p、或安慰劑PBSA稀釋物后的銅綠假單胞菌的生長水平；圖2是舉例說明銅綠假單胞菌在用肽GIN 1p預(yù)處理、或用對照物處理后在強生Acuvue接觸透鏡(Johnson and Johnson Acuvue contact lenses)上過夜生長的柱狀圖；圖3是顯示位于24孔板上的4個孔中的2種GIN 1p處理的和2種對照處理的接觸透鏡在過夜培養(yǎng)后的外觀的照片；圖4是顯示(i)對照處理的或(ii)GIN 1p處理的接觸透鏡在過夜培養(yǎng)后的表面的外觀的光學(xué)顯微照片；圖5舉例說明用不同水平的GIN肽處理48小時的細胞中的MTT還原；圖6A，6B和6C通過酵母基因毒性測定法分別舉例說明肽GIN 1p，GIN33和GIN 34缺少基因毒性作用；圖7舉例說明將細菌接種物暴露于不同濃度的按照本發(fā)明的肽GIN 1p后銅綠假單胞菌的生長水平，其已被高壓滅菌或未經(jīng)高壓滅菌，表示為未處理的細菌生長的a％；圖8舉例說明強生Acuvue接觸透鏡，其用40μM GIN 1p(其通過添加具有熒光標記的半胱氨酸殘基合成)處理15min，然后洗滌4次，包括在25ml PBS中浸泡過夜；圖9舉例說明玻璃條狀蓋板(BG)、或先前用生物材料聚(丙交酯-共-乙膠酯)(PLGA)包被的條狀蓋板，其用40μM GIN 1p(其用熒光標記合成)處理15min，然后洗滌4次，包括在25ml PBS中浸泡過夜；圖10顯示GIN 1p的典型質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，并且舉例說明所述肽純度＞95％；和圖11顯示GIN 1p的典型HPLC數(shù)據(jù)，并且舉例說明所述肽純度＞95％。
實施例發(fā)明人實行了許多實驗以研究按照本發(fā)明的多肽的抗菌活性。研究所述多肽抗金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、和肺炎鏈球菌的活性，以及在接觸透鏡上多肽的抗菌活性。而且，發(fā)明人進行了毒性和基因毒性檢測，并且還研究在暴露于高溫即高壓滅菌后所述多肽是否保持它們的抗菌活性。另外，發(fā)明人研究了所述多肽附著到各種表面上的能力，例如，接觸透鏡、用生物材料“PLGA”包被的玻璃和表面。
實施例1抗菌效果評價細菌儲液-ATCC來源的原種細菌獲自O(shè)xoid Limited。銅綠假單胞菌(ATCC菌株9027)或金黃色葡萄球菌(ATCC菌株6538P)以‘Cultiloop’形式獲得。通過用1個Cultiloop溫育20ml LB肉湯并在37℃溫育過夜制備儲液。將過夜溫育后存在的細胞收獲下來，其通過離心(3000g，10分鐘)去除更大的聚集體，并且取出16ml上層清液，其中可能含有主要的浮游細菌。將4ml無菌甘油加入其中(甘油已經(jīng)通過高壓滅菌而滅菌)。將由此獲得的懸浮液在置于-85℃凍存前分裝15×1ml冷凍管。
抗菌測定法進行預(yù)實驗以估計稀釋細菌儲液的量，在將25μl稀釋的儲液加入到100μl新鮮LB肉湯中時經(jīng)過37℃過夜溫育后其將導(dǎo)致細菌處于對數(shù)生長期。發(fā)現(xiàn)這在溫育時對應(yīng)大約每孔40,000cfu。
肽肽(包括按照本發(fā)明的多肽)以凍干形式獲自商業(yè)供應(yīng)商(AltaBioscience，伯明翰大學(xué))，并且以5微摩的量生產(chǎn)。一旦給出肽的氨基酸序列，熟練的技術(shù)人員應(yīng)該了解可用于合成肽的標準技術(shù)。N-末端通過添加乙?；M行保護，并且C-末端通過添加酰胺基進行保護。在加入足夠的PBSA以產(chǎn)生0.4mM的儲液前，將少量的肽在無菌Eppendorf管中稱量，將儲液以等分試樣形式在-85℃凍存。
肽的分子量通過激光解吸質(zhì)譜(laser desorption mass spectrometry)進行確定，其應(yīng)用Finnigan LASERMAT 2000MALDI-time的flight質(zhì)量分析器或Scientific Analysis Group MALDI-TOF質(zhì)譜儀。肽的HPLC純化使用多孔層實心球(Vydac)分析C-4反相柱，用0.1％TFA和0.1％TFA/80％乙腈作為溶劑，或者對一些肽使用ACE C18反相柱，用0.05％TFA和60％乙腈作為溶劑而進行。肽GIN 1p的典型的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和高效液相色譜(HPLC)示蹤(純度＞95％)示于圖10和11。
(a)抗金黃色葡萄球菌的抗菌效果檢驗了所述肽的抗金黃色葡萄球菌的抗菌效果。結(jié)果示于表5。為測試肽的功效，將測試肽的稀釋液或PBS(用作對照)在LB肉湯中制備，并且將100μl等分試樣的上述溶液置于96孔板中。將1瓶浮游細菌儲液在37℃培養(yǎng)箱中解凍，并且稀釋到先前確定的水平，其將在過夜培養(yǎng)后產(chǎn)生對數(shù)期生長(參見上文)。然后，將25μl的所述細菌稀釋液加入到測試孔中(將一些含有LB肉湯不含肽的孔留下來，不進行任何細菌接種，其用作空白對照)。過夜生長后，將每個孔中細菌的濃度通過用微量培養(yǎng)板分光光度計測量620nm處的吸收進行評估。計算肽的特定濃度的孔的平均吸收，并且從這一結(jié)果還計算出抑制百分比(相對于未處理的孔)，并相對于濃度做圖(連同關(guān)于％抑制的誤差估計值)。最后，從這一圖中估計肽抑制細菌生長達50％的近似濃度，以計算IC50值。
測試肽的功效在表5中顯示。具有小于或等于約40μM的IC50值的任何肽都被認為是無效的。
表5.apoE-衍生的肽的抗金黃色葡萄球菌的活性
無活性的序列可能被刪除-
表5舉例說明按照本發(fā)明第一、第二或第三方面的多肽具有良好的抗菌功效，然而，處于本發(fā)明范圍外的肽(如GIN 6，22或39)是無效的。
(b)抗銅綠假單胞菌的抗菌效果還檢驗了按照本發(fā)明的肽的抗銅綠假單胞菌的抗菌效果，其使用如上文所描述的相同的技術(shù)來計算IC50值。被測試的按照本發(fā)明的肽在表6中顯示。
表6.apoE-衍生的肽的抗銅綠假單胞菌的活性
無活性的序列可能被刪除
表6進一步舉例說明按照本發(fā)明第一、第二或第三方面的多肽具有良好的抗菌效果，然而，處于本發(fā)明范圍外的肽(如GIN 6，10，12，22，28，39或43)是無效的。
參考圖1，顯示銅綠假單胞菌在將細菌接種物暴露于不同濃度的GIN1p(按照本發(fā)明的多肽)或PBSA的安慰劑稀釋物后的生長水平。點是通過將6個處理的孔的平均值除以6個未處理的孔的平均值而獲得，并且線顯示這些計算的值的誤差估計值。圖1清楚地顯示出GIN 1p(SEQ ID No.6)在大約4μM的濃度的抗菌效果，并且表明GIN 1p具有約3μM的IC50濃度。
綜上所述，按照本發(fā)明的多肽展現(xiàn)出抗金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性。
(c)用抗菌多肽包被按照本發(fā)明的多肽可以用于包被易于被細菌污染的醫(yī)學(xué)設(shè)備。所述醫(yī)學(xué)設(shè)備的實例包括透鏡、導(dǎo)管、斯滕特固定模(stents)、傷口愈合敷料和避孕器件。所述多肽還可以應(yīng)用到醫(yī)學(xué)環(huán)境的表面，其包括用在手術(shù)室的裝備的表面。
包被表面可以通過在對具體的多肽適宜的pH(例如pH7.4)下制備多肽的濃縮水性溶液而實行。然后將表面在合適的溫度(例如37℃)下暴露于所述水性溶液足夠的時間(例如2小時)，以允許其表面固定或吸收適宜量的多肽。
(d)測試接觸透鏡上的抗菌效果的實驗發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用按照本發(fā)明的多肽的溶液預(yù)先培養(yǎng)時，能使得接觸透鏡抗細菌感染。參見圖2，顯示的是舉例說明銅綠假單胞菌在用多肽GIN 1p預(yù)處理、或用對照物處理后在強生Acuvue接觸透鏡(Johnson andJohnson Acuvue contact lenses)上過夜生長的柱狀圖。生長通過用光學(xué)顯微鏡檢驗進行測量，并且通過用MTT還原評估存在的任何細菌的代謝活性。所述數(shù)據(jù)舉例說明按照本發(fā)明的肽當(dāng)用于接觸透鏡時的抗菌性質(zhì)的功效?？咕钚酝ㄟ^測量MTT還原進行評估。
將透鏡放在24孔板中，然后用75μl PBS(pH7.4)中的250μM GIN 1p或用75μlPBS處理，并且在37℃溫育2小時，然后通過抽吸將這些溶液從透鏡上移除。然后，再將1ml的PBS加到孔中以洗去任何松散地附著的肽，然后吸走洗滌溶液。最后，將1ml在PBS中的20％(v/v)LB肉湯加入到每一個孔中，后者含有104攻擊生物體(challenge organisms)(近似于適合眼睛的可能的攻擊水平的數(shù)量)。計算表明即使初始多肽溶液或洗滌溶液的抽吸不完全，溶液中具有的并且還存在于系統(tǒng)中的多肽的濃度(即，只作為原始肽儲液的稀釋物)將低于200nM，其將太低而不能獨立地抑制細菌感染。
將平板放回培養(yǎng)箱在37℃過夜。大約溫育15hr后，將一些透鏡暴露于2mg/ml的MTT溶液，并且在37℃進一步溫育1小時。將剩余的透鏡用光學(xué)顯微鏡(Olympus IX70)檢驗或不用放大進行檢驗。進一步溫育后將MTT處理的透鏡從MTT溶液中移出，并且放到1ml DMSO中，以溶解由于任何存在細菌的代謝活性產(chǎn)生的藍色甲晶體。甲產(chǎn)生的程度通過測量所述溶液的等分試樣在540nm處的吸收進行評估；這些值在圖2中顯示，并且代表4個透鏡的平均值，帶有顯示標準偏差的線。
參考圖3，顯示的是顯示位于24孔板的4個孔中的2個GIN 1p處理的接觸透鏡(圖3右側(cè))和2個對照處理的透鏡(圖3左側(cè))過夜培養(yǎng)后的外觀的照片。該圖清楚地表明2個GIN 1p處理的接觸透鏡不易于發(fā)展成細菌感染。未用按照本發(fā)明的多肽預(yù)處理的含有2個對照透鏡的反應(yīng)溶液是混濁的，表明其中有細菌生長。然而，含有2個GIN 1p處理的接觸透鏡的溶液是無色的，表明大部分任何細菌的生長已被減到最少。
參考圖4，顯示的是光學(xué)顯微照片，其顯示(i)對照處理的接觸透鏡，和(ii)GIN 1p處理的接觸透鏡在過夜培養(yǎng)后的表面的外觀。圖4清楚地表明對照處理的透鏡被細菌生長所覆蓋，而GIN 1p處理的透鏡表現(xiàn)出最少的細菌生長。因此，按照本發(fā)明的多肽GIN 1p清楚地展現(xiàn)出抗菌活性。
因此，發(fā)明人表明任何以活性抗微生物形式在透鏡上固定這些多肽的方法將減少接觸透鏡佩戴者中微生物相關(guān)的不利反應(yīng)的風(fēng)險，例如微生物角膜炎。
(e)毒性測定法參考圖5，顯示的是用不同水平的GIN 1p和GIN 16處理48小時的細胞中的MTT還原。
將非洲綠猴腎(Vero)細胞維持在Eagle極限必需培養(yǎng)基中，其中有Earle鹽(EMEM)并且補充了10％胎牛血清(加熱滅活的)、4mM L-谷氨酰胺、和1％(v/v)非必需氨基酸，加上青霉素和鏈霉素(分別為100IU/mg和100mg/ml)(稱為10％EMEM的維持培養(yǎng)基)。將所述細胞在37℃具有5％CO2的潮濕的空氣氛圍中溫育。當(dāng)收獲時，將單層在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌，并且通過用在PBS中的胰蛋白酶溫育30min將其驅(qū)散，然后通過加入等體積的10％EMEM使胰蛋白酶失活并在500g離心(5min，4℃)。
將非洲綠猴腎細胞接種在96孔板中，每孔30,000細胞，在100μl的10％EMEM中。過夜生長后，將培養(yǎng)基輕輕地吸出，并替換為含有不同濃度的肽的10％EMEM或者在某些情形下只為10％EMEM。將細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，然后加入25μl的1.5mg/ml MTT溶液(在0.5％EMEM中制備，然后通過0.22μm無菌濾器過濾)。然后將平板放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時。最后，將培養(yǎng)基從孔中移出，并通過加入100μl二甲基亞砜(DMSO)將任何藍色甲晶體溶解掉。然后，測量由此獲得的溶液在570nm處的吸收，并且毒性作用表示為每種肽濃度的對照值的百分比。當(dāng)可能時，EC50從對于肽濃度的毒性作用的圖上計算出來。幸運地，使用40μM的肽將細胞暴露其中2天，沒有發(fā)現(xiàn)對于測試細胞系的毒性證據(jù)。
(f)基因毒性另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，盡管這些肽上有大量的正電荷，它們卻幾乎沒有或沒有基因毒性活性，如由Gentronix GreenScreen GC基因毒性測定法所揭示的(Gentronix Ltd.，72Sackville St，Manchester，M60 1QD，英國)，其用于測試肽GIN 1p、GIN 33和GIN 34，并且如圖6A-6C所概括的那樣。
使用液體操作機器人以在具有視力可見清晰的底的96孔、黑色微量培養(yǎng)板中產(chǎn)生每種測試化合物的連續(xù)稀釋系列物。將測試化合物的每個稀釋物與等體積的含有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母細胞(strainGenT01這些修飾菌株的特征詳細參見Mutation Research，2000，464297-308)的專用生長培養(yǎng)基混合，以給出固定的終體積和細胞濃度。另外，進行一系列的基因毒性和細胞毒性標準和非毒性對照，以提供內(nèi)部質(zhì)量控制。將所述平板用可呼吸的膜覆蓋并在25℃溫育過夜，不經(jīng)過搖動。
溫育后，將微量培養(yǎng)板打開，并且使用Tecan Ultra 384微量培養(yǎng)板解讀器收集數(shù)據(jù)。這種儀器在微量培養(yǎng)板中提供光吸收和熒光的測量；應(yīng)用標準熒光素濾光器裝置(激發(fā)485/25和發(fā)射535/25)。讀取在620nm處的吸收，并且其與細胞增殖成比例(其被毒性分析降低)。熒光與DNA修復(fù)系統(tǒng)的活性成比例(被基因毒性分析增強)。所用的酵母培養(yǎng)物是遺傳修飾的菌株，其在細胞進行DNA損傷修復(fù)時表達綠色熒光蛋白。將熒光標準化成為吸收信號，以校正在細胞產(chǎn)量中由所測試的化合物對酵母細胞的任何細胞毒性活性引起的變化。這產(chǎn)生稱為“亮度(brightness)”的“每細胞熒光(fluorescence per cell)”測量。除Gentronix Assay酵母菌株(GenT01)外，還應(yīng)用了對照釀酒酵母菌株(GenC01)，除了其產(chǎn)生綠色熒光蛋白的能力失活外，其等同于Gentronix Assay酵母菌株。該菌株被用來提供對照，以允許對可以自身自動熒光或誘導(dǎo)酵母細胞中的自動熒光的物質(zhì)的校正。將收集到的數(shù)據(jù)簡單地轉(zhuǎn)移到Excel模板中，在其中自動生成結(jié)果評估圖表。所述圖表含有對基因毒性和細胞毒性的繪圖和列表形式的處理結(jié)果，其具有對結(jié)果的自動評估，即，肯定的或否定的，和最低作用濃度(LEC)的計算。
參考圖6A-6C，顯示分別用多肽GIN 1p、GIN 33和GIN 34獲得的酵母基因毒性測定。對照菌株(GenC01)如期望那樣表現(xiàn)出很少的自動熒光，其在多肽的存在時在該菌株中是明顯的，盡管如此，考慮到其最小的背景，對用測試菌株(GenT01)獲得的數(shù)據(jù)進行校正。圖6A-6C顯示所有3種多肽在測試酵母菌株(GenT01)中沒有產(chǎn)生任何基因毒性反應(yīng)，由于多肽濃度達到并包含100μM對應(yīng)的值清楚地沒有達到要顯示基因毒性所需要的閾值。
總之，所述結(jié)果表明按照本發(fā)明的多肽的抗菌效果。具體地，多肽GIN 34(SEQ ID No.12)，GIN 33(SEQ ID No.16)，GIN 32(SEQ ID No.8)，GIN 1p(SEQ ID No.6)，GIN 7(SEQ ID No.7)，GIN 41(SEQ ID No.10)，GIN 2(SEQ ID No.3)，GIN 8(SEQ ID No.11)，和GIN 11(SEQ ID No.4)展現(xiàn)出抗菌活性而在基因毒性上沒有任何不利作用。
實施例2-高壓滅菌后多肽保持效果為了測試按照本發(fā)明的多肽經(jīng)過高壓滅菌處理的效果，在PBS中制備400μM的GIN 1p儲液，并將420μl等分試樣裝入4個Eppendorf管(帶螺旋蓋)。蓋緊蓋子后，將2管置于放在Pyrex燒杯中的金屬架上，并且放入Prestige醫(yī)學(xué)臨床高壓滅菌器(Prestige Medical Clinical Autoclave)。剩余的2管不進行處理，作為對照。然后將高壓滅菌器激活，并經(jīng)過2個高壓滅菌循環(huán)，其中每一個循環(huán)都包括將肽溶液暴露于126℃持續(xù)11min。最后，按先前所描述的那樣測試2種高壓滅菌的和2種對照肽樣品抗銅綠假單胞菌的效果。
參考圖7，顯示的是將細菌接種物暴露于不同濃度的GIN 1p(按照本發(fā)明的多肽)后銅綠假單胞菌的生長水平，所述GIN 1p已被高壓滅菌或未經(jīng)高壓滅菌，表示為未處理的細菌生長的a％。正如可看出的，所有4種樣品的IC50值是相同的(約2μM，如圖7中所示)。因此，按照本發(fā)明的多肽因而適合與通常在制造過程中經(jīng)過高壓滅菌進行殺菌的產(chǎn)品一起應(yīng)用。
實施例3-多肽附著到接觸透鏡、玻璃和用生物材料“PLGA”包被的表面為了測試按照本發(fā)明的肽是否可以被固定在生物材料或其它表面上，發(fā)明人獲得了熒光標記形式的GIN 1p(Advanced Biomedical，Oldham，英國)。在PBS中制備40μM該標記多肽的儲液，并將250μl等分試樣放入到24孔微量培養(yǎng)板的孔中。然后發(fā)明人將一些材料放入這些肽溶液，這些材料為(i)強生Acuvue接觸透鏡；(ii)裸露的玻璃條狀蓋板；或(iii)先前用生物材料聚(丙交酯-共-乙膠酯)(PLGA包被的蓋玻片由曼徹斯特大學(xué)物理系Jian Lu教授提供)包被的條狀蓋板。
在肽溶液中在20℃溫育15min后，將所述材料移出，然后通過放入1ml PBS中進行洗滌。然后將所述材料用熒光顯微鏡(使用裝備Chroma35002v2濾光裝置的Olympus IX70倒置顯微鏡)進行檢驗，并且通過照相記錄結(jié)果。然后將所述材料在1ml PBS中洗滌再洗滌兩次，然后最后將其在25ml PBS中37℃浸泡過夜。每一次洗滌后，將熒光水平再通過如上文所描述的顯微鏡觀察和照相進行觀察并記錄下來。
參考圖8，顯示強生Acuvue接觸透鏡，其用40μM GIN 1p(其用熒光標記合成)處理15min，然后洗滌4次，包括在25ml PBS中浸泡過夜。圖8(a)顯示未處理的透鏡和GIN 1p處理的透鏡(4次洗滌后)，其在白光、或GFP熒光照明下，使用Olympus IX70顯微鏡。因此，即使經(jīng)過反復(fù)洗滌后，所述透鏡仍保持顯著量的肽，以至于熒光甚至可以用眼睛觀察到，如圖8(b)中所示。所述圖像的捕獲通過使用Canon EOS300D數(shù)碼照相機，應(yīng)用ISO1600膠卷裝置，并且對熒光圖像用0.3s的曝光時間。
參考圖9，顯示玻璃條狀蓋板(BG)、或先前用生物材料聚(丙交酯-共-乙膠酯)(PLGA)包被的條狀蓋板，其用40μM GIN 1p(其用熒光標記合成)處理15min，然后洗滌4次，包括在25ml PBS中浸泡過夜。每一次洗滌(W1，W2，W3和W4)后，使用Olympus IX70顯微鏡觀察樣品的熒光水平。因此，可以看出任何洗滌后熒光水平?jīng)]有明顯地減少，表明所述多肽牢固地附著到一系列表面上。所述圖像的捕獲通過使用Canon EOS300D數(shù)碼照相機，用5s的曝光時間應(yīng)用ISO1600膠卷裝置進行。
因此，圖8和9顯示，盡管大量地洗滌，但是所有3種類型的材料看起來都保持相似的GIN 1p水平，這表明所述多肽適合包被各種表面(如圖8a和圖9中所示)。具體地，發(fā)現(xiàn)接觸透鏡吸收顯著量的多肽(可能由于它們大的表面積)，以至于即使在經(jīng)過第四次過夜洗滌之后，熒光對肉眼清楚可見，如圖8b所示。
實施例4-抗銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的抗菌效果發(fā)明人構(gòu)建了衍生于脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的肽的擴大的文庫，以進一步評估按照本發(fā)明的多肽。然后實行了進一步的實驗，以研究該肽文庫抗細菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的抗菌活性。用于測定每一種肽的IC50值的方法如實施例1中所描述。與實施例1中測量的IC50值形成對比，實施例4中測量的值小于或等于約60μM。
表7提供衍生于apoE的肽的數(shù)據(jù)。
表7-衍生于脫脂載脂蛋白E的肽
從表7應(yīng)該看出按照本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出抗評估的3種不同細菌菌株中的至少1種的抗菌活性，如果不是2種，和如果不是3種全部都抗的話。具體地，MU 4，MU 7，MU 10，MU 43，MU 58，MU 59，MU 60，MU 61，MU 82，MU 83，MU 112，MU 115，和GIN 34特別有效。處于按照本發(fā)明的多肽定義之外的一系列肽可以看出是無效的。
可以看出多肽MU 10(串聯(lián)重復(fù))的抗菌性高出MU 43(單體)的抗菌性很多，這舉例說明按照本發(fā)明的串聯(lián)重復(fù)是有效的抗菌物這一令人驚奇的特性。沒有顯示出抗菌活性的肽處于本發(fā)明范圍之外，例如MU 3、MU 12、MU 19、GIN 5。
表8顯示衍生于apoB的肽的數(shù)據(jù)。
表8-衍生于脫脂載脂蛋白B的肽
從表8應(yīng)該看出按照本發(fā)明的肽表現(xiàn)出抗評估的3種不同細菌菌株中的至少1種的抗菌活性，如果不是2種，和如果不是3種全部都抗的話。具體地，MU 24，MU 28，MU 37，MU 73，MU 30，和MU 32全是特別有效的。
應(yīng)該理解不展現(xiàn)抗菌活性的肽(i)不是串聯(lián)重復(fù)；(ii)不包含至少2個RKR基序；或(iii)沒有由本文提供的化學(xué)式允許或提供的氨基酸取代組成。
MU 84是一個三聚體實例，即包括3個單體的串聯(lián)重復(fù)。
序列表<110>曼徹斯特大學(xué)C·多布森K·A·克拉徹<120>細菌感染的治療<130>PCB/P089567PWO<160>98<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>人<400>1Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人<400>2Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys1 5<210>3<211>15<212>PRT<213>人<400>3Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu1 5 10 15<210>4<211>22<212>PRT<213>人<400>4Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys1 5 10 15Leu Arg Lys Arg Leu Leu20
<210>5<211>30<212>PRT<213>人<400>5Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr20 25 30<210>6<211>18<212>PRT<213>人<400>6Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg1 5 10 15Leu Leu<210>7<211>18<212>PRT<213>人<400>7Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg1 5 10 15Trp Trp<210>8<211>14<212>PRT<213>人<400>8Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg1 5 10<210>9<211>18<212>PRT<213>人
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<210>14<211>14<212>PRT<213>人<400>14Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu1 5 10<210>15<21l>18<212>PRT<213>人<400>15Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Lys Arg Leu1 5 10 15Arg Lys<210>16<211>18<212>PRT<213>人<400>16Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>17<211>0<212>DNA<213>人<400>17<210>18<211>0<212>DNA<213>人<400>18<210>19<211>37<212>PRT<213>人<400>19
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<210>70<211>18<212>PRT<213>人<400>70Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg1 5 10 15Trp Trp<210>71<211>18<212>PRT<213>人<400>71Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg1 5 10 15Trp Trp<210>72<211>18<212>PRT<213>人<400>72Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg1 5 10 15Leu Leu<210>73<211>18<212>PRT<213>人<400>73Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg1 5 10 15Leu Leu<210>74
<211>18<212>PRT<213>人<400>74Trp Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg1 5 10 15Leu Leu<210>75<211>17<212>PRT<213>人<400>75Trp Arg Lys Trp Arg Lys Phe Phe Phe Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Trp<210>76<211>18<212>PRT<213>人<400>76Trp Arg Lys Trp Arg Lys Arg Trp Trp Phe Arg Lys Phe Arg Lys Arg1 5 10 15Phe Phe<210>77<211>12<212>PRT<213>人<400>77Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys1 5 10<210>78<211>18<212>PRT<213>人<400>78
Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg1 5 10 15Leu Leu<210>79<211>0<212>DNA<213>人<400>79<210>80<211>18<212>PRT<213>人<400>80Leu Leu Arg Lys Arg Leu Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Arg Leu Lys1 5 10 15Arg Leu<210>81<211>18<212>PRT<213>人<400>81Trp Arg Trp Arg Arg Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Arg Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>82<211>18<212>PRT<213>人<400>82Trp Arg Trp Lys Lys Lys Trp Arg Lys Trp Arg Trp Lys Lys Lys Trp1 5 10 15Arg Lys<210>83
<211>18<212>PRT<213>人<400>83Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>84<211>18<212>PRT<213>人<400>84Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>85<211>18<212>PRT<213>人<400>85Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>86<211>18<212>PRT<213>人<400>86His Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>87<211>17
<212>PRT<213>人<400>87Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg1 5 10 15Lys<210>88<211>18<212>PRT<213>人<400>88Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>89<211>18<212>PRT<213>人<400>89Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Leu Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>90<211>18<212>PRT<213>人<400>90His Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys His Arg Trp Arg Lys Arg Trp1 5 10 15Arg Lys<210>91<211>16<212>PRT
<213>人<400>91Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys1 5 10 15<210>92<211>16<212>PRT<213>人<400>92Arg Trp Arg Lys Arg Gly Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Gly Arg Lys1 5 10 15<210>93<211>16<212>PRT<213>人<400>93Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Lys1 5 10 15<210>94<211>14<212>PRT<213>人<400>94Arg Lys Arg Gly Trp Lys Trp Arg Lys Arg Gly Trp Lys Trp1 5 10<210>95<211>14<212>PRT<213>人<400>95Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly1 5 10<210>96<211>9<212>PRT<213>人<400>96Leu Arg Thr Arg Lys Arg Gly Arg Lys1 5
<210>97<211>60<212>PRT<213>人<400>97Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu A1a Val Tyr Leu Arg20 25 30Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg35 40 45Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr50 55 60<210>98<211>18<212>PRT<213>人<400>98Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Trp Arg Lys Arg Trp Arg Trp Arg Lys1 5 10 15Arg Trp
權(quán)利要求
1.多肽、或者其衍生物或類似物在制造用于治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述多肽、或者其衍生物或類似物包括從脫脂載脂蛋白的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)衍生的肽的重復(fù)。
2.按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述肽是衍生于脫脂載脂蛋白B或脫脂載脂蛋白E的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)受體結(jié)合區(qū)。
3.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述肽是衍生于脫脂載脂蛋白BLDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇、或衍生于脫脂載脂蛋白ELDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇。
4.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述多肽包括至少2個RKR基序。
5.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述多肽包括下述序列的串聯(lián)二聚體重復(fù)SEQ ID No.1；SEQ ID No.2；SEQ ID No.96；或其衍生物，其中除RKR基序外，至少1個氨基酸殘基被精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或其衍生物替代。
6.按照權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中被替代或取代的殘基是所述多肽的第一個、第二個、第三個、第七個、第八個、第九個、第十個、第十一個、第十二個、第十六個、第十七個或第十八個殘基。
7.按照權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述的至少1個氨基酸取代是苯丙氨酸(F)殘基或色氨酸(W)殘基、或其衍生物。
8.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述多肽具有式{abcRKRxyz}+{a′b′c′RKRx′y′z′} (式I)其中a和a′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；b和b′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；或被刪除；c和c′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或蘇氨酸(T)；或被刪除；x和x′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或甘氨酸(G)；或被刪除；y和y′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除；z和z′＝獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)；或被刪除。
9.按照權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述多肽包括至少1個添加氨基酸，其可以獨立地選自精氨酸(R)；酪氨酸(Y)；甲硫氨酸(M)；異亮氨酸(I)；苯丙氨酸(F)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；賴氨酸(K)；組氨酸(H)，并且該添加的氨基酸在N-末端于式I的肽的‘a(chǎn)’位置的氨基酸前被添加。
10.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述多肽包括肽apoE141-149(SEQID No.1)的重復(fù)或其剪截物；或肽apoE141-149的變體的重復(fù)，其中至少1個亮氨酸(L)殘基被色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)替代，其用于制造用于治療細菌感染的藥物。
11.多肽在用于制造治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述多肽包括肽apoE141-149(SEQ ID No.1)的重復(fù)或其剪截物；或肽apoE141-149的變體的重復(fù)，其中至少1個亮氨酸(L)殘基被色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)替代。
12.按照權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述多肽包括apoE141-149(SEQ ID No.1)的重復(fù)或其剪截物，其特征在于至少1個亮氨酸(L)殘基被色氨酸(W)、或苯丙氨酸(F)殘基替代。
13.按照權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述串聯(lián)重復(fù)包括至少2個獨立選自色氨酸(W)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)、或苯丙氨酸(F)取代的取代。
14.按照任一前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述多肽包括氨基酸序列LRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.6)；WRKWRKRWWWRKWRKRWW(SEQ ID No.7)；WRKWRKRWRKWRKR(SEQ ID No.8)；WRKWRKRWWLRKLRKRLL(SEQ ID No.9)；YRKYRKRYYYRKYRKRYY(SEQ ID No.10)；LRKLRKRLRKLRKR(SEQ IDNo.11)；LRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID No.3)；FRKFRKRFFFRKFRKRFF(SEQID No.48)；WRKWRKRWWRKWRKRWW(SEQ ID NO.63)；WRKWRKRWRKWRKRW(SEQ ID NO.64)；WRKWRKRWWFRKWRKRWW(SEQ ID NO.65)；WRKWRKRFFWRKWRKRFF(SEQ ID NO.66)；WRKRWWRWRKRWWR(SEQ ID NO.67)；LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR(SEQID NO.68)；WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR(SEQ ID NO.69)；LRKLRKRLLWRKWRKRWW(SEQ ID NO.70)；LRKLRKRLLLRKLRKRWW(SEQ ID NO.71)；LRKLRKRLLWRKWRKRLL(SEQ ID NO.72)；WRKWRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.73)；WRKLRKRLLLRKLRKRLL(SEQ ID NO.74)；WRKWRKFFFRKWRKRWW(SEQ ID NO.75)；或WRKWRKRWWFRKFRKRFF(SEQID NO.76)。
15.按照權(quán)利要求1-9任一項的應(yīng)用，其中所述多肽包括衍生于apoB的HSPG受體結(jié)合區(qū)的肽的重復(fù)。
16.多肽、或者其衍生物或類似物用于制造治療細菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述多肽、或者其衍生物或類似物包括衍生于脫脂載脂蛋白B的HSPG受體結(jié)合區(qū)的肽的重復(fù)。
17.按照權(quán)利要求15或16的應(yīng)用，其中所述多肽是衍生于脫脂載脂蛋白BLDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域B簇。
18.按照權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述多肽包括apoB3359-3367(SEQ ID No.2)的重復(fù)或其剪截物或變體。
19.按照權(quán)利要求16-18任一項的應(yīng)用，其中所述多肽包括至少2個RKR基序。
20.按照權(quán)利要求16-19任一項的應(yīng)用，其中所述多肽具有序列RLTRKRGLKRLTRKRGLK(SEQ ID No.12)或其剪截物，其中除RKR基序外至少1個氨基酸殘基被甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、組氨酸(H)、色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或其衍生物替代。
21.按照權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中至少1個氨基酸殘基被色氨酸(W)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)殘基或其衍生物替代。
22.按照權(quán)利要求16-21任一項的應(yīng)用，其中所述多肽具有式{abcRKRxyz}+{a′b′c′RKRx′y′z′} (式IV)其中a和a′＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；亮氨酸(L)；色氨酸(W)；或被刪除；b和b′＝獨立地選自亮氨酸(L)；精氨酸(R)；賴氨酸(K)；或被刪除；c和c′＝獨立地選自蘇氨酸(T)；色氨酸(W)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；x和x′＝獨立地選自甘氨酸(G)；色氨酸(W)；亮氨酸(L)；或正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；y和y′＝獨立地選自亮氨酸(L)；正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或被刪除；z和z′＝獨立地選自正電荷殘基，其可以選自精氨酸(R)或賴氨酸(K)或組氨酸(H)；或亮氨酸；或被刪除。
23.按照權(quán)利要求16-22任一項的應(yīng)用，其中所述多肽是RTRKRGRRTRKRGR(SEQ ID No.13)；LRKRKRLLRKRKRL(SEQ ID No.14)；LRKRKRLRKLRKRKRLRK(SEQ ID No.15)；WRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.16)；LLRKRLKRLLLRKRLKRL(SEQ ID NO.80)；RRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.83)；KRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.84)；LRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.85)；HRWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID No.86)；RWRKRWRKWRWRKRWRK(SEQ ID NO.87)；RRWRKRWRKRRWRKRWRK(SEQ ID NO.88)；LRWRKRWRKLRWRKRWRK(SEQ ID No.89)；HRWRKRWRKHRWRKRWRK(SEQ ID No.90)；RWRKRWRKRWRKRWRK(SEQ ID NO.91)；RWRKRGRKRWRKRGRK(SEQ ID No.92)；RWRKRWRKRWRKRWRK(SEQ ID No.93)；RKRGWKWRKRGWKW(SEQ IDNo.94)；或RLTRKRGRLTRKRG(SEQ ID No.95)。
24.按照權(quán)利要求16-19任一項的應(yīng)用，其中所述多肽具有序列RLTRKRGLKRLTRKRGLK(SEQ ID No.12)。
25.一種多肽，其包括肽apoE141-149(SEQ ID No.1)的重復(fù)或其剪截物，其特征在于至少1個亮氨酸(L)殘基被酪氨酸(Y)、或苯丙氨酸(F)替代。
26.一種多肽、其衍生物或類似物，其包括下述的氨基酸序列SEQ ID No.3(GIN2)；SEQ ID No.4(GIN11)；SEQ ID No.67(MU81)；SEQ IDNo.68(MU82)；SEQ ID No.80(MU24)；SEQ ID No.94(MU73)或SEQ ID No.95(MU74)。
27.按照權(quán)利要求25或26的多肽，其用作藥物。
28.按照權(quán)利要求27的多肽的應(yīng)用，其用于制造治療細菌感染的藥物。
29.按照任一前述權(quán)利要求的多肽的應(yīng)用，其用于治療葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌目(Pseudomonadales)或鏈球菌屬(Streptococci)感染。
30.核酸序列，其編碼按照前述權(quán)利要求任一項的多肽。
31.一種預(yù)防和/或治療細菌污染的方法，其包括用有效殺死或預(yù)防細菌生長的一定量的按照前述權(quán)利要求任一項的多肽包被需要其的物體或表面。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中所述物體被包被并選自醫(yī)學(xué)裝置、透鏡、接觸透鏡、導(dǎo)管、斯滕特固定模、傷口愈合敷料、避孕用具、外科手術(shù)植入物和復(fù)位結(jié)合。
33.按照權(quán)利要求31的方法，其中所述表面被包被并且所述表面選自醫(yī)院病房表面、手術(shù)室表面、廚房表面和衛(wèi)生間表面。
34.一種接觸透鏡，其至少部分用按照任一前述權(quán)利要求的肽、其衍生物或類似物進行包被。
全文摘要
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出抗菌活性的多肽和編碼該多肽的核酸，其中多肽包含衍生于脫脂載脂蛋白的肽的重復(fù)。本發(fā)明進一步提供所述多肽、衍生物、類似物或核酸作為藥物的應(yīng)用，還提供它們在預(yù)防或治療細菌感染的方法中或物體和表面中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步延伸到用多肽包被的物體，例如接觸透鏡。
文檔編號A61K31/04GK1925866SQ200580006215
公開日2007年3月7日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者C·多布森, K·A·克拉徹 申請人:A12有限公司